CN105753959A - 一种酵母表达的鸡Cathelicidin2抗菌肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种酵母表达的鸡Cathelicidin2抗菌肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用毕赤酵母表达的重组鸡Cathelicidin2抗菌肽，并进一步公开其制备方法与应用。本发明所述制备重组鸡Cathelicidin2抗菌肽的方法，选择pPICZαA分泌型表达载体作为外源基因的真核表达体系，使重组鸡Cathelicidin2抗菌肽获得高效表达，并避免表达产物对宿主细胞造成直接的杀伤性。同时本方法表达效率高，表达产物分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适用于大规模工业化生产。经试验证实Cathelicidin2抗菌肽与抗生素联合使用，对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的协同抑菌作用，具有广阔的应用推广前景。

Description

一种酵母表达的鸡Cathelicidin2抗菌肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用毕赤酵母表达的重组鸡Cathelicidin2抗菌肽，并进一步公开其制备方法与应用。
背景技术
自抗生素发现以来，其在预防细菌感染、防治畜禽疾病等方面已经发挥了很重要的作用，对促进畜牧业和家禽业的健康、快速发展起到了巨大的推动作用。但长期大量使用抗生素类药物也带来了一系列的负面隐患。抗生素的大量使用使得病原菌逐步产生耐药性，给人类健康和疾病的预防与治疗带来威胁。而引发的药物残留也使得动物性食品的安全性问题日益突出。国际社会已经明确提出减少抗生素使用量或取消某些抗生素的使用的规定。因此，研制减少抗生素用量的替代药物已成为动物营养、食品加工、新兽药研发等领域面临的重大课题。抗菌肽(antimicrobialpeptide)是在诱导条件下，动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌活性等优势，对革兰氏阴性菌(G-)、革兰氏阳性菌(G+)、真菌、原生生物、有被膜的病毒和肿瘤细胞均表现出较强的活性，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程；对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌也表现了较好的杀灭作用。而且绝大多数抗菌肽不同于传统抗生素的独特抗菌机制，对哺乳动物的正常细胞无毒害作用，对机体也无任何毒副作用、无残留，这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题提供新途径，可见，抗菌肽广泛的生物学活性显示了其在医学上良好广阔的应用前景。迄今为止，已从包括动物、植物、昆虫、原核生物等多种生物体内分离、鉴定了千余种抗菌活性肽，有几十种抗菌肽已进入临床试验或临床前研究阶段。
目前在家禽体内发现的抗菌肽包括如下三类：即防御素类(Gallinacin)、Cathelicidin类和肝内表达抗菌肽2(LEAP-2)。Cathelicidin类抗菌肽是最初被发现于哺乳动物的一类结构多变的抗菌肽，因其在信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidin在体外具有很强的广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性，有的在50％血清和生理盐浓度下仍有杀菌活性。除了主要的杀灭细菌、真菌和病毒活性外，Cathelicidin还具有对免疫细胞的趋化作用、抑制组织损伤、促进创伤修复、结合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能。同防御素一样，Cathelicidin抗菌肽也是宿主防御系统的重要组成部分，但它们通常更耐盐和溶媒。由于具有如此广泛的生物学活性和功能，Cathelicidin抗菌肽已成为免疫学、分子生物学和生物医药领域内的研究热点，其药用开发前景十分广阔。现已证实利用原核表达系统表达的Cathelicidin2具有广泛的抑菌活性。然而，由于家禽体内天然抗菌肽的含量极低并且分子量小，导致其分离纯化十分困难，远远无法满足市场需要。因此，化学合成与基因工程方法就成为获得抗菌肽的主要手段，但目前化学合成抗菌肽的工艺较为复杂、成本也较高，难于应用于临床之用；因此，通过基因工程的方法在特定宿主内大量表达抗菌肽就成为一条有效的途径。
现有的抗菌肽表达体系主要包括大肠埃希菌、酵母菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞等4种。最初抗菌肽基因表达研究是在原核表达系统中进行的，但运用该系统表达抗菌肽则比较困难，主要表现在3个方面：(1)大肠埃希菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质翻译后加工修饰能力，其产物往往形成没有活性的包涵体，须经过变性、复性等处理才能应用；(2)抗菌肽对宿主细胞的毒性，宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制大肠埃希菌的增殖，影响抗菌肽的进一步表达；(3)容易被降解，抗菌肽本身带有大量的正电荷，对蛋白酶非常敏感，在大肠埃希菌中容易降解，难以实现大量表达。因此抗菌肽基因只能以融合蛋白的形式在大肠埃希菌中表达。
目前在采用酵母表达系统表达抗菌肽的研究方面取得了较大的成功，酵母表达系统具有表达产物可以糖基化、分泌性表达、表达量高、利于产物分离纯化、适应工业化生产等优点。研究发现，在以酵母为宿主菌的抗菌肽基因工程中，多数研究都实现了目的蛋白的表达，产物对工程菌没有明显的抑制作用，表明抗菌肽对酵母的毒性较小，适于在该系统中表达。为了使表达量增高，采用了各种不同的表达策略，直接表达、融合表达、改造后表达、串联表达和复合表达等，都有一定的预期结果，说明应用酵母表达抗菌肽具有很好的开发前景。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组鸡Cathelicidin2抗菌肽，并进一步提供一种基因工程方法制备所述重组鸡Cathelicidin2抗菌肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的重组鸡Cathelicidin2抗菌肽，其成熟肽包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码所述的重组鸡Cathelicidin2抗菌肽的基因，其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含有所述重组鸡Cathelicidin2抗菌肽基因的表达载体。
所述表达载体为重组质粒pPICZαA-CathL2。
本发明还提供了一种含有所述的表达载体的重组菌，所述的重组菌为生产鸡Cathelicidin2抗菌肽的毕氏酵母工程菌。
所述重组菌为分泌型重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL2。
本发明还提供了一种构建所述重组菌的方法，即将所述的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，以使所述表达载体在所述宿主中有效表达。
所述的构建所述重组菌的方法，包括如下步骤：
(1)以成年乌骨鸡骨髓RNA为模板，扩增其Cathelicidin2成熟肽的编码序列，克隆至pMD18-T载体中，筛选阳性克隆并测序验证；
(2)将Cathelicidin2成熟肽的编码序列与分泌型酵母表达载体pPICZαA相连接，筛选阳性克隆，并大量制备阳性质粒pPICZαA-CathL2；
(3)将pPICZαA-CathL2重组质粒经酶切线性化后利用电穿孔导入PichiapastorisX-33宿主细胞基因组中，获得分泌型重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL2；并将转化子经甲醇利用表型的MM/MD平板筛选，得到能够正常利用甲醇的重组酵母菌株。
本发明还提供了一种所述重组鸡Cathelicidin2s2抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)按上述方法构建所述重组菌；
(2)用蜗牛酶提取法制备所述重组菌的DNA模板，采用PCR方法筛选阳性转化子；
(3)将筛选到的阳性酵母菌株进行甲醇诱导表达，并对诱导表达条件进行优化；
(4)取不同时间段内的表达上清液，利用DOC-TCA蛋白浓缩方法处理上清，获得重组蛋白，即得。
本发明还提供了所述重组鸡Cathelicidin2抗菌肽用于制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染引起疾病的药物中的应用。
本发明所述制备重组鸡Cathelicidin2抗菌肽的方法，选择pPICZαA分泌型表达载体作为外源基因的真核表达体系，使重组鸡Cathelicidin2抗菌肽获得高效表达，并避免表达产物对宿主细胞造成直接的杀伤性。同时本方法表达效率高，表达产物分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适用于大规模工业化生产，具有广阔的应用推广前景。
本发明应用基因工程技术在真核宿主细胞中高效表达鸡Cathelicidin2抗菌肽，经试验证实该抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的抑制作用，且与抗生素之间存在显著的协同抑菌效应。该抗菌肽可应用于制备抗菌药物，或用于制备动物饲料添加剂和防腐剂。同时与其它来源的碱性抗菌肽相比，该组抗菌肽还具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广等有益特点。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为PCR扩增乌骨鸡Cathelicidin2抗菌肽基因产物的凝胶电泳图；其中，1为Cathelicidin2成熟肽编码序列的PCR扩增产物，M为DL2000DNAMarker；
图2为重组表达质粒pPICZαA-CathL2与空载体的SacI单酶切产物电泳鉴定图；其中，M：DL15000DNAMarker；1：pPICZαA质粒；2、3：pPICZαA质粒(SacI)；4：pPICZαA-CathL2质粒；5、6：pPICZαA-CathL2质粒(SacI)；
图3为含重组质粒pPICZαA-CathL2的重组酵母的PCR鉴定图；其中，M：DL15000DNAmarker；1，2：X-33/pPICZαAPCR产物；3：X-33/pPICZαA-CathL2PCR产物；
图4为重组抗菌肽Cathelicidin2诱导24、48、72、96、120h产物的Tricine-Tris-SDS-PAGE的电泳图；其中，M：低分子量蛋白Marker；1：X-33/pPICZαA空载体转化子诱导72h上清液；2-5：X-33/pPICZαA-CathL2转化子分别诱导24h、48h、72h、96h的上清液。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法如Sambrook等编著的《分子克隆实验室指南》(Molecularcloning：Alaboratorymanual，2nded.NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999)中所述的条件进行，或按照制造厂商提供的说明书进行。各试剂中，
RNAisoPlus总RNA提取试剂、ReverseTranscriptaseM-MLV(RnaseH-)、核糖核酸酶抑制剂-RNAsin、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、pMD18-TVector、T4DNA连接酶，DL2000、DL15000DNAMaker除特别指明外均为TAKARA公司产品；
低分子量蛋白Maker购自Thermoscientific公司；
常规药敏试纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；
Tricine-Tris-SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒购自Solarbio公司；
AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒均购自AXYGEN公司；
Zeocin(博来霉素)购自Invitrogen公司，其它试剂均为国产分析纯。
实施例1
乌骨鸡Cathelicidin2抗菌肽成熟肽编码序列的克隆及分泌型酵母表达载体的构建与鉴定，具体包括如下步骤：
1、引物的设计
根据GenBank中发表的乌骨鸡的Cathelicidin2的基因序列(GenBank序列号：FJ938358)和PCR引物的设计原则，并借助计算机软件DNASTAR进行辅助分析，设计了一对PCR基因特异性引物用于扩增鸡Cathelicidin2基因的成熟肽编码序列，引物分别为表中pCathL2F/R，其中pCathL2F为正向引物，pCathL2R为反向引物。同时根据已知的基因序列结构，合成了真核表达载体pPICZαA的一对通用引物5’AOX1/3’AOX1，引物均由Invitrogen公司合成。
本实施例和实施例2中所用的引物序列如表1所示。在pCathL2F/R引物对中，下划线处的碱基分别代表在上下游引物中引入的EcoRI和XbaI限制性内切酶位点。
表1用于扩增抗菌肽Cathelicidin2sDNA的引物和真核表达载体的通用引物
注：下划线处碱基分别为在上下游引物中引入的EcoRI、XbaI限制性内切酶位点。
2、鸡Cathelicidin2抗菌肽成熟肽编码序列的克隆
无菌采集乌骨鸡腿骨新鲜骨髓，将其加入1mLTrizol细胞裂解液中匀浆，于室温下作用10min；加入200μL氯仿，混匀后于室温下静置5min；于4℃，12000g离心15min；取上清液于无菌的1.5mL离心管中，加入0.5倍体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃下静置20min；然后4℃，12000g离心15min；弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，风干后加入10-20μLDEPC处理的超纯水溶解，即得到乌骨鸡骨髓细胞总RNA。
以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR(PCR反应条件为：95℃预变性5min，而后94℃变性15秒，50℃退火15秒，72℃延伸15秒，30个循环后，72℃再延伸5分钟结束反应。)对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1所示，可见，PCR产物大小约为100bp。
从凝胶中回收并纯化PCR产物，连入真核表达载体pPICZαA中，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，均匀涂布于LLB(含25μg/mlZeocin)平板上，37℃培养18h，筛选阳性克隆进行双酶切鉴定。同时将阳性质粒送至上海生物工程公司测序，最终获得含有目的片段的重组表达载体pPICZαA-CathL2。测序结果表明，鸡Cathelicidin2抗菌肽成熟肽编码序列长度为96bp。重组质粒经双酶切及测序鉴定，均证实其构建成功。
实施例2
重组鸡Cathelicidin2抗菌肽融合蛋白的基因工程制备方法，包括以下步骤：
1、毕赤酵母基因工程菌的构建及转化子的筛选
利用内切酶SacI将重组表达质粒pPICZαA-CathL2、pPICZαA质粒分别进行单酶切处理，结果如图2所示，即可获得线性化质粒，将线性化质粒pPICZαA-CathL2和pPICZαA依次与制备好的酵母X-33感受态细胞在石英杯中混合，然后置于电转仪槽中，分别调节参数1.5kV、25μF、200Ω、0℃下进行电击，将上述质粒依次整合到PichiapastorisX-33基因组中。
取80μL转化液均匀涂布于YPDS(含100μg/mLZeocin)平板，28℃，培养3-5天直至长出白色菌落。将长出的菌落依次转移至含有不同浓度Zeocin(200μg/mL～500μg/mL)的YPDS平板上，进行高拷贝转化子的筛选。
用蜗牛酶提取法制备酵母基因组DNA，采用PCR方法鉴定转化子，阳性转化子再进行Mut+表型筛选，得到能够正常利用甲醇的重组酵母菌株X-33/pPICZαA-CathL2。
具体操作如下：
取过夜培养的1mL菌液，10000g，离心5min，弃上清；取1mLPBS洗涤沉淀一次，10000g，离心5min，弃上清；取600μL裂解液，100μL30mg/mL蜗牛酶，100μL10％SDS，37℃消化1h；在消化液中加入450μL饱和苯酚，150μL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈震荡，以使其呈乳状，并保持10分钟，3000g，离心10分钟；取上清液，移至新的1.5mLEP管中，加入450μL氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次，10000g离心5分钟；取上清液，移至新的1.5mLEP管中，加入800μL异丙醇，-20℃保持30分钟；1000g离心10分钟，弃上清；加入1mL70％乙醇，10000g离心2分钟，弃上清；再加入1mL70％乙醇，10000g离心2分钟，弃上清；开盖吹风晾干；取30μLTE溶解沉淀，加入0.5μL10mg/mLRNase，37℃温育30分钟，冷却至室温后，-20℃保存。
用提取的酵母基因组DNA为模板，利用表1中设计的通用引物5’AOX1/3’AOX1进行酵母转化子的PCR鉴定。PCR反应体系为：10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL，dNTP1μL，5’AOX1Primer0.5μL，3’AOX1Primer0.5μL，高保真Taq酶0.5μL，补加去离子水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，而后94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后，72℃再延伸5分钟结束反应。回收PCR产物，测定其基因序列与SEQIDNo.1所示一致。同时，在整合了鸡Cathelicidin2序列的重组酵母基因组中扩增出2200bp、684bp两条条带(结果如图3所示)，在空载体酵母转化子中扩增出2200bp、588bp两条条带，表明重组质粒已经整合到毕赤酵母基因组中。
高拷贝阳性重组子的筛选：取-80℃保存的阳性重组子的菌株，室温下，待其融化，使用接种环在酒精灯上灼烧一段时间后，等其冷却下来后，向盛有菌液的离心管中稍微蘸取一点，依次接种于不同终浓度Zeocin的固体YPDS平板上，其中培养基中Zeocin的终浓度分别为200μg/mL、300μg/mL、500μg/mL。放置于30℃培养箱，培养3-5天。直至长出白色单菌落。最终得到终浓度为500mg/mL平板上的单菌落。
单菌落Mut+表型的筛选：取-80℃保存的高拷贝阳性重组子的菌株，室温下，待其融化，使用接种环在酒精灯上灼烧一段时间后，等其冷却下来后，向盛有菌液的离心管中稍微蘸取一点，依次接种于固体MM和MD平板上，放置于30℃培养箱，培养3-5天。直至长出白色单菌落。单菌落在MM和MD平板上均能正常生长者，判断该菌落就是Mut+表型；在MD板上生长正常，而在MM板上生长很差或者不正长着为Muts表型。
2、毕赤酵母基因工程菌表达产物的鉴定
将筛选到的阳性酵母菌株在5mLBMGY培养基中培养24h，然后转入100mL甲醇终浓度为1％的BMMY培养基中进行诱导表达，每24h追加1次甲醇并取1mL菌液，10000g离心3min，收集上清，直至培养72h。取1mL表达上清，利用DOC-TCA蛋白浓缩方法处理上清液，获得目的蛋白，进行Tricine-Tris-SDS-PAGE分析，并切胶送华大基因公司进行质谱鉴定。
表达上清Tricine-Tris-SDS-PAGE分析显示，凝胶中出现特异性条带，大小为7.6ku(结果如图4所示)，华大基因公司鉴定结果显示目的蛋白一级结构的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，可见其氨基酸序列结构准确，表明重组Cathelicidin2抗菌肽在Pichiapastoris中成功表达。
实施例3重组鸡抗菌肽Cathelicidin2的抑菌活性检测
抑菌试验所用的指示菌株：藤黄微球菌(MicrococcusluteusCMCC28001)、鸡白痢沙门氏菌(SalmonellapullorumCVCC79201，C79-1)、多杀性巴氏杆菌(PasteurellamultocidaCVCC474，C48-7)标准菌株均购自中国兽医药品监察所；绿脓杆菌(Pseudomonaspyocyanea)、大肠杆菌(Escherichiacoli1503)菌株为本实验室保存的临床分离、鉴定菌株。具体步骤如下：
1、大肠杆菌、沙门氏菌等标准菌株的体外药敏试验
按照药敏试剂盒的说明，选用阿莫西林(10μg/片)、阿米卡星(30μg/片)、阿奇霉素(15μg/片)等9种药敏试纸片，对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等5株菌株进行药敏试验，作为抗菌肽抑菌活性测定和抗菌肽与抗生素体外联合作用的对照。
2、重组抗菌肽Cathelicidin2的抑菌活性测定
抑菌活性测定采用标准琼脂孔穴扩散法：将大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌接种于5mL新鲜LB培养基中，37℃培养过夜，次日取10μL(1.0×1010CFU/mL)菌液，均匀涂布LB平板，用灭菌的打孔器打孔(直径4mm)，每空分别滴加200μL待测重组抗菌肽(Cathelicidin2：1.89mg/mL)，37℃培养过夜，以同体积的空载体转化子X-33/pPICZαA表达上清液为阴性对照，次日测量抑菌圈的大小。
将沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌接种于5mL营养肉汤培养基中，37℃培养过夜，次日取10μL菌液，均匀涂布于血清平板，用灭菌的打孔器(直径4mm)打孔，每空分别滴加200μL待测重组抗菌肽(Cathelicidin2：1.89mg/mL)，37℃培养过夜，以同体积的空载体转化子X-33/pPICZαA表达上清液为阴性对照，次日测量抑菌圈的大小。
3、重组抗菌肽Cathelicidin2与抗生素的体外联合作用
将大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌接种于5mL新鲜LB培养基中，37℃培养过夜，次日取10μL菌液，与200μL待测重组抗菌肽混合均匀，涂布于LB平板，取上述药敏片粘贴于平板中，37℃培养过夜，次日，测量抑菌圈的大小。
将沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌接种于5mL营养肉汤培养基中，37℃培养过夜，次日取10μL菌液，与200μL待测重组抗菌肽混合均匀，涂布于血清平板，取上述药敏片粘贴于平板中，37℃培养过夜，次日，测量抑菌圈的大小。
抑菌圈直径测定结果分别见表2-6。
表2抗菌肽与抗生素体外联合对大肠杆菌的抑菌试验结果
注：“+”：抗生素与对应重组抗菌肽联合；“-”：单独用抗生素；“对照”：单独用重组抗菌肽。
表3抗菌肽与抗生素体外联合对沙门氏菌的抑菌试验结果
注：“+”：抗生素与对应重组抗菌肽联合；“-”：单独用抗生素；“对照”：单独用重组抗菌肽。
表4抗菌肽与抗生素体外联合对多杀性巴氏杆菌的抑菌试验结果
注：“+”：抗生素与对应重组抗菌肽联合；“-”：单独用抗生素；“对照”：单独用重组抗菌肽。
表5抗菌肽与抗生素体外联合对绿脓杆菌的抑菌试验结果
注：“+”：抗生素与对应重组抗菌肽联合；“-”：单独用抗生素；“对照”：单独用重组抗菌肽。
表6抗菌肽与抗生素体外联合对藤黄微球菌的抑菌试验结果
注：“+”：抗生素与对应重组抗菌肽联合；“-”：单独用抗生素；“对照”：单独用重组抗菌肽。
重组抗菌肽Cathelicidin2与抗生素的体外联合试验结果显示，对于同一种标准菌株，重组抗菌肽Cathelicidin2单独使用的抑菌圈直径小于抗生素单独使用；重组抗菌肽Cathelicidin2与抗生素联合使用的抑菌圈均大于单独使用重组抗菌肽Cathelicidin2、抗生素的抑菌圈，说明单独使用抗菌肽效果虽然不如单独使用抗生素，但抗菌肽与抗生素联用效果却优于单独使用抗生素。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种重组鸡Cathelicidin2抗菌肽，其特征在于：其成熟肽包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的重组鸡Cathelicidin2抗菌肽的基因，其特征在于：其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述重组鸡Cathelicidin2抗菌肽基因的表达载体。
4.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒pPICZαA-CathL2。
5.一种含有权利要求3或4所述的表达载体的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为生产鸡Cathelicidin2抗菌肽的毕氏酵母工程菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为分泌型重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL2。
7.一种构建权利要求5或6所述重组菌的方法，其特征在于：将权利要求3或4所述的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，以使所述表达载体在所述宿主中有效表达。
8.根据权利要求7所述的构建所述重组菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以成年乌骨鸡骨髓RNA为模板，扩增其Cathelicidin2成熟肽的编码序列，克隆至pMD18-T载体中，筛选阳性克隆并测序验证；
(2)将Cathelicidin2成熟肽的编码序列与分泌型酵母表达载体pPICZαA相连接，筛选阳性克隆，并大量制备阳性质粒pPICZαA-CathL2；
(3)将pPICZαA-CathL2重组质粒经酶切线性化后利用电穿孔导入PichiapastorisX-33宿主细胞基因组中，获得分泌型重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL2；并将转化子经甲醇利用表型的MM/MD平板筛选，得到能够正常利用甲醇的重组酵母菌株。
9.一种权利要求1所述重组鸡Cathelicidin2抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照权利要求7或8所述方法构建所述重组菌；
(2)用蜗牛酶提取法制备所述重组菌的DNA模板，采用PCR方法筛选阳性转化子；
(3)将筛选到的阳性酵母菌株进行甲醇诱导表达，并对诱导表达条件进行优化；
(4)取不同时间段内的表达上清液，利用DOC-TCA蛋白浓缩方法处理上清，获得重组蛋白，即得。
10.权利要求1所述重组鸡Cathelicidin2抗菌肽用于制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染引起疾病的药物中的应用。
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