发明内容
本发明提供了一种多肽或其药学上可接受的盐,所述多肽具有如下氨基酸序列:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Leu-Xaa12-Xaa13-Xaa14(SEQ ID NO:2);
其中Xaa1为Lys、Gly、Dap、Dab或缺失;
Xaa2为Arg、hArg、Phe或缺失;
Xaa3为Leu、Phe、Arg或缺失;
Xaa4为Phe、Thi、Cpa或Phe(4-F);
Xaa5为Lys、Dap、Dab或Dap(Cap);
Xaa6为Lys、Dap、Dab、Asp、Ser或Thr;
Xaa7为Leu或Trp;
Xaa8为Leu或Arg;
Xaa9为Lys、Dab或Dap(Cap);
Xaa10为Tyr、Leu、Trp、Lys或Arg;
Xaa12为Arg或hArg;
Xaa13为Lys、Dab或Dap(Cap);
Xaa14为Phe、Thi或Phe(4-F)。
上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa1优选Dab或缺失;Xaa6优选Lys、Dab或Ser;Xaa7优选Leu;Xaa10优选Tyr、Lys或Arg;Xaa14优选Phe或Phe(4-F)。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr;Xaa1为Dab或缺失;Xaa6为Lys、Dab或Ser;Xaa7为Leu;Xaa14为Phe或Phe(4-F)。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa3为Leu;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa3为Leu;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr;Xaa1为Dab或缺失;Xaa6为Lys、Dab或Ser;Xaa14为Phe或Phe(4-F)。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa4为Phe;Xaa6为Lys;Xaa7为Leu;Xaa12为Arg;Xaa14为Phe。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa4为Phe;Xaa6为Lys;Xaa7为Leu;Xaa12为Arg;Xaa14为Phe;Xaa10为Tyr、Lys或Arg。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa5为Lys;Xaa6为Ser;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa9为Lys;Xaa12为Arg;Xaa13为Lys。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa5为Lys;Xaa6为Ser;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa9为Lys;Xaa12为Arg;Xaa13为Lys;Xaa10为Tyr、Lys或Arg;Xaa14为Phe或Phe(4-F)。
本发明所涉及的氨基酸残基包括天然氨基酸,也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表1所示,本发明所涉及的非天然氨基酸所对应的代码表及结构如表2所示。
本发明所涉及的所有氨基酸均为L型氨基酸。
本发明所涉及的多肽为线性肽时,其C末端既可以是羧酸的形式,也可以是酰胺的形式,优选以酰胺形式存在。
表1:天然氨基酸三字母代码表
表2:非天然氨基酸和脂肪酸的代码表及结构
本发明优选的一个实施方式中公开了一种线性多肽(CAMP-1),其氨基酸序列为Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:3)
本发明的又一个优选实施方式公开了一种带脂肪链的多肽(CAMP-28),其氨基酸序列为:Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:4)
本发明另一个优选的实施方式中公开了一组线性多肽(CAMP-2,CAMP-3,CAMP-4,CAMP-5,CAMP-6,CAMP-7,CAMP-8,CAMP-9,CAMP-10,CAMP-11,CAMP-12,CAMP-13,CAMP-14,CAMP-15,CAMP-16,CAMP-17,CAMP-18,CAMP-19,CAMP-20,CAMP-21,CAMP-22,CAMP-23,CAMP-24,CAMP-25,CAMP-26,CAMP-27,CAMP-29,CAMP-30,CAMP-31,CAMP-32,CAMP-33)其氨基酸序列分别为:
Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-Arg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:5)
Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:6)
Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:7)
Dab-Arg-Leu-Thi-Dap-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:8)
Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:9)
Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQID NO:10)
Gly-Arg-Leu-Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:11)
Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:12)
Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:13)
Cpa-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:14)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:15)
Phe(4-F)-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:16)
Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:17)
Phe-Phe-Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:18)
Phe-Dab-Thr-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:19)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:20)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:21)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Trp-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:22)
Thi-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:23)
Thi-Dab-Ser-Trp-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:24)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:25)
Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:26)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:27)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:28)
Phe-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:29)
Arg-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:30)
Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:31)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH2(SEQ ID NO:32)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:33)
Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:34)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH2(SEQ ID NO:35)
本发明还提供了上述线性多肽或其药学上可接受的盐在制备抗大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、耐药鲍曼不动杆菌和耐药铜绿假单胞菌的药物中的应用。
本发明还提供了上述线性多肽的制备方法,可以采用固相化学合成技术制备线性肽,制备步骤如下:
(1)在树脂上固相合成多肽;
(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解,优选三氟乙酸;并加入侧链保护基清除剂,然后用5-20倍体积的冰乙醚沉淀多肽,离心,弃上清,再用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次,真空干燥,得到粗肽。
本发明所涉及的多肽C末端若为羧酸形式,则步骤(1)采用Wang树脂进行合成;本发明所涉及的多肽C末端若为酰胺形式,则步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。
步骤(1)是在液相环境中进行,具体包括:浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基(顺序偶联剩余氨基酸)—干燥树脂。
其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲基羰基(Fmoc),优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。
固相多肽合成中,对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护,例如Arg或hArg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)保护;Lys及Trp可以采用叔丁氧羰基(Boc)保护;Tyr可以采用叔丁基(tBu)保护;Dap可以采用Mtt或BOC保护;Dab可以采用BOC保护;本发明中,Fmoc-L-Dap(Mtt)-OH具有如下所示的结构:
所述的保护基团不限于此,可以根据本领域常规方案进行合理选择。
步骤(1)的液相环境所用溶剂选自:二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM),优选DMF。
步骤(1)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂,氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺溶液,浓度为10-40%(PIP体积/DMF体积),脱除时间为20-50min;优选浓度为20-25%(PIP体积/DMF体积),脱除时间25-35min。
步骤(1)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂,偶联试剂由:碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。
碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt),或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt),进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
步骤(1)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
步骤(1)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
步骤(2)所述的侧链保护基清除剂包括但不限于茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇、间甲酚或上述任意两种或者两种以上的组合,并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20%(V/V)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA):茴香硫醚:75%苯酚:水=85:5:5:5。
本发明的制备方法中,可以进一步包含正辛酸的偶联。具体而言,若制备的多肽为带脂肪链的多肽,则当偶联到带脂肪链氨基酸位置时,先偶联相应的不带脂肪链的氨基酸,再加入正辛酸和偶联剂,监测至反应完成时,再偶联下一个氨基酸。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求,本发明所提供的多肽制备方法还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法,优选反相色谱法。
本发明所涉及多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC),培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基以及改良型RPMI-1640培养基。以两性霉素B、硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明,本发明提供的抗菌肽具有更高的抗菌活性,特别抗阴性菌(如铜绿假单胞菌)或抗耐药菌(如耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌)的活性得到显著改善。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面,不是本发明主题的局限。