ES2429108T3 - Péptidos antibióticos - Google Patents

Abstract

Un péptido con al menos 16 residuos y la fórmula general:**Fórmula** en donde X1 es un residuo cargado positivamente; X2 es un residuo con una cadena lateral polar o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas; X3 es un radial que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas; X4 es un reisduo neutro con una cadena lateral polar, preferiblemente no glutamina, o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condicones fisiológicas; X5 es prolina o un derivado de prolina;siendo Sub1 una modificación del grupo amino N-terminal, en el que la modificación es guanidación; siendo Sub2 el grupo carboxilo C-terminal libre del aminoácido C-terminal o una modificación del grupo carboxilo C-terminal.

Description

Peptidos antibi6ticos

Esta invenci6n se refiere a nuevos peptidos antibi6ticos, especialmente para su uso en medicina.

Ademas, la invenci6n se refiere a composiciones y metodos para eliminar microbios, tales como bacterias u hongos, 5 y a los metodos para el tratamiento de infecciones microbianas. La invenci6n se refiere ademas a un metodo para el analisis de escrutinio de farmacos.

La incidencia de las infecciones bacterianas y fungicas graves esta aumentando a pesar de los notables avances en la terapia con antibi6ticos. Cada ano hay mas de 40 millones de hospitalizaciones en los Estados Unidos, y aproximadamente 2 millones de pacientes adquieren infecciones nosocomiales, de las cuales 50 a 60% implican a 10 bacterias resistentes a los antibi6ticos [1]. El numero de muertes relacionadas con la enfermedad nosocomial se estima en 60.000-70.000 anualmente en los EE.UU. y hasta 10.000 en Alemania [2]. Si bien las bacterias Gramnegativas resistentes fueron un problema importante en la decada de 1970, la ultima decada ha visto un ascenso en el numero de incidentes con cepas Gram-positivas resistentes a multiples farmacos [3]. Actualmente, la rapida aparici6n de cepas resistentes implica tanto a pat6genos Gram-positivos como Gram-negativos [4]. La resistencia se 15 desarroll6 primero en las especies en las que las eran suficientes mutaciones individuales para ocasionar niveles clinicamente importantes, tales como Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, seguido por las bacterias en la que se requieren multiples mutaciones, tales como E. coli y Neisseria gonorrea. Esto se debe principalmente a la amplia utilizaci6n de fluoroquinolonas [5]. Las causas importantes de la resistencia de los Gram-negativos incluyen las lactamasas de amplio espectro en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae [6]. Casi la mitad de las cepas

20 clinicas de Haemophilus ducreyi, el agente causante del chancroide, porta los genes que confieren resistencia a amoxicilina, ampicilina y una serie de otras �-lactamas [7]. Del mismo modo, para Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, la resistencia a las tetraciclinas se ha incrementado de cero en 1948 a un nivel de 98% en 1998 [8].

Esto requiere una busqueda continua de nuevos antibi6ticos. Los peptidos antibacterianos inducibles representan un campo de estudio en el que convergen la bioquimica, la inmunologia y el diseno de farmacos contemporaneos. Los 25 antibi6ticos peptidicos, que varian en tamano de 13 a mas de un centenar de residuos de aminoacidos, se han aislado a partir de plantas, animales y microbios [9]. Un solo animal produce cerca de 6-10 antibi6ticos peptidicos, mostrando cada peptido a menudo un espectro de actividad completamente diferente [10]. Esta bien establecido que la inmensa mayoria de los peptidos antibacterianos, incluyendo las defensinas, cecropinas y magaininas bien estudiadas, funcionan a traves de un mecanismo quot;litico/ionof6ricoquot;. Un punto comun de todos los peptidos quot;liticosquot; es 30 un efecto de permeabilizaci6n de las membranas citoplasmicas bacterianas [11,12,13]. Una estructura cati6nica, anfipatica que permite la formaci6n de canales i6nicos hidr6filos (protones) en una bicapa lipidica es fundamental para esta actividad; la fuga de protones ocasiona la disipaci6n del potencial de membrana, necesario para muchos procesos vitales esenciales, causando asi la muerte celular. Como la perturbaci6n de las membranas por estos peptidos no es dependiente del reconocimiento de moleculas quirales, las sustituciones de aminoacidos que no 35 anulan la estructura anfipatica general o la carga neta basica son toleradas funcionalmente [14,15]. Los peptidos que actuan directamente sobre la membrana bacteriana a menudo tienen tambien efectos t6xicos sobre las membranas de mamiferos a concentraciones mas altas, lo que limita su potencial como farmacos futuros. Cuando se insertan prolinas en las secuencias de los peptidos antimicrobianos a-helicoidales, la capacidad de los peptidos para permeabilizar la membrana citoplasmatica de E. coli disminuye sustancialmente como una funci6n del numero de

40 residuos de prolina incorporados. A este respecto, es interesante que algunos de los peptidos antibacterianos nativos mas activos, al menos frente a pat6genos Gram-negativos seleccionados, pertenezcan a la familia de peptidos ricos en prolina [16].

Tales efectos secundarios pueden ser superados por otros peptidos antimicrobianos que se dirigen a proteinas bacterianas especificas u otros compuestos intra- o extracelulares sin reactividad cruzada con analogos de 45 mamifero. Esto parece ser cierto para peptidos antimicrobianos ricos en prolina, incluyendo la apidaecina, originalmente aislada de insectos. Con esta enorme variaci6n en el tamano y las propiedades bioquimicas, no es sorprendente que las relaciones estructura-actividad y conformaci6n-actividad sean el foco de los estudios de peptidos antibacterianos. Un reajuste completo del repertorio de peptidos antibacterianos naturales a sus potencias biol6gicas no s6lo es importante en terminos de la bioquimica general, sino que tiene un interes permanente para la

50 industria farmaceutica. A pesar de los problemas con los ensayos in vitro de antibi6ticos basados en peptidos, unos pocos peptidos antibacterianos cati6nicos nativos ya han alcanzado la fase de pruebas clinicas [17]. Mientras que algunos de ellos han dado muestras de eficacia en pruebas clinicas tempranas como agentes t6picos, otros muestran actividad como terapia sistemica. Por ejemplo, la proteina cati6nica de rBPI 21 ha completado recientemente la fase III de pruebas clinicas para su uso parenteral en la meningococemia [17].

55 La apidaecina, que fue aislada originalmente de abejas, pertenece a la familia de peptidos antimicrobianos ricos en prolina y muestra similitudes de secuencia con pirrocoricina, drosocina y formaecina (Tabla 1) [18]. Las apidaecinas son peptidos de 18-20 residuos de longitud que contienen L-aminoacidos no modificados s6lo con extremos C PRPPHPRI/L altamente conservados y un contenido de prolina relativamente alto (33%). Pueden ser facilmente sintetizadas en fase s6lida usando la estrategia Fmoc/tBu normal. El peptido inhibe la viabilidad de muchas bacterias

60 gram negativas en dosis nanomolares, mientras las gram positivas no se ven afectadas. La actividad letal es casi

inmediata y se demostr6 que era independiente del mecanismo quot;liticoquot; convencional [19]. Ademas, los mutantes resistentes a la apidaecina tienen una sensibilidad sin merma a los peptidos quot;formadores de porosquot; y el enanti6mero D esta desprovisto de actividad antibacteriana. El modelo actual es que los efectos antag6nicos de la apidaecina sobre las bacterias implican el reconocimiento estereoselectivo de las dianas quirales [19]. Los peptidos antimicrobianos ricos en prolina que incluyen apidaecina como un miembro de esta familia no se limitan a eliminar las bacterias por permeabilizaci6n de sus membranas, sino que se unen estereoespecificamente a una proteina diana, que no se ha identificado para la apidaecina, y en ultima instancia conducen a la muerte celular. Por otra parte, en agudo contraste con los AMP con estructuras secundarias definidas como la melitina o la gramdicidina S, los peptidos ricos en prolina parecen no ser t6xicos in vitro para las celulas eucari6ticas y no son hemoliticos. En suero de mamifero la apidaecina es completamente degradada en una hora debido a las divisiones en los extremos N y C, lo que podria ser el resultado de la escisi6n con amino-y carboxi-peptidasas, de la escisi6n con endoproteasas o de todo ello. Los metabolitos antes mencionados perdieron la actividad antimicrobiana con unos valores de CIM tipicamente por encima de 125 1g/ml.

Tabla 1: Comparaci6n de las secuencias de apidaecina 1a o 1b (Apis mellifera) [18], drosocina (Drosophila melanogaster) [20], formaecina 1 (Myrmecia gulosa) [21], y pirrocoricina (Pyrrhocoris apterus) [22].

SEC ID NO

Peptido Secuencia

1

Apidaecina 1a GNNRPVYIPQPRPPHPRI

2

Apidaecina 1b GNNRPVYIPQPRPPHPRL

161

Drosocina GKPRPYSPRPTSHPRPIRV

162

Formaecina 1 GRPNPVNNKPTPYPHL

163

Pirrocoricina VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN

Todavia existe una necesidad de nuevos compuestos anti-bacterianos y anti-fungicos, nuevas composiciones farmaceuticas anti-bacterianas y anti-fungicas, metodos de uso de los mismos, y compuestos novedosos que se puedan emplear en el analisis de escrutinio de farmacos para detectar nuevos antibi6ticos farmaceuticos.

Un objetivo de la invenci6n es proporcionar nuevos peptidos antibi6ticos, preferiblemente con estabilidad elevada. Otro objetivo de la invenci6n es proporcionar un metodo para el analisis de escrutinio de farmacos.

Este primer objetivo se resuelve mediante los peptidos de acuerdo con la invenci6n, con al menos 16 residuos y la f6rmula general

Sub1-X1-NX2-X3-PVYIPX4-X5-RPPHP-Sub2 (F6rmula 1)

en donde

X1 es un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas, que aun lleva una carga positiva despues de la modificaci6n con Sub1. Los residuos X1 preferidos se seleccionan preferiblemente del grupo de residuos cargados positivamente, incluyendo arginina, o-hidroxilisina, homoarginina, -homoarginina, D-arginina, metilarginina (preferiblemente alfa-N-metilarginina), nitroarginina (preferiblemente N(G)-Nitroarginina), nitrosoarginina ( preferiblemente N(G)-Nitrosoarginina), arginal (el -COOH de la arginina se sustituye por -CHO), acido guanidinopropi6nico, acido 2,4-diaminobutirico, £-N-metil lisina, alohidroxilisina, acido 2,3-diaminipropionico, acido 2,2'-diaminopimelico, lisina, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6 -diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, acido paminobenzoico, y 3-amino-tirosina;

X2 es un residuo con una cadena lateral polar (tal como asparragina, serina, citrulina o glutamina) o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas (tal como lisina

o arginina, ornitina u homoarginina). Los residuos X2 preferidos se seleccionan entre los grupos que incluyen asparragina, glutamina, serina, treonina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3hidroxiprolina, citrulina, N-metilserina, N-metilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3,5-dinitrotirosina asi como arginina, lisina, ohidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, D-arginina, metilarginina (preferiblemente alfa-N-metilarginina), nitroarginina (preferiblemente N(G)-Nitroarginina), nitrosoarginina (preferiblemente N(G)-Nitrosoarginina), arginal, acido guanidinopropi6nico, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminipropionico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, acido p-aminobenzoico, y 3-amino-tirosina;

X3 es un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas. Los residuos X3 preferidos se seleccionan del grupo que incluye arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, D-arginina, metilarginina (preferiblemente alfa-Nmetilarginina), nitroarginina (preferiblemente N(G)-Nitroarginina), nitrosoarginina (preferiblemente N(G)

Nitrosoarginina), arginal, acido guanidinopropi6nico, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminipropionico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, acido p-aminobenzoico, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina;

X4 es un residuo neutro con una cadena lateral polar, tal como asparragina o citrulina, o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas. Los residuos X4 preferidos se seleccionan entre los grupos que incluyen asparragina, homoglutamina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, citrulina, N-metilserina, N-metilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, y 3,5-dinitrotirosina asi como arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, D-arginina, metilarginina (preferiblemente alfa-N-metilarginina), nitro-arginina (preferiblemente N(G)-Nitroarginina), nitrosoarginina (preferiblemente N(G)-Nitrosoarginina), arginal, acido guanidinopropi6nico, £-N-metil lisina, alohidroxilisina, acido 2,3-diaminopropionico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, acido p-aminobenzoico, 1-metil-histidina, 3-metilhistidina, y 3-amino-tirosina;

X5 es prolina o un derivado de prolina, como cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3hidroxiprolina, -ciclohexilalanina, 3,4-cis-metanoprolina, 3,4-deshidroprolina, homoprolina o pseudoprolina;

Un residuo neutro se define como un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral sin carga en condiciones fisiol6gicas. Las condiciones fisiol6gicas se definen como pH 7,4, 37quot;C y una presi6n osm6tica de 300 mOsm/kg. Una cadena lateral polar se define como una cadena lateral que porta al menos un grupo polar (por ejemplo, un grupo hidroxilo, amino, amida, o sulfhidrilo) que permite la formaci6n de un enlace de hidr6geno con otro grupo polar. Un derivado de prolina es una estructura derivada de prolina que contiene un anillo de pirrolidina sustituido o no sustituido. Un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas es un residuo de aminoacido alcalino. Un radical hidr6fobo es un residuo neutro sin grupos polares en la cadena alifatica o lateral de un aminoacido aromatico, siendo preferiblemente mas hidr6fobo que la alanina.

Siendo Sub1 una guanidinaci6n del grupo amino N-terminal (remplazando el grupo amino N-terminal de la secuencia de aminoacidos X1 porSub1).

Siendo Sub2 el grupo carboxilo C-terminal libre del aminoacido C-terminal o una modificaci6n del grupo carboxilo Cterminal, preferiblemente con la f6rmula general COR3 (remplazando R3 el grupo hidroxilo del ultimo aminoacido) X6-COR3 o X7-COR3 o X6X7-COR3.

COR3 se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:

(i)

carboxilo (siendo R3 un hidroxilo libre), un ester (siendo R3 alcoxi), una amida (siendo R3 una amina) o una imida;

(ii)

junto con Sub1 un conector que une mediante puente los extremos N- y C-terminales del mismo para obtener un peptido ciclico

(iii) COR3, siendo R3 un residuo de aminoacido adicional seleccionado del grupo que consiste en Pro, Ile, Leu, Arg, Val o siendo R3 un peptido, preferiblemente con dos a tres aminoacidos que contienen al menos un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Pro, Ile, Leu, Arg, Val sustituido con un miembro del grupo que consiste en carboxilo (siendo R3 un hidroxilo libre), un ester (siendo R3 un alcohol, tal como metanol, etanol, propanol, isopropanol o butanol), una amida (siendo R3 una amina) o una imida (siendo R3 una alquilamina o dialquilamina, tal como metilamina, etilamina, dimetilamina, o ciclohexilamina).

(iv) COR3 siendo R3 un aminoacido ramificado adicional para formar una estructura oligomerica o dimerica, tal como lisina, hidroxilisina, ornitina, acido 2,4-diaminobutanoico, acido 2,3-diaminopropi6nico, acido 2,2'diaminopimelico, desmosina, isodesmosina o combinaciones de estos aminoacidos ramificados.

De esta manera, los peptidos C-terminales pueden estar formados, en particular, como un ester (R3 = Alcoxi), una amida (R3 = Amida), una imida o un peptido prolongado por aminoacidos adicionales seleccionados del grupo que consiste en Pro, Ile, Arg, Val modificado de nuevo en el extremo C-terminal en forma de ester, amida, o imida. Se pueden formar otros peptidos por modificaciones en los extremos N-o C-terminales del peptido. Estos cambios pueden ser, por ejemplo, la adici6n de un grupo alquilo o alcanoilo (o bien que tiene una cadena lineal o bien que es ramificado o ciclico o heterociclico) o un grupo guanidino o la adici6n de una macromolecula o un radical informador, ya sea a traves de un enlace permanente o una conexi6n que puede ser escindida bajo ciertas condiciones (tales como puentes disulfuro o conectores labiles en medio acido).

Todos los aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales o derivados de aminoacidos (tales como iminoacidos) que forman los peptidos o derivados de peptidos de la invenci6n pueden estar o bien en configuraci6n L o bien en configuraci6n D. Sin embargo, si no se especifica lo contrario, los aminoacidos, elementos esenciales de las secuencias estan preferiblemente en configuraci6n L.

X6 y X7 son residuos adicionales opcionales. Asi, en el caso en el que X6 y X7 estan ausentes, la ultima Prolina (P) de la secuencia mencionada anteriormente tiene un grupo carboxilo C-terminal libre o esta conectada a Sub2.

Por lo tanto en el caso en el que al menos uno de los residuos X6 y X7 estan presentes, el peptido tiene por ejemplo una de las siguientes f6rmulas generales:

Sub1-X1-NX2-X3-PVYIPX4-X5-RPPHPX6-X7-COR3(F6rmula 2)

Sub1-X1-NX2-X3-PVYIPX4-X5-RPPHPX6-COR3 (F6rmula 3)

Sub1-X1-NX2-X3-PVYIPX4-X5-RPPHPX7-COR3 (F6rmula 4)

X6 se selecciona entre prolina o un derivado de prolina o un resido que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas. Los residuos X6 preferidos se seleccionan entre los grupos que incluyen prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, ciclohexilalanina, 3,4-cis-metanoprolina, 3,4-deshidroprolina, preferiblemente D-arginina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3diaminipropionico, homoprolina, pseudoprolina, asi como arginina, acido 2,2'-diaminopimelico, lisina, ornitina, metilarginina (preferiblemente alfa-N-metilarginina), nitroarginina (preferiblemente N(G)-Nitroarginina), nitrosoarginina (preferiblemente N(G)-Nitrosoarginina), arginal, acido guanidinopropi6nico, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, o 3-aminotirosina.

X7 se selecciona entre prolina o derivados de prolina, un radical polar (tal como serina) o un radical hidr6fobo. Los residuos X7 preferidos se seleccionan entre los grupos que incluyen prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, �-ciclohexilalanina, 3,4-cis-metanoprolina, 3,4deshidroprolina, homoprolina o pseudoprolina, serina, treonina, o-hidroxilisina, citrulina, homoserina, o alo-treonina, asi como fenilalanina, N-metil-leucina, leucina, isoleucina, valina, metionina, terc-butil-glicina, ciclohexilalanina, alanina, -alanina, acido 1-amino-ciclohexilcarb6nico, N-metil-isoleucina, norleucina, norvalina, N-metilvalina, o una secuencia de peptido corta, preferiblemente con uno a 3 residuos, seleccionados preferiblemente entre prolina, isoleucina o cualquiera de los radicales anteriomente mencionados, o un conector ramificado que contiene varias unidades peptidicas, tales como lisina, hidroxilisina, ornitina, acido 2,4-diaminobutanoico, acido 2,3diaminopropi6nico, acido 2,2'-diaminopimelico, desmosina, isodesmosina.

El aminoacido C-terminal es por ejemplo la ultima prolina (P) en la F6rmula 1, X6 (en la F6rmula 3) o X7 (en las F6rmulas 2 y 4).

Las secuencias naturales con la apidaecina 1a y 1b no modificadas de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 (GNNRPVYIPQPRPPHPRI-OH) y el SEQ ID NO: 2 (GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH) en las que OH representa un grupo carboxilo libre en el extremo C-terminal (Sub1 = NH2 y Sub2 = RI-OH o RL-OH, R3 = OH), estan excluidas del alcance de la invenci6n.

Los peptidos descritos en este documento poseen al menos una de las siguientes ventajas en comparaci6n con los peptidos naturales de apidaecina de origen natural:

(i)

un aumento de la vida media en suero de mamifero debido a una mayor resistencia a la proteasa y

(ii)

un aumento de la actividad antimicrobiana frente a una o varias cepas de bacterias, pat6genos, especialmente humanos, u hongos u otras infecciones microbianas y

(iii) los peptidos no son t6xicos para las celulas humanas incluyendo los eritrocitos.

Los ejemplos de los peptidos tienen las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 88, 120, 125, 128, 134, 137, 146, 147, 151, 155, 156, 157, y 158. (Vease tambien la Tabla 2 en el Ejemplo 1).

Los peptidos y/o constructos de peptidos multimericos descritos en la presente memoria, que estan modificados para mejorar la actividad antimicrobiana o antifungica y para ampliar el espectro de actividad a otras bacterias u hongos y para mejorar la estabilidad frente a proteasas y peptidasas, se caracterizan por una elevada potencia antibacteriana y/o antifungica y una buena estabilidad metab6lica en el suero de mamiferos.

Las modificaciones apropiadas en las posiciones 3 (X2), 4 (X3), y 10 (X4) mejoran la actividad antibacteriana de la secuencia de apidaecina de tipo salvaje frente a diferentes bacterias, como se comenta a continuaci6n y se muestra en los ejemplos.

Se supone que las primeras posiciones (Sub1, X1, X2 y X3) son responsables de un mejor transporte a traves de la membrana al interior de la celula mientras que la posici6n 10 (X4) tambien puede contribuir a la inhibici6n de una diana intracelular. Por otra parte, el residuo X2 puede estabilizar aun mas la secuencia del peptido N-terminal frente a la degradaci6n y por lo tanto aumentar la vida media en el suero.

Los ejemplos preferidos de acuerdo con la invenci6n son las secuencias con un residuo cargado positivamente X4 (posici6n 10), al igual que las secuencias seleccionadas entre las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 88, 125, 128, 134, 137, 146, 147, 151 y 155 a 158. Menos preferidas son las secuencias con una glutamina (Q) en X4 (posici6n 10).

Los ejemplos preferidos de acuerdo con la invenci6n son las secuencias con residuos de carga positiva como X3 (posici6n 4), al igual que las secuencias seleccionadas entre las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 125, 128, 134, 137, y 155.

Por otra parte, el grupo amino N-terminal y el grupo carboxilo C-terminal libres se modifican preferiblemente, ya que estos extremos son propensos a la degradaci6n por peptidasa y proteasa en el suero, fluidos corporales en general, tejidos, 6rganos o celulas, y parecen ser muy criticos para la actividad antibi6tica de los peptidos, derivados de peptidos y multimeros de los mismos. El aumento de la resistencia a la proteasa incrementa la vida media del peptido en el suero. Ademas, la modificaci6n de los extremos tambien permite el acoplamiento del peptido a otros radicales, tales como otras secuencias de aminoacidos (creando posiblemente de ese modo peptidos o proteinas multimericos), u otras biomoleculas que pueden funcionar como portador o marca. En una realizaci6n especifica la molecula portadora tambien funciona como una molecula de redireccionamiento, que es capaz de localizar la infecci6n bacteriana y se puede unir a la bacteria, con el fin de llevar el compuesto antibi6tico a las proximidades de la celula (bacteriana) para atacarla o incluso transportarla a traves de la membrana bacteriana al interior de la celula bacteriana. Tales radicales de redireccionamiento pueden ser moleculas que se sabe que se unen a moleculas de lipopolisacarido (LPS), que forman la parte exterior de las bacterias Gram-negativas. Los compuestos conocidos para este uso son, por ejemplo, peptidos de anclaje, tales como el motivo AcmA de Lactobacillus, o anticuerpos dirigidos a lipopolisacaridos. Se prefiere esto ultimo ya que tambien tienen un efecto antibi6tico intrinseco y por lo tanto podrian usarse para potenciar la acci6n del peptido de la invenci6n.

Como aminoacido N-terminal, que es Sub1-X1, resulta muy ventajoso tener un radical que tenga una carga positiva bajo circunstancias fisiol6gicas, es decir, en el organismo (humano). Las circunstancias fisiol6gicas, por lo tanto, significan un pH de aproximadamente 6-8 y una temperatura de aproximadamente 30-40quot;C. Es muy probable que esta carga positiva, en Sub1 o en X1 en el peptido sea necesaria para la funci6n antibacteriana.

La estabilizaci6n N-terminal frente a la escisi6n proteolitica se logra por guanidinaci6n (siendo preferiblemente Sub1 = N(CH3)2-(C-N+(CH3)2)-NH-), que introduce al mismo tiempo un grupo cargado positivamente en la posici6n 1.

Los ejemplos mas preferidos de acuerdo con la invenci6n son las secuencias con residuos de carga positiva como X1 y X4 (posici6n 1 y 10), al igual que las secuencias seleccionadas entre las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 88, 125, 128, 134 y 137.

Otros ejemplos preferidos son las secuencias con prolina, un derivado de prolina o un residuo cargado positivamente como X6 (posici6n 17), al igual que las secuencias seleccionadas entre las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 128, 134, 146, 151 y 155 al 158.

Otros ejemplos preferidos son las secuencias con prolina, un derivado de prolina, un radical polar o un radical hidr6fobo como X7 (posici6n 18).

Los ejemplos muy preferidos son peptidos con un aminoacido con carga positiva en la posici6n 1 (X1) o 10 (X4) (como ornitina, arginina o lisina) y un extremo C-terminal modificado, en particular, los peptidos de acuerdo con los SEQ ID NO: 134 y 137.

Los peptidos mas preferidos contienen ornitina en la posici6n 1 (residuos X1), arginina en la posici6n 10 (residuos X4), prolina o hidroxiprolina en la posici6n 11 (residuo X5), arginina o un derivado de la misma (como ornitina, homoarginina) en posici6n 17 (residuo X6 en Sub2) y un extremo N con guanidina anadida, tales como los SEQ ID NO: 88, 134 y 137.

A partir de los ejemplos se puede observar que ya una pequena modificaci6n del extremo C en una amida (Sub2 = -NH2) mejora el efecto inhibidor contra E. coli y S. typhi significativamente. La secuencia preferida con una amida como extremo C es el SEC ID NO: 134.

Tambien se prefieren modificaciones, tales como metilo, propilo, amida y prolina, en la posici6n o posiciones 17 (X6) y/o 18 (X7) y/o el extremo C (Sub2) para reducir la degradaci6n C-terminal. A partir de los resultados experimentales se puede deducir que al parecer los aminoacidos en las posiciones 17 y 18 tambien son muy criticos para la acci6n antibi6tica, ya que el reemplazo de un solo aminoacido en estas posiciones por alanina suprimi6 la eficacia con respecto a la actividad antibi6tica de la apidaecina de tipo salvaje.

Los ejemplos mas preferidos son peptidos, que cumplen todas las ventajas:

(i)

un aumento de la vida media en suero de mamifero debido a una mayor resistencia a la proteasa y

(ii)

un aumento de la actividad antimicrobiana frente a una o varias cepas de bacterias, especialmente

pat6genos de humanos, u hongos u otras infecciones microbianas y

(iii) los peptidos no son t6xicos para las celulas humanas incluyendo eritrocitos.

La acci6n de los peptidos antimicrobianos es muy compleja, ya que tienen que atravesar la membrana de la celula bacteriana y entrar en el citoplasma para inhibir especificamente una diana bacteriana intracelular sin ser t6xicos para las celulas de mamifero y las celulas de la sangre. Otro punto importante a tratar es la estabilidad de los peptidos o derivados de peptidos frente a la degradaci6n por peptidasas o proteasas. Asi, el peptido ideal tiene una alta actividad antibacteriana (bajos valores de CIM), sin toxicidad celular, sin actividad hemolitica, y una vida media en sangre de varias horas. Con respecto a las secuencias de apidaecina nativa, los mejores derivados peptidicos descritos en esta invenci6n tienen un aumento de la actividad antimicrobiana de mas de diez veces. Esto se logr6 en parte por la amidaci6n del extremo C y la sustituci6n de la Gln en posici6n 10 (X4) por un residuo alcalino, mas favorablemente arginina u ornitina. Como la vida media de estos peptidos es relativamente corta en el suero, el extremo N es modificado (por guanidaci6n) para reducir la degradaci6n por aminopeptidasas o aminoproteasas. En el extremo N-terminal se prefiere una carga positiva a fin de lograr una buena actividad antibacteriana. La glicina de la posici6n 1 (X1) de la secuencia de apidaecina nativa se sustituye preferiblemente por un residuo alcalino como arginina, lisina u ornitina, mas favorablemente por ornitina, ya que su enlace peptidico C-terminal no es escindido por la tripsina y enzimas relacionadas. Por la misma raz6n la Arg-17 (X6) de la secuencia nativa de apidaecina se sustituye preferiblemente para reducir la escisi6n del enlace peptidico entre Arg-17 (X6) y Leu/Ile-18 (X7) por las endoproteasas. Los ejemplos son la sustituci6n de Arg-17 (X6) por ornitina o la N-metilaci6n de Leu-18 (X7) que incrementan ambas la estabilidad en suero mas de 24 veces desde una vida media de 15 minutos a mas de 360 min. Aunque ninguno de los peptidos es t6xico para las lineas celulares COS-7 o los gl6bulos rojos de la sangre, la sustituci6n de Pro-11 (X5) por trans-4-Hyp tiene el potencial de reducir aun mas los posibles efectos secundarios, ya que las sustituciones polares reducen la tendencia de los peptidos o derivados de peptidos a unirse a las membranas de celulas de mamiferos sin una reducci6n de la actividad antibacteriana.

Ventajosamente, los peptidos descritos en la presente memoria no inducen resistencia o inducen menos resistencia que los peptidos de tipo salvaje.

Ventajosamente, numerosos peptidos descritos en la presente memoria muestran un espectro mayor de actividad antimicrobiana, que muestra actividad contra bacterias tales como Bacillus Subtilis y Mycobacterium vaccae, que no se observa para los peptidos de apidaecina de tipo salvaje nativos. La caracteristica comun de estas secuencias con actividad contra B. subtilis es un extremo N cargado positivamente. La caracteristica comun de estas secuencias con actividad contra M. vaccae es un extremo N cargado positivamente, un residuo cargado (preferiblemente arginina u ornitina) como X4 (posici6n 10) y un residuo cargado (preferiblemente ornitina) como X1 (posici6n 1). Un ejemplo de estas secuencias preferidas es el SEC ID NO: 155.

El termino quot;peptidoquot; segun se utiliza en la presente memoria significa una secuencia de aminoacidos unidos por un enlace peptidicos, en la que los aminoacidos son preferiblemente uno de los veinte aminoacidos constructores de peptidos de origen natural y en la que los aminoacidos pueden estar en la configuraci6n L o en la configuraci6n D, o, para isoleucina y treonina en la configuraci6n D-alo (inversi6n solo en uno de los centros quirales).

Tambien estan incluidos los radicales que pueden formar un enlace covalente tanto con el grupo COOH del residuo aminoacido precedente como con el grupo NH2 del siguiente residuo de aminoacido, y que por lo tanto no necesariamente tienen que mantener la estructura del esqueleto del peptido, tales como los is6steros dipeptidicos de aminoacidos azucarados, azapeptidos, 6-homopolimeros, y-peptidos, analogos Y-lactamicos, oligo(fenilenetileno), sulfonopeptidos vinilogos, glicinas, glicinas poli-N-sustituidas, u oligocarbamatos. Estas modificaciones se prefieren en las posiciones propensas a la degradaci6n enzimatica, especialmente en los tres residuos N-terminales (posiciones 1 a 3 -X1-N-X2) y los dos residuos C-terminales (despues de la posici6n 16 -X6-X7). Por lo tanto, preferiblemente al menos uno de los enlaces entre X1-N (p. ej., Gly-Asn), N-X2 (p. ej., Asn-Asn), X2-X3 (p. ej., Asn-Arg), X6-X7 (p. ej., Arg-Leu o Arg-Ile) es un enlace no escindible.

Este enlace no escindible se define como un enlace que no es susceptible de escisi6n por proteasas y se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un enlace amida reducido, un enlace amida alquilado, o un enlace tioamida. Un enlace amida reducido es un enlace peptidico, en el que el radical carbonilo (C=O) o se reduce a un radical hidroxilo (HCOH) o a un radical metileno (CH2). Un enlace amida alquilado es un enlace peptidico en el que o bien el nitr6geno (N-alfa) o bien el carbono (C-alfa) esta sustituido con alquilo, preferiblemente con 1 a 3 atomos de C, siendo un ejemplo preferido N-metilaci6n.

Los peptidos como los descritos en la presente memoria pueden ser lineales, es decir, en los que el primer y el ultimo aminoacidos de la secuencia estan modificados por Sub1 y Sub2, o tienen un grupo COOH libre, respectivamente, o pueden ser ciclicos, es decir, cuando el primer y el ultimo aminoacidos estan acoplados por medio de un enlace peptidico o un conector.

Otros objetos de la invenci6n son los metodos para producir los nuevos compuestos antibi6ticos mencionados anteriormente.

Los peptidos descritos en la presente memoria pueden ser producidos sinteticamente o, cuando sea aplicable, de

manera recombinante mediante metodos convencionales. Las realizaciones especificas de los peptidos o derivados de peptidos antibi6ticos derivados de apidaecina se describen en detalle en la parte experimental a continuaci6n. Preferiblemente, los peptidos o derivados de peptidos de la invenci6n se preparan convencionalmente mediante tecnicas de sintesis quimica conocidas, tales como, por ejemplo, las descritas por Merrifield [23].

Alternativamente, los peptidos pueden ser producidos por medio de tecnicas de ADN recombinante por clonaci6n y expresi6n en un microorganismo anfitri6n o celula de un fragmento de ADN que porta una secuencia de acido nucleico que codifica uno de los peptidos descritos anteriormente. Las secuencias codificantes de acido nucleico pueden prepararse sinteticamente [24], o pueden derivar de secuencias de acidos nucleicos existentes (p. ej., la secuencia codificante de apidaecina de tipo salvaje) mediante mutagenesis dirigida al sitio. Las secuencias codificantes asi preparadas pueden ser amplificadas a partir de ARN (o ADN) usando cebadores disenados en consecuencia en una reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) por medio de tecnicas conocidas. Despues de la purificaci6n por electroforesis en gel de agarosa por ejemplo, el producto de la PCR se liga en un vector, y en una celula anfitriona transformada finalmente con el plasmido recombinante apropiado. Varias celulas anfitrionas son bien conocidas en la tecnologia recombinante, tales como E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, celulas de mamifero (p. ej., Celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas COS-1), levaduras (p. ej., Saccharomyces, Schizophyllum), celulas de insecto o sistemas de expresi6n virales (p. ej., sistemas de baculovirus). La selecci6n de otras celulas anfitrionas adecuadas y de los metodos para la transformaci6n, el cultivo, la amplificaci6n, el escrutinio, la producci6n y la purificaci6n del producto se puede realizar por un experto en la tecnica haciendo referencia a las tecnicas conocidas [25]. Cuando se producen mediante medios recombinantes convencionales, los peptidos de esta invenci6n se pueden aislar o bien a partir de la celula anfitriona mediante tecnicas de lisis convencionales, o bien a partir del medio celular mediante metodos convencionales, tales como cromatografia liquida, preferiblemente cromatografia de afinidad. El peptido antimicrobiano puede ser expresado como un solo peptido, o un olig6mero de varias secuencias de peptidos combinadas ya sea N-o C-terminalmente, o incluso una etiqueta N- o C-terminal para permitir la facil purificaci6n del peptido recombinante o de los constructos de proteinas. Se pueden emplear adicionalmente tecnicas de biologia molecular convencionales y de mutagenesis dirigida al sitio, para modificar las secuencias y proporcionar secuencias deseadas de peptidos no nativos. Todas estas tecnicas recombinantes son conocidas por el experto en la tecnica y se ha informado de muchos peptidos antimicrobianos incluyendo apidaecina [26], perinerina [27], y defensina [28].

Tambien es posible incluir aminoacidos de origen no natural en los peptidos por medio de tecnicas de ingenieria genetica. Esto ha sido descrito exhaustivamente por Noren et al. y Ellman et al. [29,30].

Con posterioridad, el peptido se puede aislar a partir del cultivo de las celulas anfitrionas o de sistema de traducci6n in vitro. Esto se puede lograr mediante mecanismos de purificaci6n y aislamiento comunes de proteinas que constituyen el estado de la tecnica. Dichos mecanismos pueden implicar, por ejemplo inmunoadsorci6n o cromatografia. Tambien es posible proporcionar a los peptidos una etiqueta (tal como una etiqueta de histidina) durante la sintesis, lo que permite una rapida uni6n y purificaci6n, despues de lo cual la etiqueta se retira enzimaticamente para obtener el peptido activo.

Si el propio peptido no puede ser codificado o expresado, pero es muy similar a un peptido que puede ser codificado

o expresado, puede aplicarse el metodo para preparar el peptido al cual es similar el peptido, seguido de una o mas etapas en las que dicho peptido es modificado mediante tecnicas quimicas o enzimaticas para preparar el peptido o peptidomimetico finales. Algunos resumenes mas exhaustivos de los metodos que pueden ser aplicados en la preparaci6n de los peptidos se describen en la bibliografia [31,32, 33,34,35].

Los peptidos descritos en la presente memoria se pueden usar solos, o combinados, o en forma de multimeros o en forma de multimeros ramificados. Las combinaciones adecuadas de peptidos comprenden concatameros de los peptidos descritos en la presente memoria acoplados en serie entre si a traves de espaciadores, por ejemplo, en forma de un dimero peptidico, un trimero peptidico, etc., en donde los peptidos individuales se alinean con posterioridad. Este multimero puede estar compuesto por peptidos con secuencias identicas o por varias de las secuencias de acuerdo con la f6rmula 1.

Un unico peptido puede estar acoplado a una proteina biocompatible, tal como albumina de suero humano, un anticuerpo humanizado, liposomas, micelas, polimeros sinteticos, nanoparticulas y fagos. Alternativamente, los multimeros de peptidos combinados individualmente se preparan en forma de dendrimeros, o agrupaciones, en donde tres o mas peptidos estan conectados a un centro comun.

En una realizaci6n, multiples peptidos de f6rmula 1 descritos anteriormente se organizan en constructos o composiciones multimericos. Por ejemplo, los aminoacidos opcionales (p. ej.,-Gly-Ser-) u otros espaciadores de aminoacidos o compuestos quimicos se incluyen en los extremos N-o C-terminales de los peptidos con el prop6sito de conectar dos o mas peptidos entre si o a un portador. Esta composici6n puede tomar la forma de uno o mas de los peptidos descritos anteriormente expresados como un peptido sintetico acoplado a una proteina portadora. Alternativamente, una composici6n contiene multiples peptidos, cada uno expresado como un peptido antigenico multiple, opcionalmente acoplado a una proteina portadora. Alternativamente, los peptidos seleccionados estan conectados sucesivamente y se expresan como una proteina o polipeptido producidos de forma recombinante. Como una realizaci6n, se conectan sucesivamente multiples peptidos, con o sin aminoacidos espaciadores entre

ellos, para formar una proteina recombinante mas grande. Alternativamente, la proteina recombinante se puede fusionar en marco con una proteina portadora.

En otra realizaci6n, el constructo multimerico contiene al menos dos de los peptidos definidos anteriormente (que pueden ser los mismos o diferentes peptidos de f6rmula 1), un peptido esta unido a cualquier aminoacido del otro peptido o de los otros peptidos. Cualquier numero de peptidos adicionales puede estar anclado a cualquier aminoacido de los otros peptidos de la composici6n. En otra realizaci6n de una composici6n multimerica que contiene al menos dos peptidos, los segundos peptidos o peptidos adicionales estan anclados a un constructo ramificado de los otros peptidos de la composici6n. Alternativamente, cada peptido adicional esta conectado covalentemente al Sub1 o Sub2 de otro peptido de la composici6n.

En otra realizaci6n de un constructo o composici6n multimericos que contiene al menos dos de los peptidos, por lo menos uno o mas de los peptidos estan unidos a un portador. En otra realizaci6n, uno o mas de dichos peptidos son peptidos sinteticos fusionados a una proteina portadora. Tambien alternativamente muchos de los peptidos descritos anteriormente con o sin secuencias flanqueantes, pueden combinarse sucesivamente en un polipeptido. Los peptidos o este polipeptido o bien estan acoplados al mismo portador, o bien se pueden acoplar individualmente diferentes peptidos como peptidos a las mismas o diferentes proteinas portadoras inmunol6gicamente inertes.

Los portadores adecuados pueden mejorar la estabilidad o la liberaci6n, mejorar la producci6n, o cambiar el espectro de actividad del peptido. Los ejemplos de portadores son la albumina humana, el polietilenglicol, otros biopolimeros u otros polimeros de origen natural o no natural. En una realizaci6n, el radical es deseablemente una proteina u otra molecula que puede mejorar la estabilidad del peptido. Un experto en la tecnica puede seleccionar facilmente un radical de conjugaci6n adecuado.

Los ejemplos de una composici6n multimerica tienen la estructura (Ac-OrnAsnAsnArgProValTyr IleProArgProArgProProHisProArgLeu)2-Dab y (OrnAsnAsnArgProValTyrIleProArgProArgProProHisProArgLeu)2-Dab correspondiente a los SEC ID NO: 83 y 119.

Otros dimeros preferidos se seleccionan entre:

SEC ID NO:

Secuencia/estructura

125

(Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL)2-Dab

128

(Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPOL)2-Dab

130

(Guan-GNNRPVYIPQPRPPHPRL)2-Dab

En otra realizaci6n mas, los peptidos estan en forma de un peptido antigenico multiple (quot;MAPquot;), que puede estar disenado, p. ej., de acuerdo con el quot;sistema MAPquot; como describen Tam et al. [36]. Este sistema hace uso de una matriz central de residuos de lisina en la que se sintetizan multiples copias del mismo peptido de la invenci6n como se ha descrito [vease, p. ej., 37]. Cada MAP contiene multiples copias de uno o mas de los peptidos de esta invenci6n. Una realizaci6n de un MAP contiene al menos tres, y preferiblemente cuatro o mas peptidos. Un experto en la tecnica puede elaborar facilmente cualquier numero de constructos multimericos a partir de los peptidos de la f6rmula identificada anteriormente recurriendo solamente a habilidades y conocimientos convencionales a la luz de esta memoria descriptiva. Se pretende que todas estas composiciones y constructos multimericos esten incluidos en esta invenci6n.

Sin embargo, otras combinaciones en forma de multimeros estan formadas por cuentas sobre la superficie de las cuales estan expuestos los peptidos o peptidomimeticos de la invenci6n. La cuenta puede en ese caso funcionar como un portador para el peptido o peptidomimetico, y puede funcionar de manera similar a la de una marca detectable. Los multimeros pueden ser preparados, por ejemplo, mediante biotinilaci6n del extremo N de las cadenas del peptido o peptidomimetico y la subsiguiente formaci6n de complejos con estreptavidina. Como la estreptavidina es capaz de unirse a cuatro moleculas o productos conjugados de biotina con alta afinidad, se pueden formar complejos peptidicos tetramericos muy estables por este metodo. Los multimeros pueden estar compuestos de peptidos o peptidomimeticos identicos o diferentes de acuerdo con la invenci6n. Preferiblemente, sin embargo, los multimeros de la invenci6n se componen de dos o mas peptidos o peptidomimeticos, en los que cada componente constituye un factor positivo de la actividad biocida total (redireccionamiento, actividad antimicrobiana, captaci6n).

Otro objetivo de la invenci6n es el uso de los peptidos de la invenci6n en medicina o farmacia, p. ej., para la terapia con antibi6ticos o en una composici6n antimicrobiana (en particular bactericida).

Un objeto adicional son las composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los peptidos o constructos multimericos, ya sea en presencia o no de otros compuestos farmaceuticamente activos.

Tambien es parte de la invenci6n el uso de un peptido de acuerdo con la invenci6n como un producto farmaceutico y/o para la preparaci6n de un farmaco que puede ser usado como un antibi6tico.

Los peptidos se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas de forma individual. Alternativamente, con el prop6sito de mejorar la farmacocinetica o la biodisponibilidad sin provocar respuestas inmunitarias, se fusionan o se conjugan uno o mas peptidos con otros radicales como se describe anteriormente. Cualquier numero de peptidos individuales o constructos multimericos pueden mezclarse entre si para formar una unica composici6n.

Una composici6n farmaceutica de la invenci6n comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas peptidos tal como se describe en la presente memoria. Una vez formuladas, las composiciones farmaceuticas se pueden administrar directamente al sujeto en un metodo de tratamiento de una infecci6n microbiana (bacteriana, en particular), que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente eficaz de la composici6n.

Las composiciones descritas en la presente memoria estan disenadas para tratar las infecciones por la bacteria u hongo seleccionados de un mamifero infectado, p. ej., un ser humano. Al menos uno, o alternativamente, varios de los peptidos o constructos multimericos descritos en la presente memoria se pueden formular en una composici6n antimicrobiana (en particular anti-bacteriana o anti-fungica) con un portador farmaceuticamente aceptable y otros componentes opcionales. Para el uso en tales composiciones, el peptido seleccionado puede ser producido preferiblemente sinteticamente, pero tambien recombinantemente, como se describe anteriormente.

La liberaci6n directa de las composiciones generalmente se realizara mediante la aplicaci6n t6pica u otras formas de administraci6n, ya sea por via oral, parenteral, subcutanea, sublingual, intralesional, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, por via pulmonar, o se libera en el espacio intersticial de un tejido.

La composici6n farmaceutica tambien puede comprender un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable adecuado y puede estar en forma de una capsula, comprimido, pastilla, gragea, pildora, gota, supositorio, polvo, aerosol, vacuna, unguento, pasta, crema, inhalantes, parche, aerosol, y similares. Como portador farmaceuticamente aceptable, se puede utilizar cualquier disolvente, diluyente u otro vehiculo liquido, coadyuvante de dispersi6n o suspensi6n, agente tensioactivo, agente isot6nico, agente espesante o emulsionante, conservante, agente de encapsulaci6n, aglutinante s6lido o lubricante que sea el mas adecuado para una determinada forma de dosificaci6n y que sea compatible con el peptido, los peptidomimeticos (derivado de peptido), producto conjugado de peptido o producto conjugado de peptidomimetico.

La composici6n farmaceutica contiene por lo tanto preferiblemente un portador farmaceuticamente aceptable. El termino quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; incluye tambien un portador para la administraci6n de un agente terapeutico, tal como anticuerpos o un polipeptido, genes, y otros agentes terapeuticos. El termino hace referencia a cualquier portador farmaceutico que no induzca por si mismo la producci6n de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composici6n, y que se pueda administrar sin toxicidad indebida. Los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados pueden ser macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteinas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglic6licos, aminoacidos polimericos, copolimeros de aminoacidos, y particulas de virus inactivos. Tales portadores son bien conocidos por los expertos normales en la tecnica.

Las sales de peptidos o los equivalentes funcionales se preparan por medio de metodos conocidos, que implican tipicamente la mezcla del peptido o peptidomimetico o el producto conjugado de peptido o el producto conjugado de peptidomimetico con un acido farmaceuticamente aceptable para formar una sal de adici6n de acido, o con un alcali farmaceuticamente aceptable para formar una sal de adici6n de alcali. Que un acido o una base sea farmaceuticamente aceptable puede ser facilmente decidido por un experto en la tecnica despues de considerar el uso especifico previsto del compuesto. Por ejemplo, no todos los acidos y alcalis que son aceptables para aplicaciones ex vivo se pueden utilizar para composiciones terapeuticas. Dependiendo del uso pretendido, los acidos farmaceuticamente aceptables incluyen acidos organicos e inorganicos tales como acido f6rmico, acido acetico, acido propi6nico, acido lactico, acido glic6lico, acido oxalico, acido piruvico, acido succinico, acido maleico, acido mal6nico, acido cinamico, sulfurico acido, acido clorhidrico, acido bromhidrico, acido nitrico, acido percl6rico, acido fosf6rico, y acido tiocianico, que forman sales de amonio con grupos amino libres de peptidos y equivalentes funcionales. Los alcalis farmaceuticamente aceptables, que forman sales carboxilato con grupos carboxilicos libres de peptidos y equivalentes funcionales, incluyen etilamina, metilamina, dimetilamina, trietilamina, isopropilamina, diisopropilamina y otras mono-, di-y tri-alquilaminas, asi como arilaminas. Por otra parte, tambien se incluyen los solvatos farmaceuticamente aceptables.

Se pueden utilizar sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, sales de acidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares; y sales de acidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Una discusi6n a fondo sobre los receptores farmaceuticamente aceptables esta disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J., 1991).

Los portadores farmaceuticamente aceptables en las composiciones terapeuticas pueden contener liquidos tales como agua, soluci6n salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales vehiculos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH, y similares. Tipicamente, las composiciones terapeuticas se preparan en forma de inyectables, ya sea como disoluciones o suspensiones liquidas; tambien se pueden preparar formas s6lidas adecuadas para la disoluci6n, o suspensi6n, en

vehiculos liquidos antes de la inyecci6n. Los liposomas se incluyen dentro de la definici6n de portador farmaceuticamente aceptable.

Para el tratamiento terapeutico se pueden producir peptidos, derivados de peptidos, productos conjugados de peptidos o productos conjugados de derivados de peptidos como se describi6 anteriormente y aplicarlos al sujeto que lo necesite. El peptido, derivado de peptido, producto conjugado de peptido, o producto conjugado de derivado de peptido se pueden administrar a un sujeto por cualquier ruta adecuada, preferiblemente en forma de una composici6n farmaceutica adaptada a tal ruta, y en una dosis que es eficaz para el tratamiento pretendido.

Las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria pueden contener otros agentes activos, tales como los antibi6ticos convencionales (como p. ej., vancomicina, estreptomicina, tetraciclina, penicilina) u otros compuestos antimicrobianos, tales como antifungicos, p. ej., itraconazol o miconazol. Tambien se pueden anadir compuestos que alivian otros sintomas de infecci6n, tales como fiebre (p. ej., acido salicilico), o erupciones en la piel.

Junto al uso terapeutico para el tratamiento de infecciones, tambien en la guerra biol6gica, es posible asimismo utilizar los peptidos descritos en la presente memoria en un agente de desinfecci6n o limpieza (p. ej., una composici6n bactericida), que puede ser utilizada para desinfectar o limpiar superficies y/o equipamiento. Otro campo de aplicaci6n es en el embalaje, en donde los peptidos se pueden vincular a o embeber en material de envasado o como un agente para la conservaci6n de otro material que es facilmente degradable por los microorganismos. Los peptidos son especificamente utilizables para el envasado de alimentos, ya que no son t6xicos al entrar en contacto o despues de la ingesti6n.

Otra parte de la invenci6n proporciona un metodo de tratamiento de una infecci6n microbiana (en particular, bacteriana o fungica) en mamiferos, que comprende administrar a un mamifero que tiene dicha infecci6n una cantidad antimicrobiana eficaz de una composici6n farmaceutica descrita en la presente memoria.

El termino quot;cantidad terapeuticamente eficazquot; segun se utiliza en la presente memoria hace referencia a una cantidad de un agente terapeutico, que es un peptido, peptidomimetico, producto conjugado de peptido o producto conjugado de peptidomimetico de acuerdo con la presente invenci6n, para reducir o prevenir el crecimiento y colonizaci6n de bacterias, o para mostrar un efecto terapeutico o profilactico detectable. El efecto puede detectarse, por ejemplo, por medio del cultivo de biopsias y el analisis de la actividad bacteriana o por cualquier otro metodo adecuado para evaluar el progreso o la gravedad de la infecci6n bacteriana. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependera del tamano y estado de salud del sujeto, de la naturaleza y el grado de la afecci6n, y del agente terapeutico o combinaci6n de agentes terapeuticos seleccionados para la administraci6n. Especificamente, las composiciones de la presente invenci6n se pueden utilizar para reducir o prevenir la infecci6n bacteriana y/o las manifestaciones biol6gicas o fisicas que la acompanan, tales como la reducci6n de la fiebre. Los metodos que permiten al clinico establecer las dosis iniciales son conocidos en la tecnica. Las dosis determinadas que se vayan a administrar deben ser seguras y eficaces.

La cantidad de proteinas, peptidos o secuencias de acidos nucleicos descrita en la presente memoria presente en cada dosis antibacteriana eficaz se selecciona con respecto a la consideraci6n del pat6geno causante de la infecci6n, la gravedad de la infecci6n, la edad, el peso, el sexo, el estado fisico general del paciente y similares. La cantidad de componente activo requerida para inducir un efecto anti-bacteriano o anti-fungico eficaz sin efectos secundarios adversos significativos varia dependiendo de la composici6n farmaceutica empleada y de la presencia opcional de otros componentes, p. ej., antibi6ticos, antifungicos y similares. Para los prop6sitos de la presente invenci6n, una dosis eficaz sera de aproximadamente 0,01 1g/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0,5 1g/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peptido, peptidomimetico, producto conjugado de peptido, o producto conjugado de peptidomimetico en el individuo al que se administra.

Las dosis iniciales de los peptidos, peptidomimeticos, multimeros, o productos conjugados de peptidos, producto conjugados de peptidomimeticos descritos en la presente memoria estan opcionalmente seguidas de una administraci6n repetida. La frecuencia de la dosificaci6n depende de los factores identificados mas arriba, y oscila preferiblemente de 1 a 6 dosis por dia para una duraci6n de aproximadamente 3 dias a un maximo de aproximadamente 1 semana.

Sin embargo, en otra realizaci6n alternativa, el peptido o peptidomimetico o producto conjugado de peptido o producto conjugado de peptidomimetico o composici6n de la invenci6n se administran a partir de una matriz de liberaci6n controlada o sostenida insertada en el organismo del sujeto.

En una realizaci6n, un compuesto descrito en la presente memoria se administra en una forma de dosificaci6n transmucosa. Esta via de administraci6n es no invasiva y agradable para el paciente y, al mismo tiempo conduce probablemente a una biodisponibilidad mejorada del compuesto en comparaci6n con la administraci6n oral, especialmente si el compuesto no es estable en los fluidos del sistema digestivo, o si es demasiado grande para ser absorbido eficazmente desde el intestino. La administraci6n transmucosa es posible, por ejemplo, a traves de formas de dosificaci6n nasales, bucales, sublinguales, gingivales, o vaginales. Estas formas de dosificaci6n se pueden preparar mediante tecnicas conocidas; se pueden formular para que representen gotas o pulverizadores nasales,

insertos, peliculas, parches, geles, pomadas o comprimidos. Preferiblemente, los excipientes usados para una forma de dosificaci6n transmucosa incluyen una o mas sustancias que proporcionan mucoadherencia, prolongando de ese modo el tiempo de contacto de la forma de dosificaci6n con el sitio de absorci6n y por lo tanto aumentando potencialmente el grado de absorci6n.

En una realizaci6n adicional, los compuestos se administran a traves de la ruta pulmonar, usando un inhalador de dosis medidas, un nebulizador, un pulverizador de aerosol, o un inhalador de polvo seco. Las formulaciones adecuadas se pueden preparar por medio de metodos y tecnicas conocidos. La administraci6n transdermica, rectal, u ocular tambien puede ser factible en algunos casos.

Puede ser ventajoso el uso de la liberaci6n anticipada de farmacos o de metodos de redireccionamiento para liberar un compuesto de la invenci6n con mayor eficacia. Por ejemplo, si se elige una via de administraci6n no parenteral, una forma de dosificaci6n apropiada puede contener un agente potenciador de la biodisponibilidad, que puede ser cualquier sustancia o mezcla de sustancias que aumenta la disponibilidad del compuesto. Esto se logra, por ejemplo, por medio de la protecci6n del compuesto de la degradaci6n, tal como mediante un inhibidor enzimatico o un antioxidante. Mas preferiblemente, el agente potenciador aumenta la biodisponibilidad del compuesto mediante el aumento de la permeabilidad de la barrera de absorci6n, que es tipicamente una mucosa. Los potenciadores de la penetraci6n pueden actuar a traves de diversos mecanismos; algunos aumentan la fluidez de las membranas mucosas, mientras que otros abren o ensanchan los espacios intersticiales entre las celulas de la mucosa. Otros reducen la viscosidad del moco que cubre la capa de celulas de la mucosa. Entre los potenciadores de la biodisponibilidad preferidos estan las sustancias anfifilas tales como derivados de acido c6lico, fosfolipidos, etanol, acidos grasos, acido oleico, derivados de acidos grasos, EDTA, carb6meros, policarb6filo y quitosano.

Las indicaciones para las cuales se pueden utilizar los peptidos, productos conjugados, o multimeros descritos en la presente memoria son las infecciones bacterianas por bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas, tales como Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Errinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Haemophilus influenzae.

Otro objeto de la invenci6n es el uso de un peptido o un multimero como se describe en la presente memoria en la investigaci6n biotecnol6gica o farmaceutica o en un analisis de escrutinio, en particular, para identificar un compuesto, que tiene un potencial efecto bactericida o antifungico.

En este sentido, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto, que tiene un potencial efecto antibacterano o antifungico, que comprende:

(i) realizar un analisis competitivo con:

(a)

un microorganismo susceptible a un peptido o multimero como se describe en la presente memoria,

(b)

un peptido o multimero como se describe en la presente memoria,

(c)

al menos un compuesto que se va a someter a ensayo;

mediante la exposici6n de (a) a (b) y (c); y

(ii) seleccionar un compuesto de ensayo que desplaza competitivamente la uni6n del peptido o multimero al microorganismo.

Este metodo de escrutinio identifica compuestos de ensayo que compiten con los peptidos, o composiciones multimericas de esta invenci6n para la uni6n al receptor desconocido en el pat6geno. Por lo tanto pequenas moleculas que se unen especificamente al mismo sitio elegido como diana por el peptido se pueden identificar de manera efectiva en un escrutinio de alto rendimiento. De este modo, los compuestos de ensayo poseen muy probablemente el mismo modo de acci6n que la secuencia del peptido original y por lo tanto seran activos tambien contra los microbios multirresistentes eliminados por la apidaecina o uno de sus analogos descritos en esta invenci6n.

Este metodo de escrutinio se lleva a cabo por medios conocidos, utilizando sin embargo al menos un peptido o derivado de peptido o multimero de acuerdo con la invenci6n. En una realizaci6n, el peptido o multimero esta marcado con un marcador fluorescente, radiactivo o de otro tipo y la uni6n del peptido o derivado de peptido o multimero marcado al microorganismo se detecta y se compara en presencia o ausencia de la sustancia o las sustancias que se van a someter a ensayo.

Preferiblemente, despues de eso, los compuestos de ensayo, que compiten con los peptidos o constructos multimericos por la uni6n al receptor se identifican y se escrutan para uso antibacteriano o antifungico.

En una realizaci6n, se utiliza el metodo de complementaci6n bimolecular de fluorescencia (BIFC) en el analisis competitivo. Este metodo permite la visualizaci6n directa de las interacciones de las proteinas intracelulares, que se

ejemplific6 para la interacci6n del dominio SH3 de la c-Abl tirosina quinasa con dianas tanto naturales como disenadas en E. coli [38]. El analisis es lo suficientemente sensible para permitir la detecci6n de las interacciones entre las proteinas que son escasamente expresadas en bacterias. Se basa en la asociaci6n de dos fragmentos de la proteina amarilla fluorescente funcional (YFP) despues de que el dominio SH3 se una a su companero. Una vez que estas dos proteinas se unen entre si, los dos fragmentos de YFP forman un complejo muy similar a la estructura de la proteina nativa. Esto puede ser controlado por la fluorescencia obtenida del complejo YFP, ya que los fragmentos individuales no muestran ninguna actividad de fluorescencia. Se puede disenar un constructo similar para el escrutinio de compuestos que compiten con los peptidos y derivados de peptidos descritos en esta invenci6n. Un escrutinio de alto rendimiento puede ser facilmente adaptado a placas de microtitulaci6n de 386 pocillos por un experto en la tecnica.

En otra realizaci6n se emplean los peptidos en un metodo de analisis competitivo adecuado con los compuestos de ensayo para evaluar la capacidad del compuesto de ensayo para desplazar competitivamente el peptido de la uni6n a su receptor actualmente desconocido en el pat6geno. Cuando se desea, y dependiendo del analisis seleccionado, un microorganismo (por ejemplo, bacteria, virus u hongo) al que se sabe que se unen el peptido o los peptidos seleccionados, por ejemplo, cepas de E. coli o K. pneumoniae, se puede inmovilizar directamente o indirectamente sobre una superficie adecuada, p. ej., en un formato ELISA. Tales superficies de inmovilizaci6n son bien conocidas. Por ejemplo, se puede utilizar una cuenta inerte. Adicionalmente, el ligando puede estar unido a una placa de 96 pocillos. Despues de eso, se exponen cantidades seleccionadas de los compuestos de ensayo y los peptidos de esta invenci6n al microorganismo inmovilizado y aquellos compuestos de ensayo seleccionados que pueden competir con los peptidos por la uni6n al microorganismo inmovilizado. Una vez que se identifican los compuestos de ensayo, que compiten con los peptidos por la uni6n al receptor sobre las bacterias o los hongos, estos se pueden escrutar adicionalmente para determinar las actividades antibacterianas o anti-fungicas en los metodos descritos en los ejemplos a continuaci6n.

En otro aspecto mas, la invenci6n proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica un peptido o multimero como se describe en la presente memoria. El acido nucleico codifica el peptido antibacteriano o anti-fungico o las composiciones multimericas de la invenci6n en asociaci6n operativa con una secuencia reguladora que dirige la expresi6n del mismo en una celula anfitriona. En otro aspecto mas, la invenci6n proporciona una celula anfitriona transfectada o transformada con la molecula de acido nucleico descrita anteriormente.

Ejemplo 1: Sintesis de peptidos en fase s6lida

Todos los peptidos y derivados de peptidos se sintetizaron mediante sintesis peptidica en fase s6lida convencional usando la estrategia Fmoc/tBu [39]. Los derivados de aminoacidos fueron de MultiSynTech GmbH (Witten, Alemania). Los peptidos y derivados de peptidos con un extremo C (grupo COOH) libre se sintetizaron sobre resina de Wang con una base de poliestireno (capacidad de carga 1,33 mmoles/g) de Merck Biosciences (Schwalbach, Alemania). Los peptidos y derivados de peptidos con una amida C-terminal (grupo -CONH2) fueron sintetizados sobre resina de 4-metilbenzhidrilamina con una base de poliestireno (MBHA) (capacidad de carga 0,64 mmoles/g) de Merck Biosciences. Los peptidos y derivados de peptidos se sintetizaron en un sintetizador de peptidos multiple Syro2000 (MultiSynTech GmbH) utilizando cuatro equivalentes del derivado de aminoacido activado con 2-(1-Hbenzotriazol-1-il)tetrametiluronio (HBTU; MultiSynTech GmbH) y N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA; (Fluka, Buchs, Suiza) en dimetilformamida (DMF; Biosolve V. B., Valkenswaard, Paises Bajos). Los grupos protectores de las cadenas laterales fueron trifenilmetilo (tritilo) para Asn, His, y Gln, eter terc-butilico para Tyr, Ser, y Thr, ester tercbutilico para Asp y Glu, N-omega-2, 2,4,6,8-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo para Arg y �Har, y terc-Butiloxicarbonilo para Lys y Orn. El grupo protector de Fmoc temporal se escindi6 con piperidina al 40% en DMF (v/v) durante 3 min y de nuevo con piperidina al 40% de nueva aportaci6n en DMF (v/v) durante 10 min.

Los extremos N de los peptidos o derivados de peptidos fueron acetilados con diez equivalentes de acido acetico activado con HBTU y DIPEA en DMF, como se describe anteriormente para los derivados de aminoacidos con Fmoc. La guanidaci6n de los extremos N de los peptidos o derivados de peptidos se realiz6 con diez equivalentes de HBTU y DIPEA en DMF, como describen Gausepohl et al. [40].

Una vez completada la sintesis de los peptidos o derivados de peptidos, las resinas se lavaron a fondo con DMF y DCM y se secaron al vacio. Los peptidos unidos a la resina se escindieron del soporte s6lido y al mismo tiempo se desprotegieron las cadenas laterales con una mezcla de agua al 5%, m-cresol al 4%, tioanisol al 5% y etanoditiol al 2% (en vol.) en acido trifluoroacetico (TFA) a temperatura ambiente durante 4 h. Los peptidos o derivados de peptidos se precipitaron con eter dietilico frio y se centrifugaron a 3.000 G. El sedimento se lav6 dos veces con eter frio, se sec6 y se disolvi6 en TFA acuoso al 0,1% (calidad de espectroscopia UV, Fluka). Las muestras se almacenaron a -20quot;C.

Los peptidos y derivados de peptidos metilados C-terminalmente, es decir, que contienen un ester metilico (CO-OMe) o propilico (CO-OPr), se sintetizaron en resina AM con acido 4-hidroximetilbenzoico (resina HMBA-AM, capacidad de carga de 1,1 mmoles/g, Novabiochem, Merck-Biosciences, Darmstadt, Alemania). El primer aminoacido se acopl6 manualmente a la resina como un anhidrido simetrico utilizando 10 eq. del derivado de aminoacido Fmoc, 5 eq. de diisopropilcarbodiimida (DIC), y 0,1 eq. de N,N-dimetil-4-aminopiridina en DCM. La

capacidad de carga se determin6 en un analisis de fulveno-piperidina escindiendo el grupo Fmoc con piperidina al 50% en DMF durante 1 h, basandose en la absorci6n registrada a 301 nm [41]. Las capacidades de carga tipicas fueron de aproximadamente 0,8 mmoles/g. La sintesis automatica se realiz6 como se ha descrito anteriormente. Una vez completada la sintesis del peptido, la resina HMBA-AM con el peptido se lav6 cuidadosamente con DMF y DCM y se sec6 a vacio. Los grupos protectores de los peptidos unidos a la resina se escindieron con agua al 5%, m-cresol al 4%, tioanisol al 5% y etanoditiol al 2% (en vol.) en acido trifluoroacetico (TFA) a temperatura ambiente durante 4 h. La resina se lav6 con TFA y DMF. La resina se embebi6 en DMF y el peptido o derivado de peptido se escindi6 de la resina con DIPEA/MeOH/DMF (1:5:5 en volumen; 50 mL de disoluci6n por g de resina) para obtener el ester metilico C-terminal. Para obtener el ester propilico C-terminal, el peptido o derivado de peptido se sintetizaron sobre resina AM con 4-sulfamilbutirilo (capacidad de carga 1,1 mmoles/g, Novabiochem, Merck-Biosciences, Darmstadt, Alemania) y se escindieron con 50 eq. de propilamina en DMF despues de la activaci6n con trimetilsilildiazometano en THF. Los disolventes se eliminaron a vacio, los peptidos (o derivados de peptidos) se precipitaron con eter dietilico frio y se centrifugaron a 3.000 G. El sedimento se lav6 dos veces con eter frio, se sec6 y se disolvi6 en TFA acuoso al 0,1% (calidad espectroscopia de UV, Fluka ). Las muestras se almacenaron a -20quot;C. Para obtener derivados de peptidos dimericos, se acopl6 Fmoc2-DAB a la resina. Despues de la escisi6n de los grupos protectores Fmoc, se obtuvieron dos extremos N libres y se sintetizaron los derivados de peptidos como se ha descrito anteriormente. Los derivados de peptidos con PEG3000 se sintetizaron mediante la activaci6n de PEG3000-OH con HBTU y DIPEA en DMF y el acoplamiento al extremo N del peptido o derivados de peptido, como se describi6 anteriormente para los derivados de aminoacidos con Fmoc.

Los peptidos brutos y derivados de peptidos se purificaron en un Sistema de HPLC Akta (Amersham Bioscience GmbH, Freiburg, Alemania) utilizando una columna C18 Jupiter (20 mm x 250 mm, Phenomenex Inc., Torrance, EE.UU.). La eluci6n se realiz6 por medio de un gradiente lineal de acetonitrilo, tipicamente partiendo de acetonitrilo acuoso al 5%, con un aumento de acetonitrilo al 1% por minuto en presencia de TFA al 0,1% como reactivo de par i6nico. La velocidad de flujo fue de 10 ml/min y los peptidos se detectaron por absorci6n a 220 nm. La pureza de los peptidos se determin6 mediante RP-HPLC analitica usando una columna C18 Jupiter (4,6 mm x 150 mm, Phenomenex Inc., Torrance, EE.UU.) y espectrometria de masas con analizador de tiempo de vuelo y desorci6n/ionizaci6n mediante laser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS; analizador prote6mico 4700, Applied Biosystems GmbH, Darmstadt, Alemania).

Se sintetizaron los siguientes peptidos representados en la tabla 2:

Tabla 2

SEC ID NO

Sintesis No. Nombre Secuencia

1

A24 C3 Apidaecina 1a acido GNNRPVYIPQPRPPHPRI-OH

2

A24 C4 Apidaecina 1b acido GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH

3

A17 A3 ac. Api 1a Amida ac. Ac-GNNRPVYIPQPRPPHPRI-NH2

4

A17 A3 Api 1a Amida GNNRPVYIPQPRPPHPRI-NH2

5

A17 A6 ac. Api 1b Amida ac. Ac-GNNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

6

A17 A6 Api 1b Amida GNNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

7

A18 G5 ac. Api 1b 01 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

8

A18 G5 Api 1b O1 ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

9

A17 A4 Api 1a, O10 GNNRPVYIPOPRPPHPRI-NH2

10

A21 E5 Api.1b K4 R10 V19 GNNKPVYIPRPRPPHPRLV-OH

11

A18 B4 Api 1b O10 Hyp 11 GNNRPVYIPO-4tHyp-RPPHPRL-NH2

12

A20 B1 Api 1b O1 O10 ONNRPVYIPOPRPPHPRL-NH2

13

A20 B1 ac. Api 1b O1 O10 ac. Ac-ONNRPVYIPOPRPPHPRL-NH2

14

A14 B3 Api 1a R10 GNNRPVYIPRPRPPHPRI-NH2

15

A17 B3 Api 1a R 10 Hyp 11 GNNRPVYIPR-4tHyp-RPPHPRI-NH2

16

A17 B5 Api 1a O1 R10 ONNRPVYIPRPRPPHPRI-NH2

17

A14 B4 Api 1a K10 GNNRPVYIPKPRPPHPRI-NH2

18

A17 B5 ac. Api 1a R10 O1 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRI-NH2

SEC ID NO

Sintesis No. Nombre Secuencia

19

A14 D1 Api 1a, Hyp5 GNNR-4tHyp-VYIPQPRPPHPRI-NH2

20

A17 B2 Api 1b R10 Hyp11 GNNRPVYIPR-4tHyp-RPPHPRL-NH2

21

A24 Cl Api 1b K1 K10 KNNRPVYIPKPRPPHPRL-NH2

22

A24 C1 ac. Api 1b K1 K10, ac. Ac-KNNRPVYIPKPRPPHPRL-NH2

23

A21 A5 Api O1 R10 PIRV ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-OH

24

A21 A5 ac. Api O1 R10, PIRV, ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-OH

25

A5 A20 Api 1b V19 R10 GNNRPVYIPRPRPPHPRLV-NH2

26

A14 B5 Api 1a, L8 GNNRPVYLPQPRPPHPRI-NH2

27

A24 A1 Api O1 R10 PIRV ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-NH2

28

A24 A1 ac. Api O1 R10 PIRV ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-NH2

29

A21 B3 Api 1b O1 V19 acido ONNRPVYIPQPRPPHPRLV-OH

30

A21 B3 ac. Api 1b O1 V19 acido ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRLV-OH

31

A21 A6 Api 1b V19 R10 acido GNNRPVYIPRPRPPHPRLV-OH

32

A25 D5 Orn ac. Api MeLeu18 O1 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-MeLeu-NH2

33

A25 D5 Gly Api MeLeu18 GNNRPVYIPQPRPPHPR-MeLeu-NH2

34

A26 C2 Api MeLeu18 R10 GNNRPVYIPRPRPPHPR-MeLeu-NH2

35

A26 C5 Orn Api Cha18 O10 O1 ONNRPVYIPOPRPPHPR-Cha-NH2

36

A26 C3 Orn ac. Api MeLeu R10 O1 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPR-MeLeu-NH2

37

A26 C4 Api Cha18 R10 GNNRPVYIPRPRPPHPR-Cha-NH2

38

A18 G6 Api 1b O1 R10 ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

39

A18 G6 ac. Api 1b O1 R10 ac. CA-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

40

A26 B2 ac. Api 1b R10 Hyp11 O1 ac. Ac-ONNRPVYIPR-4tHyp-RPPHPRL-NH2

41

A26 ac B4. Api F18 O1 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRF-NH2

42

A26 B4 Api F18 O1 ONNRPVYIPQPRPPHPRF-NH2

43

A26 B5 Api 1b sin R17 GNNRPVYIPQPRPPHPL-NH2

44

A26 B3 Api F18 GNNRPVYIPQPRPPHPRF-NH2

45

A26 B2 Api 1b O1 R10 Hyp11 ONNRPVYIPR-4tHyp-RPPHPRL-NH2

46

A26 C5 Orn ac. Api Cha18 O10 O1 ac. Ac-ONNRPVYIPOPRPPHPR-Cha-NH2

47

A26 C3 Orn Api MeLeu O1 R10 ONNRPVYIPRPRPPHPR-MeLeu-NH2

48

A27 B6 ac. Api 1b met. O1 R10 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-OMe

49

A27 B5 ac. Api. 1b met O1 O10 ac. Ac-ONNRPVYIPOPRPPHPRL-OMe

50

A27 ac B4. Api 1b met O1 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-OMe

51

A14 C3 Api 1a K15 GNNRPVYIPQPRPPKPRI-NH2

52

A14 C4 Api K15 P18 GNNRPVYIPQPRPPKPRP-NH2

53

A14 C5 Api R15 GNNRPVYIPQPRPPRPRI-NH2

54

A14 A5 Api I18 -PI GNNRPVYIPQPRPPHPRPI-NH2

55

A14 B6 Api L8, R10 GNNRPVYLPRPRPPHPRI-NH2

56

A14 C1 Api L8, K10 GNNRPVYLPKPRPPHPRI-NH2

SEC ID NO

Sintesis No. Nombre Secuencia

57

A14 D2 Api 1a Hyp9 GNNRPVYI-4tHyp-QPRPPHPRI-NH2

58

A14 D3 Api 1a Hyp11 GNNRPVYIPQ-4tHyp-RPPHPRI-NH2

59

A14 D4 Api 1a Hyp13 GNNRPVYIPQPR-4tHyp-PHPRI-NH2

60

A14 D5 Api 1a Hyp14 GNNRPVYIPQPRP-4tHyp-HPRI-NH2

61

A14 D6 Api 1a Hyp16 GNNRPVYIPQPRPPH-4tHyp-RI-NH2

62

A18 A1 Api 1a O1 ONNRPVYIPQPRPPHPRI-NH2

63

A18 A1 ac. Api 1a O1 Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRI-NH2

64

A18 A2 Api 1a O1 R10 ONNRPVYIPRPRPPHPRI-NH2

65

A18 A2 ac. Api 1a O1 R10 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRI-NH2

66

A18 A5 Api. 1b R10 GNNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

67

A18 A5 ac. Api. 1b R10 aceti. Ac-GNNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

68

A18 B1 Api 1b K4 R10 V19 GNNKPVYIPRPRPPHPRLV-NH2

69

A20 B4 Api. 1b V19, R10 GNNRPVYIPRPRPPHPRLV-OH

70

A21 A6 Api. I18 --gt; PIRV GNNRPVYIPQPRPPHPRPIRV-OH

71

A25 D3 Orn Api. O1, Cha18, ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-Cha-NH2

72

A25 D4 Orn Api O1 D-Leu18 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-(D-Leu)-NH2

73

A25 D6 Orn Api O1 tercGly18 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-tertGly-NH2

74

A25 E1 Orn Api O1 [Ala18 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-[Ala-NH2

75

A25 E2 Orn Api O1 Chex18 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-Chex-NH2

76

A25 D3 Gly Api Cha18 ac. GNNRPVYIPQPRPPHPR-Cha-NH2

77

A25 D4 Gly Api D-Leu18 ac. GNNRPVYIPQPRPPHPR-(D-Leu)-NH2

78

A25 D6 Gly Api tercGly18 ac. GNNRPVYIPQPRPPHPR-tertGly-NH2

79

A25 E1 Gly Api [Ala18 ac GNNRPVYIPQPRPPHPR-[Ala-NH2

80

A25 E2 Gly Api Chex18 ac. GNNRPVYIPQPRPPHPR-Chex-NH2

81

A29 C1 Api 1b O1 R10 O17 ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2

82

A29 C1 ac. Api 1b O1 R10 O17 ac Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2

83

A29 C4 ac. Api. 1b O1 R10 Dab-Dimero (Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB

84

A29 C5 FA Formil Api 1b For-GNNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

85

A29 C5 guan Api 1b N-guan. Guan-GNNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

86

A28 A3 Api O1 R10 PIRV Amida ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-NH2

87

A28 A3 ac. Api O1 R10 PIRV Amida ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-NH2

88

A30 C1 guan Api O1 R10 guan. Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

89

A17 A5 Api Cit10 GNNRPVYIP-Cit-PRPPHPRI-NH2

90

A17 B1 Api 1a R10 Hyp11 GNNRPVYIPR-4tHyp-RPPHPRI-NH2

91

A17 B4 Api 1a Cit 10 Hyp11 GNNRPVYIP-Cit-4tHyp-RPPHPRI-NH2

92

A17 C1 Api 1a acortado NNRPVYIPQPRPPHPRI-NH2

93

A14 C6 Api P15 P18 GNNRPVYIPQPRPPPPRP-NH2

94

A14 A6 Api.1a K15 I18 -PI GNNRPVYIPQPRPPKPRPI-NH2

SEC ID NO

Sintesis No. Nombre Secuencia

95

A18-A6 Api 1b K4 GNNKPVYIPQPRPPHPRL-NH2

96

A18 B2 Api 1b S3 V19 GNSRPVYIPQPRPPHPRLV-NH2

97

A18 B3 Api 1b S3 R10 K4 GNSKPVYIPRPRPPHPRL-NH2

98

A18 F4 Api 1a [-Homoarg10 GNNRPVYIP-[Har-PRPPHPRI-NH2

99

A18 F5 Api 1b [-Homoarg10 GNNRPVYIP-[Har-PRPPHPRL-NH2

100

A19 C4 Api 1b K4 R10 GNNKPVYIPRPRPPHPRL-NH2

101

A19 C5 Api S3 1b GNSRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

102

A6 A20 Api 1b O1 O10 Hyp11 ONNRPVYIPO-4tHyp-RPPHPRL-NH2

103

A20 A6 ac. Api 1b O1 O10 Hyp11 ac Ac-ONNRPVYIPO-4t-Hyp-RPPHPRL-NH2

104

A20 B2 Api 1b O10 Hyp11 GNNRPVYIPO-4tHyp-RPPHPRL-NH2

105

A20 B3 Api. 1b O1 Hyp11 ONNRPVYIPQ-4tHyp-RPPHPRL-NH2

106

A20 B3 ac. Api 1b O1 Hyp11 ac. Ac-ONNRPVYIPQ-4tHyp-RPPHPRL-NH2

107

A21 E4 Api V18 GNNRPVYIPQPRPPHPRV-NH2

108

A21 E6 Api V18 GNNRPVYIPQPRPPHPRV-OH

109

A24 A2 Api PIPP Amida GNNRPVYIPQPRPPHPRPIPP-NH2

110

A24 A3 Api pIRV Amida GNNRPVYIPQPRPPHPRPIRV-NH2

111

A24 B5 Api 1b, P17 Amida GNNRPVYIPQPRPPHPPL-NH2

112

A24 B6 Api 1b O1 O10 P17 Amida ONNRPVYIPOPRPPHPPL-NH2

113

A24 B6 ac. Api 1b O1 O10 P17 amida ac. Ac-ONNRPVYIPOPRPPHPPL-NH2

114

A24 C2 Api Y18 GNNRPVYIPQPRPPHPRY-NH2

115

A24 C5 Api sin 18 GNNRPVYIPQPRPPHPR-NH2

116

A27 B1 ac. Api O1 ac. I18 met. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRI-OMe

117

A27 B2 ac. Api O1 ac. O10 I18 met. Ac-ONNRPVYIPOPRPPHPRI-OMe

118

A27 B3 ac. Api O1 ac. R10 I18 met. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRI-OMe

119

A29 C4 Api O1 R10 Api.1b Dab-Dimero (ONNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB

120

A30 C3 guan. Api O1 guan. Guan-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2

121

A30 C6 ac. Api 1b [-Homoarg17 ONNRPVYIPQPRPPHP-Har-L-NH2

122

A32 C1 Api 1b, R10, Dimero (GNNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB

123

A32 C1 guan. Api 1b, R10 guan, Dimero (Guan-GNNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB

124

A32 C2 ac. Api 1b O1 R10 Dimero (Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB

125

A32 C2 guan Api 1b O1 R10 Dimero (Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB

126

A6 A36 Api 1b O1 R10 PIRV ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-OH

127

B2 A36 ac. Api 1b Dimero, O1 R10 O17 (Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPOL)2-DAB

128

A36 B2 guan. Api 1b Dimero, O1 R10 O17 (Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPOL)2-DAB

129

A36 B3 ac. Api 1b Dimero (Ac-GNNRPVYIPQPRPPHPRL)2-DAB

130

A36 B3 guan Api 1b Dimero (Guan-GNNRPVYIPQPRPPHPRL)2-DAB

131

A36 B6 ac. Api 1b O1, R10, Har17 Ac-ONNRPVYIPRPRPPHP-Har-L-NH2

SEC ID NO

Sintesis No. Nombre Secuencia

132

A36 C1 ac. Api 1b Har17 Ac-GNNRPVYIPQPRPPHP-Har-L-NH2

133

A36 C1 guan. Api 1b Har17 Guan-GNNRPVYIPQPRPPHP-Har-L-NH2

134

A37 A1 guan. Api. 1b O1 R10 O17 guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2

135

A37 C3 PEG Api 1b O1 R10 PEG3000 PEG-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

136

A44 A4 Fl Api 1b A7, A17 GNNRPVYIAQPRPPHPAL-NH2

137

A47 A1 guan. Api 1b O1 R10 acido, guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-OH

138

A49 A1 Api 1b O1 R10 Cit17 ONNRPVYIPRPRPPHP-Cit-L-NH2

139

A49 A3 Api 1b A17 GNNRPVYIPQPRPPHPAL-NH2

140

A49 A4 Api 1b A9 GNNRPVYIAQPRPPHPRL-NH2

141

A49 A5 Api. 1b inversa LRPHPPRPQPIYVPRNNG-NH2

142

A49 A6 Api 1b, GNN acortado RPVYIPQPRPPHPRL-NH2

143

A49 B1 Api 1b E4 GNNEPVYIPQPRPPHPRL-NH2

144

A49 B2 Api 1b-L acortado GNNRPVYIPQPRPPHPR-OH

145

A49 B3 Api 1b O1 R10 Arginal17 ONNRPVYIPRPRPPHPArginal-Leu-NH2

146

A53 G5 guan. Api 1b O1 R10, Agp17 Guan-ONNRPVYIPRPRPPHP-AgP-L-NH2

147

A53 H1 guan. Api 1b O, R10 propilester, guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-OPr

148

A34 B6 ac. Api 1b Cit17 ac Ac-GNNRPVYIPQPRPPHP-Cit-L-NH2

149

A34 B6 guan. Api 1b; Cit17 guan Guan-GNNRPVYIPQPRPPHP-Cit-L-NH2

150

A34 C1 ac. Api 1b O1 R10 Cit17 Ac-ONNRPVYIPRPRPPHP-Cit-L-NH2

151

A34 C1 guan. Api 1b, O1 R10 Cit17 Guan-ONNRPVYIPRPRPPHP-Cit-L-NH2

152

A35 ac D2. Api 1b O1 R10 D-R17 Ac-ONNRPVYIPRPRPPHP-DR-L-NH2

153

A35 D4 ac. Api 1b O1 R10 Me-R17 Ac-ONNRPVYIPRPRPPHP-mer-L-NH2

154

A35 D5 ac. Api 1b O1 R10 NO2-R17 Ac-ONNRPVYIPRPRPPHP-NO2R-L-NH2

155

A38 A1 guan. Api 1b O1 R10 Har17 Guan-ONNRPVYIPRPRPPHP-Har-L-NH2

156

A57 A1 guan. Api 1b O1 R10 4tHyp 5, guan Guan-ONNR-4tHyp-VYIPRPRPPHPRL-NH2

157

A57 A2 guan. Api 1b O1 R10 4tHyp 9 guan Guan-ONNRPVYI-4tHyp-RPRPPHPRL-NH2

158

A57 A3 guan. Api 1b O1 R10 4tHyp 11, guan Guan-ONNRPVYIPR-4tHyp-RPPHPRL-NH2

159

A32 C5 guan Api 1b R10 guan Guan-GNNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

160

Dy675 A36 B5 Api 1b O1, R10, Dy675 N-alfa-Dy675-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

DR: D-arginina, MER = metilarginina, preferiblemente alfa-N-metilarginina (acido 5-(diaminometilidenamino)-2metilaminopentanoico), NO2R = nitroarginina, preferiblemente N(G)-nitroarginina (acido 2-amino-5-[(aminonitramidometiliden)amino]pentanoico), Cit: citrulina; Ac = acetilo, For = formilo, Guan = grupo guanido son ejemplos de extremos N modificados (grupo alfa-amino modificado del aminoacido N-terminal, Sub1 = Acetil-NH, formil-NH o guanido). AGP: acido alfa-Amino-beta-guanidinopropi6nico, Arginal: el -COOH de la arginina se sustituye por -CHO, Cha: ciclohexilalanina, Chex: acido 1-amino-ciclohexilcarb6nico, Cit: citrulina, OMe representa un ester metilico en el extremo C (Sub2 = OR3 = OMe), OPr representa un ester propilico en el extremo C (Sub2 = OR3 =O-Pr); MeLeu = N-metilleucina -una leucina con una metilaci6n en el enlace peptidico; Ac = acetilo, For = formilo, Guan = grupo guanido son ejemplos de extremos N modificados (grupo alfa-amino modificado del aminoacido N-terminal, Sub1 = Acetil-NH, formil-NH o guanido); [Ala y [Har son ejemplos de beta-aminoacidos.

Ejemplo 2: Estabilidad en suero

Los estudios de estabilidad en suero se llevaron a cabo por duplicado como describen Hoffmann et al. [42]. Brevemente, se anadieron 28 1l de una disoluci6n acuosa de peptido o peptidomimetico (0,5 mg/ml) a 0,2 ml de suero de rat6n al 25% recien reunido (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, Alemania) en agua. Las mezclas se incubaron a 37quot;C bajo agitaci6n suave. Las proteinas se precipitaron con 40 1l de TCA acuoso al 15% despues de 5 tiempos de incubaci6n de 0, 0,5, 1, 2, 4 y 6 h a 0quot;C durante 20 min antes de centrifugar (13.500 x g) a 4quot;C durante 5 min. Los sobrenadantes de todas las muestras (240 1l) se neutralizaron con 1 mol/L de NaOH acuoso e inmediatamente se almacenaron a -20quot;C. Los sobrenadantes se analizaron por medio de RP-HPLC utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo como se ha descrito anteriormente con TFA al 0,1% como reactivo de par i6nico. Las fracciones recogidas de los principales picos se analizaron adicionalmente mediante espectrometria de masas en 10 tandem (MALDI-TOF/TOF-MS, 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Alemania) en el modo reflector de ion positivo usando acido a-cianohidroxicinamico (CH3CN al 50% en TFA acuoso al 0,1%) como matriz para identificar los productos de degradaci6n de los peptidos y peptidomimeticos, es decir, metabolitos, en los diferentes momentos puntuales. Las muestras de suero de control consistieron en 200 1l de suero de rat6n al 25% reunido en agua, que tambien se hicieron precipitar con 40 1l de TCA acuoso al 15%, como se ha descrito antes. 15 Las muestras de referencia de peptidos consistieron en 28 1l de la disoluci6n de partida de peptido diluida en 0,2 ml

de agua y 40 1l de acido tricloroacetico acuoso al 15% (TCA).

Las estabilidades en suero de varios peptidos estan representadas en la tabla 3:

Tabla 3:

SEC ID NO

Peptido Secuencia Tiempo de Vida media

1

A24 C3 GNNRPVYIPQPRPPHPRI-OH 120 min

2

A24 C4 GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH 120 min

4

A17 A3 amida GNNRPVYIPQPRPPHPRI-NH2 15 min

6

A29 C2 GNNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2 15 min

7

A18 G5 ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2 15 min

8

A18 G5 ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2 30 min

12

A20 B1 ONNRPVYIPOPRPPHPRL-NH2 15 min

13

A20 B1 ac. Ac-ONNRPVYIPOPRPPHPRL-NH2 15 min

23

A21 A5 ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-OH 240 min

24

A21 A5 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRPIRV-OH 240 min

32

A25 D5 Orn ac. Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-MeLeu-NH2 gt; 360 min

81

A29 C1 Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2 120 min

82

A29 C1 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2 gt; 360 min

83

A29 C4 ac. (Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRL)2-DAB 15 min

88

A30 C1 guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2 15 min

110

A24 A3 GNNRPVYIPQPRPPHPRPIRV-NH2 360 min

131

A36 B6 ac. Ac-ONNRPVYIPRPRPPHP-Har-L-NH2 120 min

134

A37 A1 guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2 gt; 360 min

137

A47 A1 guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-OH gt; 360 min

155

A38 A1 guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHP-Har-L-NH2 gt; 360 min

Las secuencias de apidaecina nativa (tipo salvaje) SEQ ID NO. 1 y 2 estan degradadas por los dos extremos, es 20 decir, los residuos o peptidos N-terminales y C-terminales son escindidos.

De este modo, la secuencia del peptido se puede estabilizar preferiblemente en ambos extremos frente a exopeptidasas o exoproteasas, asi como endoproteasas. Un enlace susceptible a endoproteasas es especialmente el enlace entre la arginina en la posici6n 17 y la isoleucina o leucina en la posici6n 18. La degradaci6n se control6 por medio de MALDI-MS determinando las masas moleculares de los metabolitos peptidicos y el espectro de masas

25 en tandem de los peptidos correspondientes. La degradaci6n del extremo N dio lugar a secuencias acortadas en uno a tres residuos.

La acetilaci6n N-terminal (SEC ID NO: 7, 13, 24, y 32), por ejemplo, redujo esta via de degradaci6n

significativamente sin un impacto importante sobre la degradaci6n del extremo C. Por ejemplo, los peptidos Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2 (SEC ID NO: 7) y Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2 (SEC ID NO: 13) no fueron degradados N-terminalmente, si no s6lo en el extremo C escindiendo la amida de la leucina C-terminal o los dos residuos C-terminales (Fig. 1).

La guanidaci6n N-terminal es incluso superior a la acetilaci6n en la reducci6n de la degradaci6n N-terminal (SEC ID NO: 134, 137 y 155).

La Fig.1 muestra las cantidades de peptido Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2 (SEC ID NO: 7) presentes en el suero acuoso al 25% despues de 30, 60, 120, 240, y 360 minutos, asi como los dos metabolitos detectados Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPR-OH (SEC ID NO: 164 -escisi6n de la leucinamida C-terminal) y Ac-ONNRPVYIPQPRPPHP-OH (SEC ID NO: 165 -escisi6n de dos residuos C-terminales) segun lo cuantificado por las areas de los picos obtenidos mediante RP-HPLC utilizando detecci6n UV.

Del mismo modo la degradaci6n del extremo C se redujo por amidaci6n del extremo C por ejemplo, que no afect6 tampoco a la degradaci6n del extremo N. Por lo tanto, la combinaci6n de ambas modificaciones N-y C-terminales redujo significativamente la degradaci6n por exopeptidasas o exoproteasas (SEC ID NO: 7, 13 y 32). La escisi6n Cterminal de Arg-17, es decir, Arg-Leu o Arg-Ile, se redujo eficazmente por medio de la N-metilaci6n de este enlace peptidico. Preferiblemente, un peptido se estabiliza frente a las tres posibles rutas de degradaci6n como se ilustra para Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRMeLeu-NH2 (SEC ID NO: 32), que mostr6 una vida media (suero acuoso al 25%, 37quot;C) de mas de 6 horas. La misma estabilidad se obtuvo para la secuencia Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPOL-NH2 (SEC ID NO: 82) mediante la sustituci6n de Arg-17 por ornitina, puesto que la ornitina no es un sitio de escisi6n por tripsina.

Ejemplo 3: Analisis antibacterianos

1. Analisis de la zona de inhibici6n (Analisis en placa de agar)

Los peptidos y derivados de peptidos derivados de apidaecina purificados se diluyeron a una concentraci6n final de 500 1g/ml en agua. Se aplicaron alicuotas de 10 1l y controles (10 1l de agua o disoluci6n de antibi6tico) a una placa de agar sembrado con una suspensi6n de un cultivo bacteriano en fase semilogaritmica. Las placas se incubaron a 37quot;C en la oscuridad. El diametro de las zonas de inhibici6n se midi6 despues de 20 h. En general, las bacterias se hicieron crecer en caldo de cultivo de soja con tripsina anadida al 1% (TSB, Fluka, Neu-Ulm, Alemania) y agar al 1,2% (Fluka). Todas los ensayos se realizaron bajo condiciones aer6bicas.

Un barrido con alanina de la secuencia de apidaecina nativa identific6 varios residuos responsables de la actividad antimicrobiana frente a tres diferentes cepas de E. coli (Fig. 2) y K. pneumoniae (Fig. 3).

La Figura 2 muestra la actividad antibacteriana de analogos de apidaecina 1a (barrido con alanina) frente a diferentes cepas de E. coli utilizando un analisis en placa de agar.

La Fig. 3 muestra la actividad antibacteriana de analogos de apidaecina 1a (barrido con alanina) frente a la cepa ATCC 10031 de Klebsiella pneumoniae utilizando un analisis en placa de agar.

En los diagramas mostrados en la Fig. 2 y la Fig. 3, se muestra la secuencia del peptido natural apidaecina 1a GNNRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID NO. 1) en el eje de las X. Cada residuo representa el correspondiente peptido, en donde el residuo es remplazado por una alanina, p. ej. G en la posici6n 1 representa: ANNRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID NO. 166), N en la posici6n 2 representa GANRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID NO. 167), y asi sucesivamente.

La barra representa el diametro de la zona de inhibici6n. De este modo, cuanto mas alta es la barra, mas alta es la actividad antibacteriana del peptido modificado con alanina.

Con el barrido con alanina, se determinaron todas las posiciones responsables de la actividad antibacteriana en apidaecina 1. La actividad antibacteriana se redujo fuertemente si las posiciones Pro11 a Ile18, Arg4, Tyr7 y Pro9 eran remplazadas por alanina. En experimentos adicionales se remplazaron posiciones de aminoacidos especificos por otros aminoacidos similares para incrementar la actividad y la resistencia a las proteasas. En la mayor parte de los casos se obtuvo un fuerte descenso de la actividad.

Todas las cepas sometidas a ensayo de ambas bacterias mostraron una respuesta muy similar a las diferentes mutaciones en un solo sitio con Pro en la posici6n 11 y Arg en la posici6n 17 de la secuencia nativa que era obligatoria para restaurar al menos una actividad parcial.

2. Analisis de inhibici6n del crecimiento

Las concentraciones inhibidoras minimas (CIM) de los peptidos y derivados de peptidos derivados de apidaecina se determinaron por medio de un analisis de inhibici6n del crecimiento utilizando una diluci6n seriada de peptido en placas de 96 pocillos de fondo redondo esterilizadas (poliestireno, fondo en U, Greiner Bio-One GmbH) con un volumen final de 100 1L por pocillo. Las bacterias, p. ej., E. coli BL21 AI, se hicieron crecer en caldo nutriente (NB, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania) a 37quot;C durante la noche. A cada pocillo de la placa de 96 pocillos,

se le anadieron 50 1L del cultivo durante la noche ajustado con 5 x 106 UFC/mL en TSB al 1%. Los peptidos y peptidomimeticos liofilizados se disolvieron en TSB (caldo de soja con tripsina anadida) al 1% o agua para dar una concentraci6n final de 250 1g/mL. Se anadieron 50 1L de la disoluci6n de peptido o peptidomimetico al primer pocillo de una fila de la placa y se mezclaron. Se transfirieron 50 1L del primer pocillo que contenia la disoluci6n de peptido 5 al segundo pocillo, se mezclaron y de nuevo se transfirieron 50 1L al siguiente pocillo y asi sucesivamente. De ese modo, se obtuvo una serie de diluciones a la mitad que empezaba en 250 1g/mL en el primer pocillo hasta 120 ng/mL en el 12o pocillo de una fila dando una concentraci6n de peptido o peptidomimetico final de 125 1g/mL (pocillo 1) a 60 ng/mL (pocillo 12). Las placas se incubaron a 37quot;C durante 20 hrs. Se midi6 la absorbancia a 595 nm utilizando un espectr6metro de microplaca TECAN (Tecan, Alemania). Todos los peptidos y peptidomimeticos se

10 midieron por triplicado. Se utiliz6 agua esterilizada como control negativo. El valor de CIM expresa la concentraci6n mas baja a la cual no se observ6 crecimiento bacteriano despues de la incubaci6n a 37quot;C durante al menos 20 horas.

Los valores de CIM de los peptidos y derivados de peptidos sometidos a ensayo frente a bacterias de diversas bacterias resistentes a multiples farmacos se resumen en la tabla 4.

15 Se sometieron a ensayo las siguientes cepas de bacterias resistentes a multiples farmacos:

•

Eschericha coli 45849 y D31,

•

Klebsiella pneumoniae 123132 y K6,

•

Salmonella typhi S5 y Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (ATCC 700408),

•

Rhizobium radiobacter (ATCC 15955 depositada como Agrobacterium tumefaciens).

20 Tabla 4

SEQ ID NO

Sintesis Num. E. coli K. Pneumonia S. typhi E. coli K. Pneumonia S. enterica subsp. Enterica serovar. typhi R. radiobacter

45849

123132 S5 D31 K6, ATCC 700603 G10215 ATCC 700408 ATCC 15955

1

A24 C3 64 64 2

2

A24 C4 32 64

2

6

A29 C2 0,5 16 0,125 1 16 0,125 n.t.

7

A18 G5 ac. 1 16 2 4-8 64 0,5-1 lt; 0,16

8

A18 G5 lt; 0,25 1 lt; 0,5 2 16 lt; 0,25 lt; 0,16

9

A17 A4 1 8 2 16 16 0,5 lt; 0,16

11

A18 B4 1 8 lt; 0,5 8 8 lt; 0,25 lt; 0,16

12

A20 B1 1 4 lt; 0,5 4 4 lt; 0,25 0,65

13

A20 B1 ac. 2 8 lt; 0,5 4 8 lt; 0,25 lt; 0,16

14

A14 B3 64 8 2

15

A17 B3 1 4 2 64 16 2 0,33

16

A17 B5 128 32 2

17

A14 B4 8 16 16 32 32 4 a 8 0,65

20

A17 B2 1 4 lt; 0,5 32 8 0,5 0,33

21

A24 C1 lt; 0,25 4 1 8 8 0,25-0,5 0,65

22

A24 C1 ac. 1 16 1 16 16 1 lt;0,16

23

A21 A5 8 16 8 64 32 8 0,65

25

A20 A5 1 16 2 64 16 1 0,65

SEQ ID NO

Sintesis Num. E. coli K. Pneumonia S. typhi E. coli K. Pneumonia S. enterica subsp. Enterica serovar. typhi R. radiobacter

45849

123132 S5 D31 K6, ATCC 700603 G10215 ATCC 700408 ATCC 15955

26

A14 B5 16 32 32 gt; 128 128 4 2,6

32

A25 D5 Orn ac. 8 gt; 64 32 64 gt; 128 8 1,3

33

A25 D5 Gly 32 gt; 128 8

34

A26 C2 4 32 8 8 32 4 a 8 1,3

35

A26 C5 Orn 16 32 16 8 16 4 a 8 2,6

36

A26 C3 Orn ac. 4 32 16-32 8 64-128 4 a 8 1,3

37

A26 C4 16 16 16 8 32 8 10,5

38

A18 G6 0,5 2 lt; 0,5 2 4 2 1,3

39

A18 G6 ac. 1 4 lt; 0,5 4 16 4 0,33

40

A26 B2 ac. 1 4 lt; 0,5 8 16 4 0,33

41

A26 B4 ac. 4 32 8 gt; 128 128 8 5,25

43

A26 B5 gt; 128 gt; 64 gt; 64

44

A26 B3 128 64 4

45

A26 B2 1 4 lt; 0,5 8 4 2 0,65

46

A26 C5 Orn ac. 32 32-64 32 16 32-64 8 10,5

47

A26 C3 Orn 4 32 32 8 32-64 8 1,3

48

A27 B6 4 32 4 64 128 16 1,3

49

A27 B5 2 64 4 32 128 8 1,3

50

A27 B4 gt; 128 gt; 128 32

81

A29 C1 8 8 4 8 16 4 n.t.

82

A29 C1 ac. 16 8 8 32 32 8 n.t.

83

A29 C4 ac. 8 8 4 2 8 4 n.t.

84

A29 C5 guan 0,5 32 0,25 1 32 0,25 n.t.

85

A29 C5 FA 2 16 0,5 16 64 0,5 n.t.

88

A30 C1 guan 0,5 1 0,125 0,5 0,5 0,125 n.t.

120

A30 C3 guan 0,25 4 0,125 0,5 8 0,125 n.t.

121

A30 C6 guan 128 128 n.t. 16 gt; 128 n.t. n.t.

133

A37 A1 guan 16 16 16 16 16 2 n.t.

SEQ ID NO

Sintesis Num. E. coli K. Pneumonia S. typhi E. coli K. Pneumonia S. enterica subsp. Enterica serovar. typhi R. radiobacter

45849

123132 S5 D31 K6, ATCC 700603 G10215 ATCC 700408 ATCC 15955

137

A47 A1 guan lt; 1 1 lt; 1 lt; 1 4 lt; 1 n.t.

155

A38 A1 guan 4 2 4 4 4 0,5 n.t.

159

A32 C5 guan 1 4 0,25 1 4 0,25 n.t.

Los SEQ ID NO: 1, 2 son las secuencias de tipo salvaje como ejemplos de comparaci6n, los SEQ ID NO: 4, 19, 26, 32, 33, 41, 43, 44, 50, 121 y 133 son ejemplos menos preferidos de acuerdo con la invenci6n (con una Q como X4 en la posici6n 10). Los otros SEQ ID NO: mostrados, son peptidos o derivados de peptidos preferidos de acuerdo con la invenci6n. Los ejemplos mas preferidos son los SEQ ID NO: 6, 7-8, 11-13, 20-22, 25, 39, 40, 45, 65, 67, 84, 85, 88, 137, 155 y 159.

La amidaci6n del extremo C no solo da como resultado mejores actividades microbianas, es decir, valores de CIM mas bajos, sino que tambien reduce la degradaci6n C-terminal por las exoproteasas. De un modo similar la modificaci6n, preferiblemente la acetilaci6n o guanidaci6n, del grupo amino N-terminal reduce la degradaci6n Nterminal, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, la acetilaci6n N-terminal reduce los valores de CIM para algunas de las cepas bacterianas sometidas a ensayo (p. ej., el SEQ ID NO: 21 en comparaci6n con el SEQ ID NO: 22 y el SEQ ID NO: 38 en comparaci6n con el SEQ ID NO: 39), lo que indica que los residuos N-terminales deben llevar una carga positiva. Por consiguiente, la glicina de la posici6n X1 se remplaz6 por residuos que portaban una cadena lateral cargada positivamente, como lisina (p. ej. SEQ ID NO: 21), arginina y ornitina (p. ej. SEQ ID NO: 12). Otra posibilidad para introducir una carga positiva en el extremo N es la guanidaci6n N-terminal, que al mismo tiempo estabiliza el extremo N frente a la degradaci6n (p. ej. los SEQ ID NO: 133 y 137). Estos peptidos modificados N-terminalmente que portan un residuo con una cadena lateral cargada positivamente en la Posici6n X1 mostraron mejores valores de CIM que las secuencias de apidaecina de tipo salvaje acetiladas. Otro residuo importante para mejorar la actividad antimicrobiana es la sustituci6n de la glutamina de la posici6n 10 (residuo X4) por un residuo que porta una cadena lateral cargada positivamente, tal como ornitina (p. ej. los SEQ ID NO: 12 y 13), lisina (p. ej. los SEQ ID NO: 21 y 22) o arginina (p. ej. los SEQ ID NO: 38 y 39). Esta sustituci6n en la posici6n 10 (residuo X4) por un residuo que porta una cadena lateral cargada positivamente no reduce la resistencia a la proteasa, ya que la siguiente posici6n contiene una prolina, que reduce eficazmente la escisi6n proteolitica del enlace peptidico Nterminal por las endoproteasas. La sustituci6n de la prolina de la posici6n 11 (residuo X5) por hidroxiprolina no influye en los valores de CIM dentro del intervalo de error del analisis ni reduce la resistencia a la proteasa de su enlace peptidico N-terminal. Mientras esta sustituci6n por hidroxiprolina en la posici6n 11 (residuo X5) no afecta a los valores de CIM ni a la estabilidad en suero, la polaridad mas alta reduce adicionalmente la toxicidad celular y la actividad hemolitica, ya que peptidos mas polares se unen a menos membranas celulares. De este modo un peptido muy preferido contiene ornitina en la posici6n 1 (residuo X1), arginina en la posici6n 10 (residuo X4) e hidroxiprolina en la posici6n 11 (residuo X5, un extremo N acetilado, y una amida C-terminal, tal como el SEQ ID NO: 40). Ademas, el enlace peptidico entre las posiciones 17 y 18, esto es, Arg y Leu/Ile de la secuencia original, es modificado para incrementar su resistencia a proteasa o peptidasa, tal como N-metilaci6n (p. ej. los SEQ ID NO: 33, 34). Alternativamente la arginina de la posici6n 17 (residuo X6) es remplazada por un residuo alcalino no propenso a proteolisis, tal como ornitina (p. ej. los SEQ ID NO: 38, 131 a 133, 146 a 155).

Los valores de CIM de los peptidos y derivados de peptidos sometidos a ensayo frente a bacterias de diversas especies se resumen en la tabla 5.

Se sometieron a ensayo las cepas de bacterias:

•

Eschericha coli 1103, 10233, BL 21 AI, DC 2,

•

Klebsiella pneumoniae 681,

•

Micrococcus luteus ATCC 10240,

•

Mycobacterium vaccae

•

Bacillus subtilis 347. Tabla 5

SEQ ID NO:

Sintesis Num. E. coli E. coli M. luteus E. coli E. coli K. pneumonia Mycobacterium B. subtilis

10233

BL 21 AI ATCC 10240 1103 DC 2 681 vaccae 347

1

A24 C3 1,95 0,98 31,25 1,95 3,91 15,62 gt; 125 gt;125

2

A24 C4 1,95 0,98 31,25 7,81 62,5 gt; 125

7

A18 G5 ac. 0,49 3,91 1,95 3,9 1,95 125 gt; 125

8

A18 G5 0,24 7,84 1,95-0,95 0,98 1,95 125 gt; 125

9

A17 A4 0,49 1,95 3,9 1,95 3,9 125 gt; 125

11

A18 B4 3,91 0,49 1,95 3,9 0,98 1,95 125 125

12

A20 B1 0,98-1,95 0,98 1,95 3,91 7,81 62,5

13

A20 B1 ac. 1,95 1,95 1,95 3,81 3,91 125

14

A14 B3 0,49 0,98 0,98 7,81 15,62

15

A17 B3 0,98 1,95 1,95 3,9 3,9 125 gt; 125

16

A17 B5 0,98 3,91

17

A14 B4 0,98 0,98 1,95 31,25 31,25

20

A17 B2 0,49 1,95 3,9 1,95-3,91 3,9 125 gt; 125

21

A24 C1 1,95-3,91 1,95-0,98

22

A24 C1 ac. 1,95 1,95

23

A21 A5 3,91 1,95-3,91 0,12 7,81 62,5 125

25

A20 A5 3,91 1,95

26

A14 B5 3,91 1,95 3,91 7,81 15,62

32

A25 D5 Orn ac. 31,25 15,63 7,81 31,4 gt; 125 gt; 125

33

A25 D5 Gly 15,63 15,63 31,25 62,5 gt; 125 gt; 125

38

A18 G6 1,95 1,95 1,95 3,91 0,98 1,95 125 62,5

39

A18 G6 ac. 1,95 1,95 0,98 3,91 0,98 3,9 125 125

40

A26 B2 ac. 1,95 3,91 3,91 125

45

A26 B2 1,95-3,91 7,81 7,81 62,5

62

A18 A1 1,95 7,81

63

A18 A1 ac. 3,91 3,91

65

A18 A2 ac. 0,98 0,98 1,95 7,81 7,81 62,5 125

66

A18 A5 1,95 1,95 3,9 1,95 3,9 125 62,5

SEQ ID NO:

Sintesis Num. E. coli E. coli M. luteus E. coli E. coli K. pneumonia Mycobacterium B. subtilis

10233

BL 21 AI ATCC 10240 1103 DC 2 681 vaccae 347

67

A18 A5 ac. 3,91 1,95 3,9 3,9 3,9 125 125

68

A18 B1 7,81 0,24 3,9 7,81 31,25 125 gt; 125

69

A20 B4 7,81 0,24

70

A21 A6 15,63 0,49

71

A25 D3 Orn 62,531,25 7,81-3,91

72

A25 D4 Orn gt; 125 7,81

73

A25 D6 Orn 62,5 7,81

74

A25 E1 Orn gt; 125 7,81

75

A25 E2 Orn gt; 125 7,81

76

A25 D3 Gly 62,5 15,63

77

A25 D4 Gly gt; 125 31,25

78

A25 D6 Gly 125-62,5 31,25

79

A25 E1 Gly gt; 125 62,5

80

A25 E2 Gly gt; 125 15,63

83

A29 C4 ac. 31,25 1,95 1,95 125 15,6

84

A29 C5 for 1,95 1,95 3,91 62,5 gt; 125

85

A29 C5 guan 1,95 0,24 15,63 31,25 gt; 125

86

A28 A3 3,91 0,98 62,5

88

A30 C1 guan 1,95 0,98 1,95 7,81 62,5

89

A17 A5 1,95 15,63

90

A17 B1 0,98 7,81

91

A17 B4 1,95 7,81

92

A17 C1 3,91 31,25

102

A20 A6 1,95 1,95

103

A20 A6 ac. 1,95 3,91

131

A36 B6 ac. 4 0,5 16 16 32

132

A36 C1 ac 32 32 64 32 128

SEQ ID NO:

Sintesis Num. E. coli E. coli M. luteus E. coli E. coli K. pneumonia Mycobacterium B. subtilis

10233

BL 21 AI ATCC 10240 1103 DC 2 681 vaccae 347

133

A36 C1 guan 64 32 16 8

134

A37 A1 guan 2 4 32 16 gt; 128

135

A37 C3 PEG gt;125 gt; 125 8 gt; 125 gt; 125 gt; 125

136

A44 A4 Fl gt; 125 gt; 125

137

A47 A1 guan lt; 0,5 8 8 2 64

138

A49 A1 64 64

139

A49 A3 Fl gt; 125 gt; 125

140

A49 A4 Fl gt; 125 125

141

A49 A5 gt; 125 gt; 125 gt; 125 gt; 125 gt; 125 gt; 125

142

A49 A6 Fl 125 125

144

A49 B2 gt; 125 gt; 125

146

A53 G5 32 4 64 32 125

147

A53 H1 guan 4 16 16 8 64

148

A34 B6 ac. gt; 125 gt; 125

150

A34 C1 ac. 32 32

151

A34 C1 guan 16 64

152

A35 D2 ac. 32 32

153

A35 D4 ac. 16 32

154

A35 D5 ac. 16 32

155

A38 A1 guan 4 1 4 4 32

Los SEQ ID NO: 1, 2 son las secuencias de tipo salvaje como ejemplos de comparaci6n. Los SEC ID NO: 32, 33, y 70-80, asi como los SEC ID NO: 132, 133, 135, 136, 139, 140, 143, 144 y 148 son ejemplos menos preferidos de acuerdo con la invenci6n (con Q como X4 -posici6n 10). La apidaecina inversa (SEC ID NO: 141) y los peptidos de apidaecina acortados (SEC ID NO: 92 y 142) tambien son menos preferidos. Los otros SEQ ID NO: mostrados, son

5 peptidos o derivados de peptidos preferidos de acuerdo con la invenci6n. Los ejemplos mas preferidos son los SEC ID NO: 7, 8, 9, 11-17, 20-23, 25, 38 40, 45, 65-67, 84, 85, 88, 134 y 137.

En general, la actividad antibacteriana medida en el analisis de microdiluci6n para las secuencias de peptidos sometidos a ensayo es muy similar a los datos presentados en la tabla 4 y discutidos posteriormente. En resumen, se desea la amidaci6n del extremo C, ya que reduce significativamente los valores de CIM para las bacterias 10 sometidas a ensayo. La acetilaci6n del extremo N reduce la degradaci6n N-terminal por las peptidasas o las proteasas, como se ha descrito anteriormente. Los mejores valores de CIM se obtuvieron para los peptidos y peptidomimeticos que llevaban un grupo cargado positivamente en el extremo N-terminal del peptido, por lo tanto, es ventajoso sustituir la glicina en la posici6n 1 por lisina (p. ej., SEC ID NO: 21 y 22), arginina u ornitina (p. ej., SECID NO: 7 y 8) ya que todos llevan una cadena lateral cargada positivamente. Se prefiere la ornitina puesto que no

introduce un sitio de escisi6n por tripsina. Estos peptidos acetilados N-terminalmente mostraron mejores valores de CIM que las secuencias de tipo salvaje acetiladas. Otro residuo importante para mejorar la actividad antimicrobiana es la sustituci6n de la glutamina de la posici6n 10 (residuo X4) por residuos que llevan una cadena lateral cargada positivamente, tales como ornitina (p. ej., SEC ID NO: 12 y 13), lisina (p. ej., SEC ID NO: 21 y 22) o arginina (p. ej., SEC ID NO: 38 y 39). Esta sustituci6n no reduce la resistencia a las proteasas, ya que la siguiente posici6n contiene una prolina, lo que reduce eficazmente la escisi6n proteolitica del enlace peptidico N-terminal. Como una alternativa a la acetilaci6n N-terminal, la guanidaci6n (p. ej., SEC ID NO: 88, 134 y 137) fue tambien muy eficaz y, ademas, prolong6 la actividad para B. subtilis que es resistente a las secuencias de apidaecina de tipo salvaje asi como a la mayoria de los analogos. La sustituci6n de la prolina de la posici6n 11 (residuo X5) por hidroxiprolina no reduce los valores de CIM ni la resistencia a la proteasa, pero como aminoacido mas polar reduce aun mas la toxicidad celular y la actividad hemolitica. De este modo, un peptido preferido contiene ornitina en la posici6n 1 (residuo X1), arginina u ornitina en la posici6n 10 (residuos X4) e hidroxiprolina en la posici6n 11 (residuo X5), un extremo N acetilado o guanidado, y una amida C-terminal, tal como los SEC ID NO: 40, 103.

Curiosamente, algunas modificaciones introdujeron una actividad contra B. subtilis, que no se observa para los peptidos de apidaecina nativa de tipo salvaje. La caracteristica comun de estas secuencias con actividad contra B. subtilis es un extremo N cargado positivamente, es decir, un grupo con amino libre o un extremo N guanidado, una arginina u ornitina en la posici6n 10 (residuos X4) y preferiblemente un ornitina en la posici6n 1 (residuo X1) de la secuencia de apidaecina 1b (leucina en la posici6n 18 -p. ej., los SEQ ID NO: 12, 38, 45, 66, 131 a 134 y 155). Los correspondientes peptidos de apidaecina 1a hom6logos (isoleucina en la posici6n 18) no fueron activos contra B. subtilis. Las mismas modificaciones de secuencia (extremo N cargado, una arginina u ornitina en la posici6n 10 y una ornitina en la posici6n 1) de la secuencia de apidaecina 1a prologaron la actividad para M. vaccae (SEC ID NO: 65).

Ejemplo 4: Analisis para determinar la toxicidad para celulas de mamifero

1. Analisis hemolitico

Para determinar si los peptidos y derivados de peptidos de acuerdo con la invenci6n eran t6xicos para las celulas de mamiferos, se examinaron varios peptidos y peptidomimeticos del Ejemplo 1 de mas arriba, un control positivo y un control negativo para determinar la actividad hemolitica. La actividad hemolitica se analiz6 con eritrocitos humanos [43]. Se proporcion6 un producto concentrado de eritrocitos humanos en tamp6n de cloruro de sodio con adeninaglucosa-manitol del Hospital de la Universidad de Leipzig (Leipzig, Alemania). Los eritrocitos se centrifugaron a 1000 g y se lavaron tres veces con 10 volumenes de soluci6n salina fria tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). Los eritrocitos se diluyeron a una concentraci6n final de 1% en PBS. Se anadieron 100 microlitros de esta suspensi6n de eritrocitos humanos en PBS a cada pocillo de una placa de microtitulaci6n de polipropileno de 96 pocillos en forma de V (Greiner Bio-One GmbH). A cada pocillo se le anadieron 100 1l de peptido disuelto en PBS para obtener una serie de diluciones que partia de 600 1g/ml hasta 4,8 1g/ml en siete etapas de diluci6n. La placa de microtitulaci6n se incub6 a 37quot;C durante 1 h y con posterioridad se centrifug6 durante 10 min a 1000 g. Se transfirieron cien microlitros del sobrenadante a una placa de microtitulaci6n de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Bio-One GmbH) y se registr6 la absorci6n a 405 nm en un espectrofot6metro de microplaca (Tecan) para evaluar la liberaci6n del grupo hemo. Se utilizaron PBS y Triton X-100 al 0,1% como controles negativos y positivos. El porcentaje de hem6lisis se calcul6 por medio de la siguiente ecuaci6n [44]:

(Epeptido -EPBS) / (ETriton -EPBS) X 100% con E = Extinci6n a 405 nm

Todos los analisis hemoliticos se llevaron a cabo por duplicado. La Figura 4 y la tabla 6 muestran el promedio de tres experimentos independientes.

La Figura 4 muestra el resultado del analisis hemolitico para los peptidos A30 C1 guan. (SEC ID NO: 88) y A18 G6 ac. (SEC ID NO: 39) y A17 A6 (SEQ ID NO. 6), a una concentraci6n de peptido de 600 1g/ml, PBS y Triton X-100� (p-terc-Octilfenoxi)polietoxietanol, 0,1%) como controles.

Los resultados para nuevos peptidos y derivados de peptidos se resumen en la tabla 6:

Tabla 6 5

SEQ ID NO:

Sintesis Num. Tasa de hem6lisis [%]

1

A24 C3 0,9

2

A24 C4 0,8

38

A18 G6 1,0

39

A18 G6 ac. 1,4

23

A21 A5 1,1

SEQ ID NO:

Sintesis Num. Tasa de hem6lisis [%]

24

A21 A5 ac. 0,9

83

A29 C4 ac. 1,3

84

A29 C5 FA 0,8

33

A25 D5 Gly 0,6

88

A30 C1 guan. 1,3

120

A30 C3 guan lt;1

131

A36 B6 ac lt;1

133

A36 C1 guan lt;1

134

A37 A1 guan lt;1

135

A37 C3 PEG lt;1

151

A34 C1 guan lt;1

155

A38 A1 guan lt;1

Triton X-100 �

100

Ninguno de los peptidos examinados mostr6 actividad hemolitica a una concentraci6n de peptido de 600 1g/ml, es decir, ni siquiera a concentraciones de 100 hasta 1200 veces mas altas que los valores de CIM obtenidos. Las tasas hemoliticas para todos los peptidos fueron s6lo de alrededor de 1% con respecto a trit6n, que esta dentro del contexto de este analisis. El agente tensioactivo no i6nico Triton X-100� se utiliz6 como control positivo, ya que destruye completamente los gl6bulos rojos de la sangre en el entorno experimental en una hora. Este analisis de celulas indica que los peptidos y derivados de peptidos se pueden aplicar a la sangre a concentraciones altas, sin efectos secundarios sobre los gl6bulos rojos de la sangre. En conclusi6n, todos los peptidos y derivados de peptidos sometidos a ensayo cumplen el requisito de que los compuestos antimicrobianos ideales no deben mostrar ninguna actividad hemolitica a concentraciones 100 veces mas altas que los valores de CIM.

2. Analisis para determinar la toxicidad para las celulas COS

Se hicieron crecer celulas COS-7 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Cellgro, Meidatech Inc., Herndon, VA, EE.UU.) que contenia suero bovino fetal al 10% a 37quot;C en una atm6sfera de 10% de CO2. Las celulas (5 x 103 celulas/pocillo) se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se incubaron durante 24 h antes de la adici6n del peptido. Los peptidos se disolvieron en 0,5 ml de agua y se inocularon en 1 ml de medio a concentraciones finales de 60, 200 y 600 1g/ml por duplicado. Las placas se incubaron durante 24 h mas a 37quot;C en una atm6sfera de 10% de CO2. El medio se aspir6 y el analisis se termin6 mediante la adici6n de 100 1l de tripsinatetraacetato de etilendiamina (EDTA) (tripsina al 0,25%/EDTA al 0,1% en soluci6n salina equilibrada de Hank; Cellgro). Las muestras tratadas y de control se cosecharon, se lavaron en PBS y se fijaron con etanol acuoso frio al 70% durante 2 horas. Las celulas se resuspendieron a continuaci6n en PBS que contenia 10 1g/ml de yoduro de propidio (PI) y 250 1g/ml de ARNAsa y se incubaron durante 30 min a 37quot;C. Las tasas de necrosis/apoptosis se evaluaron mediante analisis de citometria de flujo realizados en un Guava� EasyCyte� Mini System (Guava Technologies, Hayward, CA, EE.UU.).

Este analisis estudia el efecto de los peptidos y derivados de peptidos sometidos a ensayo en dobletes a diferentes concentraciones sobre el ciclo celular de un cultivo de celulas COS-7, es decir, el porcentaje de celulas en fase G1, S, G2/M, asi como de celulas necr6ticas y apopt6ticas. Los datos se evaluan con respecto a un blanco (sin peptidos y derivados de peptidos anadidos) y una disoluci6n de DMSO al 10%, que destruye completamente las celulas.

Los resultados se resumen en la tabla 7. Como se muestra en la tabla anterior, ninguno de los peptidos y derivados de peptidos tuvo ninguna influencia detectable sobre la distribuci6n del ciclo celular, ya que todos estuvieron dentro del intervalo de error de los dos blancos, incluso a las mas altas concentraciones de 600 1g/ml. La necrosis y la apoptosis mas importantes no fueron elevadas en comparaci6n con el blanco. Estos datos, combinados con las actividades hemoliticas (Tab. 6) son la prueba de que los peptidos y derivados de peptidos estudiados no son citot6xicos a nivel celular ni siquiera a concentraciones de hasta 600 1g/ml, que es mas de 100 veces por encima de los valores de CIM.

Tabla 7

SEC ID NO:

Peptido Concentraci6n [1g/ml] Necrosis y apoptosis G1 S1 G2/M

%

%

%

%

8

A18 G5 600 11 39 26 24

600

15 38 26 21

200

17 47 26 9

200

16 43 27 14

60

18 44 29 9

32

A25 D5 Orn ac. 600 10 35 28 27

600

13 42 28 17

200

29 29 27 15

200

18 37 32 13

60

18 39 29 14

45

A26 B2 600 11 40 25 23

600

16 43 27 14

200

20 49 26 6

200

18 50 24 9

60

18 45 25 13

23

A21 A5 600 11 40 27 22

600

11 38 28 24

200

200

19 39 29 13

60

20 40 28 13

controles

blanco 12 35 28 25

blanco 1

23 33 33 10

blanco 2

17 41 22 20

DMSO 1 al 10%

10% (v/v) 0 0 0 0

DMSO 2 al 10%

10% (v/v) 0 0 0 0

Ejemplo 5: Inducci6n de resistencia

La inducci6n de cepas de resistencia se determin6 de acuerdo con el metodo de diluci6n macro en las condiciones del NCCLS (Comite Nacional de Normas de Laboratorio Clinico -ahora Normas de Laboratorios Clinicos Instituto 5 Wayne, PA, EE.UU., Pauta de NCCLS, M7-A5, vol. 20, Num. 2; 2000).

En primer lugar, se determinaron las concentraciones inhibidoras minimas (CIM) para los peptidos que se van examinar como se describe en el ejemplo 3.2. Para determinar la inducci6n de resistencia se seleccionaron diluciones continuas del peptido con concentraciones que oscilaban de 3 veces a 4 veces por encima y por debajo de la CIM. El ensayo se llev6 a cabo en placas de microtitulaci6n de 96 pocillos esteriles con fondo redondo

10 (poliestireno, de fondo en U, Greiner Bio-One GmbH, Alemania) y 200 1l de volumen final por pocillo. El peptido o derivado de peptido liofilizados se disolvieron en agua y se diluyeron en relaci6n con la CIM en TSB al 1% (caldo de soja con tripsina) para obtener un volumen de 100 1l. Como ejemplo para un valor de CIM de 2 1g/ml se seleccionaron series de diluci6n de 32 1g/ml a 0,25 1g/ml. Las diluciones dentro de la serie fueron a la mitad.

Las bacterias, E. coli BL21 AI, se cultivaron durante la noche a 37quot;C en caldo nutriente (NB, Carl Roth GmbH + Co.

15 KG, Karlsruhe, Alemania) y se diluyeron a 5 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en TSB al 1%. Para iniciar el analisis se anadieron 100 1l de la diluci6n de bacterias por pocillo de la placa de microtitulaci6n cargada con el peptido. Despues de incubar las placas durante 24 horas a 37quot;C, se determin6 la absorci6n a 595 nm utilizando un lector de placas de microtitulaci6n TECAN (Tecan, Alemania).

Los valores de CIM se calcularon como se describe en el ejemplo 3.2. El ensayo se repiti6 utilizando una nueva serie de diluci6n con concentraciones de peptido adaptadas a los nuevos valores de CIM determinados y utilizando el cultivo de bacterias que creci6 a pesar de la presencia del peptido inhibidor. Este cultivo de bacterias (1er pase) se diluy6 a 5 x 106 UFC/ml en TSB al 1%. Despues de la incubaci6n con la nueva serie de diluci6n de peptido durante 24 horas a 37quot;C, se determin6 la absorci6n a 595 nm y de nuevo se calcularon valores de CIM. El ensayo se repiti6 de nuevo con el uso de nueva serie de diluci6n con concentraciones de peptido adaptadas a los nuevos valores de CIM determinados y utilizando el cultivo de bacterias que creci6 a pesar de la presencia del peptido inhibidor (2o pase). El mismo procedimiento se aplic6 durante aproximadamente 8 pases mas.

Como control se eligi6 un cultivo de E. coli BL21 AI sin tratar y se hizo pasar sin peptidos inhibidores. Todos los peptidos y derivados de peptidos se midieron por triplicado. El numero de pases fue elegido dependiendo de la rapidez de inducci6n de resistencia y comunmente fue de 10 pases a lo largo de 10 dias continuos.

La Figura 5 muestra la inducci6n de resistencia, comparando la Apidaecina 1b de tipo salvaje (SEC ID NO: 2) y dos secuencias optimizadas de acuerdo con la invenci6n (SEC ID NO: 88 y 137):

SEC ID NO:

Nombre Secuencia

2

Apidaecina 1b acido GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH

88

Api 1b O1 R10 guan. Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2

137

Api 1b O1 R10 acido guan Guan-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-OH

Para la secuencia de Apidaecina de tipo salvaje se obtuvieron las primeras cepas de resistencia ya despues del segundo pase. La resistencia aument6 hasta un valor de CIM de 128 1g/ml en el 10o pase.

Sin embargo, para las dos secuencias de acuerdo con la invenci6n (SEC ID NO: 88 y 137) no se observ6 inducci6n de resistencia en absoluto. Por lo tanto, la inducci6n de resistencia no depende del extremo C.

Los valores de CIM del control de E. coli BL21 AI no tratado, que se hizo pasar, no cambiaron durante el ensayo.

Estos resultados ilustran que los compuestos de acuerdo con la invenci6n se pueden aplicar ventajosamente durante un largo periodo de tiempo como nuevos antibi6ticos sin la inducci6n de la resistencia en E. coli.

Ejemplo 6: Medici6n de la distribuci6n in vivo

La distribuci6n in vivo se midi6 en ratones usando derivados de peptidos marcados con fluorescencia.

Se activ6 el colorante fluorescente que absorbia cerca de infrarrojo Dy675 (Dyomics GmbH, Jena, Alemania) con DIC y se acopl6 al extremo N de los derivados de peptidos una vez completada la sintesis de peptidos en fase s6lida (vease el ejemplo 1). Despues, los peptidos se escindieron con TFA y se purificaron mediante RP-HPLC (vease el ejemplo 1).

Se inyectaron 40 1g de los derivados de peptido marcados por via subcutanea (sc) o intra-peritoneal (ip) en ratones Balb/c hembra anestesiados con isoflurano y afeitados. Los animales se colocaron en la camara del microscopio de fluorescencia bajo una exposici6n continua a isoflurano. Las fotografias de exposici6n a fluorescencia se tomaron con un microscopio IVIS ajustado a 695 nm de longitud de onda de emisi6n a cada minuto en los primeros 10 minutos despues de la adici6n del peptido y cada 5 min posteriormente, hasta 65 min.

La Figura 6 muestra la formaci6n de imagenes in vivo y la biodistribuci6n del peptido marcado con fluorescencia Dy675-ONNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2 (SEC ID NO: 160) 60 y 65 minutos despues de la inyecci6n intra-peritoneal. Se muestran las imagenes despues de 60 min (Fig. 6A, vientre, de baja intensidad), 65 min (Fig. 6B, vientre, de alta intensidad) y despues de 65 min (Fig. 6C, dorso, de alta sensibilidad). La barra de color indica la intensidad de fluorescencia. El derivado de peptido marcado con fluorescencia se inyect6 i.p. y se estudi6 su distribuci6n mediante la formaci6n de imagenes in vivo en varios momentos puntuales (Fig. 6). La Fig. 6C tomada del dorso demuestra claramente que los peptidos fueron enriquecidos en el cerebro, el higado, y los dos rinones. En la Fig. 6B el cerebro tambien se tine mientras que los rinones y el higado no se observan debido a la alta concentraci6n de peptido en el sitio de la inyecci6n.

La mayor parte del peptido inoculado se mantuvo despues de 60 min en el sitio de la administraci6n del farmaco. Pequenas cantidades del peptido se distribuyeron por todo el cuerpo.

La promesa farmaceutica de los nuevos derivados de peptidos es que llegan a los diferentes 6rganos de los animales en 60 min incluyendo el cerebro, el higado y el rin6n, lo que demuestra claramente que los peptidos son distribuidos por la sangre a todos los 6rganos en el cuerpo.

Abreviaturas:

Las siguientes abreviaturas se utilizan para referirse a los aminoacidos:

Agp

Acido guanidinopropi6nico

A

Ala Alanina

�Ala o bAla

beta-Alanina, Acido beta-aminopropi6nico

R

Arg Arginina

Har

Homoarginina

�Har o bHar

beta-Homoarginina

Cha

Ciclohexilalanina

Chex

Acido 1-amino-ciclohexilcarb6nico

Dab o Dbu:

Acido diaminobutirico

D

Asp Acido aspartico

N

Asn Asparragina

Cit

Citrulina

C

Cys Cisteina

GABA

Acido gamma (v)-aminobutirico

Q

Gln Glutamina

E

Glu Acido glutamico

G

Gly Glicina

H

His Histidina

Hyl

o-Hidroxilisina

I

Ile Isoleucina

L

Leu Leucina

MeLeu

N-Metil Leucina

K

Lys Lisina

M

Met Metionina

O

Orn Ornitina

P

Pro Prolina

3Hyp

3-Hidroxiprolina en cis o trans

4Hyp

4-Hidroxiprolina en cis o trans

3cHyp

cis-3-Hidroxiprolina

3tHyp

trans-3-Hidroxiprolina

4cHyp

cis-4-Hidroxiprolina

4tHyp

trans-4-Hidroxiprolina

F

Phe Fenilalanina

T

Thr Treonina

tercGly

terc-butilglicina

Y

Tyr Tirosina

S

Ser Serina

W

Trp Tript6fano

V

Val Valina

Otras abreviaturas incluyen las siguientes: Ac: Acetilo Api: Apidaecina AMP: Peptidos antimicrobianos,

5 BSA: Albumina de suero bovino, UFC: Unidades formadoras de colonias, DCM: Diclorometano, DMF: Dimetilformamida, EDTA: Tetraacetato de etilendiamina,

10 ESI: Ionizaci6n por electropulverizaci6n, DIPEA: N,N'-Diisopropiletilamina, For: Formilo (Metanoilo), Fmoc: 9-Fluorenilmetoxicarbonilo, Guan: grupo guanidino,

15 HBTU: hexafluorofosfato de 2-(1-H-benzotriazol-1-il)-tetrametiluronio, HPLC: Cromatografia liquida de alta resoluci6n, HMBA: Acido 4-Hidroximetilbenzoico, MALDI: Desorci6n/ionizaci6n por laser asistida por matriz, Me: Metilo,

20 MeCN: Acetonitrilo, MeOH: Metanol, CIM: Concentraci6n inhibidora minima, MS: Espectrometria de masas, NB: Caldo nutriente,

25 OMe: �ster metilico, PBS: Soluci6n salina tamponada con fosfato, PI: Yoduro de propidio, RP: Fase inversa, RT: Temperatura ambiente,

30 tBu: terc-butilo, TCA: Acido tricloroacetico, TFA: Acido trifluoroacetico, TOF: Tiempo de vuelo, TSB: Caldo de agar con tripsina,

35 UV: Ultravioleta.

Bibliografia

En la solicitud se cita la siguiente bibliografia no de patente:

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LISTADO�DE�SECUENCIAS

lt;110gt;

Universittt Leipzig

lt;120gt;

Peptidos antibi6ticos

lt;130gt;

00401P0026DEWO

5

lt;150gt; lt;151gt; DE 10 2007 036 128 23.07.2007

lt;160gt;

167

10

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 1 18 PRT Apis mellifera

lt;400gt;

1

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 2 18 PRT Apis mellifera

lt;400gt;

2

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 3 18 PRT artificial

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;223gt; lt;220gt; lt;221gt; caracteristica miscelanea lt;222gt; Xaa es N-Acetilglicina caracteristica miscelanea (1)..(1)

30

lt;222gt; lt;223gt; (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

3

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 4 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt;

caracteristica miscelanea

40

lt;222gt; lt;223gt; (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

4

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 5 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt; lt;223gt;

(1)..(1) Xaa es N-Acetilglicina

10

lt;220gt; lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; lt;223gt;

(18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

5

lt;210gt; 6

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

20 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 6

lt;210gt; 7

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

30 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; 35 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 7

40 lt;210gt; 8

lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

18 PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

8

10

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 9 18 PRT artificial

15

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

9

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 10 19 PRT artificial

lt;400gt;

10

lt;210gt; 11

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

30 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 11

lt;210gt; 12

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

40 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 12

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 13 18 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

15

lt;400gt; 13

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 14 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

25

lt;400gt; 14

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 15 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

35

lt;400gt; 15

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 16 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt; 16 5

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 17 18 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

17

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 18 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

18

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 19 18 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

19

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 20 18 PRT artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

20

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lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

10 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 21

lt;210gt; 22

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

20 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-lisina

lt;220gt; 25 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

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lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 23 21 PRT artificial

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23

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lt;211gt; 21

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

40 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-Acetil-ornitina

lt;400gt;

24

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36

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 25 19 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Valina-amida

lt;400gt;

25

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 26 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

26

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 27 21 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (21)..(21) Xaa es Valina-amida

lt;400gt;

27

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lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 28 21 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (21)..(21) Xaa es Valina-amida

5

lt;400gt; 28

10

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 29 19 PRT artificial

lt;400gt;

29

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 30 19 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

lt;400gt;

30

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 31 19 PRT artificial

lt;400gt;

31

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 32 18 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es N-Metil-Ieucina-amida

lt;400gt;

32

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 33 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es N-Metil-Ieucina-amida

10

lt;400gt; 32

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 34 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es N-Metil-Ieucina-amida

lt;400gt;

34

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 35 18 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Ciclohexilalanina-amida

lt;400gt;

35

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 36 18 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es N-Metil-Ieucina-amida

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 37 18 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Ciclohexilalanina-amida

lt;400gt;

37

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 38 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

38

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 39 18 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

35

lt;400gt; 39

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 40 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt; lt;223gt;

(1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

40

10

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 41 18 PRT artificial

15

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Fenilalanina-amida

lt;400gt;

41

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 42 18 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Fenilalanina-amida

lt;400gt;

42

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 43 17 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

43

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

44 18 PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Fenilalanina-amida

lt;400gt;

44

lt;210gt; 45

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

15 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 45

lt;210gt; 46

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

25 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-Acetil-ornitina

lt;220gt; 30 lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Ciclohexilalanina-amida

lt;400gt; 46 15

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 47 18 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es N-Metil-Ieucina-amida

lt;400gt;

47

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 48 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-metilester

lt;400gt;

48

lt;210gt; 49

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

20 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; 25 lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-metilester

lt;400gt; 49

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 50 18 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa Leucina-metilester

lt;400gt;

50

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 51 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

10

lt;400gt; 51

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 52 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Prolina-amida

20

lt;400gt; 52

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 53 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

30

lt;400gt; 53

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 54 19 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (19)..(19) Xaa es Isoleucina-amida

40

lt;400gt; 54

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 55 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

10

lt;400gt; 55

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 56 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

20

lt;400gt; 56

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 57 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

30

lt;400gt; 57

y

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 58 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

40

lt;400gt; 58

lt;210gt;

59

lt;210gt;

63

lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

18 PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

59

10

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 60 18 PRT artificial

15

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

60

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 61 18 PRT artificial

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

61

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

62 18 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

62

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt;

artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

10

lt;400gt; 63

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 64 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

20

lt;400gt; 64

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 65 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

65

lt;210gt; 66

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

40 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 66

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 67 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es N-Acetil-glicina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

67

lt;210gt; 68

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

20 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es Valina-amida

lt;400gt; 68

lt;210gt; 69

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

30 lt;400gt; 69

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 70 21 PRT artificial

lt;400gt;

70

lt;210gt;

71

lt;210gt;

75

lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

18 PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Ciclohexilalanina-amida

lt;400gt;

71

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 72 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es D-Leucina-amida

lt;400gt;

72

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 73 18 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es terc-Glicina-amida

40

lt;400gt; 73

lt;210gt;

74

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

45

lt;213gt; artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es Alfa-N-Acetil-ornitina

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es beta-Alanina-amida

lt;400gt;

74

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

15 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-orntina

lt;220gt; 20 lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es amida de acido 1-aminociclohexilcarb6nico

lt;400gt; 75

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 76 18 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Ciclohexil-alanina-amida

lt;400gt;

76

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 77 18 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es D-Leucina-amida

lt;400gt;

77

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 78 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es terc-Glicina-amida

10

lt;400gt; 78

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 79 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es beta-Alanina-amida

20

lt;400gt; 79

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 80 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es amida de acido 1-Amino-ciclohexilcarb6nico

30

lt;400gt; 80

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 81 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

40

lt;400gt; 81

lt;210gt;

82

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

82

lt;210gt; 83

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con alfa-N-Acetil-Orn-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-ProArg-Pr o-Pro-His-Pro-A rg-Leu

lt;400gt; 83 15

lt;210gt;

84

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es N-Formil-glicina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

84

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 85 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es N-Guanido-glicina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

85

lt;210gt; 86

lt;211gt; 21

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

20 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (21)..(21)

lt;223gt; Xaa es Valina-amide

lt;400gt; 86

lt;210gt; 87

lt;211gt; 21

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

30 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; 35 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (21)..(21)

lt;223gt; Xaa es Valina-amida

lt;400gt; 87

40 lt;210gt; 88

lt;211gt; 18

lt;212gt; lt;213gt;

PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

88

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 89 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (10)..(10) Xaa es Citrulina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

25

lt;400gt; 89

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 90 18 PRT artificial

35

lt;400gt; lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; 90 caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

89

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 91 18 PRT artificial

45

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (10)..(10) Xaa es Citrulina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

91

lt;210gt;

92

lt;211gt;

17

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

92

lt;210gt;

93

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Prolina-amida

lt;400gt;

93

lt;210gt;

94

lt;211gt;

19

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(19)..(19)

lt;223gt;

Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

94

lt;210gt;

95

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

95

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 96 19 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (19)..(19) Xaa es Valina-amida

lt;400gt;

96

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 97 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

97

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 98 18 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (10)..(10) Xaa es beta-Homoarginina

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-amida

lt;400gt;

98

lt;210gt;

99

40

lt;211gt; 18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(10)..(10)

lt;223gt;

Xaa es beta-Homoarginina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

99

lt;210gt;

100

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

100

lt;210gt;

101

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

101

lt;210gt;

102

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

102

lt;210gt;

103

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

103

lt;210gt;

104

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

104

lt;210gt;

105

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

105

lt;210gt;

106

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

106

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 107 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Valina-amida

10

lt;400gt; 107

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 108 18 PRT artificial

lt;400gt;

108

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 109 21 PRT artificial

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (21)..(21) Xaa es Prolina-amida

lt;400gt;

109

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 110 21 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (21)..(21) Xaa es Valina-amida

lt;400gt;

110

lt;210gt; 111

lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

18 PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

111

10 lt;210gt; 112

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt; 15 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 112 10

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 113 18 PRT artificial

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

113

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 114 18 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Tirosina-amida

lt;400gt;

114

lt;210gt;

115

lt;211gt;

17

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

5

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es Arginina-amida

lt;400gt;

115

lt;210gt; 116

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

15 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; 20 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Isoleucina-metilester

lt;400gt; 116

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 117 18 PRT artificial

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Isoleucina-metilester

lt;400gt;

117

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 118 18 PRT artificial

45

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Isoleucina-metilester

lt;400gt;

118

lt;210gt; 119

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con Orn-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-IIe-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu-

lt;400gt; 119

lt;210gt;

120

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

120

lt;210gt;

121

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es beta-Homoarginina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

121

lt;210gt;

122

lt;211gt;

19

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(19)..(19)

lt;223gt;

Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con

lt;210gt; 123

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es N-Guanido-glicina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con N-Guanido-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-IIe-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-His- Pro-Arg-Leu

lt;400gt; 123

lt;210gt; 124

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con alfa-N-Acetil-Orn-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu

lt;400gt; 124

lt;210gt; 125

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con alfa-N-Guanido-Orn-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-His- Pro-Arg-Leu

lt;400gt; 125

lt;210gt;

126

lt;211gt;

21

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;400gt;

126

lt;210gt; 127

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con alfa-N-Acetil-Orn-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Orn-Leu

lt;400gt; 127

lt;210gt;

128

lt;211gt;

19

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con alfa-N-Guanido-Orn-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Orn-Leu

lt;400gt; 128

lt;210gt; 129

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es N-Acetil-glicina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con N-Acetil-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu

lt;400gt; 129

lt;210gt; 130

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es N-Guanido-glicina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (19)..(19)

lt;223gt; Xaa es acido 2,4-Diaminobutirico sustituido con N-Guanido-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Gln-ProArg-Pro-Pro-H s- Pro-Arg-Leu

lt;400gt; 130

lt;210gt;

131

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt; lt;223gt;

(17)..(17) Xaa es Homoarginina

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

131

10

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 132 18 PRT artificial

15

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es N-Acetil-glicina

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es Homoarginina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

25

lt;400gt; 132

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 133 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es N-Guanido-glicina

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es Homoarginina

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

133

45 lt;210gt; 134

lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt;

18 PRT artificial

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

134

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 135 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Polietilenglicol-ornitina

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

135

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 136 18 PRT artificial

35

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

136

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 137 18 PRT artificial

45

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;400gt; 137

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 138 18 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es Citrulina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

15

lt;400gt; 138

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 139 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

25

lt;400gt; 139

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 140 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

35

lt;400gt; 140

40

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 141 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Glicina-amida

lt;400gt;

141

5 lt;210gt; 142

lt;211gt; 15

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt; 10 lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (15)..(15)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 142

15 lt;210gt; 143

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt; 20 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 143

25 lt;210gt; 144

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;400gt; 144

lt;210gt; 145

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

35 lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (17)..(17)

lt;223gt; Xaa es Arginal

lt;220gt; 40 lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (18)..(18)

lt;223gt; Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 145

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 146 18 PRT artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (17)..(17) Xaa es acido alfa-Amino-beta-guanidinopropi6nico

15

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

146

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 147 18 PRT artificial

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-propil-ester

lt;400gt;

147

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 148 18 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es N-Acetil-glicina

45

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es Citrulina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

148

lt;210gt;

149

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es N-Guanido-glicina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es Citrulina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

149

lt;210gt;

150

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es Citrulina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

150

lt;210gt; 151

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; artificial

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

5

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es Citrulina

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

151

15

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 152 18 PRT artificial

20

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

25

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (17)..(17) Xaa es D-Arginina

30

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

152

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 153 18 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica miscelanea (17)..(17) Xaa es Metil-arginina

45

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

153

lt;210gt;

154

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-Ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es Nitro-arginina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

154

lt;210gt;

155

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Guanido-Ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(17)..(17)

lt;223gt;

Xaa es Homoarginina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

155

lt;210gt;

156

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

156

lt;210gt;

157

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

157

lt;210gt;

158

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Guanido-ornitina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt;

158

lt;210gt;

159

lt;211gt;

18

lt;212gt;

PRT

lt;213gt;

artificial

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica-miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es N-Guanido-glicina

lt;220gt;

lt;221gt;

caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(18)..(18)

lt;223gt;

Xaa es Leucina-amida

lt;400gt; 159

5

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 160 18 PRT artificial

10

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt; caracteristica-miscelanea (1)..(1) Xaa es Dy 675-N-alfa-Ornitina

lt;220gt; lt;221gt; lt;222gt; lt;223gt;

caracteristica-miscelanea (18)..(18) Xaa es Leucina-amida

15

lt;400gt; 160

20

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 161 19 PRT Drosphilamelanogaster

lt;400gt;

161

25

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 162 16 PRT Myrmeciagulosa

lt;400gt;

162

30

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 163 20 PRT Pyrrhocorisapterus

lt;400gt;

163

35

lt;210gt; lt;211gt; lt;212gt; lt;213gt; 164 17 PRT artificial

40

lt;220gt; lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt;

(1)..(1)

lt;223gt;

Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;400gt;

164

5 lt;210gt; 165

lt;211gt; 16

lt;212gt; PRT

lt;213gt; a

lt;220gt; 10 lt;221gt; caracteristica-miscelanea

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Xaa es alfa-N-Acetil-ornitina

lt;400gt; 165

15 lt;210gt; 166

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; a

lt;400gt; 166

lt;210gt; 167

lt;211gt; 18

lt;212gt; PRT

lt;213gt; a

25 lt;400gt; 167

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un peptido con al menos 16 residuos y la f6rmula general

   Sub1-X1NX2X3PVYIPX4X5RPPHP-Sub2

   en donde

   X1 es un residuo cargado positivamente;

   X2 es un residuo con una cadena lateral polar o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas;

   X3 es un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas;

   X4 es un residuo neutro con una cadena lateral polar, preferiblemente no glutamina, o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas;

   X5 es prolina o un derivado de prolina;

   siendo Sub1 una modificaci6n del grupo amino N-terminal, en el que la modificaci6n es guanidaci6n;

   siendo Sub2 el grupo carboxilo C-terminal libre del aminoacido C-terminal o una modificaci6n del grupo carboxilo Cterminal.

2. 2.

   El peptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que comprende al menos un residuo adicional X6 y/o X7 en Sub2, mientras que X6 se selecciona entre prolina o un derivado de prolina o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas y X7 se selecciona entre de prolina o derivados prolina, un radical polar o un radical hidr6fobo.

3. 3.

   El peptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o 2, en donde el residuo X1 se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, D-arginina, metilarginina, alfa-N-metilarginina, nitroarginina, N(G)nitroarginina, nitrosoarginina, N(G)-nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropi6nico, acido 2,4-diaminobutirico, homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminopropi6nico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metilhistidina, y 3-amino-tirosina.

4. 4.

   El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el residuo X2 se selecciona del grupo que consiste en asparragina, glutamina, serina, treonina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, citrulina, N-metilserina, N-metilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3,5-dinitrotirosina, arginina, lisina, ohidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, homoarginina, -homoarginina, D-arginina, metilarginina, alfaN-metilarginina, nitroarginina, N-(G)-nitroarginina, nitrosoarginina, N-(G)-nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropi6nico, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminopropi6nico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2,6-diaminohexanoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, acido p-aminobenzoico, y 3-aminotirosina.

5. 5.

   El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, mientras que el residuo X3 se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminopropi6nico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, metilarginina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, nitroarginina, nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropi6nico, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina.

6. 6.

   El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el residuo X4 se selecciona del grupo que consiste en asparragina, N-metilserina, N-metilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3,5-dinitrotirosina, y citrulina, asi como arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminopropi6nico, acido 2,2'-diaminopimelico, ornitina, metilarginina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, nitroarginina, nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropi6nico, acido 2,6diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina.

7. 7.

   El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el residuo X5 es prolina o un derivado de prolina seleccionado del grupo que consiste de cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, -ciclohexilalanina, 3,4-cis-metanoprolina, 3,4-deshidroprolina, homoprolina y pseudoprolina.

8. 8.

   El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el residuo X6 se selecciona del grupo que consiste en prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina,

   -ciclohexilalanina, 3,4-cis-metanoprolina, 3,4-deshidroprolina, homoprolina, pseudoprolinas, arginina, preferiblemente D-arginina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2,4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2,3-diaminopropi6nico, acido 2,2'-diaminopimelico, lisina, ornitina, metilarginina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, nitroarginina, nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropi6nico, acido 2,6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina.

9. 9.

   El peptido de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que comprende al menos un residuo adicional X6 y/o X7 en Sub2, mientras que X6 se selecciona entre prolina o un derivado de prolina o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiol6gicas y X7 se selecciona del grupo que consiste en prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, -ciclohexilalanina, 3,4cis-metanoprolina, 3,4-deshidroprolina, homoprolina, pseudoprolinas, serina, treonina, citrulina, N-metilserina, Nmetilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3,5-dinitrotirosina, o-hidroxilisina, fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, acido 1aminociclohexilcarb6nico, N-metilleucina, N-metilisoleucina, terc-butilglicina, -alanina, norleucina, norvalina, Nmetilvalina, acido 6-aminocaproico, acido 2-aminoheptanoico, acido 2-aminoisobutirico, acido 3-aminoisobutirico, acido aminovalerico, acido 2-aminopimelico, acido pipecol6nico, tript6fano, yodo-tirosina, 3,5-diyodo-tirosina, 3,5dibromotirosina, -ciclohexilalanina, acido p-aminobenzoico, acido £-aminocaproico, 3,4-cis-metanoprolina, fenilglicina, 3,4-deshidroprolina, acido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico, O-fosfotirosina, O-sulfotirosina, acido aminoetillpirrolocarboxilico, acido 4-aminopiperidino-4-carboxilico, acido a-aminoadipico, homoprolina, homofenilalanina, p-fluoro-fenilalanina, 3,4-diclorofenilalanina, p-bromo-fenilalanina, p-yodo-fenilalanina, p-nitrofenilalanina, una secuencia peptidica corta, y un conector ramificado que contiene varias unidades peptidicas.

10. 10.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 88, 120, 125, 128, 134, 137, 146, 147, 151, 155, 156, 157, y 158.

11. 11.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde al menos uno de los enlaces peptidicos de la cadena principal del peptido se sustituye por un enlace no escindible.

12. 12.

    El peptido de acuerdo con la reivindicaci6n 11, en donde el enlace entre X6-X7 es un enlace no escindible.

13. 13.

    El peptido de acuerdo con la reivindicaci6n 11 o 12, en donde el enlace no escindible se selecciona del grupo que consiste en un enlace amida reducido, un enlace amida alquilado, y un enlace tioamida.

14. 14.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que esta fusionado a una proteina o acoplado a un polimero.

15. 15.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho peptido esta unido a un portador.

16. 16.

    Un multimero, en donde al menos dos peptidos se acoplan entre si, mientras que al menos uno de los peptidos es un peptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15.

17. 17.

    Una composici6n farmaceutica que comprende al menos uno de los peptidos o un multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16.

18. 18.

    Un peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o un multimero de acuerdo con la reivindicaci6n 16 o una composici6n farmaceutica de acuerdo con la reivindicaci6n 17, para su uso en el tratamiento de una infecci6n microbiana, bacteriana o fungica en un mamifero.

19. 19.

    El uso de un peptido o un multimero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, como agente de limpieza, como agente de conservaci6n o en un material de envasado.

20. 20.

    El uso de un peptido o un multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16 en un metodo de escrutinio.

21. 21.

    Un metodo para identificar un compuesto, que tiene un efecto antimicrobiano, bactericida o antifungico, que comprende:

    (i) realizar un analisis competitivo con:

    (a)

    un microorganismo susceptible a un peptido o multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16;

    (b)

    un peptido o multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16; y

    (c)

    al menos un compuesto que se va a someter a ensayo;

    mediante la exposici6n de (a) a (b) y (c); y

    (ii) seleccionar un compuesto de ensayo que desplaza competitivamente la uni6n del peptido o multimero al microorganismo.
22. 22. El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 21, en donde el microorganismo es una especie que pertenece a uno de los generos seleccionados entre Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Errinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti y Haemophilus influenzae.