KR20230134485A

KR20230134485A - 선천성 면역 기억을 자극하는 cath2 유도체

Info

Publication number: KR20230134485A
Application number: KR1020237024122A
Authority: KR
Inventors: 헨드릭 피터 행스맨; 알베르트 밴 디즈크; 에드윈 조하네스 아드리아누스 벨드후이젠
Original assignee: 유니버시테이트 우트레크트 홀딩 비.브이.
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-09-21
Also published as: AU2021400851A9; JP2024501498A; CA3202622A1; CN117120071A; WO2022131922A1; MX2023007306A; AU2021400851A1; EP4262842A1; US20240050526A1

Abstract

본 발명은 CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 항균 치료를 개선하는 방법, 및 병원체 특이적 백신의 보조제로서 CATH2 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.

Description

선천성 면역 기억을 자극하는 CATH2 유도체

본 발명은 의학 및 수의학 분야에 관한 것으로, 특히, 면역 자극 활성을 갖는 펩티드, 특히 CATH2 유도체에 관한 것이다.

"선천성 면역 기억(innate immune memory)" 또는 "훈련된 면역(trained immunity)"은 NK 세포 및 단핵구(monocytes)/대식세포(macrophages)에서 다양한 미생물 성분에 의해 유도되는 것으로 확인되었다[1-4]. 박테리아, 진균 및 바이러스 리간드는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRR)의 활성화를 통해 단핵구 표현형을 재자극에 대한 강화된(훈련된) 또는 감소된(내성) 면역 반응으로 재프로그래밍할 수 있다. 열-살균된 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 진균 세포벽 성분 β-글루칸에 대한 사전 노출은 TLR2 및 TLR4 리간드에 대한 전염증성 사이토카인 반응의 증폭을 통해 대식세포 의존적 방식으로 마우스의 재감염에 대한 방어를 유도하는 것으로 나타났다[2]. β-글루칸 외에도 시험관내 훈련된 면역은 그람 양성균의 성분(뮤라닐 디펩타이드(muranyl dipeptide))[2, 3], BCG(Bacille Calmette-Guerin)[3], 저용량의 다당류[1] 및 산화된 저밀도 지단백질[5]에 의해 단핵구/대식세포에서 유도될 수 있다. 훈련된 면역의 기본 메커니즘은 호기성 해당과정(aerobic glycolysis)을 향해 변화된 세포 대사 및 면역-관련 유전자를 포함하는 특정 유전자좌에서 후성유전학적(epigenetic) 환경의 변화이다[6].

카텔리시딘(Cathelicidins)은 숙주 방어 펩티드(host defence peptides, HDP)이며 선천성 면역 체계의 일부이다[7]. 이 펩티드는 조직 손상 또는 감염 시 미생물 노출 또는 호중구 및 비만 세포 탈과립을 통해 수동적으로(괴사) 또는 능동적으로 방출되는 내인성 경보물(alarmin)로 알려져 있다[8]. 대식세포에 대한 강력한 면역조절 효과가 시험관내 인간 카텔리시딘 LL-37 및 닭 CATH-2에 대해 보고되었다[9-12]. 생체내에서, 침습성 스탤필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)[13, 14], MRSA[15], 대장균(Escherichia coli)[13] 및 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)[14] 감염에 대한 마우스 감염 모델에서 카텔리시딘 유래 펩티드의 항균 효능이 입증되었다. 카텔리시딘 유래 펩티드의 치료 효능을 높이기 위해, 완전한 D-아미노산 유사체를 사용하여 낮은 면역원성(imuunogenecity)을 유지하면서 프로테아제에 대한 높은 내성을 얻을 수 있다[16]. DCATH-2의 종란 주사(ovo injection)에 의한 닭 배아(embryo)의 예방적 치료는 대장균증(colibacilossis) 관련 사망률(mortality)과 질병율(morbidity)을 상당히 감소시켰다[17]. 또한, DCATH-2를 제브라피쉬(zebrafish) 배아(embryo)의 난황(yolk)에 주사한 후 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 치사량으로 정맥 주사시 지연된 사망이 관찰되었다[18].

다양한 항균 치료법이 공지되어 있지만, 특히 감염성 질환의 치료 및 예방의 개선된 방법에 대한 당업계에서의 요구가 여전히 존재한다.

본 발명의 목적은 CATH2 및 이의 유도체의 신규한 용도를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 약물의 제조에서의 CATH2 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화 또는 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화 또는 유도하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화 또는 유도하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 불활성화 또는 결함있는 선천성 면역 기억을 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 상기 불활성화 또는 결함 있는 선천성 면역 기억을 치료하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서, 특히, 이를 필요로 하는 대상체에서, 불활성화 또는 결함있는 선천성 면역 기억을 치료하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 항균제의 항균 활성을 개선 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 치료는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 대장균(Escherichia coli)의 치료이며, 보다 바람직하게는 살모넬라 엔테리티디스 또는 칸디다 알비칸스의 치료이다.

다른 측면에서, 본 발명은 항균제의 항균 활성을 개선 또는 증가시키는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 항균제의 항균 활성을 개선 또는 증가시키기 위한 약물의 제조에 있어서 CATH2 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 병원체 특이적 백신에 대한 보조제(adjuvant)로서 CATH2 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 병원체 특이적 백신에 대한 보조제, 바람직하게는, 상기 병원체에 의해 유발되는 감염성 질환의 치료 또는 예방의 방법에서 병원체 특이적 백신의 보조제로서 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 병원체에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체 및 상기 병원체 특이적 백신을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 병원체 특이적 백신에 사용하기 위한 보조제 제조에서의, 바람직하게는 CATH2 또는 이의 유도체 및 상기 병원체 특이적 백신을 포함하는 약물의 제조에 있어서, CATH2 또는 이의 유도체의 용도, 바람직하게는 상기 병원체에 의해 유발되는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 병원체에 특이적인 병원체 특이적 백신 및 CATH2 또는 이의 유도체를 보조제로서 투여하는 단계를 포함하는 상기 병원체에 의해 유발되는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 바람직하게는 상기 병원체 특이적 백신은 (약독화된(attenuated)) 병원체 또는 병원체 유래 펩티드 또는 단백질이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다" 및 이의 활용형은 이 단어가 가리키는 항목들을 포함하는 것으로서, 구체적으로 언급되지 않은 항목들을 제외하지 않는 비제한적인 의미로 사용된다. 또한, 용어 "구성하는"은 "필수적으로 구성되는"으로 대체될 수 있는데, 이는 본 명세서에 정의된 화합물 또는 부속 화합물이 구체적으로 확인된 것 이외의 추가 성분(들)을 포함할 수 있다는 것을 의미하며, 상기 추가 성분(들)은 본 발명의 고유한 특성을 변경하지 않는다.

수사 "하나" 및 "한"은 수사의 문법적 대상물의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 의미하는 것으로 사용된다. 예로서, "한 성분"는 하나의 성분 또는 하나 이상의 성분을 의미한다.

단어 "대략" 또는 "약"은 수치 값(대략 10, 약 10)과 관련하여 사용될 때 바람직하게는 그 값이 주어진 갑의 10% 이상 또는 10% 미만의 값을 포함하는 의미로 사용된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 존재하는 질환, 특히 감염성 질환, 바람직하게는 세균 감염, 예컨대 대장균(E. coli) 또는 살모넬라균(Salmonella), 특히 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis)의 감염, 또는 진균 감염, 예컨대 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 감염을 치료하기 위한 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료(treatment)", "치료하다(treat)" 및 "치료하는(treating)"은 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 진행을 역전, 완화, 발생을 지연시키거나 억제하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 하나 이상의 증상이 발생한 후에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료제는 증상이 없는 상태에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료제는 (예컨대, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 인자에 비추어) 증상의 발생 전에 예민한 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 재발을 예방하거나 지연시키기 위해 증상이 해결된 후에도 치료를 계속할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 질환, 특히 감염성 질환, 바람직하게는 세균 감염, 예컨대 대장균 또는 살모넬라균, 특히 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis), 감염, 또는 진균 감염, 예컨대 칸디다 알비칸스 감염의 예방을 위한 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "예방(prevention)"은 아직 질환의 임상적 증상을 경험하지 않는 대상체에서 질환 또는 병태의 발병 및/또는 질환 또는 병태의 임상적 증상의 출현을 배제 또는 지연시키는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "펩티드(peptide)"는 펩티드 결합에 의해 결합되는 아미노산의 서열을 의미하며, 상기 아미노산은 20개의 천연 펩티드-구축 아미노산 중 하나이고, 상기 아미노산 중 하나 또는 전부는 L-형 또는 D-형일 수 있거나, 또는 이소류신 및 트레오닌의 경우 D-알로 형(키랄 중심 중 하나에서만 반전)일 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 선형일 수 있으며, 상기 서열의 첫 번째 및 마지막 아미노산은 각각 유리 NH₂- 또는 COOH-그룹을 갖거나, N-말단(아세틸화) 및/또는 C-말단(아미드화) 변형될 수 있다. 본 명세서에 정의된 아미노산 서열에서, 아미노산은 단일 문자 기호 또는 세 문자 기호로 표시된다. 이들 단일 문자 기호 및 세 문자 기호는 해당 분야 기술자에게 잘 알려져 있으며, 다음과 같은 의미를 갖는다: A(Ala)는 알라닌, C(Cys)는 시스테인, D(Asp)는 아스파르트산, E(Glu)는 글루탐산, F(Phe)는 페닐알라닌, G(Gly)는 글리신, H(His)는 히스티딘, I(Ile)는 이소류신, K(Lys)는 라이신, L(Leu)는 류신, M(Met)은 메티오닌, N(Asn)은 아스파라긴, P(Pro)는 프롤린, Q(Gln)는 글루타민, R(Arg)은 아르기닌, S(Ser)는 세린, T(Thr)는 트레오닌, V(Val)는 발린, W(Trp)는 트립토판, Y(Tyr)는 티로신이다.

용어 "선천성 면역 기억(Innate immune memory)" 및 "훈련된 면역(trained immunity)"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 외인성 또는 내인성 공격 후에 기능적으로 재프로그래밍하고, 비-활성화 상태로 복귀한 후의 이어지는 위협에 비특이적으로 반응하는 선천성 면역 세포의 능력을 의미한다. 훈련된 면역은 선천성 면역 세포의 유전자 발현 및 세포 생리학의 변화로 이어지는 후성유전학적 변형에 의해 조정된다. 선천성 면역 기억은 선천성 면역 세포의 면역 항상성, 프라이밍, 훈련 및 내성의 섬세한 균형을 조절하는 강력한 도구를 제공한다. 훈련된 면역으로 입증된 장기 적응은 항균제를 사용한 직접 치료와 비교하여 감염성 질환을 포함한 다양한 면역 관련 질병에서 보다 강력한 반응으로 장기 치료 효과를 달성하는 데 사용될 수 있다.

본 발명자들은 CATH2 및 이의 유도체가 선천성 면역 기억의 강력한 자극제임을 발견하였다. 본 명세서의 실시예에서 나타낸 바와 같이, CATH2 및 이의 유도체는 선천성 면역 세포(대식세포)에서 훈련된 면역을 유도하여 상이한 TLR 리간드로 반복적인 자극시 전염증성 사이토카인 생산을 향상시킨다는 것이 밝혀졌다. 특히, 다음과 같은 사실을 발견하였다:

1) CATH 훈련된, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)로 분화된 dTHP-1 세포의 LPS(TLR4)로의 재자극은 전염증성 사이토카인 반응(IL-6)을 증폭시킨다. THP1 세포는 단핵구 유사(비부착성) 세포이며, PMA 분화된 대식세포 유사 표현형(부착성)을 생성한다.

2) Pam3CSK4(TLR1/2), Pam2CSK4(TLR2/6), 매끄럽거나 거친 LPS(TLR4)로 DCATH2 훈련된 dTHP-1 세포를 재자극하면 전염증성 사이토카인 반응(TNF-알파, IL-6)을 증폭한다.

3) L-, DCATH2 훈련은 기저 dTHP1 세포 TNF-알파 및 IL-6 생산을 변화시키지 않는다.

4) DCATH2 훈련 dTHP-1 세포는 살모넬라 엔테리티디스 및 칸디다 알비칸스에 대한 항균 활성을 증가시켰다.

5) DCATH2 훈련은 dTHP-1 세포 대사를 mTOR 의존성 호기성 해당과정 및 장쇄 지방산 축적으로 이동시키며, 이는 둘 다 LPS 자극 동안 유지된다.

6) dTHP-1 세포의 DCATH2 훈련은 후성유전학적 조절(히스톤 아세틸화)에 의존적이다.

7) dTHP-1 세포의 DCATH2 훈련은 MAPK p38 신호 전달에 의존적이다.

8) THP-1 세포의 DCATH2 훈련은 수용체 매개이며, 일반적으로 P2 계열 수용체, 특히, 호기성 해당작용의 핵심 조절자이자 펩티드 내재화에 관여하는 P2X7R에 의한 퓨린성(purinergic) 신호전달에 의존적이다.

이러한 모든 발견은 종합적으로 CATH2와 이의 유도체가 훈련된 면역을 활성화, 유도 및 자극할 수 있음을 나타낸다.

첫번째 관점에서, 본 발명은 CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.

본 발명에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 자극한다는 것은 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하기 전과 비교하여 CATH2 또는 이의 유도체를 투여한 후에 선천성 면역 기억이 활성화, 유도 또는 자극되는 것을 의미한다. 이러한 활성화, 유도 또는 자극은 특히 CATH2 또는 이의 유도체의 투여 후 재자극 후에 측정될 수 있으며, 면역세포의 TNF-알파 및 IL-6 생산, mTOR 의존성 호기성 해당작용 및 장쇄 지방산 축적과 같은 기본 특징들이 CATH2 또는 그의 유도체의 투여 후에 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 기술된 바와 같이, TLR4 리간드를 사용한 재자극 및 TNF-알파 및/또는 IL-6과 같은 사이토카인 생산 수준 측정했을 때, 세포 대사가 mTOR 의존성 호기성 해당작용 및 장쇄 지방산 축적으로 편향하였다.

일 실시형태에서, CATH2 및 유도체는 선천성 면역 세포에서 훈련된 면역을 유도한다. 선천성 면역 세포는 선천성 면역을 매개하는 백혈구이며 호염기구(basophils), 수지상 세포(dendritic cells), 호산구(eosinophils), 랑게르한스 세포(Langerhans cells), 비만 세포(mast cells), 단핵구 및 대식세포, 호중구(neutrophils) 및 NK 세포를 포함한다.

일 실시형태에서, 선천성 면역 기억은 감염성 질환, 즉 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염에 대한 선천성 면역 기억이다. 감염성 질환은 특히 그람 양성균(Gram-positive) 및 그람 음성균(Gram-negative) 모두에 의한 세균 감염 또는 칸디다 알비칸스 감염과 같은 진균 감염이다. 일 실시형태에서, 감염성 질환, 특히 그람 양성 및 그람 음성균 둘 다에 의한 세균 감염을 치료 또는 예방한다. 본 발명에 따라 적합하게 치료 및/또는 예방될 수 있는 감염성 질환 및 세균 감염은 하기에 보다 상세히 설명된다.

일 실시형태에서, 상기 방법은 항균제, 특히 CATH2 또는 이의 유도체를 사용하여 항균 치료를 개선 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 항균 치료를 개선하는 방법이 제공된다. 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 항균 치료를 개선하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명자들이 CATH2, DCATH2 및 이의 유도체가 선천성 면역 기억을 유도한다는 것을 확인하였으므로, 이를 이용하여 기존의 항균 요법을 개선함으로써 치료 결과 및/또는 치료 효능을 향상시킬 수 있을 것이다. 특히, 상기 개선은 CATH2 또는 유도체의 투여 시기, CATH2 또는 유도체의 투여량, CATH2 또는 유도체의 제형 및/또는 투여 경로와, 본 명세서의 다른 부분에서 보다 상세히 설명한 바와 같은 다른 활성 또는 비활성 화합물과의 조합과 같은 치료 효율의 개선이다. 특히, 이제 CATH2 및 유도체가 선천성 면역 기억을 자극한다는 것을 알게 되어, 보조제(adjuvant)와 같은 적절한 부속성분, 및/또는 다른 활성 또는 비활성 성분과의 조합을 포함하는 적당한 제형 및 활성화, 유도 또는 촉진 또는 선천성 면역 기억을 유도하는 투여량 및 계획을 선택하는 것이 가능해졌다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따라 CATH2 또는 이의 유도체로 치료 또는 투여받을 대상체는 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 자극할 필요가 있는 대상체이다.

동물은 접촉, 섭취 및 흡입을 통해 매일 수많은 잠재적 병원체에 노출된다. 감염을 피하는 능력은 부분적으로 적응 면역 체계에 달려 있으며, 적응(adaptive) 면역 체계는 특정 병원체와의 이전 만남을 기억하고 그것이 다시 공격할 때 이를 파괴한다. 그러나, 적응 면역 반응은 B 및 T 세포의 특정 클론이 활성화되고 확장되어야 하기 때문에 새로운 병원체에 처음 노출시 느리게 발달한다. 따라서, 응답이 효과적일 때까지 적어도 일주일이 걸릴 수 있다. 대조적으로, 배가 시간이 1시간인 단일 박테리아는 단 하루에 수백만 개의 자손을 생산하여 본격적인 감염을 일으킬 수 있다. 따라서, 새로운 병원체에 노출된 첫 번째 중요한 시간과 날들 동안, 동물은 감염으로부터 보호하기 위해 선천성 면역 체계에 의존한다. 선천성 면역 반응은 적응 면역 반응과 같은 방식으로 특정 병원체에 특이적이지 않다. 이는 병원체의 보편적 특징을 인식하고 침입자를 파괴하는 데 도움이 되도록 빠르게 활성화되는 단백질, 식세포(예: 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포 및 비만 세포) 및 비식세포(예: NK 세포) 군에 의존한다. 따라서, 선천성 면역 체계의 빠른 활성화는 동물에게 매우 중요하다. 일부 동물은 타고난 면역 기억을 유도하거나 활성화하지 못하는 문제가 있다. 이것은 병원체의 보존된 특징을 인식하는 단백질 및 식세포 그룹의 기전적 장애 때문일 수 있다. 이 동물들은 비활성화 되거나 결함이 있는 선천성 면역 기억을 가지고 있다. 이 동물들은 병원체, 질병 또는 병태에 대한 면역 보호를 제공하기 위해 활성화되거나 유도된 선천적 면역 기억이 필요하다.

대상체가 활성화, 유도 또는 자극된 선천성 면역 기억을 필요로 하는지 여부는 당업자에게 공지된 방법 및 기술을 기반하여 확인될 수 있다. 특히, 상술된 바와 같이, 병원체의 보존된 특징을 인식하는 단백질, 식세포 또는 비식세포(NK 세포)의 군에서의 장애 또는 결함으로 인해, 선천성 면역 기억을 유도 또는 활성화시킬 수 없는 대상체가 활성화, 유도 또는 자극된 선천성 면역 기억을 필요로 하는 대상체이다. 따라서, 한 가지 가능성은 이들 단백질 및/또는 식세포 또는 NK 세포, 특히 식세포 또는 NK 세포 행동을 평가하여, 대상체가 선천적 면역 기억을 유도하거나 활성화할 수 없는지와, 그로 인해 활성화, 유도 또는 자극된 선천성 면역 기억이 필요한지 여부를 결정하는 것이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 또는 용도는 대상체가 활성화, 유도 또는 자극된 선천성 면역 기억을 필요로 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 결정하는 단계는 예를 들어 박테리아 생성물에 대한 자극 후, 예컨대, 단핵구, 호중구, 호염기구 및 비만 세포와 같은 식세포의 기능성(예컨대 식세포 활성), 또는 자연 살해 세포의 기능을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 확인하는 단계는 예컨대, 박테리아 생성물에 의한 자극 후의 사이토카인 생성(예컨대, TNF-알파, IL-1, IL-12, 인터페론 α, 인터페론 γ 및/또는 IL-6)을 확인하거나 측정하는 단계를 포함한다. 상기 확인은 바람직하게는 대상체로부터 단리된 세포, 예컨대, 대상체의 혈액으로부터 단리된 세포를 사용하여 시험관내에서 수행된다.

또한, 본 발명은 대상체, 특히 이를 필요로 하는 대상체에서 불활성화 또는 결함 있는 선천성 면역 기억을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 불활성화된 선천성 면역 기억을 치료하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 대상체, 특히, 이를 필요로 하는 대상체에서 불활성화 또는 결함있는 선천성 면역 기억을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다. 여기 쓰인 "불활성화된 선천성 면역 기억" 및 "결함있는 선천성 면역 기억"은 특히 병원체의 보존된 특징을 인식하는 단백질 및 식세포의 군에서의 기전적(mechanistic) 장애로 인해, 선천성 면역 기억을 유도하거나 활성화하는 능력이 불능이거나 감소된 것을 특징으로 하는 상태를 의미한다. 대상체가 불활성화 또는 결함있는 선천성 면역 기억으로 고통받는지 여부는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 대상체가 활성화, 유도 또는 자극된 선천성 면역 기억을 필요로 하는지 여부를 확인하기 위해 상술된 바와 같이 결정될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "CATH2" 및 "CMAP27"은 상호교환적으로 사용된다. 카텔리시딘 계열의 다른 구성원과 마찬가지로 CMAP27은 프리프로펩티드(154개 아미노산)로 암호화되며 단백질 분해 처리 후 강력한 광범위 항균 활성이 입증된 C-말단 펩티드가 방출된다. CMAP27 또는 CATH2라고 하는 이 C-말단 펩티드의 27개 아미노산 서열은 RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG이다. 본 명세서에서, 용어 "CATH2 유도체"는 일반적으로 CATH2 서열의 적어도 일부를 함유하고, 반드시 동일한 정도는 아니지만, CATH2의 적어도 하나의 항균 특성을 유지한다는 점에서 CATH2의 유도체인 펩티드를 의미한다. 특히, 그람 음성균에 대한 항균 활성이 유지된다.

바람직한 일 실시형태에서, CATH2 유도체는 C-말단 및/또는 N-말단 절단된 CATH2 유도체, D-아미노산 CATH2 유도체, C-말단 또는 N-말단 절단된 D- 아미노산 CATH2 유도체, 고리형 CATH2 유도체 및 인베르소(inverso) 및 레트로인베르소(retroinverso) CATH2-유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 유도체는 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 CATH2 유도체는 C-말단 및/또는 N-말단 절단된 CATH2 유도체, D-아미노산 CATH2 유도체 및 C-말단 또는 N-말단 절단된 D-아미노산 CATH2 유도체, 예컨대, C-말단 또는 N-말단 절단된 DCATH2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 바람직한 실시형태에서, CATH2 또는 DCATH2가 사용된다. DCATH2는 D-아미노산으로 구성된 전장 CATH2 펩티드이다.

"C-말단 절단된 CATH2 유도체"는 CATH2의 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 결여된 절단 펩티드를 의미하며, 바람직하게는 최대 17개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 12개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 최대 6개의 아미노산이 결여되어 있다. 바람직한 예는 본 명세서에 참고로 포함되는 WO 2010/093245에 기재되어 있으며, 특히, 상기 문서의 표1에 열거된 펩티드, CMAP26-NH₂, CMAP26, CMAP26(P14→G), CMAP26(P14→L), CMAP1-21, CMAP1-15, CMAP1-15(F2→L), CMAP1-15(F5→L), CMAP1-15(F12→L), CMAP1-15(3xF→L), CMAP1-15(F2→W), CMAP1-15(F5→W), CMAP1-15(F12→W), CMAP1-15(F2→W; F5→W; F12→W), CMAP1-13, CMAP1-12, CMAP1-11, CMAP1-10 및 이들의 아세틸화 및/또는 아미드화 유도체가 바람직하다. 본 명세서에 정의된 모든 아미노산 서열에서, 화살표 표기는 아미노산 치환을 나타낸다. 예를 들어, F2→L은 위치 2의 F가 L로 대체됨을 나타내고, F2, 5→W는 위치 2와 5의 F가 W로 대체됨을 나타낸다. 또한 바람직하게는 CMAP1-21(F2→W), CMAP1-21(F5→W), CMAP1-21(F12→W), CMAP1-21(F2, 5→W), CMAP1-21(F5, 12→W), CMAP1-21(F2, 12→W), CMAP1-21(F2, 5, 12→W), CMAP1-21(F2→Y), CMAP1-21(F5→Y), CMAP1-21(F12→Y), CMAP1-21(F2, 5→Y), CMAP1-21(F5, 12→Y), CMAP1-21(F2, 12→Y), CMAP1-21(F2, 5→Y), CMAP1-21(F2, 5, 12→Y), CMAP1-21(F2→W; F5→Y), CMAP1-21(F2→Y; F5→W), CMAP1-21(F5→W; F12→Y), CMAP1-21(F5→Y; F12→W), CMAP1-21(F2→W; F12→Y), CMAP1-21(F2→Y; F12→W), CMAP1-21(F2→W; F5→Y; F12→Y), CMAP1-21(F2→Y; F5→W; F12→Y), 및 CMAP1-21(F2→Y; F12→Y; F12→W)이다. C-말단 절단된 CATH2 유도체의 바람직한 예는 또한 WO2015/170984 에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. 상기 확인된 CMAP 단백질은 CATH2 펩티드로도 나타낼 수 있다. CMAP1-21은 CATH2(1-21)가 된다.

"N-말단 절단된 CATH2 유도체"는 CATH2의 N-말단 아미노산(아르기닌)에서 절단되어 CATH2의 N-말단에 하나 이상의 아미노산이 결여된 CATH2 유도체로서, 바람직하게는 최대 10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 7개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 최대 6개의 아미노산이 결여되어 있다. 바람직하게는 CMAP1-21의 하기 N-말단 절단 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유도체이다: CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21 (F5→W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21 (F12→Y), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→Y), CMAP4-21 (F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12→W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21(F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y).

"D-아미노산 CATH2 유도체"는 D 형인 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 본 명세서에 정의된 CATH2 유도체(상기 정의된 C- 및 N-말단 절단된 CMAP27 유도체 포함)이다. 이러한 D-아미노산 CATH2 유도체의 특별한 범주는 D 아미노산으로만 구성된 펩티드(즉, L 아미노산이 존재하지 않는 경우)이다. 이 특수 범주는 본 명세서에서 DCATH2로 정의된다. 또한, CATH2 자체는 하나 이상, 또는 다르게는 모든 D 아미노산을 포함하는 것이 이러한 정의에 포함된다. 바람직한 D-아미노산 CATH2 유도체는 DCATH2 및 하기의 D-아미노산 CATH2 유도체(여기서 모든 아미노산은 D-형태이다)이다:

D-C(1-26) RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH₂

D-C(1-21) RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQ-NH₂

D-C(4-21) RFLRKIRRFRPKVTITIQ-NH₂

D-C(7-21) RKIRRFRPKVTITIQ-NH₂

D-C(7-21)F/W RKIRRWRPKVTITIQ-NH₂

D-C(7-21)F/Y RKIRRYRPKVTITIQ-NH₂

D-C(10-21)F/W RRWRPKVTITIQ-NH₂

D-C(1-15) RFGRFLRKIRRFRPK-OH

특히 바람직한 DCATH2 유도체는 DC(1-21) 및 DC(4-21), 특히 DC(1-21)이다.

"고리형 CATH2-유도체"는 적어도 2개의 비인접 아미노산이 연결되어 고리 구조를 형성하는 CATH2 유도체이다. 원칙적으로 상술된 CATH2 유도체 중 임의의 것에서 2개의 인접하지 않은 아미노산을 시스테인으로 대체하여, 이들 시스테인이 S-S 브리지를 형성하는 것과 같은 임의의 화학적 결합 구조가 사용될 수 있지만, 바람직한 결합 시스템은 Bpg(Fmoc-L-비스호모프로파길글리신)와 아지도-수지 사이의 결합을 사용하며, 상기 Bpg는 내부 아르기닌, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판 잔기에 부착되고, 상기 아지도-수지는 C 말단 글루탐산 잔기에 부착된다. 특히, 이러한 고리형 유도체는 다음과 같다:

cycCMAP(1-21)[Lys8] RFGRFLR(Bpg)IRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)

cycCMAP(1-21)[Arg7] RFGRFL (Bpg) KIRRFRPKVTITIQ (아지도-수지)

cycCMAP(1-21)[Leu6] RFGRF(Bpg)RKIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)

cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe2/Trp RWGRF(Bpg)RKIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)

cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe2,5/Trp RWGRW(Bpg)RKIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)

cycCMAP (1-21) [Leu6], Phe2,5,12/Trp RWGRW(Bpg)RKIRRWRPKVTITIQ(아지도-수지)

cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe5,12/Trp RFGRW(Bpg)RKIRRWRPKVTITIQ(아지도-수지)

cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe12 /Trp RFGRF(Bpg)RKIRRWRPKVTITIQ(아지도-수지).

"인베르소(Inverso)" 및 "레트로인베르소(Retroinverso)" CATH2 유도체("I"-CATH2 및 "RI"-CATH2 유도체)는 아미노산이 역순으로 서로 연결되어 있다는 의미에서 상술된 CATH2 유도체에 대하여 역서열을 갖는 펩티드이다. 거꾸로 된 CATH2 유도체가 하나 이상의 D 아미노산을 함유하는 경우, 이를 "레트로인베르소" 또는 "RI"라고 한다. 거꾸로 된 유도체에 L-아미노산만 포함되어 있는 경우 "인베르소" 또는 "I"라고 한다. CATH2의 I 및 RI 등가물은 GFRASGQITITVKPRFRRIKRLFRGFR이 되며, 이러한 I 또는 RI-CMAP27 유도체의 다른 바람직한 예는 다음과 같다:

RI-C(1-21) QITITVKPRFRRIKRLFRGFR

RI-C(4-21) QITITVKPRFRRIKRLFR

RI-C(7-21) QITITVKPRFRRIKR

RI-C(7-21) F/W QITITVKPRWRRIKR

RI-C(7-21) F/Y QITITVKPRYRRIKR

RI-C(10-21) F/W QITITVKPRWRR.

상기 I 및 RI-CMAP27 유도체는 이들의 N-말단에서 아세틸화될 수 있고 및/또는 이들의 C-말단에서 아미드화될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 사용되는 CATH2 또는 이의 유도체는 CATH2, DCATH-2, DCATH2(1-21), DCATH2(4-21), CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21(F5→W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→Y), CMAP4-21(F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12→W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21(F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y)이고, 더욱 바람직하게는 상기 CATH2 또는 그것의 유도체는 CATH2, DCATH2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 사용되는 CATH2 또는 이의 유도체는 DCATH-2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)이다.

본 명세서에 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 동물을 아우르며, 소 및 버팔로를 포함하는 젖소 및 육우, 양, 염소, 알파카, 말, 노새(mules), 당나귀, 낙타, 라마(llamas), 돼지, 어류, 설치류(rodents), 가금류(polutry), 개, 고양이, 친칠라, 페렛(ferrets), 조류, 햄스터, 토끼, 마우스, 저빌(gerbils), 래트, 및 기니피그를 포함하는 가축 및 농장 동물을 포함하는 동물을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 대상체는 포유동물, 예컨대 농장 동물, 가축 또는 반려동물과 같은 포유동물이다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 대상체는 조류 대상체, 더욱 바람직하게는 가금류이다. 가금류라는 용어에는 닭, 오리, 거위, 꿩(pheasants) 및 칠면조가 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 닭 또는 칠면조, 더욱 바람직하게는 닭이다.

선천성 면역 기억을 유도 또는 개선 및/또는 항균 치료를 개선하는 것은 약화된 선천성 면역계를 갖거나 그렇지 않으면 강화된 선천성 면역 기억을 필요로 하는 대상체에서 특히 유리하다. 그러므로, 일 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 강화된 선천성 면역 기억을 필요로 하는 대상체 또는 약화된 선천성 면역 기억을 갖는 대상체이다. 이러한 대상체의 예로는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염과 같은 감염으로 고통 받는 대상체, 또는 스트레스를 받는 대상체가 있다. 다른 예는 면역 억제를 유발할 수 있는 조절되지 않은 활성화 또는 훈련된 면역의 부적절한 유도로 고통 받는 대상체이다. 본 발명의 방법은 적절한 선천성 면역 기억을 회복시키는 데 도움이 될 수 있다.

가금류, 소, 돼지, 염소 및 양 사육을 포함하는 농업분야에서와 같이 동물이 함께 사육되는 농장 또는 마구간에서 CATH2 또는 이의 유도체를 적용하는 것이 특히 유용하다. 이러한 환경에서 발생하는 감염병은 시설 전체로 빠르게 확산될 수 있다. 일 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 감염성 질환을 앓고 있거나 감염성 질환을 앓을 위험이 있다. 특히, 상기 감염성 질환은 그람 양성균 또는 그람 음성균에 의한 세균 감염, 또는 칸디다 알비칸스 감염과 같은 진균 감염이다. 감염성 질환 및 세균 감염은 하기에 보다 상세히 기재되어 있다. 살모넬라 엔테리티디스 감염은 어린 닭에서 상당한 사망률과 질병률을 유발할 수 있다. 특히, 부화 후 처음 2주 동안, 획득한 면역 체계가 아직 충분히 발달되지 않은 육계 병아리는 매우 취약하다. 육계용 닭의 건강 상태를 개선 할 수있는 가능한 전략은 퇴색하는 모체 유래 보호와 적응 면역의 성숙 사이의 격차를 해소하기 위해 타고난 면역 기억을 향상시키는 것이다. 일 실시형태에서, 감염성 질환으로 고통받을 위험이 있는 대상체는, 바람직하게는 가금류, 소, 돼지, 염소 또는 양이며, 상기 감염성 질환을 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 가금류, 소, 돼지, 염소 또는 양과 접촉한 대상체이다. 예를 들어, 대상체가 동일한 공간, 토지, 마구간, 집 또는 농장에 있는 경우 전염병을 앓고 있는 대상체와 접촉한다. 예를 들어, 감염성 질환, 특히 세균성 감염성 질환 또는 진균 감염성 질환이 농장 또는 마구간에서 발생된 경우, 본 발명에 따른 CATH2 또는 이의 유도체로 감염되지 않은 대상체를 치료하는 것이 유익하다. 일 실시형태에서, 감염된 대상체 및 감염으로 고통 받을 위험이 있는 대상체 모두는, 특히 감염된 대상체와 접촉하기 때문에, 본 발명에 따라 치료된다. 따라서, 일 실시형태에서, CATH2 또는 이의 유도체는 상기 집단의 하나 이상의 대상체에서 감염성 질환이 발생된 대상체 집단의 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 상기 대상체는 바람직하게는 가금류 또는 닭이고, 상기 대상체의 집단은 바람직하게는 가금류 또는 닭의 집단이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 대상체는 소이고, 상기 대상체의 집단은 소의 집단이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 대상체는 돼지이고, 상기 대상체의 집단은 돼지의 집단이다. CATH2 및 유도체가 선천성 면역 기억을 유도하거나 촉진한다는 것이 밝혀졌으므로, 이미 감염성 질환을 앓고 있는 대상체와 그로 인해 고통받을 위험이 있는 대상체 모두를 효율적으로 동시에 치료하는 것이 좋다.

일 실시형태에서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체는 백신에 포함된다. 따라서, CATH2 또는 이의 유도체를 포함하는 백신을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 유도 또는 촉진하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 포함하는 백신이 제공된다. 또한, CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 항균 치료를 개선하기 위한 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 포함하는 백신이 제공된다. 하기 상술된 바와 같이, 백신은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 하나 이상의 보조제(adjuvant)를 포함하는 추가의 구성 성분을 포함할 수 있다.

본 명세서에 상술된 바와 같이, 본 발명의 방법은 감염성 질환에 대한 선천성 면역 기억을 유도 또는 촉진하고, 특히 항균 치료를 개선하는데 특히 적합하다. 본 명세서에서 사용되는 "감염성 질환(infectious disease)"은 바람직하게는 세균 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염이며, 보다 바람직하게는 세균 감염 또는 진균 감염, 더욱 바람직하게는 세균 감염이다. 박테리아 감염은 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에 의한 감염일 수 있고, 예컨대, 대장균(E. coli), 살모넬라 티피무룸(Salmonella typhimurum), 클렙시엘라 뉴모니아이(Klebsiella pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 트루페렐라 파이오제네스(Trueperella pyogenes), 아비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 보르데텔라 종(Bordetella spp.), 브라키스피라 종(Brachyspira spp.), 브루셀라 종(Brucella spp.), 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 셉티쿰(Clostridium septicum), 트루페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes), 콕시엘라 버네티(Coxiella burnetii), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp.), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 만헤미아 헤몰리티카(Mannheimia haemolytica), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae), 오르니토박테리움 리노트라키알(Ornithobacterium rhinotracheale), 파스테우렐라 에루기노사(Pasteurella aeruginosa), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 뉴모코커스 종(Pneumococcus spp.), 수도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리메렐라 아나티페스티퍼(Riemerella anatipestifer), 살모넬라균 종(Salmonella spp.), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 파이오게네스(Staphyloccus pyogenes), 비브리아 콜레라(Vibria cholerae), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 모락셀라(Moraxella), 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonnorhoea), 에어로박터 종(Aerobacter spp.), 보렐리아 종(Borellia spp.)이다. 상기 진균 감염은 바람직하게는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 감염이다.

선천성 면역 기억을 유도 또는 촉진하기 위해 본 발명에 따라 투여된 CATH2 또는 유도체는 다른 생물학적 활성제 또는 부형제와 이롭게 조합될 수 있다. 일 실시형태에서, CATH2는 병원성 미생물 또는 이의 항원성 부분으로의 처치 전, 후 또는 동시에 투여된다. 일 실시형태에서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체는 선천성 면역 세포를 훈련시키는 역할을 담당하는 자극을 유발하는 병원성 미생물 또는 이의 항원 부분을 이용한 처치 전, 후 또는 동시에 투여된다. 본 명세서에서, 병원성 미생물의 "항원 부분(antigenic part)"은 미생물에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다는 점에서 미생물과 동일한 활성을 갖는다. 본 명세서에서, "처치 전, 후 또는 동시에"는 CATH2 또는 유도체의 투여가 상기 치료와 바람직하게는 최대 48시간 간격으로, 더욱 바람직하게는 최대 24시간 간격으로 투여되는 것을 의미한다. 감염성 질환의 치료 또는 예방에 사용되는 임의의 병원성 미생물 또는 이의 병원성 부분은, 예컨대 백신에서, 본 발명의 방법에서 CATH2 또는 이의 유도체와 유리하게 조합될 수 있다. 병원성 미생물은 예를 들어 약독화 또는 불활성화된 병원성 미생물이다. 이러한 조합은 선천성 면역 기억의 유도 또는 촉진을 병원성 미생물에 대한 직접적인 활성 및/또는 특이적 활성과 유리하게 결합시킨다. 특히, 상기 병원성 미생물은 감염성 질환을 일으키는 미생물이다. 예를 들어, 상기 병원성 미생물은 대장균(E. coli), 살모넬라 티피무룸(Salmonella typhimurum), 클렙시엘라 뉴모니아이(Klebsiella pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 트루페렐라 파이오제네스(Trueperella pyogenes), 아비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum), 바실러스 안트락시스(Bacillus anthracis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 보르데텔라 종(Bordetella spp.), 브라키스피라 종(Brachyspira spp.), 브루셀라 종(Brucella spp.), 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 셉티쿰(Clostridium septicum), 트루페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes), 콕시엘라 버네티(Coxiella burnetii), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp.), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 만헤미아 헤몰리티카(Mannheimia haemolytica), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae), 오르니토박테리움 리노트라키알(Ornithobacterium rhinotracheale), 파스테우렐라 에루기노사(Pasteurella aeruginosa), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 뉴모코커스 종(Pneumococcus spp.), 수도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리메렐라 아나티페스티퍼(Riemerella anatipestifer), 살모넬라균 종(Salmonella spp.), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 파이오게네스(Staphyloccus pyogenes), 비브리아 콜레라(Vibria cholerae), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 모락셀라(Moraxella), 네이세리아 고노로에아(Neisseria gonnorhoea), 에어로박터 종(Aerobacter spp.), 보렐리아 종(Borellia spp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라 종(Salmonella species), 특히, 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis), 및 대장균(E. coli)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법에 있어서, CATH2 또는 이의 유도체는 선천성 면역기억을 유도 또는 촉진할 수 있는 다른 제제 또는 선천성 면역에 특이적인 보조제와 추가로 조합된다. 이러한 제제/보조제의 예는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 리간드, β-글루칸, 뮤라밀디펩티드(muramyl dipeptide, MDP) 또는 MDP를 포함하는 펩티드, 바실칼메트구에린(Bacille Calmette-Guerin, BCG), 올리고디옥시뉴클레오티드를 포함하는 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 포함한다. TLR 리간드는 당업자에게 공지되어 있으며, 지질단백질의 트리아실 및 디아실 부분(TLR2, TLR1, TLR6), 플라겔린(TLR5), 이중-가닥 RNA(TLR3), 단일-가닥 RNA(TLR7) 및 박테리아 및 바이러스(CpG) DNA(TLR9)를 포함한다. MDP는 N-아세틸무라믹산과 L-알라닌 D-이소글루타민 디펩티드의 짧은 아미노산 사슬을 포함하는 합성 펩티드 접합체이다. β-글루칸은 효모, 박테리아 및 곰팡이의 세포벽에서 발견되는 자연 발생 다당류이다. 바실칼메트구에린(BCG)은 마이코박테리움 튜버툴로시스(Mycobacterium tuberculosis)(TB)에 대한 백신이다. CpG 올리고디옥시뉴클레오티드는 일반적으로 바이러스/미생물 DNA에 존재하며 상기 표시된 바와 같이 TLR9에 대한 리간드이다.

본 발명의 한 측면은 병원체 특이적 백신을 위한 보조제로서 본 명세서에 정의된 CATH2 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, CATH2 및 유도체를 선천성 면역 기억 유도 펩티드로 인식했기에 특정 병원체 특이적 백신에 대한 보조제로서의 이의 사용이 가능하다. 병원체는 바람직하게는 병원성 미생물, 즉 병원성 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 또는 기생충이다. 일 실시형태에서, 병원체-특이적 백신은 선택적으로 불활성화되거나 약독화된, 병원체 또는 병원체 유래 펩티드 또는 단백질, 특히 항원성 병원체 유래 펩티드 또는 단백질이다. 당업자에게 공지된 임의의 병원체-특이적 백신은 본 명세서에 정의된 바와 같은 CATH2 또는 이의 유도체와 바람직하게 조합될 수 있다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따라 치료되는 대상체는 바람직하게는 가금류, 예컨대 닭이다. 본 발명의 방법에 따른 CATH2 또는 유도체의 투여는 가금류 배아에 종란 투여 또는 부화 후 어린 가금류의 투여에 의해 달성될 수 있다. 후자의 경우, 투여는 바람직하게는 부화 후 1주일 이내, 보다 바람직하게는 부화 후 3일 이내이다. 본 명세서에서, "종란 투여"는 조류 종의 알, 바람직하게는 배양의 4/4분기의 알에 투여하는 것을 의미한다. 즉, 달걀의 경우, 투여는 바람직하게는 배양의 약 15일 내지 19일째에 실시되고, 더욱 바람직하게는 배양의 약 18일째에 수행된다. 칠면조 알의 경우, 투여는 바람직하게는 배양 약 21일 내지 26일에 실시하고, 더욱 바람직하게는 배양 약 25 일에 실시한다. 이러한 투여는 하나 이상의 CATH2 또는 유도체를 껍질을 통해 알 내로 도입하는 결과를 유도하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 투여 방법은 주사에 의한 것이다. 주사는 잘 알려진 알 주사 장치, 예를 들어 약 18 내지 22 게이지의 바늘이 장착된 종래의 피하 주사기, 또는 미국 특허 제4,681,063호, 제4,040,388호, 제4,469,047호 및 제4,593,646호에 기재된 바와 같은 고속 자동 계란 주입 시스템 중 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있다.

일 실시형태에서, 대상체에게 CATH2 유도체를 2회 투여한다. 상기 2회 투여는 바람직하게는 적어도 2일의 간격으로 수행된다. 일 실시형태에서, 투여 중 하나는 종란 투여이고, 투여 중 하나는 부화 후, 바람직하게는 부화 후 1주일 이내, 더욱 바람직하게는 부화 후 3일 이내 투여이다.

상기 CATH2 또는 유도체는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 적절한 방식으로 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, CATH2 또는 유도체는 예를 들어 저장 목적으로, 예를 들어 0℃ 미만의 온도에서 동결건조된다.

본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수의학적 허용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 허용가능한 담체는 용매, 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 분산 매질, 코팅제, 보조제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등을 포함할 수 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제에는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 유당 등이 포함될 수 있다. 안정제에는 알부민 등이 포함된다.

본 방법에서 사용하기에 적합한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 미네랄 겔, 예컨대, 알루미늄하이드록사이드; 계면활성 물질, 예컨대 리소레시틴; 글리코사이드, 예컨대, Quil A 또는 GPI-0100(U.S. Pat. No. 5,977,081) 같은 사포닌 유도체; 양이온성 계면활성제, 예컨대, DDA, 플루로닉폴리올; 다가 음이온(polyanions); 비이온성 블록 중합체, 예컨대, 플루로닉 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩티드; 미네랄 오일, 예컨대, 몬타나이드(Montanide)ISA-50(Seppic, Paris, France), 카보폴, 암피젠(Amphigen)(Hydronics, Omaha, Nebr. USA), 알하이드로겔(Alhydrogel)(Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark) 오일 에멀젼, 예컨대, BayolF/Arlacel A와 같은 미네랄 오일 에멀젼 및 물의 에멀젼, 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 에멀젼; 명반(alum), 콜레스테롤, rmLT, 사이토카인 및 이들의 조합. 면역원성 성분은 또한 리포솜 내로 혼입되거나, 백신 제형에 사용하기 위해 다당류 및/또는 다른 중합체에 접합될 수 있다. 본 방법에서 사용하기 위한 제품에 포함될 수 있는 추가 물질은, 하나 이상의 보존제로, 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediaminetetracetic acid, EDTA)의 디소듐(disodium) 또는 테트라소듐(tetrasodium) 염, 메르티올레이트(merthiolate) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항원에 대한 면역계의 반응을 증가시키는 면역자극제가 또한 제품에 포함될 수 있다. 적합한 면역자극제의 예는 사이토카인, 예컨대 IL-12 또는 IL-2; 또는 자극성 분자, 예컨대 뮤라밀디펩티드, 아미노퀴놀론(aminoquinolones), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 등을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 보조제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 선천성 면역 세포, 즉 호염기구, 수지상 세포, 호산구, 랑게르한스 세포, 비만 세포, 단핵구 및 대식세포, 호중구 및/또는 NK 세포에 대한 보조제: TLR 리간드, β-글루칸, 뮤라밀디펩티드(MDP) 또는 MDP를 포함하는 펩티드, 바실칼메트구에린(BCG) 및 올리고디옥시뉴클레오티드를 포함하는 CpG이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체를 포함하는 조성물은 인산염 완충 식염수(PBS) 용액 또는 콜레스테롤과 같은 완충 용액을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체를 포함하는 조성물은 인산염 완충 식염수(PBS) 용액 및 콜레스테롤과 같은 완충 용액을 포함한다. 예를 들어, 콜레스테롤은 먼저 에탄올에 가용화되고, PBS와 혼합된 다음, 바람직하게는 용해된 형태로 CATH2 또는 유도체와 혼합되어, 미립자 조성물을 생성한다. 일 실시형태에서, 투여 전에 용해된 CATH2 또는 유도체를 콜레스테롤 용액과 혼합하여 미세 입자를 형성하고 이어서 투여한다.

본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 유효량의 CATH2 또는 유도체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 유도 또는 촉진하기에 충분한 양으로 투여되는 CATH2 또는 유도체의 양을 의미한다.

일 실시형태에서, 상기 조성물은 치료적 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 치료되는 질환 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시키기에 충분하게 투여되는 CATH2 또는 유도체의 양을 의미하며, 특히 감염성 질환, 바람직하게는 세균 감염 또는 진균 감염, 더욱 바람직하게는 세균 감염을 완화시키기에 충분한 양을 의미한다. 이는 증상의 감소 또는 경감, 질환 또는 병태의 원인의 감소 또는 경감, 또는 임의의 다른 바람직한 효과를 나타낼 수 있다.

일 실시형태에서, 상기 조성물은 예방적 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "예방적 유효량"은 질환 또는 병태의 발병 및/또는 질환 또는 병태의 임상증상의 출현을 배제 또는 지연시키기에 충분하게 투여되는 CATH2 또는 유도체의 양을 의미하며, 이는 질병의 임상적 증상, 특히 감염성 질환, 바람직하게는 세균 감염 또는 진균 감염, 더욱 바람직하게는 세균 감염의 임상적 증상의 출현을 아직 경험하지 않은 대상체에서 적용된다.

약제학적 조성물은 또한 본 명세서에 정의된 CATH2 및 하나 이상의 유도체를 포함할 수 있거나, 또는 DCATH-2 및 D(1-21)의 조합과 같이 본 명세서에 정의된 바와 같은 2개 이상의 CATH2 유도체를 포함할 수 있다. 이 경우의 "유효량", "치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"은 둘 이상의 CATH2 및/또는 하나 이상의 이의 유도체의 조합량을 의미한다.

본 발명의 방법 또는 용도에 쓰이기 위해 필요한 CATH2 또는 유도체의 유효량 또는 투여량은, 예를 들어 동물 모델을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유효 용량은 투여되는 대상체에서 CATH2 또는 이의 유도체의 약 0.01μg/kg 내지 50mg/kg, 바람직하게는 0.5μg/kg 내지 약 10mg/kg일 것이다. 종란 적용의 경우, 동일한 용량을 사용할 수 있지만 배아의 무게에 대해서는 다시 계산될 수 있다.

약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용가능한"은 담체, 희석제 또는 부형제가 제제의 다른 성분과 상용성이어야 하고, 이의 수용자에게 유해하지 않은, 예를 들어 독성이 없어야 함을 의미한다. 일반적으로, 활성 화합물의 기능을 방해하지 않는 임의의 약제학적으로 적합한 첨가제가 사용될 수 있다. 부형제의 적합한 예는 담체 또는 희석제이다. 상기 약제학적 조성물은 캡슐, 정제, 약용 캔디(lozenges), 당과(dragee), 환제(pill), 적제(droplet), 좌제(suppository), 분말, 분무제, 백신, 연고, 페이스트, 크림, 흡입제(inhalant), 패치(patch), 에어로졸 등의 형태일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체로서, 특정 투여 형태에 가장 적합하고 CATH2 또는 유도체와 상용성이 있는 임의의 용매, 희석제 또는 다른 액체 담체, 분산제 또는 현탁 보조제, 계면활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 캡슐화제, 고체 결합제 또는 윤활제가 사용될 수 있다.

CATH2 또는 유도체의 염이 또한 사용될 수 있다. 펩티드의 염은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이는 일반적으로 펩티드를 약제학적으로 허용가능한 산과 혼합하여 산 부가염을 형성하거나, 또는 약제학적으로 허용가능한 염기와 혼합하여 염기 부가염을 형성하는 것을 포함한다. 산 또는 염기가 약제학적으로 허용되는지 여부는 펩티드의 구체적인 의도된 용도를 고려한 후에 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 사용 목적에 따라, 약제학적으로 허용가능한 산은 유기 및 무기산, 예컨대, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 글리콜산, 옥살산, 피루브산, 숙신산, 말레산, 말론산, 계피산, 황산, 염산, 브롬화수소산, 질산, 과염소산, 인산 및 티오시안산을 포함하고, 이들은 펩티드 및 기능적 등가물의 유리 아미노기를 갖는 암모늄염을 형성한다. 펩티드 및 기능적 등가물의 유리 카르복실기와 카르복실레이트 염을 형성하는 약제학적으로 허용가능한 염기는 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 디이소프로필아민 및 기타 모노-, 디- 및 트리알킬아민 뿐만 아니라 아릴아민을 포함한다.

경구 투여의 경우, 다양한 부형제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 구연산나트륨, 탄산칼슘, 인산이칼슘 및 글리신을 함유하는 정제를 전분(및 바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 알긴산 및 특정 복합 실리케이트와 같은 다양한 붕해제와 함께 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제와 함께 사용할 수 있다. 또한, 마그네슘스테아레이트, 소듐라우릴설페이트 및 탈크와 같은 윤활제는 종종 정제 목적에 매우 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 사용될 수 있고, 이와 관련하여 바람직한 물질은 또한 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여를 위해 적합한 경우, 활성 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료, 및 필요하다면, 유화제 및/또는 현탁제와 조합될 수 있으며, 또한 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 및 이와 유사한 다양한 조합과 같은 희석제와 함께 조합될 수 있다.

비경구 투여의 경우, 오일 또는 수성 프로필렌글리콜 안의 CATH2 또는 유도체 용액을 사용할 수 있다. 수용액은 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 등장성으로 만들어질 수 있다. 이러한 수용액은 정맥 주사 목적에 적합하다. 유성 용액은 관절 내, 근육 내 및 피하 주사 목적에 적합하다. 무균 조건 하에서 이들 모든 용액의 제조는 당업자에게 공지된 표준 약제학적 기술에 의해 용이하게 달성된다.

추가로, CATH2 또는 유도체를 국소적으로 투여하는 것도 가능하며, 이는 표준 약제학적 관행에 따라 크림, 젤리, 겔, 페이스트, 패치, 연고 등의 방법으로 수행될 수 있다.

일단 제형화되면, 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 유도 또는 촉진하기 위한 본 발명에 따른 방법 또는 용도에서 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 항균 치료를 개선하는 방법 또는 용도에 직접 사용될 수 있다. 조성물의 직접 전달은 일반적으로 경구, 비경구(parenterally), 피하(subcutaneously), 설하(sublingually), 복강내(intraperitoneally), 정맥내(intravenously) 또는 근육내(intramuscularly), 폐(pulmonary)를 포함하는 투여 형태로 이루어질 것이다. 이러한 투여는 단일 또는 다회 투여로 수행될 수 있다.

또한, CATH2 또는 유도체를 경점막(transmucosal) 투여 형태로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 투여 경로는 비침습적이므로, 치료되고 있는 대상체에 대해 덜 번거롭고, 동시에 경구 투여에 비해 개선된 생체이용률을 유도할 수 있으며, 특히 화합물이 소화계의 체액에서 안정하지 않거나, 장으로부터 효과적으로 흡수되기에 너무 큰 경우 유리할 수 있다. 경점막 투여는 예를 들어 비강(nasal), 협측(buccal), 설하, 치은(gingival) 또는 질(vaginal) 투여 형태를 통해 가능하다. 이들 투여 형태는 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 비강 점안액 또는 스프레이, 삽입물, 필름, 패치, 젤, 연고 또는 정제로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 경점막 투여 형태에 사용되는 부형제는 점막 부착을 위해 제공하는 하나 이상의 물질을 포함하여, 흡수 부위와 투여 제형의 접촉 시간을 연장시키고, 잠재적으로 흡수 정도를 증가시킨다.

일 실시형태에서, CATH2 또는 유도체는 정량 흡입기(metered dose inhaler), 분무기(nebulizer), 에어로졸 스프레이, 또는 건조 분말 흡입기(dry powder inhaler)를 사용하여 폐 경로를 통해 투여된다. 적절한 제형은 공지된 방법 및 기술에 의해 제조될 수 있다. 경피(transdermal), 직장(rectal) 또는 안구(ocular) 투여도 경우에 따라 가능할 수 있다.

본 발명에 따라 투여되는 약제학적 조성물은 다른 활성제, 예컨대 통상적인 항생제(예를 들어, 반코마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 페니실린 등) 또는 다른 항미생물 화합물, 예컨대 이트라코나졸 또는 미코나졸 같은 항진균제를 함유할 수 있다. 또한 발열(예: 살리실산) 또는 피부 발진과 같은 다른 감염 증상을 완화시키는 화합물이 첨가될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체는 합성으로 제조되거나, 적용가능한 경우, 통상적인 방법에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 적합한 방법은 참고문헌 10 및 11에 기재되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 CATH2 또는 유도체는 공지된 화학 합성 기술(예컨대, Merrifield(J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2154))로 통상적으로 제조될 수 있다. 이들은 크로마토그래피 방법, 예컨대 역상 HPLC에 의해 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다.

또는, 본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체는 상술한 펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산 서열을 운반하는 DNA 단편을 숙주 미생물 또는 세포 내에서 클로닝 및 발현함으로써 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 핵산 코딩 서열은 합성적으로 제조될 수 있거나, 또는 부위-지향 돌연변이 유발에 의해 존재하는 핵산 서열(예를 들어, 야생형 CATH2를 암호화하는 서열)로부터 유래될 수 있다. 이어서, 이들 핵산 서열을 적합한 발현 벡터 내에 클로닝하고, 적합한 숙주 세포, 예를 들어 대장균, 바실러스, 락토바실러스, 스트렙토마이세스, 포유동물 세포(예를 들어, CHO, HEK 또는 COS-1 세포), 효모(예를 들어 사카로마이세스, 스키조파일룸), 곤충 세포 또는 바이러스 발현 시스템, 예컨대 바큘로바이러스 시스템, 또는 식물 세포 내로 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있다. 당업자는 핵산 서열을 구성하고 이들의 발현을 가능하게 하는 수단을 제공하는 기술에 대한 지식을 가질 것이다. 이어서, CATH2 또는 유도체는 숙주 세포의 배양물로부터 분리될 수 있다. 이는 당업계에 이용가능한 일반적인 단백질 정제 및 분리 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 면역흡착(immunoadsorption) 또는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 또한, 합성 동안 펩티드에 태그(예: 히스티딘 태그)를 제공할 수 있으며, 이는 신속한 결합 및 정제를 가능하게 하고, 그 후 태그를 효소적으로 제거하여 활성 펩티드를 얻을 수 있다.

또는, CATH2 또는 유도체는 Invitrogen의 Expressway™ cell-free system과 같은 무세포 시스템에서 생산될 수 있다.

펩티드, 즉 CATH2 또는 이의 유도체를 포함하는 펩티드의 제조에 적용될 수 있는 방법에 대한 좀 더 포괄적인 요약은 하기 문헌에 기술되어 있다: W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.

본 명세서에서는 명료성 및 간결한 설명을 목적으로 실시형태와 동일하거나 개별적인 측면들 또는 실시예들의 일부로서 특징을 설명할 수 있다. 당업자는 본 발명의 범위가 실시예와 동일하거나 다른 일부로서 여기 기술된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 구현예를 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명은 하기, 비제한적 실시예를 통하여 보다 상세히 설명될 것이다.

도1: CATH-2 유사체는 dTHP-1 세포에서 훈련된 선천성 면역 반응을 유도한다.
a 시험관내 THP-1 분화 및 훈련의 개략도. b 100nM PMA로 분화된 dTHP-1 세포의 카텔리시딘 훈련 및 3일 휴지 후 10ng/ml S. minnesota LPS로 재자극(평균 ±SEM, 3개의 독립 실험). c 자극이 없는 경우, TNFα 및 IL-6 기저 수준은 3일 휴지 후 24시간 카텔리시딘 훈련에 의해 증폭되지 않음(평균±SEM, 3개의 독립 실험). LPS 자극 대조군 세포: 567±166pg/ml TNFα, 152±18pg/ml IL-6. d 1μg/ml Pam3CSK4 재자극에 대한 반응으로 TNFα 생산 증폭에 대한 DCATH-2 훈련의 시간 의존성. 대표 실험(평균±SD, n=6). e DCATH-2 훈련은 10ng/ml 대장균 B4:O111 LPS(TLR4), 1μg/ml Pam3CSK4(TLR1/2) 및 1μg/ml Pam2CSK4(TLR2/6)에 반응하여 100nM PMA dTHP-1 세포에 의한 TNFα 및 IL-6 생산의 증폭을 유도하였다. DCATH-2 훈련된 dTHP-1 세포는 TLR2 및 TLR4 작용제에 반응하여 CCL5 또는 CXCL10 생산의 증폭을 유발하지 않았다. 대장균 LPS 자극 대조군 세포: 592±102pg/ml TNFα, 132±45pg/ml IL-6, 6.3±2.0ng/ml CCL5, 16.8±3.3ng/ml CXCL10, 평균±SEM, 4개의 독립 실험. Pam3CSK 자극 대조군 세포: 646±154pg/ml TNFα, 428±181pg/ml IL-6, 6.0±3.5ng/ml CCL5, 3.8±0.6ng/ml CXCL10, 평균±SEM, 5개의 독립 실험. Pam2CSK 자극 대조군 세포: 450±124pg/ml TNFα, 424±197pg/ml IL-6, 평균±SEM, 3개의 독립 실험. * p<0.05, ** p<0.01, b-d Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석, e student t-검정.
도 2: dTHP-1 세포에서 카텔리시딘에 의해 유도된 훈련된 선천성 면역 반응.
dTHP-8 세포의 카텔리시딘 훈련은 8nM PMA로 분화되고, 3일 휴지 후 10ng/ml S. enterica LPS로 재자극되었다. 3개의 독립 실험; 평균±SEM 세 가지 독립 실험. LPS 자극 대조군 세포: 282±63pg/ml TNFα, 166±30pg/ml IL-6. * p<0.05, ** p<0.01, Dunnett의 검정을 사용한 일원 분산 분석.
도 3: DCATH-2 훈련은 dTHP-1 항균 활성을 향상시켰다.
a 살모넬라 엔테리티디스 706의 세포내 사멸. b 칸디다 알비칸스 ATCC10231에 대한 칸디다살균 활성. 3개의 독립 실험, 평균±SEM. Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석. **p<0.01, *p<0.05.
도 4: DCATH-2 훈련은 mTOR를 통한 dTHP-1 세포 대사를 호기성 해당과정으로 전환한다.
a 1μg/ml Pam3CSK4로 자극된 dTHP-1 세포에 의한 DCATH-2 훈련(5μM)이 증폭한 TNFα 생산은 mTOR 경로 억제제의 존재 하에서 억제된다. Pam3CSK 유도 TNFα 생산: 배지, 304±84pg/ml; 워트만닌, 354±135pg/ml; 라파마이신, 318±45pg/ml; 메트포르민 387±99pg/ml; AICAR, 335±89 pg/ml; 아스코르베이트, 421±112pg/ml(평균±SEM, 3개의 독립 실험). * p<0.05, Dunnett의 검정을 사용한 일원 분산 분석. b-h mTOR 억제제 라파마이신(10nM)의 존재 또는 부재 하에 5μM DCATH-2 또는 배지로 24시간 동안 프라이밍된 100nM PMA 분화 dTHP-1 세포를 사용한 대표적인 대사체 실험(n=3) 후 3회 세척 및 3일 휴지. b 24시간 프라이밍 후 TNFα 및 IL-6 생산, 3일 휴지 후 50ng/ml 대장균 B4:O111 LPS로 재자극. c-h DCATH-2 또는 배지 프라이밍 및 3일 휴지 후 얻은 dTHP-1 세포 용해물 및 배양 배지의 대사 스크리닝. c 락테이트 생산은 dTHP-1 조건화 배양 배지에서 측정되었다. d 세포 내 포도당과 락테이트 농도. e-g 자극되지 않은 세포에 대한 해당과정(e), 피리미딘 대사(f) 및 오탄당 인산염 경로(g)에서 log2 배수 변화를 보여주는 히트맵. h L-카르니틴 및 아실-카르니틴 수치. 평균±SD. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석.
도 5: DCATH-2 훈련은 dTHP-1 세포 대사를 호기성 해당과정으로 전환한다.
100nM PMA dTHP-1 세포를 이용한 대표적인 대사체 실험(n=3). 세포 용해물 및 배양 배지를 DCATH-2 또는 배지 프라이밍(24h) 후 3일간 휴지시켰다. a-e 자극되지 않은 세포 대비 TCA 회로(a), 요소 회로(b), 퓨린 합성(c), 피리미딘 대사(d) 및 아미노산 대사(e)의 대사 산물의 log2 배 변화를 보여주는 히트맵. f 아실카르니틴 수치. 평균±SD. ** p<0.01, **** p<0.0001, Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석.
도6: DCATH-2 훈련 유도 대사 변화는 LPS 자극 동안 유지된다.
대표적인 대사체 실험(n=3)에서, 10nM 라파마이신의 존재 또는 부재 하에 5μM DCATH-2 또는 배지로 24시간 동안 프라이밍된 100nM PMA 분화 dTHP-1 세포를 3회 세척, 3일 휴지 및 대장균 B4:O111 LPS로 24시간 자극했다. a 락테이트 생산은 dTHP-1 조건화 배양 배지에서 측정되었다. b 세포 내 포도당과 락테이트 농도. c-e 자극되지 않은 세포 대비 해당과정(c), 피리미딘 생합성(d) 및 오탄당 인산염 경로(e)의 대사산물에서 log2 배수 변화를 보여주는 히트맵. f L-카르니틴 및 아실-카르니틴 수치. 평균±SD. * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001, Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석.
도7: DCATH-2 훈련은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제의 영향을 받지 않는다.
dTHP-1 세포는 3일 휴지 및 1μg/ml Pam3CSK4 재자극 전에 광범위 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HTM) 억제제 5'-메틸티오아데노신(MTA) 및 MML1 특이적 HTM 억제제인 MM-102의 부재 또는 존재 하에 5μM DCATH-2로 프라이밍되었다. 억제제가 없는 경우 Pam3CSK 유도 TNFα 생산: a, 328±45pg/ml(4개의 독립 실험, 평균±SEM); b, 290±37pg/ml(5개의 독립 실험, 평균±SEM). Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석. NS : 유의적이지 않음.
도8: DCATH-2 훈련에 의한 dTHP-1 세포의 후성유전학적 조절.
dTHP-1 세포는 히스톤 아세틸화 전이효소 억제제의 부재 및 존재 하에 5μM DCATH-2로 프라이밍되었고 3일 휴지 후 1μg/ml Pam3CSK4로 재자극되었다. a 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), b 아나카르딕산(AA), c 커큐민 및 d 가르시놀(4개의 독립 실험, 평균±SEM). 억제제가 없는 경우 Pam3CSK 유도 TNFα 생산: a, 290±41pg/ml; b, 287±38pg/ml; cd 251±4pg/ml 및 e 261±24pg/ml. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석.
도9: dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련은 MAPK p38 의존성이다.
dTHP-1 세포는 5μM DCATH-2를 추가하기 전에 p38(SB203580), ERK(PD98059), JNK(SP600125) 또는 NFκB(Bay-11-7085) 억제제와 함께 1시간 사전배양했다. 3일 휴지 및 1μg/ml Pam3CSK4로 24시간 재자극후 TNF 알파 생산의 배수 증가. 3-4개의 대표 실험, 평균±SEM. Pam3CSK4 자극 대조군 세포: 304±84pg/ml TNFα(p38), 332±68pg/ml TNFα(ERK), 247±20pg/ml TNFα(JNK), 261±24pg/ml(NF-kB). 3개의 독립 실험, 평균±SEM. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도10: 퓨린성 수용체 관련 DCATH-2 흡수는 dTHP-1 세포의 훈련에 필수적이다.
dTHP-1 세포는 퓨린성 신호 전달 및 엔도사이토시스(endocytosis) 억제제의 부재 및 존재 하에 5μM DCATH-2로 프라이밍되고 1μg/ml Pam3CSK4로 재자극되었다. a 광범위 P2R 억제제 수라민(4개의 독립 실험, 평균±SEM) 및 P2X7R-특이적 억제제 KN-62는 각각 Pam3CSK4-유도된 TNFα 생산의 증폭을 폐지 및 감소시켰다(3개의 독립 실험, 평균±SEM). b DCATH-2 훈련 증폭된 TNFα 생산은 지질 래프트(raft)/카베올라(caveola)-매개 엔도사이토시스 억제제 니스타틴의 존재 하에서 감소되었지만 클라트린-매개 엔도사이토시스 억제제 클로르프로마진에 의해서는 감소되지 않았다(3개의 독립 실험, 평균±SEM). Pam3CSK4 자극 대조군 세포: 294±79pg/ml TNFα(수라민), 306±93pg/ml TNFα(KN-62), 260±42pg/ml TNFα(엔도사이토시스). c 공초점 영상을 통해 수라민, KN-62 및 니스타틴이 있는 상태에서는 dTHP-1 세포에 의한 탐라(Tamra) 표지 D-CATH-2 펩티드의 흡수(uptake) 감소를 확인했지만, 클로르프로마진에 의해서는 흡수가 영향을 받지 않았다. d 퓨린성 수용체 및 엔도사이토시스 억제제의 부재 및 존재 하에서 세포당 총 강도 및 세포당 반점(puncta) 강도로 표현되는 내재화된 탐라-DCATH-2 펩티드의 바이올린 곡선, 3개의 독립 실험, 중앙값은 점선으로 표시됨. Dunnett의 다중 비교 검정(a, d)을 사용한 일원 분산 분석과 Dunn의 다중 비교 검정(d)을 사용한 Kruskal-Wallis. **P ≤ 0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001.
도11: DCATH-2 훈련된 dTHP-1 세포의 RNA 시퀀싱.
100nM PMA 분화된 dTHP-1 세포를 5μM DCATH-2 또는 배지로 24시간 동안 프라이밍한 후 3회 세척, 3일 휴지 및 대장균 B4:O111 LPS 또는 배지로 6시간 자극하였다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석, *p<0.05, **** p<0.0001. a LPS 자극 후 TNFα 및 IL-6의 생산. b 대조군에 비해 FDR<0.01 및 최소 2배 증가한 차등 발현 유전자(DEG)의 히트맵. c 모든 DEG의 기초 성분 분석. d-e 대조군 세포에 대비 재자극이 없을 때(Dns 대 Mns, d) 및 LPS 재자극 후(Dlps 대 Mlps, e) DCATH-2 훈련된 dTHP-1 세포에서 DEG의 화산 곡선.

재료 및 방법

시약

살모넬라 엔테리카 subsp. enterica serovar minnesota R595 LPS(InvivoGen, tlrl-smlps), 대장균혈청형 O111:B4 LPS(InVivoGen, tlrl-eblps), Pam3CSK4(InvivoGen, tlrl-pms), Pam2CSK4(InvivoGen, tlrl-pm2s-1), 포르볼 12-미리스테이트13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)(Sigma P8139), mTOR 억제제 라파마이신(Sigma, R 0395), AMPK 활성제 5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보뉴클레오티드(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)(AICAR, Sigma A9978) 및 메트포민(metformin)(InvivoGen, tlrl-metf), Akt 억제제 워트만닌(wortmannin)(InvivoGen, tlrl-wtm), HIF-1a 억제제 아스코르베이트(Sigma, A 4034), MAPK p38 억제제 SB203580(Invivogen, tlrl-sb20), ERK 억제제 PD98059(Sigma, P 215), JNK 억제제 SP600125(Sigma, S 5567), 히스톤아세틸트랜스퍼라제 억제제 에피갈로카테킨 갈레이트(histone acetyl transferase inhibitors epigallocatechin gallate)(EGCG, Sigma E 3768), 아나카딕산(anacardic acid)(Sigma, A 7236), 커큐민(Sigma, C 1386), 및 가르시놀(garcinol)(Enzo BML-GR343-0010), NFkB 억제제 Bay-11-7085(InvivoGen, tlrl-b82), 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제(MTA, Sigma, D 5011), HMTase 억제제 MM-102(SelleckChem, S7265), P2X/P2Y 수용체 억제제 수라민(suramin)(Sigma, S 2671), P2X7 수용체 억제제 KN-62(Sigma, I 2142), 지질 래프트/카베올라-매개 엔도사이토시스 억제제 니스타틴(nystatin)(Sigma, N 3503), 클라트린-매개 엔도사이토시스 억제제 클로르프로마진(chlorpromazine)(Sigma, C 8138).

펩티드

펩티드 CATH-2(Chicken cathelicidin-2; RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH2), 그의 전체 D-아미노산 유사체, DCATH-2(rfgrflrkirrfrpkvtitiqgsarf-NH2), LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES) 및 N-말단 탐라-표지된 DCATH-2(TD, TAMRA-rfgrrkirrfrpkvtitiqgsarf-NH2)는 CPC Scientific(San Jose, CA)에서 FMOC 화학법에 의해 합성되었다. 펩티드를 역상 HPLC로 ≥95%까지 정제하고, 질량 분광법으로 확인하였다. 펩티드를 LPS-비함유 물(WFI, Gibco)에 용해시키고, 세포 배양 배지에서 추가 희석하기 전에 형광 표지된 펩티드를 먼저 DMSO에 용해시켰다.

자극 실험

THP-1 세포는 37℃ 및 5% CO₂에서 Glutamax-I, 피루브산나트륨, 10% 우태혈청을 함유하는 Iscove Modified Dulbecco Media(IMDM, Gibco)에서 배양되었다. 대식세포-유사 세포로의 분화를 위해, THP-1 세포를 100nM PMA의 8을 함유하는 IMDM/FCS 배지에서 성장시키고, 96웰(5×10⁴세포/웰), 24웰(3×10⁵세포/웰) 또는 6웰 플레이트(1×10⁶세포/웰)에 48시간 동안 심었다. 그 후, dTHP-1을 예열된 IMDM/FCS로 세척하고, 밤새 휴지시키고, 신선한 IMDM/FCS 배지의 2-10μM 펩티드로 1-24시간 동안 프라이밍하고, 배지에서 3회 세척하였다. 3일 휴지 후 세포를 다양한 자극원으로 자극하였다: S. minnesota LPS(10ng/ml), 대장균 LPS(10 또는 50ng/ml), Pam3CSK4(1μg/ml) 또는 Pam2CSK4(1μg/ml). 24시간 후 상청액을 수집하여 -20℃에서 보관하였다. 억제를 위해, dTHP-1 세포를 프라이밍 전 및 프라이밍 중 1시간 동안 라파마이신(10nM), AICAR(50nM), 메트포민(0.3mM), 워트만닌(1μM), 아스코르베이트(50μM), SB203580(10μM), PD98059(10μM), SP600125(10μM), EGCG(40μM), 아나카르딕산(50μM), 커큐민(10μM), 가르시놀(10μM), Bay-11-7085(10μM), MTA(1mM), MM-102(25μM), 수라민(50μM), KN-62(3μM), 니스타틴(10μg/ml) 및 클로르프로마진(10μM)과 함께 전-배양하였다.

ELISA

TNFa, IL-6, CXCL10 및 CCL5 생성은 제조사의 설명서에 따라 ELISA (R&D 시스템즈)를 사용하여 측정하였다.

항균 활성

항균 활성은 Tang et al.에 따라 측정되었다[30]. dTHP-1 세포를 6웰 플레이트에 심고, DCATH-2 또는 기재된 배지로 프라이밍하였다. Salmonella enterica subsp. enterica serovar enteritidis 706(Se706)의 로그상 배양물을 MOI 1로 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 배양한 후 따뜻한 DPBS로 세포를 2회 세척하고 300μg/ml 콜리스틴을 함유한 IMDM/FCS 배지를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 세포를 DPBS로 3회 세척하고 1% 트리톤 X-100으로 용해시켰다. 웰 내용물을 트립톤 대두 브로스(Oxoid)에 연속적으로 희석하고, 트립톤 대두 한천에 도말하고, 37℃에서 24시간 후에 계수하였다.

칸디다살균(Candidacidal) 활성

dTHP-1 세포를 6웰 플레이트에 심고, DCATH-2 또는 기술된 배지로 프라이밍하였다. 칸디다 알비칸스 ATCC10231을 30℃의 효모 맥아 배양액(Oxoid)에서 성장시키고, DPBS에서 1×10⁴CFU/ml로 희석하고, 각 웰에 첨가하였다(MOI 0.03). 30℃에서 5시간 배양 후, 상청액을 옮겨 보관하였다. 나머지 세포는 0.5ml의 멸균수를 보충하고, 격렬하게 혼합하여 각 대응하는 웰 상청액과 혼합하였다. 효모 맥아 브로스에 마련된 일련의 희석액을 효모 맥아 한천에 도말하였다. 콜로니는 30℃에서 48시간 후에 계수하였다.

공초점 이미징

3 x 10⁵ dTHP-1세포를 24웰 플레이트의 8mm 커버슬립에 심고 0.5ml 배지에서 100nM PMA로 48시간 동안 분화시켰다. 웰을 3회 세척하고, 세포를 탐라-표지된 DCATH-2 (TD) 또는 배지로 3시간 동안 프라이밍하였다. 억제 조건의 경우, 프라이밍하기 전에 세포를 3μM KN-62, 50μM 수라민, 10μM 클로르프로마진 또는 10μg/ml 니스타틴과 함께 1시간 동안 전-배양하였다. 프라이밍 후, 커버슬립을 따뜻한 배지로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드 용액(0.1M 인산염 완충액, pH 7.4)에서 30분 동안 고정시켰다. 10분 동안 Hoechst(분자 프로브)로 핵을 염색한 후 ProLong 유리 항-탈색(antifade) 마운팅제(Thermofisher, P36980)를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 덮었다. 라이카 SPE-II에서 100x HCX PLAN APO(NA = 1.4-0.7) 대물렌즈를 사용하여 공초점 이미지를 얻었다. 이미징은 561nm 레이저에 대해 4중 대역 빔 스플리터를 사용하여 수행되었다. Hoechst 염색된 dTHP-1 세포의 시각화는 405nm(100mW) Coherent Violet Cube 레이저로 수행되었다. 이미지 분석은 두 채널의 합성 이미지를 사용하여 수행되었다. 간단히, 관심 영역은 분할을 위해 DIC를 사용하여 수동으로 설정했다. 배경 노이즈로부터 반점을 분리하기 위해 탐라 채널에 대한 임계값을 설정하고 스크립트를 사용하여 반점의 강도와 면적을 부분적으로 자동화하여 측정하였다.

대사체(metabolomics) 실험

dTHP-1 세포를 6웰 플레이트에 심고(1×10⁶세포/웰) 배지를 대조군으로 사용하여 기술된 바와 같이 5μM DCATH-2로 24시간 동안 프라이밍하였다. 세포 상청액, 세포 용해물 및 배지 대조군은 10nM 라파마이신의 부재 및 존재 하에서 24시간 프라이밍 전후에 수집되었으며, 세척 후 3일 휴지하고, 뒤이어 24시간 LPS(E. coli O111:B4) 자극하였다. 샘플 수집을 위해, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS에서 1회 세척하고, 1ml 차가운 메탄올/아세토니트릴/물(2:2:1) 용해 완충액을 첨가하여 용해시키고, 스크래핑하여 바이알에 옮겼다. 세포 상청액 및 배지 대조군 샘플(10μl)을 200μl 용해 완충액과 직접 혼합하였다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 진탕하고 18,000×g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액은 액체 질소에서 급속 냉동하고 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 액체 크로마토그래피-질량 분석은 Dionex Ultimate 3000 자동 샘플러 및 펌프(Thermo Scientific)에 결합된 Exactive 질량 분석기(Thermo Scientific)를 사용하여 수행되었다. 질량 분석은 4.5 및 -3.5 kV의 분무 전압으로 극성 스위칭 모드에서 작동하였다. 대사산물은 Sequant ZIC-pHILIC 컬럼(2.1×150mm, 5mm, 가드 컬럼 2.1×20 mm, 5mm; Merck)을 사용하여 아세토니트릴 및 용리액 A 20mM(NH4)2CO3, ULC/MS 등급 물(Biosolve BV, Valkenswaard, The Netherlands) 내의 0.1% NH4OH의 선형 구배 및 150μl/min의 유속으로 분리했다. 대사 산물을 식별하고 LCquan 소프트웨어(Thermo Scientific)를 사용하여 5ppm 이내의 정확한 질량을 기준으로 피크 강도를 정량화하고 상업적으로 이용 가능한 표준물질의 체류 시간과 일치시켜 추가로 검증하였다. 피크 강도는 LPS 자극 전후의 평행 웰의 세포 계수에서 정규화되었다.

RNA 시퀀싱

dTHP-1 세포(1x10⁶/웰)는 배양 배지를 대조군으로 사용하여 1ml 배지가 포함된 6웰 플레이트에서 DCATH-2로 24시간 동안 프라이밍하였다. 프라이밍 후, 세포를 3회 세척하고 배양 배지에 3일 동안 휴지시켰다. 세포를 50ng/ml 대장균 O111:B4 LPS 또는 신선한 배지로 6시간 동안 자극하였다. 상청액은 사이토카인 분석을 위해 저장하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 DPBS로 1회 세척하고 1% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 100μl RLT 완충액(Qiagen)에서 세포를 용해시켜 수확하였다. 스크래핑 후 조건에 따라 두 웰의 내용물을 바이알로 옮기고 액체 질소에서 급속 냉동하고 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 총 RNA는 2-메르캅토에탄올로 보충된 RLT 완충액(RNeasy kit, Qiagen)에서 추출하고, Qiagen QiaSymphony SP 시스템을 사용하여 정제하였다. RNA 라이브러리는 제조사의 설명서에 따라 Truseq 가닥 총 RNA(리보-제로) 라이브러리 준비 키트(Illumina)를 사용하여 준비하였다. RNA 시퀀싱은 NextSeq 500 시스템 1x 75bp 고출력 키트를 사용하여 수행되었다.

RNA 시퀀싱 분석

단일 말단 RNASeq 읽기는 기본 설정의 UMCU RNASeq 파이프라인(v2.3.0)을 사용하여 처리했다. 읽기 품질은 FastQC(0.11.4)로 평가한 후 STAR(2.4.2a)를 사용하여 인간 참조 게놈(GRCh37)에 대한 스플라이스 인식 정렬로 평가하였다. RNA 발현 정량화는 역가닥 모드에서 htseq-count(0.6.0)로 수행하였다. 차등 유전자 발현 분석은 DEBrowser(https://debrowser.umassmed.edu/)에서 DESeq2 패키지로 수행하였다. 각각의 비교에서, 유전자는 절대 배수-변화 > 1.5 및 알파 P < 0.05로 선택되었다. 경로 풍부화 분석은 다중 테스트에 대한 Benjamini-Hochberg FDR 보정 및 FDR<0.05 임계값을 사용하여 상향 및 하향 조절 유전자에 대해 별도의 FDR 순위 차등 발현 유전자 목록을 사용하여 g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/)에서 수행되었다. GO 생물학적 공정의 풍부화 경로는 EnrichmentMap(http://www.baderlab.org/Software/EnrichmentMap)과 0.01의 FDR 컷오프를 사용하여 Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)에서 시각화되었다. 유사성 통계 임계값은 Jaccard>0.25로 설정되었고 5 내지 500개의 유전자 사이의 유전자 세트 크기에 대해 필터링되었다[61].

통계 분석

그룹 간의 차이는 Dunnett 또는 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 일원 분산 분석으로 계산되었다. 추가로, Kruskal-Wallis 시험이 사용되었다. 유의 수준은 p<0.05(*), p<0.01(**), p<0.001(***) 또는 p<0.0001(****)로 정의되었다.

결과

CATH-2 유사체에 의한 dTHP-1 세포의 선천성 면역 훈련.

인간 단핵구[2, 3, 20]를 사용한 훈련된 면역 실험에서 외삽하여 성숙한 카텔리시딘 펩티드가 인간 단핵구 세포주인 THP-1 세포에서 훈련된 면역을 유도할 수 있는지 조사하였다. THP-1 세포를 48시간 동안 100 nM 또는 8 nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 분화시키고, 3회 세척하고, 하룻밤 휴지 후, 2-10 μM의 닭 카텔리시딘 2(CATH-2), 이의 전장 D-유사체 DCATH-2 또는 인간 카텔리시딘 LL-37로 24시간 동안 프라이밍하였다. 이어서, dTHP-1 세포를 3회 세척하고, TLR 작용제로 3일간의 휴지기 후에 재자극하였다(24시간)(도1a). 10μM CATH-2로 프라이밍하자, 100nM PMA dTHP-1 세포에서 10ng/ml 살모넬라 미네소타 LPS로 재자극시 IL-6 생산이 1.8배 증폭되었다(도1b). 5μM의 그것의 전장 D-아미노산 유사체 DCATH-2로 프라이밍하자 LPS 자극에 반응하여 TNFα 및 IL-6 생산이 2-3배 증폭되었다. 10μM LL-37로 프라이밍한 것은, 100nM 분화된 세포에서 IL-6 생산을 1.4배 증폭시킨 경미한 반응이 발견되었다. 더 낮은 농도의 PMA로 THP-1를 분화시켰을 때 전염증성 사이토카인 생산의 기저 수준을 낮추고[21] 훈련 효율성에 영향을 미칠 수 있다고 제안되었다. 그러나, 8nM PMA 분화된 THP-1 세포의 CATH-2 및 DCATH-2 훈련에 대해 유사한 반응이 관찰되었다(도2).

DCATH-2 훈련된 면역은 TLR2 및 TLR4 활성화를 모두 증폭한다.

TNFα 및 IL-6의 기저 생산 수준은 2.5-5μM DCATH-2를 사용한 24시간 프라이밍에 의해 변화되지 않았다(도1c). dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련은 시간 의존적이었고, β-글루칸을 사용한 1차 단핵구의 훈련과 유사하게 24시간 후에 최고 수준의 훈련에 도달하였다(도1d). 다음으로, 본 발명자들은 DCATH-2 훈련이 상이한 TLR2 및 TLR4 리간드에 대한 dTHP-1 반응에 영향을 미치는지 조사하였다. 5μM DCATH-2로 dTHP-1 훈련에 이어 대장균 O111:B4 LPS, Pam3CSK4 또는 Pam2CSK4로 재자극하자 증폭된 TNFα 및 IL-6 생산이 이루어졌다(도1e). CCL5 및 CXCL10의 생산은 DCATH-2 훈련에 의해 변화되지 않았다(도1e). 따라서, 거친(도1b, 도2) 및 평활 LPS(TLR4), 트리아실-(TLR1/2) 및 디아실 리포펩티드(TLR2/6)에 의한 자극은 모두 DCATH-2 훈련된 dTHP-1 세포에 의한 증폭된 전염증성 반응을 유도한다.

DCATH-2 훈련된 dTHP-1 세포는 항미생물 사멸 능력을 증가시켰다.

세포내 병원체는 숙주의 선천성 면역계를 성공적으로 회피하거나 이용하려고 시도한다[22-24]. dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련(24시간)이 살모넬라 엔테리티디스 감염 및 칸디다 알비칸스 감염에 대한 항미생물 활성을 향상시킨다는 것을 확인하였다(도3). 프라이밍되지 않은 dTHP-1 세포와 비교하여 DCATH-2 프라이밍된 dTHP-1 세포는 24시간 후 살모넬라 엔테리티디스의 성장을 78±11%, 48시간 후 칸디다 알비칸스의 성장을 68±10% 억제하였다.

DCATH-2 훈련은 Akt-mTOR-HIF1α 신호 전달 경로를 활용한다.

인간 단핵구의 훈련은 세포 대사를 Akt-mTOR-HIF1α 경로를 통해 매개되는 호기성 해당과정으로의 전환으로 유도하는 것으로 알려져 있다[6]. DCATH-2 훈련에서 Akt-mTOR-HIF1α 경로의 관여를 조사하기 위해, dTHP-1 세포를 DCATH-2 펩티드로 프라이밍하기 전에 mTOR 경로 특이적 억제제와 함께 사전 배양하였다. Akt(워트만닌), mTOR(라파마이신) 및 HIF1α(아스코르베이트)의 직접적인 억제는 dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련을 강력하게 억제하였으며(도4a), 이는 DCATH-2가 β-글루칸과 유사한 경로를 활용하여 세포 대사를 호기성 해당과정으로 전환한다는 것을 나타낸다. DCATH-2 훈련 동안 메트포민 및 AICAR에 의한 AMPK 활성화에 의한 간접 mTOR 억제는 Pam3CSK 유도 TNFα 생산의 유의한 감소를 유도하지 않았다.

mTOR/Akt 신호전달은 SREBP1을 통한 해당과정, 지방산 합성 및 오탄당 인산염 경로(PPP)에서 mTORC1 상향 조절 속도 제한 효소와 피리미딘 합성의 속도 제한 효소인 증가된 CAD 활성을 통한 뉴클레오티드 합성을 통해 대식세포의 대사 및 활성화를 제어한다[25]. DCATH-2 훈련이 dTHP-1 세포에 미치는 영향을 조사하기 위해, 3일 휴지 후 DCATH-2 훈련된 dTHP-1 세포와 훈련되지 않은 세포의 배양 배지 및 세포 용해물을 사용하여 대사체 분석을 수행하였다. DCATH-2는 대장균 LPS 자극에 대한 TNFα 및 IL-6 생산을 증폭시켰고, 그것이 프라이밍 동안 라파마이신의 존재에 의해 강하게 감소되었다(도4b). 증가된 호기성 해당작용에 대해 예상된 바와 같이, DCATH-2 훈련은 배지로의 락테이트 분비를 증가시켰다(도4c). 이러한 결과에 따라, DCATH-2 훈련 세포에서 세포 내 락테이트 수치가 더 높고 세포 내 포도당 농도가 더 낮았다(도4d). 대사 중간체의 분석은 DCATH-2 훈련이 해당작용을 증가시켰고(도4e), 오탄당 인산 경로(도4f)를 약간 증가시켰으며, 새로운(de novo) 피리미딘 합성을 증가시켰고(도4g), 이는 향상된 mTOR 활성화의 관여를 나타낸다. DCATH-2 프라이밍 동안 라파마이신의 존재는 락테이트 생산, 해당과정, 오탄당 인산염 경로 및 새로운 피리미딘 합성의 증가를 억제했으며(도4b-g), DCATH-2 훈련된 면역이 호기성 해당과정으로의 mTOR 조절 전환을 동반함을 확증한다. TCA 회로 및 요소 회로는 DCATH-2 훈련에 의해 유의한 영향을 받지 않았다(도5a-c). DCATH-2 훈련은 증가된 단백질 합성을 암시하는 아미노산의 전반적인 사용 증가를 일으켰다(도5d). DCATH-2 훈련은 세포 내 중쇄 및 장쇄 아실카르니틴 수준을 상당히 증가시키고(도5f), 이는 미토콘드리아로의 지방산 수송 감소를 나타낸다.

24시간 LPS 자극 후, DCATH2 훈련된 세포는 여전히 증가된 포도당 흡수 및 락테이트 생성과, 해당과정 및 더 낮은 정도지만 PPP 경로 대사산물 증가를 나타냈다(도6a-e). 중쇄 및 장쇄 아실카르니틴의 세포내 수준은 DCATH-2 훈련된 세포에서 상승된 상태로 유지되었다(도6f). 라파마이신은 LPS 자극 동안 세포 대사에 대한 DCATH-2 훈련 유도 효과를 감소시켰다(도6). DCATH-2 훈련된 세포의 LPS 자극은 TCA 회로, 요소 회로 또는 아미노산 대사에 영향을 미치지 않았다(도5a-e). 따라서, DCATH-2 훈련 유도된 대사 이동은 LPS 자극 동안 유지된다.

dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련은 후성유전학적으로 조절된다

DCATH-2 유도 훈련은 기저 TNFα 및 IL-6 생산을 변화시키지 않고 TLR2/4 리간드 유도된 TNF α및 IL-6 생산을 증가시켰으며, 이는 DCATH-2 프라이밍이 dTHP-1 세포의 후성유전학적 재프로그래밍을 유도했음을 암시한다. TNFα 및 IL-6을 포함한 면역 관련 유전자의 프로모터에서 풍부한 H3K4me3 수준은 BCG[3], β-글루칸[2] 또는 산화된 LDL[20]로 훈련된 인간 단핵구에서 발견되었으며, 이는 2차 자극시 증가된 전사와 명확하게 관련이 있다. 사이토카인 암호화 유전자의 증가된 H3K27ac 수준은 BCG 백신 접종 후 분리된 단핵구와 β-글루칸 훈련 단핵구에서 확인되었다[6, 26]. DCATH-2 훈련에서 히스톤 아세틸화의 역할을 확인하기 위해, dTHP-1 세포를 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 억제제인 커큐민(10μM), 가르시놀(10μM), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG, 40μM) 및 아나카르딕산(50μM)의 존재 하에 프라이밍하였다. dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련은 히스톤 아세틸 전이효소(HAT) 억제제 EGCG 및 아나카르딕산에 의해 무효화 되었지만 가르시놀 또는 커큐민에 의해서는 그렇지 않은 것으로 확인되었다(도8a-d). 메틸트랜스퍼라제 억제제 MTA(5'-메틸티오아데노신) 또는 MLL1 억제제 MM-102는 DCATH-2 프라이밍 세포에서 Pam3CSK4 유도 TNFα 생산의 증폭을 억제하지 못하였다(도7).

DCATH-2에 의해 훈련된 면역은 MAPK p38 신호 전달이 필요하다.

p38과 ERK는 모두 TNFα[27, 28] 및 IL-6[29]과 같은 전염증성 사이토카인의 조절을 위한 중요한 신호 전달 경로이며, MAPK p38 매개 신호 전달은 β-글루칸으로 훈련된 면역에 관여한다[1, 2]. DCATH-2 훈련에서 MAPK의 관여를 확인하기 위해, dTHP-1 세포를 p38(SB203580), ERK(PD58059) 및 JNK(SP600125)의 특이적 억제제와 함께 제공하였다. MAPK p38의 억제는 DCATH-2 훈련된 증가된 Pam3CSK 유도 TNFα 생산을 완전히 차단한 반면, ERK 및 JNK 억제는 효과가 없었다(도9). 10 μM NF-κB 억제제 Bay-11-7085를 사용하여 사전-배양 했을 때 dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련을 손상시키지 않았다(도9).

dTHP-1 세포의 D-CATH-2 훈련은 퓨린성 수용체에 의해 매개된다

카텔리시딘의 면역 조절 기능은 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 포르밀 펩티드 수용체(FPR) 및 퓨린성 수용체 P2X7R과 같은 다양한 G-단백질 결합 수용체와 관련이 있다[30]. P2X7R 활성화는 주로 높은 수준의 ATP에 의해 유발되지만 카텔리시딘 LL-37을 포함한 다른 내인성 리간드는 P2X7R과 상호 작용하고 활성화할 수 있다[31]. 카텔리시딘 훈련에서 P2X7R의 관여를 확인하기 위해, dTHP-1 세포를 P2 계열 억제제 수라민 또는 P2X7 억제제 KN-62와 사전-공동-배양하였다. 수라민은 DCATH-2 훈련-유도된 TNFα의 증가된 생산을 완전히 손상시킨 반면, 이것은 P2X7R 억제제 KN-62에 의해 부분적으로 억제되었다(도10a). 단핵구에 의한 LL-37의 내재화는 P2X7 의존성인 것으로 알려져 있으며 클라트린 및 카베올라/지질 래프트 매개 엔도사이토시스를 통해 일어난다[30]. 따라서, 훈련에서 P2X7 수용체의 기능은 단핵구/대식세포에 의한 DCATH-2 펩티드의 흡수를 촉진하는 것일 수 있다. 이 가설을 테스트하기 위해, dTHP-1 세포를 엔도사이토시스 억제제 니스타틴(카베올라/지질 래프트 매개) 및 클로르프로마진(클라트린 매개)으로 전처리하였다. Pam3CSK4 유도 TNFa 생산은 니스타틴 처리된 세포에서 크게 손상되었지만 클로르프로마진의 영향은 받지 않았으며(도10b), 이는 dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련이 지질 래프트 매개 엔도사이토시스를 통한 흡수를 필요로 함을 암시한다. 수라민, KN-62 또는 니스타틴이 있는 상태에서 dTHP-1 세포에 의한 탐라 표지 DCATH-2 흡수의 공초점 이미징 분석에서 P2/P2X7R 억제제의 존재 시 전체 신호 강도의 감소와 P2/P2X7R 억제제에 대해 반점의 상대적 강도가 줄고, 카베올라/지질 래프트-매개 엔도사이토시스도 감소함을 나타내었다(도10c,d). 탐라-DCATH-2 흡수는 클라트린-매개 엔도사이토시스의 억제에 의해 감소되지 않았다. 이러한 발견은 DCATH-2 훈련이 dTHP-1에 의한 카베올라/지질 래프트 매개 흡수와 상관관계가 있음을 증명하였다.

DCATH-2 훈련 변형된 전사는 재자극 동안 지속된다.

dTHP-1 세포의 DCATH-2 훈련에 의해 변형된 생물학적 과정이 지속적인지 확인하기 위해, DCATH-2 프라이밍 세포의 전사체(transcriptome)(RNAseq)를 3일 휴지 및 6시간 LPS 자극 후 대조군 세포의 전사체(RNAseq)와 비교하였다. LPS 자극은 TNFα 및 IL-6 생산의 2.5배 및 3.3배 증폭을 일으켰다(도11a). RNAseq 데이터의 계층적 클러스터링은 3일 휴지 후 DCATH-2 프라이밍에 의해 변화된 유전자의 하위 집합이 유지됨을 나타내었다(도11b). 주요 성분 분석은 차등적으로 발현된 유전자(DEGs) 간의 대부분의 변이가 LPS 자극(52.6%)과 DCATH-2 훈련(10.3%)에 의해 설명될 수 있음을 나타낸다(도11c). 자극되지 않은 대조군 세포와 비교하여 훈련되고 휴지된 dTHP-1 세포에서 156개의 상향 조절 및 126개의 하향 조절된 DEGs가 확인되었다. LPS 자극 후, LPS 자극 대조군 세포에 비해 DCATH-2 훈련된 LPS 자극 세포에서 71개의 상향 조절 및 54개의 하향 조절된 DEGs가 확인되었다. 화산(volcano) 플곡선을 사용한 유전자 비교를 통해 훈련된 세포에서 LPS 자극에 의해 독특하게 상향 조절/유도된 유전자의 하위 집합을 밝혀냈으며(도11d, e, 표1), 세포 외 및 원형질막에서 발생하는 사건과 관련이 있으며 사이토카인 자극, 사이토카인 매개 신호 전달 및 사이토카인/케모카인 수용체 결합에 대한 향상된 세포 반응과 관련이 있음을 밝혔다.

DCATH-2 훈련 후에 유전자는 LPS 자극 동안 독특하게 상향 조절된다.

유전자	설명	조정된 p-값	Log 2 배수 변화
IL6	Interleukin-6	7.47E-23	2.17
MFSD2A	Major Facilitator Superfamily Domain Containing 2A	4.83E-17	1.04
CXCL3	C-X-C Motif Chemokine Ligand 3	6.93E-12	1.18
IL1A	Interleukin-1A	4.58E-11	1.15
TNFSF15	TNF Superfamily Member 15	2.24E-10	1.19
TRPM8	Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 8	5.84E-07	1.36
FOXF1	Forkhead Box F1	1.31E-06	1.21
LIF	LIF Interleukin 6 Family Cytokine	2.03E-06	2.73
MYLK	Myosin Light Chain Kinase	1.35E-05	1.17
CSF2	Colony Stimulating Factor 2	1.88E-05	1.81
CD22	CD22 Molecule	7.46E-05	1.18
TIE1	Tyrosine Kinase With Immunoglobulin Like And EGF Like Domains 1	1.61E-04	1.46
AHNAK2	AHNAK Nucleoprotein 2	1.77E-04	1.12
CCRL2	C-C Motif Chemokine Receptor Like 2	1.01E-03	1.04
ZNF358	Zinc Finger Protein 358	4.52E-03	1.04
HSPBAP1	HSPB1 Associated Protein 1	5.56E-03	1.06
SEPT3	Septin 3	6.92E-03	1.06
KLF2	Kruppel Like Factor 2	6.96E-03	2.54
CCL18	C-C Motif Chemokine Ligand 18	7.05E-03	2.81
FAM213B	Peroxiredoxin Like 2B	7.63E-03	1.02
TRIM47	Tripartite Motif Containing 47	8.53E-03	2.45
PTGS2	Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2	9.60E-03	1.29

DCATH-2 훈련에 의해 영향을 받는 생물학적 과정의 경로 분석

3일 휴지 후 DCATH-2 프라이밍에 의해 변경된 생물학적 과정을 매핑하기 위해 G:profiler[32]로 경로 풍부화 분석을 수행하고 Cytoscape[33] 및 Enrichment Map[34]을 사용하여 시각화하였다. 차등적으로 발현된 유전자의 G:profiler 분석은 DCATH-2 훈련된 비자극 dTHP-1 세포에서 590개의 상향 조절 및 612개의 하향 조절된 GO 생물학적 과정(FDR<0.05)을 밝혀냈다. 풍부화된 경로(Enriched pathways)(FDR<0.01)는 Cytoscape에서 EnrichmentMaps를 사용하여 별도로 시각화하고 자동 주석을 사용하여 주제 내에서 클러스터링하였다. 주요 상향 조절 주제는 자극, 전사 및 번역에 대한 세포 반응이었다. 경미한 상향 조절된 주제는 신호 전달, 자가포식 및 대사였다(표2). 상향 조절된 경로는 향상된 전사 및 번역과 관련된 산화 스트레스, 소포체(ER) 스트레스 및 풀린 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)과 관련이 있었다. 선행구간(leading edge) 유전자 발현의 히트맵은 넌센스-매개 mRNA 붕괴(nonsense-mediated mRNA decay)의 상향 조절, PERK 매개 풀린 단백질 반응(UPR), 스트레스에 대한 RNA 중합효소 II의 양성 조절 및 리보솜 생물 발생(biogenesis)을 확인시켜 주었다. 가장 두드러진 하향 조절 과정은 항원 처리 및 제시 주변으로 클러스터링되었다(표2).

LPS 자극 훈련된 dTHP-1 세포의 생물학적 과정에 대한 경로 분석

다음으로, DCATH-2 훈련이 염증 조건에서 생물학적 과정에 어떻게 영향을 미치는지 조사하였다. DEGs의 G:프로파일러 분석(FDR<0.05)을 통해 훈련되지 않은 대조군 세포에 비해 DCATH-2 훈련된 LPS 자극 세포에서 322개의 상향 조절 및 416개의 하향 조절된 GO 생물학적 경로를 확인하였다. 풍부화된 경로(FDR<0.01)는 자극에 대한 반응, 신호 전달 및 면역 반응, 분화 및 대사와 관련된 생물학적 과정이 상향 조절됨을 나타내었다(표3). 하향조절된 경로는 항원 제시 및 대사와 관련이 있었다(표3).

DCATH-2 프라이밍된 비자극 dTHP-1 세포의 경로 풍부화 분석.

클러스터	생물학적 주제	유전자 온톨로지	GO 생물학적 과정	유전자 세트 크기	FDR Q-값
상향조절
공동 번역 표적 ER	번역	GO:0000184	핵 전사 된 mRNA 이화 과정, 넌센스 매개 붕괴	119	1.40E-26
중합효소 II 프로모터	전사	GO:0036003	스트레스에 대한 반응으로 RNA 중합효소 II 프로모터로부터의 전사의 양성 조절	22	2.00E-04
NCRNA 처리 생물 발생	번역	GO:0042254	리보솜 생물 발생	279	1.62E-09
위상학적으로 부정확한 단백질	자극에 대한 반응	GO:0034976	소포체 스트레스에 대한 반응	253	3.04E-07
ER 핵 신호 전달	자극에 대한 반응	GO:0036499	PERK 매개 풀림 단백질 반응	20	5.55E-06
양성 조절 creb	신호전달	GO:0032793	CREB 전사 인자 활성의 양성 조절	12	2.27E-04
고리형 뉴클레오티드 과정	신호전달	GO:0046058	cAMP 대사과정	14	4.80E-03
자가포식 메커니즘 활용	자가포식	GO:0006914	자가포식	452	1.90E-03
선택적 세포기관 분해	자가포식	GO:0000422	미토콘드리아 자가포식	70	4.94E-03
스핑고리피드 생합성 세라마이드	대사	GO:0090154	스핑고지질 생합성 과정의 양성 조절	10	3.94E-03
오탄당 인산염 우회(shunt)	대사	GO:0006098	오탄당 인산염 우회(shunt)	14	6.44E-03
하향조절
외인성 펩티드 항원	항원제시	GO:0019882	항원 처리 및 제시	207	1.03E-08
조직화 액틴 필라멘트	세포골격 조직화	GO:0032956	액틴 세포 골격 조직화의 조절	262	6.57E-06
지질 이화 당지질	대사	GO:0046466	막 지질 이화과정	28	3.74E-03

DCATH-2 프라이밍 LPS 자극 dTHP-1 세포의 경로 풍부화 분석.

클러스터	생물학적 주제	유전자 온톨로지	GO 생물학적 과정	유전자 세트 크기	FDR Q-값
상향조절
단백질 표적화 ER	번역	GO:0000184	핵 전사 된 mRNA 이화 과정,넌센스 매개 붕괴	119	4.04E-05
단백질 표적화 ER	번역	GO:0006413	번역개시	184	4.04E-05
인터루킨 1 매개	신호전달	GO:0070498	인터루킨-1 매개 신호 전달 경로	95	8.56E-04
티로신 인산화 stat	신호전달	GO:0042531	STAT 단백질의 Tyr 인산화(+) 조절	44	4.28E-03
분자 박테리아 지질다당류	면역반응	GO:0071222	지질다당류에 대하 세포 반응	165	8.14E-05
케모카인 사이토카인 생합성	면역반응	GO:0045073	케모카인 생합성 과정의 조절	13	1.29E-03
프로스타노이드 과정 프로스타글란딘	면역반응	GO:0001516	프로스타글란딘 생합성 과정	19	8.84E-03
대식세포 거품 분화	분화	GO:0030730	트리글리세리드의 격리	11	9.52E-04
오탄당 인산염 우회	대사	GO:0006098	오탄당-인산염 우회	14	3.10E-03
스핑고지질 생합성 세라마이드	대사	GO:0090154	스핑고지질 생합성 과정의 양성 조절	10	7.44E-03
하향조절
외인성 펩티드 항원	항원 제시	GO:0002495	MHC 클래스 II를 통한 펩티드 또는 다당류 항원의 항원 처리 및 제시	89	1.41E-04

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derivative <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> is Fmoc-L-bishomopropargylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> azido resin attached <400> 15 Arg Trp Gly Arg Trp Xaa Arg Lys Ile Arg Arg Trp Arg Pro Lys Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Ile Gln 20 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe5,12/Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> cyclic derivative <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> is Fmoc-L-bishomopropargylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> azido resin attached <400> 16 Arg Phe Gly Arg Trp Xaa Arg Lys Ile Arg Arg Trp Arg Pro Lys Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Ile Gln 20 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe12/Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> cyclic derivative <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> is Fmoc-L-bishomopropargylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> azido resin attached <400> 17 Arg Phe Gly Arg Phe Xaa Arg 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Claims

대상체에서 불활성화된 또는 결함있는 선천성 면역 기억을 치료하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
대상체에서 불활성화된 또는 결함있는 선천성 면역 기억을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하여, 상기 대상체에서 불활성화된 또는 결함있는 선천성 면역 기억을 치료하는 단계를 포함하는 것인 방법.
이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하여, 상기 대상체에서 선천성 면역 기억을 활성화, 유도 또는 촉진하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선천성 면역 기억은 감염성 질환에 대한 선천성 면역 기억인 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항미생물제, 특히, CATH2 또는 이의 유도체의 항미생물 활성을 개선 또는 증가시키기 위한 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
항미생물제의 항미생물 활성을 개선 또는 증가시키는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
항미생물제의 항미생물 활성을 개선 또는 증가시키는 방법.
제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 치료인 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체는 병원성 미생물 또는 이의 항원성 부분을 사용한 처치 전, 후 또는 동시에 투여되는 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 상기 대상체는 감염성 질환을 앓고 있거나 감염성 질환의 위험에 놓인 상태이며, 바람직하게는 상기 감염성 질환을 앓고 있는 대상체와 접촉한 대상체인 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체를 대상체 집단의 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 집단의 하나 이상의 대상체에서 감염성 질환이 발생한 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체는 톨-유사수용체(Toll-like receptor, TLR) 리간드, β-글루칸, 뮤라밀디펩티드(muramyl dipeptide, MDP), 바실칼메트구에린(Bacille Calmette-Guerin, BCG), CpG 올리고디옥시뉴클레오티드와 같은 선천성 면역에 특이적인 보조제(adjuvant)와 조합되는 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 가축, 농장 동물 또는 반려동물이고, 바람직하게는 가금류인 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 가금류이고, 상기 투여는 종란내(in ovo) 및/또는 부화후 수행되는 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 CATH2 유도체가 2회, 바람직하게는 적어도 2일 간격으로 투여되는 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
제17항에 있어서, 상기 대상체는 가금류이고, 투여 중 하나는 종란내 투여, 투여 중 하나는 부화 후 투여인 것인 방법, 또는 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
병원체-특이적 백신에 대한 보조제(adjuvant)로서 CATH2 또는 이의 유도체의 용도로서, 바람직하게는 상기 병원체-특이적 백신은 (약독화된(attenuated)) 병원체 또는 병원체 유래 펩티드 또는 단백질인 것인 용도.
병원체에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 병원체에 특이적인 병원체-특이적 백신과 보조제로서 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 병원체 특이적 백신은 (약독화된) 병원체 또는 병원체 유래 펩티드 또는 단백질인 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 유도체는 DCATH2, C-말단 및/또는 N-말단 절단된 CATH2 및 C-말단 또는 N-말단 절단된 DCATH2으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 DCATH-2, DCATH2(1-21), DCATH2(4-21), CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21(F5→W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→Y), CMAP4-21(F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12→W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21(F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 상기 CATH2 또는 유도체는 DCATH2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)인 것인 방법, 사용을 위한 CATH2 또는 이의 유도체, 또는 용도.