CN113603748A - 一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种β‑折叠抗菌肽HINGE‑RV及其制备方法和应用。抗菌肽的序列如SEQID No.1所示。选择猪骨髓源抗菌肽PMAP‑23的铰链结构PXXP作为转角单元，在两个脯氨酸Pro中间加入两个色氨酸Trp，选择PWWP作为抗菌肽HINGE‑RV的β‑转角。选择带正电荷的精氨酸Arg和疏水性氨基酸缬氨酸Val作为基本结构单元，通过四次交替排列精氨酸Arg和缬氨酸Val序列，构成β‑折叠的反向平行片层，最后得到含有20个氨基酸残基的β‑折叠抗菌肽HINGE‑RV。本抗菌肽具有成为革兰氏阳性菌或阴性菌感染的抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。本抗菌肽具有较好的抑菌活性和生物相容性，表明其是一种较为理想的抗生素替代物。

Description

一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用

技术领域

本发明归属于农业畜牧兽医领域，提供了一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素是20世纪以来最重要的医学发现之一，其在医学、食品、畜牧等行业有着广泛的应用。在畜牧业中，抗生素具有杀灭病原菌、促进畜禽快速生长的优点，为畜牧业发展带来了巨大贡献。但是抗生素的滥用也引起了畜禽体内药物残留超标、细菌耐药性不断增加、环境污染、危害人体健康的一系列问题。我国在2020年提出禁止除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂的使用。因此，迫切需要研发出一类新型有效、绿色安全、不受传统细菌耐药性机制影响的新型抗生素替代物。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是存在于生物体免疫系统中的一类小分子多肽，又称宿主防御肽。由于其来源广、种类多、具有广谱抗菌活性(包括细菌、病毒、真菌等)、且不易产生耐药性等原因，成为理想的抗生素替代品之一。但是在AMPs的研究过程中，很多高抗菌活性的肽，还具有一定的细胞毒性，使其无法投入到畜牧业使用中。寻找设计高抗菌活性低细胞毒性AMPs的方法，是能否实现其替代抗生素应用于动物生产的关键环节。α-螺旋和β-折叠是AMPs中常见的两个结构。有研究表明，具有相同电荷和疏水性的条件下，β-折叠AMPs比α-螺旋AMPs具有更高的选择性。尽管β-折叠AMPs的选择性更高，但是α-螺旋AMPs的应用却更为广泛。这是由于天然的β-折叠AMPs中通常含有二硫键，增加了合成成本。因此，在不使用昂贵的非天然氨基酸、不引入二硫键的情况下，如何提高抗菌肽的抗菌活性，降低抗菌肽的细胞毒性和合成成本是急需解决的问题。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的是为了提供一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV，其序列如SEQ ID No.1所示，该抗菌肽打破原有的β-折叠结构，提高了抗菌活性，降低抗菌肽细胞毒性和合成成本。

本发明的另一目的在于提供一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV的制备方法，步骤如下：

1)首先，选择猪骨髓源抗菌肽PMAP-23的铰链结构PXXP作为转角单元，在两个脯氨酸Pro中间加入两个色氨酸Trp，选择PWWP作为抗菌肽HINGE-RV的β-转角；

2)然后，选择带正电荷的精氨酸Arg和疏水性氨基酸缬氨酸Val作为基本结构单元，通过四次交替排列精氨酸Arg和缬氨酸Val序列，构成β-折叠的反向平行片层，最后得到含有20个氨基酸残基的如SEQ ID No.1所示的序列；

3)最后，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成β-折叠抗菌肽HINGE-RV的制备。

本发明的另一目的是提供一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引发的感染性疾病药物中的应用。

本发明的设计原理：通过观察富含脯氨酸的猪骨髓源抗菌肽PMAP-23的二级结构，发现在其序列中心位置存在一个PXXP(X为除脯氨酸外的任意氨基酸)的灵活铰链结构，且铰链的存在提高了抗菌肽对细菌细胞膜的插入作用。色氨酸可与脂质的疏水尾部相互作用，有助于膜的插入。因此，选择PWWP为β-转角。富含精氨酸的抗菌肽比富含赖氨酸的抗菌肽具有更强的膜静电吸引作用，而且，精氨酸可拉动阴离子膜上的磷脂致使其形成环形孔。缬氨酸可促进β-折叠片层的延伸。因此，选择精氨酸和缬氨酸交替排列构成β-折叠的反向平行片层，并借助交替排列氨基酸间的氢键作用提供作用力稳定β-折叠结构。抗菌肽HINGE-RV打破原有的β-折叠结构，提高抗菌肽的抗菌活性，降低抗菌肽细胞毒性和合成成本。

本发明具有如下有益效果及优点：通过本方法制备的抗菌肽HINGE-RV试验技术路线简单，由PWWP铰链结构提供转角单元，以交替排列的精氨酸和缬氨酸构成β-折叠片层，通过片层间的氢键作用稳定折叠构象，设计得到β-折叠抗菌肽。此方法避免了天然的β-折叠AMPs依赖半胱氨酸形成二硫键构成β-折叠结构，有效降低了合成成本，同时抑制了AMPs的毒性。本方法设计得到的抗菌肽HINGE-RV通过计算机预测表现出β-折叠结构，表明β-折叠抗菌肽设计成功。对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现HINGE-RV对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等几种测定的革兰氏阳性菌和阴性菌都具有强抑菌活性，且具有较好的生物相容性。综上所述，抗菌肽HINGE-RV具有成为革兰氏阳性菌或阴性菌感染的抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。

附图说明

图1为抗菌肽HINGE-RV的反相高效液相色谱图；

图2为抗菌肽HINGE-RV的质谱图；

图3为抗菌肽HINGE-RV的计算机结构预测图；

图4为抗菌肽HINGE-RV的溶血活性图；

具体实施方法

下面举例对本发明做进一步的说明：

实施例1

1.1抗菌肽的设计

抗菌肽HINGE-RV的氨基酸序列为：

以PWWP为转角单元，以精氨酸和缬氨酸的交替连接作为β-折叠结构的两条侧链设计出模板XYXYXYXYPWWPYXYXYXYX-NH₂，X为正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸，当X＝R，Y＝V时，抗菌肽命名为HINGE-RV。抗菌肽的序列如表1所示。

表1抗菌肽的氨基酸序列

HINGE-RV的序列长度为20，转角单元为PWWP单元，将肽的C端酰胺化以提高一个正电荷，电荷数为+9。该方法使多肽在不含半胱氨酸对形成的二硫键条件下，形成稳定的β-折叠结构，具有高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性。

实施例2

2.1抗菌肽的合成和鉴定

设计得到的抗菌肽使用多肽合成仪，通过固相合成法合成，经电喷雾质谱法鉴定和反相高效液相色谱纯化，得到目标化合物，用于后续结构和活性测定。

抗菌肽HINGE-RV的反相高效液相色谱图见附图1。

抗菌肽HINGE-RV的质谱图见附图2。

实施例3

3.1计算机软件预测抗菌肽的二级结构

应用在线的结构预测软件I-TASSER，输入氨基酸序列预测抗菌肽的二级结构。

抗菌肽HINGE-RV的计算机结构预测图见附图3。从图中可以看出抗菌肽HINGE-RV表现出标准的β-折叠结构。

实施例4

4.1抗菌肽的最小抑菌浓度

将肽配置成为2.56mM储存液用于生物活性测定。将待测菌种接种于新鲜的MH(B)肉汤培养基培养过夜，最后将所得菌液的菌落数调整为约10⁵CFU/mL用于接种。取无菌的96-孔培养板，以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。将抗菌肽储存液加入到96-孔培养板的稀释液中，进行2倍的梯度倍比稀释，然后接种菌液。其中以不加抗菌肽组作为阳性对照，以不接种细菌组作为阴性对照。确定所有试验操作是在无菌环境下进行的。将培养板于37℃培养箱中孵育18-20h，无肉眼可见细菌生长的最低药物浓度即为该测定药物对检测菌的最小抑菌浓度。

抗菌肽的最小抑菌浓度见表2。从表中可以看出，抗菌肽HINGE-RV对测定的6种菌株都表现出极强的抗菌活性，最小抑菌浓度分别为4μM或8μM。

表2抗菌肽的最小抑菌浓度

4.2抗菌肽的溶血活性

使用肝素钠抗凝管采集新鲜的人的血液1mL，1000×g离心5min，弃除上清，收集红细胞。将收集到的红细胞用PBS缓冲溶液洗涤三遍，弃上清，重悬血细胞定容至10mL。首先取无菌96-孔培养板，在其中加入PBS缓冲溶液，再加入待测抗菌肽，作2倍的梯度倍比稀释，然后加入等体积的血细胞溶液，37℃孵育1h，使用96-孔培养板离心机，1000×g离心5min，收集上清。使用酶标仪在570nm处测定吸光度值。本试验以0.1％Tritonx-100组作为100％溶血的阳性对照，以不加抗菌肽组作为阴性对照，最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见说明书附图4。

为了评估抗菌肽的安全性，研究了在1～256μM浓度范围内的肽对人血红细胞的溶血行为。由说明书附图4可以看出，抗菌肽HINGE-RV在5％溶血时的肽浓度为128μM，说明抗菌肽HINGE-RV具有很好的生物相容性。

以上结果显示，以PWWP为转角单元，以精氨酸和缬氨酸的交替连接作为β-折叠结构的两条侧链的抗菌肽HINGE-RV具有较好的抑菌活性和生物相容性，表明其是一种较为理想的抗生素替代物。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> STRAND

<222> (9)..(12)

<400> 1

Arg Val Arg Val Arg Val Arg Val Pro Trp Trp Pro Val Arg Val Arg

1 5 10 15

Val Arg Val Arg

20

Claims (3)

1.一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV，其序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)首先，选择猪骨髓源抗菌肽PMAP-23的铰链结构PXXP作为转角单元，在两个脯氨酸Pro中间加入两个色氨酸Trp，选择PWWP作为抗菌肽HINGE-RV的β-转角；

2)然后，选择带正电荷的精氨酸Arg和疏水性氨基酸缬氨酸Val作为基本结构单元，通过四次交替排列精氨酸Arg和缬氨酸Val序列，构成β-折叠的反向平行片层，最后得到含有20个氨基酸残基的如SEQ ID No.1所示的序列；

3)最后，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成β-折叠抗菌肽HINGE-RV的制备。

3.根据权利要求1所述的一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引发的感染性疾病药物中的应用。

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