CN107337713B - 一组抑菌肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及一组抑菌肽及其制备方法，具体而言涉及一组具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肽、肽衍生物、环肽及其制备方法和应用。本发明的抗菌肽对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌均具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。

Description

一组抑菌肽及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体而言涉及一组具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肽、肽衍生物、环肽及其制备方法和应用。
背景技术
自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器，但随着传统抗生素的滥用，越来越多的病原菌开始对传统抗生素产生耐药性，所以急需寻找一类全新的抗菌药物来替代抗生素进行使用。
天然抗菌肽是基因编码或大分子蛋白水解产生的小分子多肽，一般是由12-50个氨基酸残基组成的阳离子型(富含赖氨酸和精氨酸)多肽，是宿主对抗外来微生物的防御机制之一。传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶变性，来达到杀菌的目的，但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。抗菌肽的作用靶点是细菌的细胞膜，通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，以此穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。此外，抗菌肽还具有广谱抗菌、抗病毒、抗原虫及抗肿瘤等活性，具有较高的成药价值。但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性，对病原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用，而且线性抗菌肽在体内易被各类蛋白酶水解，半衰期短。因此如何提高其活性并最大程度延长半衰期、降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。
发明内容
本发明涉及一组多肽或其药学上可接受的盐，其序列通式为：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11；其中R1为芴甲氧羰基、一氯乙酰基或缺失；Xaa1为Phe、D-Phe、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸或2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4,4-联苯丙氨酸或一氯乙酰基；Xaa2为Lys或Arg、4-三氟甲基苯丙氨酸；Xaa3为Arg、Lys、D-Lys或D-Arg；Xaa4为Met、Lys、Ile或Leu；Xaa5为Lys、D-Lys、Leu或D-Leu；Xaa6为Lys或Cys；Xaa7为Leu、Lys、Ile、D-Leu或D-Lys；Xaa8为Met、Lys、ILe或Leu；Xaa9为Lys、Arg、D-Arg或D-Lys；Xaa10为Lys或Cys；Xaa11为Cys、Phe、D-Phe、4-碘苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸或4,4-联苯丙氨酸。
作为本发明的一种优选方案，上述多肽或其药学上可接受的盐具有以下序列通式：R1-Xaa1-Lys-Arg-Leu-Lys-Xaa6-Leu-Leu-Lys-Lys-iF；其中R1为一氯乙酰基或缺失，Xaa1为4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸或2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸；Xaa6为Lys或Cys，当Xaa6为Cys时，Cys和R1位的一氯乙酰基发生环化。
在某些特定的实施方式中，上述多肽或其药学上可接受的盐其氨基酸序列为：
iF-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:1)；
brF-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:2)；
5fF-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:3)；
环(Caa-iF-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys)-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:4)；
环(Caa-brF-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys)-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:5)；
环(Caa-5fF-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys)-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:6)。
作为本发明的另一种优选方案，上述多肽或其药学上可接受的盐具有以下序列通式：Caa-Xaa1-Lys-Xaa3-Leu-Xaa5-Cys-Xaa7-Leu-Xaa9-Lys-Xaa11；其中Xaa1为Phe或D-Phe，Xaa3为Arg或D-Arg，Xaa5为Lys或D-Lys，Xaa7为Leu或D-Leu，Xaa9为Lys或D-Lys，Xaa11为Phe或D-Phe，上述序列中Cys可以与一氯乙酰基发生环化。
在某些特定的实施方式中，上述多肽或其药学上可接受的盐其氨基酸序列为：
Caa-D-Phe-Lys-D-Arg-Leu-D-Lys-Cys-D-Leu-Leu-D-Lys-Lys-D-Phe-NH2(SEQID NO:7)；
Caa-Phe-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys-Leu-Leu-Lys-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:8)；
环(Caa-D-Phe-Lys-D-Arg-Leu-D-Lys-Cys)-D-Leu-Leu-D-Lys-Lys-D-Phe-NH2(SEQ ID NO:9)；
环(Caa-Phe-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys)-Leu-Leu-Lys-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:10)。
作为本发明的又一种优选方案，上述多肽或其药学上可接受的盐中，具有以下序列：
Phe-Lys-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Met-Lys-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:11)；
Fmoc-Phe-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:12)；
D-Phe-Lys-D-Lys-Leu-D-Leu-Lys-D-Lys-Leu-D-Arg-Cys-D-Phe-NH2(SEQ IDNO:13)；
环(Caa-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Cys)(SEQ ID NO:14)；
环(Caa-Phe-Lys-Arg-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Cys)(SEQ ID NO:15)；
环(Caa-fmF-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys)-fmF-NH2(SEQ ID NO:16)；
环(Caa-dpF-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys)-dpF-NH2(SEQ ID NO:17)。
本发明所涉及的氨基酸残基包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表1所示，本发明说涉及的非天然氨基酸所对应的代码表及结构如表2所示。
本发明所涉及的所有氨基酸若不特别限定其结构，代表L型氨基酸。
本发明所涉及的多肽，既可以是线性肽，也可以是环肽。当肽链中同时存在Cys和一氯乙酰时，在碱性水溶液条件下，肽链可以发生分子内取代反应，脱去巯基上的氢和一氯乙酰氨基上的氯，形成硫醚键，使线性肽链环化。
本发明所涉及的多肽为线性肽时，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺的形式，优选以酰胺的形式存在。
表1天然氨基酸三字母代码表
Figure BDA0000980146540000021
Figure BDA0000980146540000031
表2非天然氨基酸和N末端基团的代码表及结构
Figure BDA0000980146540000032
本发明还提供了上述多肽的制备方法，可以采用本领域技术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及利用上述部分多肽在碱性水相中自身环化的特性制备环肽。
固相化学合成技术的制备方法如下：
(1)在树脂上固相合成多肽；
(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，优选三氟乙酸；并加入侧链保护基清除剂，然后用5-20倍体积的冰乙醚混合，离心，弃上清，沉淀多肽，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽；
(3)任选的，通过碱性水溶液处理步骤(2)的粗肽。
条件是，当所制备的多肽为线性肽时，所述制备方法不包括步骤(3)；当所制备的多肽为环肽时，所述制备方法包括步骤(3)。
步骤(1)是在液相环境中进行，具体包括：浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—干燥树脂。
本发明所涉及的多肽C末端若为羧酸形式，则步骤(1)采用Wang树脂进行合成；本发明所涉及的多肽C末端若为酰胺形式，步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。
其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基选自：叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲基羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。
作为固相多肽合成技术的一个优势，对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护，例如Cys可以采用三苯甲基(Trt)；Lys可以采用叔丁氧羰基(Boc)；Arg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)。所述保护基不限于此，可以根据本领域常规方案进行合理选择。
步骤(1)的液相环境所用溶剂选自：二甲基酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)，优选DMF。
步骤(1)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min；优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。
步骤(1)中偶联氨基酸所使用的偶联试剂选自碳二亚胺型试剂与1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，或苯并三氮唑鎓盐型试剂与1-羟基苯并三氮唑(HOBt)。
碳二亚胺型试剂选自二环己碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
苯并三氮唑鎓盐型试剂选自2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)。
偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
步骤(1)中的“监测”采用茚三酮检测法检测多肽的缩合反应。
步骤(1)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
步骤(2)所述的侧链保护基清除剂包括但不限于三异丙基硅烷、茴香硫醚、苯酚、水、1,2-乙二硫醇、间甲酚或上述任意两种或者两种以上的组合，并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20％(体积比)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA):茴香硫醚:75％苯酚:水＝85:5:5:5。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法还可以进一步包括纯化步骤，所采用的纯化方法选自反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。
本发明所涉及多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基以及改良型RPMI-1640培养基。以两性霉素B、硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的抗菌肽对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌均具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。因此本发明所涉及的多肽可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。
具体实施方式
实施例1：TAMP-1的制备及纯化
氨基酸序列：iF-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2(SEQ ID NO:1)
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.63mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-4-碘苯丙氨酸-OH。
试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、冷冻干燥机。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Rink Amide MBHA树脂0.24g，置于多肽合成仪反应器中，加入15mL DMF，浸泡2h，然后加入20％PIP/DMF溶液10mL，混合30min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂7次，然后向反应器中加入0.45mmolFmoc-L-4-碘苯丙氨酸-OH、等摩尔的偶联试剂DIC(0.3mol/L)和HOBt(0.3mol/L)进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。
b.裂解及沉淀
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1mL裂解试剂/100mg树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA:茴香硫醚:75％苯酚:水＝85:5:5:5，室温搅拌反应3小时，抽滤。之后向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
c.反相色谱纯化
用制备型HPLC，采用反相色谱法，纯化上述粗肽。
1)制备
HPLC条件如下：
色谱柱：Chromatorex C18制备柱(250mm×10mm，10μm)
流速：5mL/min
检测波长：220nm
流动相：A：含0.1％TFA水溶液
B：含0.1％TFA的乙腈溶液
梯度洗脱程序见表3：
表3纯化梯度洗脱表
Figure BDA0000980146540000051
2)分析
色谱柱：DIONEX C18分析柱(250mm×4.6mm,5μm)
流速：1mL/min
检测波长：215nm
柱温：35℃
流动相：A：含0.05％TFA水溶液
B：含0.05％TFA的乙腈溶液
梯度洗脱程序见表4：
表4分析梯度洗脱表
Figure BDA0000980146540000061
用步骤1)方法进行制备，收集流份，并用步骤2)的分析方法检测各流份，将目标肽纯度大于95％的流份合并，然后35℃下旋转蒸发至适当体积，最后冷冻干燥。经ESI-MS测定，该肽的分子量为1700.07，理论分子量为1669.73。
实施例2：环肽TAMP-14的制备及纯化
氨基酸序列：环(Caa-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Cys)(SEQ IDNO:14)
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.63mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Phe-OH。
试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶、一氯乙酸。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、旋转蒸发仪，冷冻干燥机。
按照实施例1中的操作步骤a合成序列Rink Amide MBHA-Cys-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Phe-Fmoc，然后加入20％PIP/DMF溶液15mL，混合30min脱除氨基保护基，用DMF洗涤树脂7次，加入0.45mmol的一氯乙酸、等摩尔偶联试剂DIC(0.3mol/L)和HOBt(0.3mol/L)，反应2h，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。再用DCM洗涤5次，真空干燥后称重。之后按照实施例1中的操作步骤b进行，得到线性粗肽。粗肽加水，稀释成1mg/mL的水溶液，用0.1mol/mL的NaOH溶液调节pH至8.0，搅拌反应3h，反应温度为室温，反应结束后用10％冰醋酸水溶液调节pH至4.0，得到环肽水溶液。之后按照实施例1中操作步骤c进行纯化，收集目标肽纯度大于95％的部分，然后35℃下旋转蒸发至适当体积，最后冷冻干燥。该肽的分子量为1443.57，理论值为1443.89。
实施例3：表5中其余TAMP系列抗菌肽的制备及纯化
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.63mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-L-4-碘苯丙氨酸-OH、Fmoc-L-4,4-联苯丙氨酸-OH、Fmoc-L-4-三氟甲基苯丙氨酸-OH、Fmoc-L-4-碘苯丙氨酸-OH、Fmoc-L-4-溴苯丙氨酸-OH、Fmoc-L-2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸。
试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶、一氯乙酸。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、旋转蒸发仪，冷冻干燥机。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
以类似实例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化表5中的多肽，若为环肽则按照实施例2中的操作步骤进行制备，收集纯度大于95％的部分，然后35℃旋转蒸发至适当体积，冷冻干燥。ESI-MS测定值如表5所示。
表5 TAMP系列抗菌肽对应序列号及分子量
抗菌肽 序列号 分子量(理论值) 分子量(ESI-MS)
TAMP-2 SEQ ID NO:2 1652.50 1651.79
TAMP-3 SEQ ID NO:3 1664.37 1664.85
TAMP-4 SEQ ID NO:4 1714.69 1714.79
TAMP-5 SEQ ID NO:5 1667.69 1668.50
TAMP-6 SEQ ID NO:6 1678.79 1678.51
TAMP-7 SEQ ID NO:7 1499.35 1498.79
TAMP-8 SEQ ID NO:8 1499.35 1499.63
TAMP-9 SEQ ID NO:9 1463.89 1463.26
TAMP-10 SEQ ID NO:10 1463.89 1463.69
TAMP-11 SEQ ID NO:11 1483.96 1483.95
TAMP-12 SEQ ID NO:12 1716.11 1717.68
TAMP-13 SEQ ID NO:13 1422.86 1422.73
TAMP-15 SEQ ID NO:15 1443.89 1443.91
TAMP-16 SEQ ID NO:16 1616.86 1616.53
TAMP-17 SEQ ID NO:17 1616.86 1616.53
实施例4：体外抗菌活性测定
根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法测定系列抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，细菌培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，白色念球菌培养基采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基。
具体步骤为：
(1)抗菌药物贮备液制备
精确配制浓度为320μg/mL的TAMP-1～17和80μg/mL阳性对照品两性霉素B、硫酸多粘菌素E及盐酸万古霉素。配置好的各贮备液至于-20℃环境中保存备用。
(2)培养基配制
细菌MIC测试采用MH Broth培养基：称取MH肉汤培养基24.00g，溶于蒸馏水中并定容至1L，121℃高温灭菌30min。
真菌MIC测试采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基，具体配制方法如下：称取18.00g葡萄糖溶于一定量蒸馏水中，定容到500mL，115℃高温灭菌15min。在无菌环境中，向已灭菌的葡萄糖溶液中加入500mL RPMI-1640培养基，混合后4℃贮存备用。
(3)接种物的制备
用接种环挑去形态相似待检菌落3～5个，细菌接种于4～5mL的MH肉汤培养基中(真菌接种于改良型RPMI-1640培养基中)，细菌35℃孵育16～20h、真菌28℃孵育24h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或对应的培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/mL。细菌用MH肉汤培养基、真菌用改良型RPMI-1640培养基将上述菌悬液进行1:1000稀释备用。整个过程需要在无菌环境中进行。
(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种
取一块96孔板，在第1孔中加入160μL MH肉汤培养基或改良型RPMI-1640培养基，第2-12孔中各加入100μL相对应培的养基，然后向第1孔加入抗菌药物原液(320μg/mL)40μL，混匀，接着吸取100μL至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μL弃去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μL，使每孔最终菌液浓度约为0.5×105CFU/mL。第1-10孔药物浓度分别为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL，第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。
(5)孵育
接种细菌的96孔板置于35℃空气培养箱孵育16～20h，接种真菌的96孔板置于28℃空气培养箱中孵育40～50h。
(6)结果
以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表6所示。
表6 TAMP系列抗菌肽的MIC测试结果
Figure BDA0000980146540000081
Figure BDA0000980146540000091
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Claims (9)

1.一种多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为：
环(Caa-iF-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys)-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2；或
环(Caa-brF-Lys-Arg-Leu-Lys-Cys)-Leu-Leu-Lys-Lys-iF-NH2；
其中，iF为4-碘苯丙氨酸，brF为4-溴苯丙氨酸。
2.权利要求1的多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在树脂上固相合成多肽；
(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解；并加入侧链保护基清除剂，然后用5-20倍体积的冰乙醚混合，离心，弃上清，沉淀多肽，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽；
(3)通过碱性水溶液处理步骤(2)的粗肽。
3.权利要求2的制备方法，其中所述步骤(1)是在液相环境中进行，具体包括：浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—干燥树脂。
4.权利要求3的制备方法，其中所述的氨基保护基选自：叔丁氧羰基、苄氧羰基或9-芴基-甲基羰基。
5.权利要求3的制备方法，其中所述的步骤(1)的液相环境所用溶剂选自：二甲基酰胺或二氯甲烷。
6.权利要求3的制备方法，其中所述的偶联氨基酸所使用的偶联试剂选自碳二亚胺型试剂与1-羟基苯并三氮唑，或苯并三氮唑鎓盐型试剂与1-羟基苯并三氮唑。
7.权利要求6的制备方法，其中所述的偶联试剂选自二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和1-羟基苯并三氮唑。
8.权利要求2的制备方法，其中所述制备方法进一步包括纯化步骤，所采用的纯化方法选自反相色谱法或离子交换色谱法。
9.权利要求1的多肽在制备抗大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、耐药鲍曼不动杆菌或耐药铜绿假单胞菌的药物中的应用。
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