CN110272501A

CN110272501A - 猪源杂合防御肽pl-5及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110272501A
Application number: CN201910629534.3A
Authority: CN
Inventors: 马清泉; 董娜; 程宝晶; 单安山; 李建平; 周昕博
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110272501B

Abstract

本发明提供一种猪源杂合防御肽PL‑5及其制备方法和应用，其序列如序列表SEQ ID No.5所示。本发明首先分析猪源防御肽PMAP‑23的氨基酸组成和排列特点，通过取代或截取方式取得N末端或C末端区域，并与LPS绑定序列相互连接，获得不同长度的杂合肽；然后使合成多肽；将合成的多肽进行纯化，并利谱法进行鉴定；最后，通过最小抑菌浓度和溶血试验测定猪源杂合肽的抑菌活性和细胞毒性，筛选具有较理想活性的多肽。本发明的有益效果：(1)该多肽衍生自猪源防御肽PMAP‑23，安全性较好，具有广谱抗菌活性和无残留特点；(2)该多肽由23个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。

Description

猪源杂合防御肽PL-5及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源杂合防御肽PL-5及其制备方法和应用。

背景技术

目前，在动物生产中使用抗生素治疗和预防病菌感染对于保证动物健康发挥重要作用，应用十分普遍。但是，细菌耐药性和药物残留等问题随抗生素的长期滥用而逐渐凸显，严重破坏养殖业的可持续发展，间接威胁人类的健康和食品安全。近年来许多国家已经禁止部分抗生素的使用，因此需要研究一种新型的有效传统抗生素替代物，保证动物的健康养殖。研究发现，防御肽具有不同于传统抗生素的抑菌机制，不易使病菌产生耐药性，同时还具有热稳定性强、抗酶解、无残留等优点。

已知，猪源防御肽PMAP-23在猪的自身免疫和抗病方面发挥重要的生物学作用。结合生物信息学等分析方法，发现PMAP-23富含疏水性和正电荷残基，这对其抗菌活性具有重要作用。但是，PMAP-23的最小抑菌浓度达到2-8μM范围，溶血活性在128μM时即达到5％，其治疗指数仅为36，远低于实际应用所要求的阈值。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猪源杂合防御肽PL-5及，该杂合肽衍生自猪源防御肽PMAP-23，其治疗指数达到288，具有高抑菌活性和低毒性，安全性较好，具有广谱抗菌活性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪源杂合防御肽PL-5，其序列如序列表SEQ ID No.6所示。

本发明的另一目的在于提供一种猪源杂合防御肽PL-5的制备方法，该杂合肽由23个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低，制备方法步骤如下：

(1)根据猪源防御肽PMAP-23的疏水性氨基酸和电荷分布特点，通过取代或截取PMAP-23的C末端或N末端部分残基，并与脂多糖绑定序列：GWKRKRFG相互连接，获得氨基酸长度从16至23不等的杂合肽，它们的序列分别如序列表SEQ ID No.1-6所示；

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成多肽；

(3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备；

(4)通过最小抑菌浓度和溶血试验测定衍生抗菌肽的抑菌活性和细胞毒性，发现肽PL-5的最小抑菌浓度为1-2μM，强于其它杂合肽的抑菌活性；而在256μM浓度未发现溶血性，证明其无毒性，综合抑菌活性和溶血活性，肽PL-5的治疗指数为288，为所有杂合肽中最大，从而选取杂合防御肽PL-5，其序列如序列表SEQ ID No.5所示。

本发明的另一目的在于提供以上所述的一种猪源杂合防御肽PL-5在治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果：采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，发现筛选的肽PL-5的最小抑菌浓度平均值为1.78μM，比其它杂合肽的抑菌活性高；而且其在256μM浓度没有发现溶血活性，其治疗指数达到288，综合评价已达到较高水平，进一步推进了防御肽在治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。该杂合肽衍生自猪源防御肽PMAP-23，其治疗指数达到288，具有高抑菌活性和低毒性，安全性较好，具有广谱抗菌活性；该杂合肽由23个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。

附图说明

图1为防御肽PMAP-23的质谱图；

图2为防御肽PL-1的质谱图；

图3为防御肽PL-2的质谱图；

图4为防御肽PL-3的质谱图；

图5为防御肽PL-4的质谱图；

图6为防御肽PL-5的质谱图；

图7为防御肽PL-6的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：猪源杂合防御肽的设计

通过NCBI获取猪源防御肽PMAP-23氨基酸全序列，通过截取C末端或N末端残基获得多肽的核心区域，并将残基D替换为带正电荷的R以提高正电荷数量；并将这些多肽与并与脂多糖绑定序列：GWKRKRFG相互连接，以增加多肽对细菌的粘合力，增强杀菌效率。获得长度从16至23不等的6条杂合肽PL-1，PL-2，PL-3，PL-4，PL-5，PL-6。如表1所示。

表1猪源杂合防御肽的氨基酸序列和分子量

实施例2：猪源杂合防御肽的合成

将表1所示七条多肽使用多肽合成仪合成，选用固相有机合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C端到N端逐一进行，具体步骤如下：

(1)选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三酮检测剂检查A-Wang脱保护的质量。

(2)将Fmoc-B(trt)-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B为每个防御肽C端第二个氨基酸)与上述得到的脱保护的Wang树脂进行缩合反应；然后再脱去Fmoc基团。按照这个程序依次从C端到N端逐个延伸，直至将整个肽链合成完毕，当最后一个氨基酸脱保护后，用DMF洗涤8次，再用乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗涤8次。将三氟乙酸(TFA)：三异丙基氯硅烷(TIS)：水＝95：2.5：2.5(体积比)进行混合，配制成为切割试剂与上述得到的多肽20℃下反应2h，把多肽从树脂上切割下来。旋转蒸发仪蒸发TFA，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚沉淀多肽3h，析出白色粉末状固体。真空干燥，得到粗品多肽。

(3)将上述粗品多肽使用90％乙腈水溶液溶解，使用制备色谱柱进行纯化，分析型色谱柱检测纯度。半制备型高效液相色谱仪为Waters Delta Prep 4000，制备色谱柱为Waters X-Bridge C₁₈、5μm反相柱。洗脱液A为含有0.1％ TFA的水溶液，B为含有0.1％ TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm，洗脱方式为30％B～65％B的线性浓度梯度洗脱，流速为30mL/min。收集纯度高于95％的馏分，并冷冻干燥。分析型高效液相色谱仪为Agilent1100，分析型色谱柱为SepaxGP-C₁₈反相柱(4.6mm×150mm,5μm)，洗脱液A液为0.1％ TFA的水溶液，B液为含0.1％ TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。洗脱方式为50％B～75％B的线性浓度梯度洗脱，流速为1.0mL/min。

(4)多肽的质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷射质谱法分析，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。如附图1-7所示。使用高效液相色谱进行纯化，使得防御肽的纯度大于95％。

实施例3：猪髓源PMAP-23衍生抗菌肽的抑菌活性测定

采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，同时针对抗菌肽的阳离子性的特征，以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为多肽稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。具体步骤如下：

(1)菌体的准备：取冻存于-20℃的待测菌，划线接种于MH(A)培养基中孵育。挑取单菌落，接种于10mL MH(B)培养基中，37℃、200rpm过夜培养。然后再将过夜菌体接种于新鲜的培养基中，培养1～2h，直至菌体处于对数生长期，使其OD600＝0.4，用MH(B)将所得菌液的菌落数调整为大约10⁵ CFU/mL左右；

(2)肽的准备：将多肽的浓度调整为256μM，吸取100μL加入到96孔板的第1列孔内，其它孔中加入50μL MH肉汤培养基，然后将第1号孔中的多肽溶液吸出50μL，加入第2号孔内，依次类推倍比稀释至第10号孔，吸出50μL弃去；

(3)接种菌：用加样枪取上述调整好的50μL菌液依次加到96孔板的前11列孔中，最终接种细菌浓度为每孔5×10⁴ CFU/mL。将96孔板置微型振荡器上振荡1min，使各孔内液体混匀，微孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并于37℃下孵育20～24h。其中设定阳性对照组为第11孔：即只加50μL MH肉汤培养基和50μL菌液；阴性对照为第12孔无菌对照组：即只加100μL MH肉汤培养基。这时从第1孔到第10孔抗菌肽的浓度将依次递减；

(4)结果判断：无菌对照孔在整个试验过程中应始终保持清亮，表明整个试验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状、孔底出现沉淀等)相比较进行判断，无肉眼可见生长的最低浓度为测定肽对检测菌的MIC值。

测定结果如表2所示。可以看出，杂合肽PL-2，PL-4，PL-5，PL-6的最小抑菌浓度分别为2.00，3.17，1.78和2.83μM，活性均强于天然防御肽PMAP-23，其中PL-5的活性最强，具有最优的抑制革兰氏阴性和阳性菌生长的能力。

表2猪源杂合防御肽的抑菌活性

备注：GM：代表最小抑菌浓度的几何平均数。

实施例4：猪髓源PMAP-23衍生抗菌肽的溶血活性和治疗指数

对于肽溶血活性的测定，具体试验步骤如下：

(1)使用肝素钠抗凝管采集新鲜的人血液1mL，4℃保存备用；

(2)将上述的血液1000×g离心5min，弃除上清，收集红细胞；

(3)将收集到的红细胞用PBS缓冲溶液洗涤三遍，在1000×g条件下离心5min，弃上清，收集红细胞，最后用约10mL左右的PBS缓冲溶液重悬细胞；

(4)多肽的稀释：向排列好的每排12个EP管的第1号管内加入90μL PBS缓冲溶液，其余管中都加入50μL PBS缓冲溶液，再向第1号管内加入10μL待测肽母液，然后将第1号管中的多肽溶液混匀吸出50μL，加到第2号管内，依次倍比稀释至第10号后，吸出50μL弃去；

(5)取50μL上述准备好的红细胞悬液分别加入到含有不同浓度抗菌肽溶液的EP管中，在37℃培养箱内恒温孵育1h。其中，第11孔加50μL PBS和50μL红细胞悬液作为阴性对照，第12孔加50μL 0.1％Triton X-100和50μL红细胞悬液作为阳性对照；

(6)lh后取出EP管，在4℃条件下1000×g离心5min；

(7)吸取上述离心溶液的上清，平行转移到一个洁净的96孔板对应的孔中，用酶标仪在570nm(OD_570nm)处测定光吸收值。

从表3的结果可以看出，猪源防御肽PMAP-23在128μM时具有5％溶血活性，而PL-4，PL-5，PL-6在最大测定浓度256μM时没有发现溶血活性。通过治疗指数判断，即：最小溶血浓度(MHC)与最小抑菌浓度几何平均数(GM)的比值，可以看出PL-5的治疗指数达到288，远高于其它衍生肽，因此PL-5具有最优的杀灭细菌同时兼顾较弱的溶血毒性，具有较理想的应用前景。

表3猪源杂合防御肽的溶血活性和治疗指数

备注：GM：代表最小抑菌浓度的几何平均数

“--”代表在最大测定浓度256μM时，没有发现对红细胞的溶血活性。

治疗指数＝最小溶血浓度/GM。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 猪源杂合防御肽PL-5及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ile Ile Asp Leu Leu Trp Arg Val Arg Arg Gly Trp Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Phe Gly

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Ile Ile Arg Leu Leu Trp Arg Val Arg Arg Gly Trp Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Phe Gly

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Trp Lys Arg Lys Arg Phe Gly Lys Phe Val Thr Val Trp Val Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Phe Val Thr Val Trp Val Arg Gly Trp Lys Arg Lys Arg Phe Gly

1 5 10 15

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Ile Ile Arg Leu Leu Trp Arg Val Arg Arg Pro Gln Lys Pro Gly

1 5 10 15

Trp Lys Arg Lys Arg Phe Gly

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Trp Lys Arg Lys Arg Phe Gly Pro Gln Lys Pro Lys Phe Val Thr

1 5 10 15

Val Trp Val Arg

20

Claims

1.一种猪源杂合防御肽PL-5，其特征在于：其序列如序列表SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的一种猪源杂合防御肽PL-5的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成多肽；

3.根据权利要求1所述的一种猪源杂合防御肽PL-5在治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。