WO2019039826A1 - 그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2019039826A1
WO2019039826A1 PCT/KR2018/009577 KR2018009577W WO2019039826A1 WO 2019039826 A1 WO2019039826 A1 WO 2019039826A1 KR 2018009577 W KR2018009577 W KR 2018009577W WO 2019039826 A1 WO2019039826 A1 WO 2019039826A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antimicrobial
pharmaceutical composition
antimicrobial polypeptide
cath
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/009577
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박찬규
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Publication of WO2019039826A1 publication Critical patent/WO2019039826A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/34635—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a novel antimicrobial polypeptide derived from a Heterocephalus glaber , and a pharmaceutical composition comprising the same. More particularly, the present invention relates to a novel antimicrobial polypeptide derived from a bacterium, And a pharmaceutical composition containing the same.
  • Antimicrobial peptide known as host defense peptide (HDP)
  • HDP host defense peptide
  • Cathelicidin is a type of AMP found in most vertebrates including humans, monkeys, rats, mice, rabbits, cows, guinea pigs, goats, sheep, horses, birds and ducks. Having a cathelicidin-like domain (CLD), and having an antimicrobial domain in the C-terminal region, including a maturation sequence of a very wide variety of its length and biological activity. They are activated by protein cleavage to release CLD and C-terminal mature peptides, which are used for antimicrobial activity against bacterial, fungal and enveloped viruses, angiogenesis and wound healing, It plays an important role in.
  • CLD cathelicidin-like domain
  • AMP antimicrobial peptide database
  • Bullless mole rats are the longest-lived rodents of very long-lived mammals, with a delayed aging, high fertility until death, and resistance to both spontaneous and experimentally induced cancers. Thus, using its available genomic information, it is very advantageous to investigate the role of AMP, but the function of AMP in the immunity of naked mole rats has not been studied yet.
  • the present invention provides an antimicrobial polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence may be derived from the genome of a naked mole rats.
  • the polypeptide has an alpha-helical structure and may include hydrophobic and positively charged amino acids on the outer surface.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for antimicrobial use comprising said antimicrobial polypeptide.
  • the polypeptide may be one having antimicrobial activity against gram-negative bacteria.
  • the pharmaceutical composition may be one having antimicrobial activity against Gram-negative bacteria including Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , and S. typhimurium .
  • the pharmaceutical composition may comprise the antimicrobial polypeptide at a concentration of 1 to 1,000 [mu] g / ml.
  • the pharmaceutical composition may further comprise at least one pharmaceutically acceptable carrier selected from the group consisting of a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, a diluent and an excipient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier selected from the group consisting of a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, a diluent and an excipient.
  • the present invention also provides a food preservative comprising the antimicrobial polypeptide.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the antimicrobial polypeptide.
  • the antimicrobial peptides derived from the naked mole rats according to the present invention have low hemolytic and cytotoxic activity and have a strong antimicrobial activity against gram negative bacteria.
  • Figure 1 shows the secondary structure predicted in the mature peptide region of naked mole rats (Figure 1a), and the helical wheel modeling (Figure 1b) of the synthesized cathelicidin.
  • the red cylindrical region in Fig. 1A is the? -Helical structure, and the yellow arrow region is the? -Shaped structure.
  • 1B shows that the blue circle of the present invention represents a positively charged amino acid and the yellow circle represents a hydrophobic amino acid.
  • the antimicrobial peptide of the present invention has positively charged and hydrophobic amino acids on the outer surface, and it is possible that the intracellular bacteria bind to the cell membrane and cell death through cell membrane penetration is possible.
  • FIG. 2A shows the number and distribution of hydrophobic amino acid residues
  • FIG. 2B shows the similarity of amino acid sequences compared with other known antimicrobial peptides
  • FIG. 2C shows the net charge values.
  • hydrophobic residues were placed on the outer surface of the polypeptide of the present invention and could form an alpha-helical structure with a maximum similarity of 45.9% to other species.
  • Figure 3 shows the results of multi-sequence alignment of the full-length sequence of 14 Kethelicidins from Hg-CATH and 11 mammalian species.
  • the gap is represented by a dash (-)
  • the same amino acid as the reference Hg-CATH (top) is represented by a dot (.).
  • the four cysteines conserved in the ktelelicidin-like domain (CLD) are shown in star (*).
  • the sequence of the segment at which the mature peptide is active is indicated by an inverted triangle ().
  • Figure 4 shows phylogenetic analysis results of CLD analysis of 19 keltelicidin from 13 vertebrate animals. 102 amino acid sequences of CLD were collected from each cathelicidin. The name of the species is shown in parentheses. The numbers in each branch represent the bootstrap values to support each branch (1000 replication).
  • accession numbers of the sequences are PMAP-36 (NP_001123437.1), PR-39 (NP_999615.1), PMAP-23 (NP_001123448.1), Bac7 (NP_001009301.1), Bac5 NP_777257.1), BMAP-28 (NP_776935.1), CAP18 (NP_001075774.1), rhLL-37 (NP_001028681.1), LL-37 (NP_004336.3), CRAMP (NP_034051.2), rCRAMP (NP_001094194.
  • Figure 5 shows the stability of Hg-CATH peptide in serum.
  • Figure 6 shows the cytotoxicity of sHg-CATH peptides to mammalian cell lines, and the effect of sHg-CATH on 5 mammalian cell lines was evaluated at different concentrations. As a result, cytotoxicity of sHg-CATH was found to be low up to 20 ⁇ g / ml.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measurement of Hg-CATH- (SEM) photograph of ATCC 25922.
  • FIG. 7A shows an enlarged image (10,000-fold enlargement) of a control (peptide-untreated), and
  • FIG. 7B shows an enlarged image (enlarged 20,000-fold) of a peptide-treated strain. This is the result of treatment of Hg-CATH in 2x MIC for 2 h in the log phase of bacteria.
  • the present invention provides an antimicrobial polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antimicrobial polypeptide may be a polypeptide isolated from a species, expressed by gene cloning, or produced by chemical synthesis, but is not limited thereto.
  • the amino acid sequence may be derived from the genome of a naked mole rats. Bullworm mice are the longest-lived rodents, which are characterized by delayed senescence, high fertility until death, resistance to both spontaneous and experimentally induced cancers, so that specific immune proteins different from other organisms can be detected It was expected to be.
  • the antimicrobial polypeptide is characterized by having the amino acid sequence of the mature peptide at the 3'end of the cathelicidin protein identified in naked mole rats.
  • Kettelicidin is an antibacterial protein composed of 10 to 90 amino acids. Structural features include a conserved catecholysin-like domain (CLD) at the 5 'end and a differentially differentiated antimicrobial mature peptide sequence at the 3' end. Particularly, the 3 'end is released to the mature peptide by protein cleavage So that the antimicrobial action can be performed.
  • CLD catecholysin-like domain
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has a length of 15 to 40 amino acids, preferably 20 to 30 amino acids, most preferably 25 amino acids.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may have a homology of 60% or less, preferably 50% or less, with the amino acid sequence of a conventional antimicrobial polypeptide.
  • the mature peptide has an ⁇ -helical structure having a positively charged and hydrophobic amino acid on its outer side .
  • the polypeptide has an alpha-helical structure and may include hydrophobic and positively charged amino acids on the outer surface.
  • the distribution of hydrophobic and positively charged amino acids on the outer surface of the polypeptide improves the binding to the cell wall of the target intrinsic microorganism, especially Gram-negative microorganisms, which has a negative (-) charge, and the ⁇ - As shown in Fig.
  • the antimicrobial polypeptide has an antimicrobial activity against gram negative and gram positive bacteria, preferably a strong antimicrobial activity against gram negative bacteria, and most preferably, Escherichia coli , at least one type of compound (Pseudomonas aeruginosa), and Salmonella typhimurium flock selected from the group consisting of Titanium (Samonella typhimurium) Gram - may have the strongest antimicrobial activity against negative bacteria, but are not limited thereto.
  • Gram-negative bacteria are bacteria that are stained red when stained with Gram stain.
  • the cell walls are thin (about 10 nm), and most of the cell membranes contain a large amount of lipopolysaccharide (LPS) Causing inflammation leading to sepsis and other diseases.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Gram-negative bacteria examples include Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter spp. , Staphylococcus aureus , Streptococcus pneumoniae , Shigella spp. , Gonococci, Neisseria gonorrhoeae , Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Clostridium difficile , Shigella , Yersinia pestis , Pseudomonas aeruginosa , Enterobacteriaceae, (Enterobacteriaceae), Haemophilus (Haemophilus), brucellosis (Brucella), Legionella (Legionella), Burke holde Ria Sepharose cyano (Burkholderia cepacia), Vibrio bacteria (Vibrio), Pomona's malto pilriah (Stenotrophomonas maltophilia
  • Gram-positive bacteria are stained purple when stained with Gram stain and have thick cell walls of peptidoglycan layers.
  • a type of Gram-positive bacteria are Staphylococcus between the nose between (Staphylococci), Streptococcus between (Streptococci), Enterobacter nose (Enterococci), Bacillus (Bacillus), Corinna tumefaciens (Corynabacterium), Listeria monocytogenes (Listeria), Lactobacillus (Lactobacillus) , Actinomyces , and the like, but are not limited thereto.
  • Gram-negative bacteria have a lower infection rate than Gram-positive bacteria, but have a higher mortality rate in infected patients.
  • Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and Streptococcus such as Escherichia coli, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, and the like are increasing in infection rates in hospitals, The mortality rate after infection is higher because it is infected mainly in terminal cancer patients, hematologic cancer patients and elderly people who have weakened immune system.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for antimicrobial use comprising said antimicrobial polypeptide.
  • the pharmaceutical composition may comprise the antimicrobial polypeptide at a concentration of 1 to 1,000 ⁇ g / ml, preferably 1 to 700 ⁇ g / ml, but is not limited to the weight, age, sex, Condition, diet, time of administration, method of administration, excretion rate, severity of disease, and the like.
  • the antimicrobial pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, depending on the intended method.
  • the pharmaceutical composition can be used for the treatment of diseases caused by Gram-negative bacteria.
  • the monitored pathogens having antibiotic resistance include Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pneumoniae bacillus, Acinetobacter bacteria, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella, Bacterial isolate, and Gonococcus, resistance to antibiotics including ciprofloxacin, cefotaxime, ceftazidime, meropenem, imipenem, penicillin, carfenem, and the like. Or have multidrug resistance, which is a problem in the treatment of the diseases caused by them.
  • the diseases caused by them are as follows.
  • Multidrug-resistant Genus Acinetobacter is present in the human respiratory and gastrointestinal tract, but it causes infections in patients with chronic lung disease, diabetics, long-term inpatients, and resuscitators.
  • multiple drug resistant Pseudomonas aeruginosa may be infected by injuries such as burns or surgery, respiratory or eye diseases, and especially in the case of cystic fibrosis and immunodeficiency, lethal sepsis, endocarditis , Peritonitis, malignant otitis externa, chronic purulent otitis media, and spinal osteomyelitis.
  • MDR - For Enterobacteriaceae spp multiple drug resistant Enterobacteriaceae, CRE
  • CRE multiple drug resistant Enterobacteriaceae
  • Salmonella Salmonella
  • Enterobacter claw Oh kegyun Salmonella
  • Enterobacter claw Oh kegyun One of the major pathogens of nosocomial infection is pneumonia, which can lead to death due to sepsis.
  • Carbapenem - resistant Klebsiella pneumoniae is a causative organism of oral and opportunistic infections. It is mainly caused by respiratory infections causing gastroenteritis, urinary tract infection, meningitis, sepsis and acute pneumonia.
  • Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis and Helicobacter pylori are also included.
  • the pharmaceutical composition may further comprise at least one pharmaceutically acceptable carrier selected from the group consisting of a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, a diluent and an excipient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier selected from the group consisting of a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, a diluent and an excipient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components. If necessary, an antioxidant, , And other conventional additives such as a bacteriostatic agent may be added.
  • composition of the present invention can be manufactured in various formulations such as an aqueous solution, a suspension, an emulsion, etc., in the form of injection, pill, capsule, granule, ointment, oral administration agent or tablet.
  • the present invention also provides a food preservative comprising the antimicrobial polypeptide.
  • the food preservative may be a food fungicide or a food preservative, but is not limited thereto.
  • Examples of the food preservative include food acceptable additives such as dihydroacetic acid, potassium sorbate, calcium sorbate, sodium benzoate, potassium benzoate, calcium benzoate, methyl paraoxybenzoate, propylparabenzoate, sodium propionate and calcium propionate But are not limited thereto.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the antimicrobial polypeptide.
  • the feed additives may include, but are not limited to, those commonly used in the manufacture of feeds such as glucose, peptone, yeast extract, dibasic phosphorus, magnesium sulfate, cysteine and the like.
  • Hg-CATH we also determined mature peptide regions in the candidate and named Hg-CATH, where "Hg” refers to the naked mole and “CATH” refers to the cathelicidin.
  • APD3 which is a representative antimicrobial peptide database (http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php), was used to analyze the hydrophobicity, net charge and sequence similarity for AMP present in Hg-CATH .
  • MSA Multiple Sequence Alignment
  • N-terminal region in the Hg-CATH excluding the nine amino acids at the end of the mature peptide.
  • N-SKFFRKARKKLGKGLQKIKNVLRKY-C truncated at the end of Hg-CATH was chemically synthesized by solid phase peptide synthesis and purified by high performance liquid chromatography (HPLC) of GenScript to give sHg-CATH Respectively.
  • Antibacterial activity tests were carried out on all strains except Streptococcus inia KCTC 3657 using a colorimetric method using a cell survival assay kit-WST (Dojindo).
  • a single colony-derived pre-inoculum of each bacteria in 5 ml of LB medium was prepared by incubating overnight at 37 ⁇ ⁇ . Overnight cultures were washed in 96-well plates with sterile saline (0.9% NaCl) containing 180 ⁇ l / well of fresh Mueller-Hinton (MH) and then inoculated at 10 5 cfu / well.
  • SHg-CATH at different, continuously diluted concentrations (0.5-70 [mu] g / ml) was diluted in 10 [mu] l MH medium and added to each well and incubated at 37 [deg.] C for 6 hours. In addition, 10 [mu] l of chromogenic reagent was added, followed by incubation at 37 [deg.] C for another 2 hours. Plates were read at 450 nm UV using a microplate spectrophotometer (Biorad). Since the Streptococcus inei KCTC 3657 grows extremely slowly in the liquid medium, the antimicrobial activity was evaluated using the disk diffusion method.
  • a single colony of Escherichia coli ATCC 25922 was inoculated into 5 ml of LB medium and incubated overnight at 37 ° C.
  • the pre-inoculum of E. coli was washed with sterile 0.9% physiological saline and inoculated at 10 5 cfu / well with 180 ⁇ l / well MH medium in 96-well plate.
  • SHg-CATH at various concentrations (1-5 ⁇ g / ml) were dissolved in 50% (v / v) fetal bovine serum (FBS; Hyclone TM) and incubated at 37 ° C. for 0, 30, 60 and 100 minutes, respectively .
  • the viability of the cultured peptides against E. coli ATCC 25922 was tested as described above and repeated twice.
  • Freshly prepared chicken erythrocytes were washed 3 times with phosphate-buffered saline (PBS) and resuspended to 2% (v / v) in PBS. 100 ⁇ ⁇ of the suspension was added to a 96-well microtiter plate containing the same volume of sHg-CATH such that the final concentration of the peptide contained the above ranges. PBS and 1% (v / v) Triton-X 100 were used as 0% and 100% hemolytic controls, respectively. The plates were left at 37 ⁇ ⁇ for 1 hour. The plate was then centrifuged and the supernatant transferred to a new plate.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the efflux of hemoglobin in the supernatant was monitored by absorbance at 550 nm using a microplate reader (Perkin-Elmer Victor X4). Results were collected from three separate experiments.
  • Hemolysis rate (%) 100 x (OD peptide -OD negative control ) / (OD positive control - OD negative control )
  • the cells were isolated by the addition of Accutase (Innovative Cell Technologies) and incubated in Dulbecco's Modified Medium containing 5% CO 2 and 37 ° C containing 10% FBS (Hyclone TM) and 1% Penicillin / Streptomycin (Hyclone TM ) After culturing to 80% density in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Hyclone TM), 1-4 ⁇ 10 4 cells were dispensed into each well of a 96-well plate (Sigma Aldrich).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • SHg-CATH diluted differently from each other to a final concentration of 5, 10, 20, 25, 30 and 64 / / ml, was added to each well of the plate and incubated for 24 hours at 5% CO 2 and 37 ⁇ .
  • wells treated with Triton-X 100 (Sigma Aldrich) and untreated wells were used, respectively.
  • E. coli ATCC 25922 cells of 0.2 OD 600 were inoculated in LB medium containing 2 x MIC (1.5 ⁇ g / ml) of sHg-CATH and incubated at 37 ° C. And cultured for 2 hours. The cultured cells were harvested by centrifugation at 4,500 rpm for 5 minutes, and 1 x PBS was added to the cell pellet and washed. The cells were then treated with 2% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde (Sigma Aldrich) in 1X PBS and allowed to stand overnight at 4 ⁇ ⁇ .
  • BLAST analysis of these vertebrate AMPs compared to genomes of naked mole rats revealed that four ⁇ -defensin, 28 ⁇ -dipenesin, 10 katelicidin, two galanin, , 60 kinds of AMP-like proteins derived from eight strains, consisting of two granulin, two LEAP-2, one hepcidin, and eleven species of snake-waffle were identified e-value ⁇ 0.001).
  • the conserved catelin-like domain (CLD) and the antimicrobial domain of the 10 predicted catecholysidine-like sequences of naked mole rats were determined by analysis using the HMMER and AMPA databases, respectively. Only two of the ten predicted catecholysidine-like sequences contained the conserved CLD and the antimicrobial domain at the same time. In that conclusion, one cathelicidin candidate was identified by analysis of the antimicrobial domain in the two catecholysidine-like sequences, and it was found that it contained an estimated antimicrobial domain with more than 30 amino acids. To evaluate its secondary structure, a PSIPRED protein sequence analysis workbench was used.
  • the length, hydrophobicity and net charge of the a-helical structure-containing region (sHg-CATH) were 25 amino acids, 32 hydrophobic, and +11 respectively (see Tables 1 and 2b).
  • the alignment result of sHg-CATH for the existing AMP revealed a maximum sequence similarity of 45.9% for pobRL-37, a typical cationic AMP and cercopithecidae, representative catechirididine (see Fig. 2a).
  • Hg-CATH the cathelicidin candidate
  • Hg-CATH and 11 mammalian species Rattus norvegicus , Mus musculus , Canis lupus familiaris , Bos taurus , Ovis aries , Sus scrofa , Oryctolagus, length sequence of 14 already identified catecholacids derived from cucumbers , cuniculus , Macaca mlatta , Pongo pygmaeus , Pan troglodytes , and Homo sapiens .
  • the CLD of individual catechirizidine was found to be preserved at a high level.
  • Hg-CATH has a unique feature of having longer CLDs than others 2). Since only one cathelicidin was identified in the present invention and there was no previously available nomenclature, the present inventors temporarily named Hg-CATH for the cathelicidin of the naked mole rats. At the C-terminus of the full-length sequence of katellicidin, as expected, the mature peptide was more diversified than in the N-terminal sequence containing CLD (see Figure 3).
  • Hg-CATH In order to study the evolutionary relationship between Hg-CATH and the other catecholizidins from various species, 19 CLDs from 13 vertebrate animals, including 9 mammals, 3 birds, and 3 snakes And a phylogenetic tree based on the sequence was created (see Fig. 4). Consistent with evolutionary relationships among the species, the CLDs of whales (Artiodactyla) were clustered together and the CLDs of reptiles and amphibians were distinct from those of mammalian CLDs. Interestingly, Hg-CATH may have evolved distinctly from primates and Rodentia, which is the result of comparing the full-length amino acid sequences of Hg-CATH with other mammalian cathelicidins as shown in Figure 3 Match.
  • Hg-CATH chemically synthesized Hg-CATH
  • MIC minimal inhibitory concentration
  • sHg-CATH may have antimicrobial activity specifically for Gram-negative bacteria.
  • the peptides were tested against clinically isolated antibiotic resistant strains Escherichia coli and pneumoniae, which showed complete resistance to ampicillin and low resistance to gentamicin.
  • sHg-CATH showed relatively strong efficacy against these pathogens at 32 and 4 ug / ml, respectively.
  • Hemolytic activity of sHg-CATH on chicken erythrocytes was calculated as a measure of cytotoxicity (see Table 3). As shown in Table 3, sHg-CATH showed low hemolytic activity as compared with melitin, an AMP derived from bee venom as a positive control. The hemolysis rate of sHg-CATH was 11% at 50 ⁇ g / ml, but melittin was completely hemolytic (100%) at 12.5 ⁇ g / ml.
  • cytotoxicity of AMP is a major problem when applying AMP to pharmaceutical preparations.
  • sHg-CATHM five mammalian cell lines treated with the peptides at different concentrations (5-20 .mu.g / ml), namely HEK293T (human fetal kidney cells), HaCaT ), PK15 (pig kidney cells), ST ATCC CRL-1746 (pig testicular fibroblasts), and 3D4 / 2 (macrophages of porcine lung).
  • HEK293T human fetal kidney cells
  • HaCaT HaCaT
  • PK15 pig kidney cells
  • ST ATCC CRL-1746 pig testicular fibroblasts
  • 3D4 / 2 macrophages of porcine lung

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균성 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 항균성 폴리펩티드는 벌거숭이두더지쥐(Heterocephalus Glaber) 유래의 신규한 카텔리시딘(cathelicidin) 단백질이며, 그람-음성 다중-약물 저항성 병원체에 대해 강한 항균 활성을 나타내나, 세포 독성 및 용혈성이 낮아 대체 항생제로서 사용될 수 있을 것이다.

Description

그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물
본 발명은 벌거숭이두더지쥐(Heterocephalus glaber) 유래의 신규한 항균 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 그람 음성 박테리아(gram-negative bacteria)에 강한 항균 활성을 갖는 신규한 카텔리시딘 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
항생제의 과용 때문에 다제내성(multiple drug resistance, MDR) 병원체가 발생하여, 미생물 감염의 치료에 사용되는 주요 항균제의 약효를 감소시켜, 전세계적으로 문제가 되고 있다. 숙주 방어 펩티드(host defense peptide, HDP)로 알려진 항균성 펩티드(antimicrobial peptide, AMP)는 선천성 면역의 중요한 구성 요소로서 자연에 널리 분포되어 있는 내재성 항생제로, 신속하고 넓은 범위의 항균 활성 및 통상의 항생제에 비해 낮은 박테리아 내성을 가지므로, 잠재적인 약제로 간주되고 있다. 이들은 크기가 작고 양이온성 및 양친매성을 갖는 분자인데, 미생물 세포벽과 상호 작용을 한 후, 일시적으로 구멍을 내거나 또는 세포 구성요소를 저해함으로서 미생물을 사멸한다.
카텔리시딘(cathelicidin)은 인간, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 소, 기니피그, 염소, 양, 말, 새 및 오리를 포함하는 대부분의 척추동물에서 밝혀진 AMP의 일종으로, N-말단 영역에 보존된 카텔리시딘-유사 도메인(cathelicidin-like domain, CLD)을 갖고, C-말단 영역에 그 길이 및 생물학적 활성이 매우 다양한 성숙 서열을 포함하는 항균성 도메인을 갖는다. 이들은 단백질 분할에 의해 활성화되어 CLD 및 C-말단 성숙 펩티드를 방출하여, 박테리아, 진균 및 외피 보유 바이러스(enveloped virus)에 대한 항균 활성, 혈관신생합성(angiogenesis) 및 상처 치유(wound healing) 등, 면역계에서 중요한 역할을 한다.
첫번째 AMP가 1960년대에 개구리 피부 점막으로부터 발견된 이래, 5,500 종이 넘는 AMP가 항균성 펩티드 데이터베이스(APD)에 업데이트되었다. AMP는 통상 미생물 감염에 의해 구조적으로(constitutively) 발현되거나 또는 유도될 수 있는 유전자-암호화 폴리펩티드이며, 따라서 이들은 AMP의 풍부한 원천인 파충류 및 양서류 동물의 피부 점막과 같은 천연 원천으로부터 분리될 수 있으나, 이들의 분리 및 특성화는 시간이 많이 소요되고 고된 일일 수 있다. 대체적인 방식으로서, 최근 고수율의(high-throughput) 서열 분석으로부터 얻은 게놈 정보의 이용가능성은 게놈-전체 분석과 이의 AMP 데이터 베이스 검색 및 생물정보학적 수단(bioinformatics tool)이 합쳐져서, 상이한 종들의 게놈 서열에서 신규한 AMP를 동정하기 위한 유용하고 강력한 수단이 되고 있다.
벌거숭이두더지쥐는 가장 수명이 긴 설치류로서 매우 오래 사는 포유동물이며, 노화가 지연되고, 죽을 때까지 생식력이 높으며, 자발적 암과 실험적으로 유도되는 암 모두에 대해 저항성을 나타낸다. 따라서, 이의 사용가능한 게놈 정보를 사용하면 AMP의 역할을 조사하기에 매우 유리하나, 벌거숭이두더지쥐의 면역에서 AMP의 기능은 아직 연구되지 않았다.
본 연구에서는, 새로운 AMP를 동정하기 위해 벌거숭이두더지쥐의 게놈 전체에 대한 인실리코(in silico) 분석을 실시하여, 신규한 카텔리시딘 유사 서열을 선별하였고, 이 서열로부터 예측된 항균 활성 도메인 및 2차 구조에 기초하여, 카텔리시딘의 성숙 서열을 화학적으로 합성하여 이의 생물학적 활성을 확인하고자 하였다. 신규한 카텔리시딘인 Hg-CATH은 그람 음성 박테리아에 대해 매우 강한 활성을 나타내었으나, 용혈성 및 세포 독성은 비교적 낮았다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균성 폴리펩티드를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 벌거숭이두더지쥐의 게놈에서 유래인 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 α-나선 구조를 가지며, 외측 표면상에 소수성 및 양전하성 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균성 폴리펩티드를 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 그람-음성 박테리아에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium)을 포함하는 그람-음성 박테리아에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 상기 항균성 폴리펩티드를 1 ~ 1,000 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 및 부형제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균성 폴리펩티드를 포함하는 식품 방부제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항균성 폴리펩티드를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에 의한 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 펩티드는 용혈성 및 세포 독성이 낮으며, 그람 음성 박테리아에 대해 강한 항균 활성을 갖는다.
도 1은 벌거숭이두더지쥐의 성숙 펩티드 영역에서 예측된 2차 구조(도 1a), 및 합성된 카텔리시딘의 나선 휠 모델링(helical wheel modeling)(도 1b)을 나타낸 것이다. 도 1a의 붉은색 원통 영역은 α-나선 구조이고, 노란색 화살표 영역은 β-병풍 구조이다. 또한, 도 1b은 본 발명의 파란색 원은 양전하성 아미노산을 나타내었고, 노란색 원은 소수성 아미노산을 나타내었다.
이로부터, 본 발명의 항균성 펩티드는 외측 표면에 양전하성 및 소수성 아미노산을 가져, 침입균의 세포막에 대한 결합 및 세포막 관통을 통한 세포 사멸이 가능할 것으로 보인다.
도 2는 항균성 펩티드의 데이터베이스인 APD3을 이용하여 본 발명의 합성 항균 펩티드(서열번호 1)를 분석한 결과(http://aps.unmc.edu/AP/alignment/align. php?Se2=SKFFRKARKKLGKGLQKIKNVLRKY)를 나타낸 것으로, 도 2a는 소수성 아미노산 잔기의 갯수 및 분포를 나타내었고, 도 2b는 다른 공지의 항균 펩티드와 비교한 아미노산 서열의 유사도를 나타내었으며, 도 2c는 순전하값을 나타낸 것이다.
상기 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 소수성 잔기들은 본 발명의 폴리펩티드의 외측 표면상에 배치되었고, 알파-나선 구조를 형성할 수 있으며, 다른 종과의 최대 유사도는 45.9%로 나타났다.
도 3은 Hg-CATH와 11개 포유류 종 유래의 14종의 카텔리시딘의 전체 길이 서열을 다중 서열 정렬에 의해 비교한 결과를 나타낸 것이다. 갭은 대쉬(-)로 나타내었고, 기준으로서의 Hg-CATH(최상단)과 동일한 아미노산은 점(.)으로 나타내었다. 카텔리시딘-유사 도메인(CLD) 중 보존된 4개의 시스테인은 별 모양(*)으로 나타나있다. 성숙 펩티드가 활성을 갖도록 하기 위한 분절 부위의 서열은 역삼각형(▼)으로 나타내었다.
도 4는 13종의 척추동물 유래의 19개 카텔리시딘의 CLD를 분석한 계통발생학적인 분석(phylogenetic analysis) 결과를 나타낸 것이다. 각각의 카텔리시딘으로부터 CLD의 102개의 아미노산 서열을 모았다. 종의 명칭은 괄호 안에 나타내었다. 각 분지 상의 숫자들은 각 분지(1000 replication)를 지원하기 위한 부트스트랩(bootstrap) 값을 나타낸다.
서열의 수탁 번호는 PMAP-36(NP_001123437.1), PR-39(NP_999615.1), PMAP-23 (NP_001123448.1), Bac7(NP_001009301.1), Bac5(NP_001009787.1), BMAP-27 (NP_777257.1), BMAP-28(NP_776935.1), CAP18(NP_001075774.1), rhLL-37 (NP_001028681.1), LL-37(NP_004336.3), CRAMP(NP_034051.2), rCRAMP (NP_001094194.1), 포울리시딘(fowlicidin)-1(NP_001001605.1), 포울리시딘-2(NP_001020001.2), 포울리시딘-3(NP_001298106.1), Na-CATH(EU622892), Oh-CATH(EU622894), Bf-CATH(EU622893), 및 Hg-CATH(XP_004834996.1)였다.
도 5는 혈청 중의 Hg-CATH 펩티드의 안정성을 나타낸 것이다. Hg-CATH 펩티드를 50% 소태아 혈청(FBS, v/v) 중에서 0, 30, 60 및 100분 동안 배양한 후, 대장균(E. coli)에 대한 항균 활성을 조사하였다. 상기 모든 시점에서 배양액은 5 ㎍/㎖에서 확실한 항균 활성을 나타내었다.
도 6은 포유류 세포주에 대한 sHg-CATH 펩티드의 세포 독성을 나타낸 것으로, 5개의 포유류 세포주에 대한 sHg-CATH의 영향을 상이한 농도들에서 평가하였다. 그 결과, 20 ㎍/㎖까지는 sHg-CATH의 세포 독성이 낮은 것으로 나타났다.
도 7은 Hg-CATH를 처리한 대장균 ATCC 25922의 주사현미경(SEM) 사진을 나타낸 것이다. 도 7a는 대조군(펩티드-무처리)의 확대 이미지(1만배 확대)을 나타내었고, 도 7b는 펩티드-처리한 균주의 확대 이미지(2만배 확대)이다. 지수 성장기(log phase)의 박테리아에 2시간 동안 2 × MIC에서 Hg-CATH를 처리한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균성 폴리펩티드를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 항균성 폴리펩티드는 생물종에서 분리하거나, 유전자 클로닝에 의해 발현되거나, 화학 합성에 의해 제조된 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 벌거숭이두더지쥐의 게놈에서 유래인 것일 수 있다. 벌거숭이두더지쥐는 가장 수명이 긴 설치류로서, 노화가 지연되고, 죽을 때까지 생식력이 높으며, 자발적 암과 실험적으로 유도되는 암 모두에 대해 저항성을 나타내므로, 다른 생물들과는 다른 특이적 면역 단백질을 탐색할 수 있을 것으로 기대되었다.
일 실시예에서, 상기 항균성 폴리펩티드는 벌거숭이두더지쥐에서 동정된 카텔리시딘 단백질의 3' 말단측의 성숙 펩티드의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
카텔리시딘은 10 ~ 90개 아미노산으로 구성된 항균성 단백질이다. 구조상의 특징으로서는, 5' 말단의 보존된 카텔리시딘 유사 도메인(CLD)과 3' 말단 측의 다양하게 분화된 항균성 성숙 펩티드 서열을 동시에 갖는데, 특히 3' 말단측은 단백질 분할에 의해 성숙 펩티드로 방출되어 항균 작용을 할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 길이는 15개 ~ 40개 아미노산, 바람직하게는 20 ~ 30개 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 아미노산일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 기존의 항균성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 60% 이하, 바람직하게는 50% 이하의 유사성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서는 항균성 펩티드의 데이터베이스인 APD3를 이용하여 소수성 및 순전하, 그리고 기존의 항균성 폴리펩티드와 서열 유사성을 조사한 결과, 상기 성숙 펩티드는 2차 구조상 양전하성 및 소수성 아미노산을 그 외측에 갖는 α-나선 구조를 포함하는 것으로 나타났다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 α-나선 구조를 가지며, 외측 표면상에 소수성 및 양전하성 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 외측 표면 상에 소수성 및 양전하성 아미노산이 분포하게 되면 대상 침입균, 특히 그람-음성균의 전체적으로 (-)전하를 띄는 세포벽에 대한 결합성을 개선하며, α-나선 구조는 대상 침입균의 세포막을 관통하는데 도움이 되는 것으로 생각된다.
일 실시예에서, 상기 항균성 폴리펩티드는 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 대해 항균 활성을 가지며, 바람직하게는 그람-음성 박테리아에 대해 강한 항균 활성을 가질 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피무리움(Samonella typhimurium)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 그람-음성 박테리아에 대해 강한 항균 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그람-음성균이란 그람염색법으로 염색했을 때 적색으로 염색되는 세균으로, 세포벽은 얇고(약 10 nm) 세포막은 외측에 다량의 리포폴리사카라이드(LPS)를 함유하고 있는 것이 대부분이며, LPS는 체내에서 염증을 유발하여 패혈증을 비롯한 다른 질병을 유발한다.
그람 음성균의 종류로는, 대장균, 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터균(Acinetobacter spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 세균성이질균(Shigella spp.), 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 녹농균, 살모넬라 티피무리움, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 쉬겔라(Shigella), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 슈도모나스 에루지노사(Psedomonas aeruginosa), 장내세균속균(Enterobacteriaceae), 헤모필루스(Haemophilus), 브루셀라(Brucella), 레지오넬라(Legionella), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 비브리오균(Vibrio), 스테노프로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 나이세리아(Neisseria)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"그람 양성균"은 그람염색법으로 염색했을 때 자주색으로 염색되며, 펩티도글리칸(peptidoglycan)층으로 된 두꺼운 세포벽을 갖는다. 그람 양성균의 종류로는 스타필로코사이(Staphylococci), 스트렙토코사이(Streptococci), 엔테로코사이(Enterococci), 바실러스(Bacillus), 코리나박테리움(Corynabacterium), 리스테리아(Listeria), 락토바실러스(Lactobacillus), 악티노마이세스(Actinomyces) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
통상, 그람 음성균은 그람 양성균보다 감염률은 낮지만 감염 환자의 사망률이 더 높아 문제가 되고 있다. 특히, 병원내 감염의 경우, 황색포도상구균이나 연쇄상구균 등의 그람 양성균이 감염률은 더 높지만, 그람 음성균은 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 아시네토박터 바우마니이균 등 종류도 많고 감염률이 점차 높아지고 있으며, 주로 면역체계가 약해진 말기암 환자, 혈액암 환자, 노인 등에 감염되므로 감염후 사망률도 더 높다.
본 발명은 또한, 상기 항균성 폴리펩티드를 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 1 ~ 1,000 ㎍/㎖ 농도, 바람직하게는 1 ~ 700 ㎍/㎖ 농도의 상기 항균성 폴리펩티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 본 발명의 항균용 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 그람-음성 박테리아에 의해 유발되는 질병의 치료에 사용될 수 있다.
최근 그람 음성 박테리아의 항생제 내성이 문제가 되고 있어, 이를 대체할 새로운 항생제의 개발이 시급하다. 예를 들어, 항생제 내성을 갖는 감시 대상 병원체는 대장균, 녹농균, 폐렴간균, 아시네토박터균, 스타필로코커스 아우레우스, 폐렴구균, 살모넬라균, 세균성이질균, 임질균 등이 있는데, 이들은 시프로플락사신(ciprofloxacin), 세포탁심(cefotaxime), 셉타지딤(ceftazidime), 메로페넴(meropenem), 이미페넴(imipenem), 페니실린(penicillin), 카르페넴(carfenem) 등을 포함하는 항생제에 대해 단일 내성(resistance)을 갖거나 또는 다제내성을 갖고 있어, 이들이 유발하는 질병의 치료에 문제가 되고 있다.
예를 들어, 이들이 유발하는 질병을 살펴보면 이하와 같다.
다제내성 아시네토박터균(multiple drug resistant Genus Acinetobacter)은 인체 호흡기 및 소화기의 상재균으로 존재하지만, 만성 폐질환자, 당뇨병 환자, 장기 입원환자 및 인공 호흡 기구 착용 환자에서는 감염병을 초래한다.
또한, 다제내성 녹농균(multiple drug resistant Pseudomonas aeruginosa)은 화상이나 외과 수술 등으로 손상된 부위, 호흡기 및 눈 등에 감염될 수 있고, 특히 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 면역 저하 환자의 경우에는 치명적인 패혈증, 내막염, 복막염, 악성 외이도염, 만성 화농성 중이염, 척수 골수염 등을 유발한다.
다제내성 장내세균속균(multiple drug resistant Enterobacteriaceae, CRE)의 경우, 인체에서 주로 장질환과 식중독의 주요원인 세균으로 대장균, 살모넬라균, 엔테로박터 클로아케균을 포함하고 있으며, 특히 엔테로박터 클로아케균은 원내 감염(nosocomial infection)의 주요 원인균 중의 하나로 주로 폐렴을 일으키고, 패혈증으로 사망을 초래할 수 있다.
카바페넴 내성 폐렴간균(Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae)은 인체 구강 및 장관 내 상재균으로, 원내 및 기회 감염의 원인균이다. 주로 호흡기에 감염하여 위장관염, 요로감염, 뇌수막염, 패혈증 및 급성 폐렴 등을 유발한다.
또한, 상기한 이외에도 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 뇌수막염균 (Neisseria meningitidis)와 소화기병 원인균(Helicobacter pylori)도 포함된다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 및 부형제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등의 형태로, 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 연고, 경구투여제 또는 정제 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균성 폴리펩티드를 포함하는 식품 방부제를 제공한다. 상기 식품 방부제는 식품 살균제 또는 식품 보존제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식품 방부제에는 디히드로초산, 소르브산칼륨, 소르브산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, 벤조산칼슘, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 프로피온산 나트륨, 프로피온산칼슘 등, 식품 첨가제에 통상 허용가능한 성분들이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 항균성 폴리펩티드를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다. 상기 사료 첨가제에는 글루코스, 펩톤, 효모추출물, 제2인산, 황산마그네슘, 시스테인 등, 사료 제조에 통상 사용되는 성분들이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 예시할 뿐 본 발명의 청구범위를 제한하지 않는다.
<실시예>
재료 및 방법
1. 벌거숭이두더지쥐의 게놈으로부터 AMP의 인실리코( in silico ) 동정
벌거숭이두더지쥐에서 AMP를 동정하기 위해, UniProtKB/Swiss-Prot로부터 2,488개의 항균성 펩티드의 서열을 다운로드 받았다. 사용된 query는 “antimicrobial peptide AND reviewed:yes"였다. 그 후, 본 발명자들은 척추동물 유래의 8개의 대표적인 AMP 패밀리로 이루어지는 310개의 서열을 수작업으로 선별하고, 벌거숭이두더지쥐(taxid: 10181)의 게놈과 NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov)에서 얻은 비-자발적 단백질 서열 데이터에 대해 BLAST 작업을 수행하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 벌거숭이두더지쥐의 게놈과 크게 매치되는 서열을 선택하였고(e-값 < 0.001), 추가 분석을 위해 10개의 카텔리시딘-유사 서열을 얻었다.
2. 카텔리시딘-유사 서열의 인실리코 분석
보존된 카텔린-유사 도메인(CLD) 및 성숙 펩티드 영역을 결정하기 위하여, 벌거숭이두더지쥐의 10개의 추정 카텔리시딘-유사 서열을 HMMER(https:// www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/) 및 AMPA(http://tcoffee.crg.cat/apps/ampa/do)에 각각 문의하였다. 이후, 카텔리시딘-유사 서열의 2차 구조의 분석은 PSIPRED 단백질 서열 분석 워크벤치(workbench)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), 및 HeliQuest(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/)에 의해 수행되었다. 또한, 본 발명자들은 후보물질 및 명명된 Hg-CATH에서 성숙 펩티드 영역을 결정하였고, 여기에서 "Hg"는 벌거숭이두더지쥐를 나타내고, "CATH"는 카텔리시딘을 나타낸다. 또한, 대표적인 항균성 펩티드 데이터베이스(http://aps.unmc.edu/AP/prediction /prediction_main.php)인 APD3를 사용하여, Hg-CATH의 존재하는 AMP에 대한 소수성, 순전하 및 서열 유사성을 분석하였다.
3. 다중 서열 정렬 및 계통발생학적 분석
11개의 포유류 종들 유래의 14개의 카텔리시딘의 전체 길이 서열들에 의한 다중 서열 정렬(MSA) 분석, 및 13개의 상이한 종들 유래의 19개의 보존된 카텔리시딘-유사 도메인(CLD)의 서열 분석은 MUSCLE을 사용하여 수행하였다. 각각의 카텔리시딘의 CLD 영역의 정보는 SignalP 4.1 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/) 및 HMMER로부터 얻었다. 계통수(phylogenetic tree)는 메가 프로그램 버전 7.0(www.megasoftware.net)을 사용하여 최대 우도법(maximum likelihood method)을 사용하여 작성하였다.
4. sHg-CATH의 합성
2차 구조 예측에 기초하여, 본 발명자들은 Hg-CATH에서 성숙 펩티드의 말단에서 9개의 아미노산을 제외한 N-말단 영역을 선택하였다. Hg-CATH의 끝이 잘려진(truncated) 성숙 영역(N-SKFFRKARKKLGKGLQKIKNVLRKY-C)을 고상 펩티드 합성법에 의해 화학적으로 합성하고, GenScript 사제의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하여, sHg-CATH로 명명하였다.
5. 항균 활성 시험
대장균 ATCC 25922, 녹농균 ATCC 27853, 살모넬라 티피무리움 ATCC 14028, 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 29213 및 바실러스 세레우스　ATCC 10876, 스트렙토코커스 이니애 KCTC 3657, 및 대장균(A15-CF-027-1S-1)으로 이루어지는 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 유래의 총 8개 균주, 및 충북병원(대한민국 전주 소재)에서 임상적으로 분리한 폐렴간균(KBN06903599) 항생제 저항성 균주에 대해 sHg-CATH(합성 Hg-CATH)의 항균 활성 시험을 실시하였다. 세포생존 에세이 키트-WST (Dojindo 사)에 의한 비색법을 사용하여, 스트렙토코커스 이니애 KCTC 3657를 제외한 모든 균주에 의한 항균 활성 시험을 수행하였다. 제조자의 프로토콜에 따라, 5 ㎖의 LB 배지 중의 각 박테리아의 단일 콜로니 유래의 예비-접종원(pre-inoculum)을 37 ℃에서 밤새 배양하여 준비하였다. 밤새 배양한 배양액을 96-웰 플레이트에서 180 ㎕/웰의 신선한 뮬러-힌톤(Mueller-Hinton, MH)을 포함하는 멸균 식염수(0.9% NaCl)에 의해 씻어낸 후, 105 cfu/웰로 접종하였다. 상이하게 연속 희석한 농도(0.5 ~ 70 ㎍/㎖)의 sHg-CATH를 10 ㎕의 MH 배지 중에 희석하여 각 웰에 첨가하고, 이를 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였다. 또한, 10 ㎕의 발색 시약을 첨가한 후, 37 ℃에서 추가로 2시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 분광광도계(Biorad 사)를 사용하여, 450 nm UV에서 플레이트들을 판독하였다. 스트렙토코커스 이니애 KCTC 3657가 액상 배지 중에서 극히 느리게 생장하므로, 디스크 확산법을 이용하여 항균 활성을 평가하였다. 뇌 심장 융합 배지(Brain heart infusion broth)(BD Diagnostic Systems)에서 생장한 단일 콜로니 유래의 스트렙토코커스 이니애 KCTC 3657의 예비 접종원을 OD600에서 0.5 맥팔랜드(McFarland) 표준이 될 때까지 멸균 식염수(0.9% NaCl) 중에 현탁한 후, 5%의 말 혈액(Hanil Komed 사)을 포함하는 양이온-조절된 MH 아가 플레이트에 도말하였다.
본 발명자들은 상이한 일련의 농도들(1 ~ 64 ㎍/㎖)의 sHg-CATH를 종이 디스크(Sigma Aldrich사)에 첨가하고, 상기 디스크들을 건조하여 아가 플레이트(agar plate) 상에 올려놓은 후, 상기 아가 플레이트를 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
6. 혈청 중의 시험관내 안정성 시험
대장균 ATCC 25922의 단일 콜로니를 5 ㎖의 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 대장균의 예비-접종액을 멸균된 0.9% 생리식염수로 씻어내고, 96-웰 플레이트에서 180 ㎕/웰의 MH 배지와 함께 105 cfu/웰로 접종하였다. 다양한 농도(1 ~ 5 ㎍/㎖)의 sHg-CATH를 50%(v/v) 소태아 혈청(FBS; Hyclone™) 중에 용해한 후, 37 ℃에서 각각 0, 30, 60 및 100분 동안 배양하였다. 배양된 펩티드의 대장균 ATCC 25922에 대한 미생물 생존성 시험은 상기와 같이 수행하였고, 두 번 반복하였다.
7. 용혈 활성 시험
새로 준비한 닭 적혈구를 인산염-완충 생리식염수(PBS)로 3회 씻어내고, PBS 중에 2%(v/v)까지 재현탁시켰다. 100 ㎕의 현탁액을 동일 부피의 sHg-CATH을 포함하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하여, 펩티드의 최종 농도가 상기 범위들을 포함하도록 하였다. PBS 및 1%(v/v) Triton-X 100은 0% 및 100% 용혈 대조군으로 각각 사용되었다. 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후, 플레이트를 원심분리하여 상등액을 새로운 플레이트로 옮겼다. 상등액 중의 헤모글로빈의 유출은 마이크로플레이트 판독기(Perkin-Elmer Victor X4)를 사용하여 550 nm에서의 흡광도로 모니터링하였다. 결과들은 3회의 개별적 실험에서 모았다. 용혈률은 이하의 수식과 같이 정의하였다:
용혈률(%) = 100 × (OD펩티드 - OD음성대조군)/(OD양성대조군 - OD음성대조군)
8. 시험관내 세포 독성 시험
다양한 세포주에 대한 sHg-CATH의 영향을 확인하기 위하여, HEK293T(인간 태아 신장 세포), HaCaT(인간 각질세포), PK15(돼지 신장 세포), ST ATCC CRL-1746(돼지 고환 섬유아세포), 및 3D4/2(돼지 폐의 대식세포)를 포함하는 5가지 포유류 세포주를 사용하였다. 상기 세포들은 아큐타제(Accutase, Innovative Cell Technologies)를 첨가하여 분리하고, 5% CO2 및 37 ℃에서 10% FBS(Hyclone™) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone™)을 포함하는 둘베코 개질 이글스 배지(Dulbeco's modified Eagle's medium, DMEM; Hyclone™) 중에서 80% 밀집도가 될 때까지 배양한 후, 1 ~ 4 × 104 세포를 96-웰 플레이트(Sigma Aldrich 사)의 각 웰에 분주하였다. 최종 농도 5, 10, 20, 25, 30 및 64 ㎍/㎖가 되도록 서로 상이하게 희석한 sHg-CATH를 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 이를 24시간 동안 5% CO2 및 37 ℃에서 배양하였다. 100% 세포 용혈에 대한 양성 대조군 및 음성 대조군에 대해서는, 각각 Triton-X 100(Sigma Aldrich 사)을 처리한 웰과 처리하지 않은 웰을 사용하였다. 배양 후, 발색 시약으로서의 10 ㎕의 세포 증식 시약 wst-1(Cell proliferation reagent wst-1™; Sigma Aldrich 사)을 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 그 플레이트를 4시간 동안 5% CO2 및 37 ℃에서 제조사의 프로토콜에 따라서 배양하였다. 모든 실험은 3회 실시하였다. 세포 생존률을 계산하기 위하여, 플레이트의 각 웰의 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(xMark™ 분광광도계; Bio-Rad 사)를 사용하여 측정한 후, 그 흡광도 결과를 3회의 개별적 시험으로부터 모아서, 세포 생존률(%) = 100 × (표적 시료의 OD450nm-블랭크의 OD650nm)/(음성대조군의 OD450nm-블랭크의 OD650nm)의 수식에 대입하였다.
9. 주사전자현미경 사진(SEM)
sHg-CATH의 미생물에 대한 멸균 기작을 연구하기 위하여, 0.2 OD600의 E. coli ATCC 25922 세포를 sHg-CATH의 2 × MIC(1.5 ㎍/㎖)를 포함하는 LB 배지 중에 접종하여, 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 4,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 모우고, 1 × PBS를 세포 펠렛에 첨가하여 씻어내었다. 그 후, 세포를 1 × PBS 중의 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 및 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde, Sigma Aldrich사)로 처리하고, 4 ℃에서 밤새 방치하여 고정시켰다. 세포를 1 × PBS로 씻어낸 후, 추후-고정 단계로서 1 × PBS 중의 1% 오스뮴 테트록사이드(Osmium tetroxide, Sigma Aldrich 사)를 4 ℃에서 1시간 30분 동안 세포에 처리하였다. 1 × PBS 및 고정을 위해 첨가한 다른 화학물질을 제거하기 위해, 세포를 멸균수로 3회 씻어낸 후, 여러 등급(50%, 70%, 90% 및 100%)의 아세톤으로 각각 탈수 단계를 거쳤다. 이어서 탈수시킨 시료들은 전계방출형 주사전자현미경(field emission scanning electron microscopy, FE-SEM)으로 관찰하기 위해, 15분간 헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane)으로 건조시켰다. 시료들은 JEOL JSM-7500F FE-SEM(Welwyn Garden City)에 의해 이미지화하기 전에, 크레싱톤　스퍼터 코터(Cressington sputter coater)(sputter coater 108 auto, Cressington 사)를 사용하여 백금으로 스퍼터-코팅하였다.
<결과>
1. 벌거숭이두더지쥐 게놈에 대한 전반적인 분석에 의한 60종의 AMP-유사 단백질의 동정
AMPA 및 APD3 데이터 베이스를 사용하여, UniProtKB/Swiss-Prot로부터 다운로드 받은 2,488 AMP의 비-중복 서열(non-redundant sequence)을 분석하였다. 이들 중, 29개의 α-디펜신, 166개의 β-디펜신, 63개의 카텔리시딘, 2개의 갈라닌, 1개의 그래뉼린(granulin), 11개의 헵시딘, 6개의 LEAP-2 및 32개의 뱀 와프린(snake waprin)을 포함하는 척추동물 유래의 310개의 AMP가 수득되었다. 이들 척추동물 AMP를 벌거숭이두더지쥐의 게놈과 비교한 BLAST 분석 결과에 의해, 4종의 α-디펜신(defensin), 28가지 β-디펜신, 10가지 카텔리시딘, 2가지 갈라닌(galanin), 2가지 그래뉼린(granulin), 2종의 LEAP-2, 1종의 헵시딘(hepcidin) 및 11종의 뱀 와프린으로 이루어지는, 8개의 과 유래의 60종의 AMP-유사 단백질을 동정하였다(e-값 < 0.001).
2. 벌거숭이두더지쥐의 추정 카텔리시딘-유사 펩티드의 특성을 위한 인실리코 분석
벌거숭이두더지쥐의 10종의 추정 카텔리시딘-유사 서열 중의 보존된 카텔린-유사 도메인(CLD) 및 항균성 도메인은, 각각 HMMER 및 AMPA 데이터베이스를 사용한 분석에 의해 결정하였다. 10종의 추정 카텔리시딘-유사 서열들 중 단지 2종의 서열만이, 보존된 CLD 및 항균성 도메인을 동시에 포함하였다. 그 결론에서, 2종의 카텔리시딘-유사 서열들 내의 항균성 도메인의 분석에 의해 하나의 카텔리시딘 후보가 동정되었고, 이는 30개 초과의 아미노산을 갖는 추정 항균성 도메인을 포함한다는 것을 알 수 있었다. 이의 2차 구조를 평가하기 위하여, PSIPRED 단백질 서열 분석 워크벤치를 사용하였다. 그 결과는, 항균성 도메인이 α-나선 구조를 포함하는 것으로 나타나며, 이는 AMP의 구조에 대한 가장 통상적인 특성 중 하나이다(도 1 참조). α-나선 구조-포함 영역 (sHg-CATH)의 길이, 소수성 및 순전하(net charge)는 각각 25개 아미노산, 32의 소수성, 그리고 +11였다(표 1 및 도 2b 참고). 존재하는 AMP에 대한 sHg-CATH의 정렬 결과는, 고도의 양이온성 AMP이자 긴꼬리원숭이과(cercopithecidae)의 대표적인 카텔리시딘인 pobRL-37에 대한 최대 서열 유사성이 45.9%인 것으로 나타났다(도 2a 참고).
Figure PCTKR2018009577-appb-T000001
3. 벌거숭이두더지쥐의 카텔리시딘 관련 단백질의 유전적 및 진화적 관계
10종의 카텔리시딘-유사 서열 중 하나의 카텔리시딘 후보(Hg-CATH)에 대해, 추가로 특성화 및 실험에 의한 검증을 실시하였다. Hg-CATH과, 11개 포유류 종[집쥐(Rattus norvegicus), 생쥐(Mus musculus), 개(Canis lupus familiaris), 소(Bos taurus), 양(Ovis aries), 돼지(Sus scrofa), 토끼(Oryctolagus cuniculus), 원숭이(Macaca mlatta), 오랑우탄(Pongo pygmaeus), 침팬지(Pan troglodytes), 및 인간(Homo sapiens)] 유래의 14개의 이미 동정된 카텔리시딘의 전체 길이 서열을 비교한 결과, 동일한 종 내의 개별적인 카텔리시딘의 CLD는 높은 수준으로 보존된다고 나타났다. 그러나, 상이한 포유류 종들에서의 상이한 카텔리시딘들은 CLD 영역의 보존 정도가 상대적으로 낮다(도 3 참조). 예측된 바와 같이, Hg-CATH를 포함하는 모든 카텔리시딘들은 보존된 모티프로서 CLD 영역 내에 4개의 시스테인을 갖는데, 흥미롭게도 Hg-CATH는 다른 것들보다 더욱 길이가 긴 CLD를 갖는 독특한 특징이 있다(도 2 참조). 본 발명에서 단지 하나의 카텔리시딘만이 동정되었고, 이전에 사용가능한 명명법이 없었으므로, 본 발명자들은 벌거숭이두더지쥐의 카텔리시딘에 대해 임시로 Hg-CATH라고 명명하였다. 카텔리시딘의 전체 길이 서열의 C-말단에서, 기대한 바와 같이 성숙 펩티드는 CLD를 포함하는 N-말단서열에서보다 더욱 다양화되어 있었다(도 3 참조).
Hg-CATH과 다양한 종 유래의 다른 카텔리시딘 사이의 진화적 관계를 연구하기 위하여, 9 마리의 포유류, 3 마리의 조류, 및 3 마리의 뱀을 포함하는 13 마리의 척추동물 유래의 19개의 CLD 서열에 의한 계통수가 작성되었다(도 4 참조). 그 종들 중 진화적 관계와 일관되는 결과로는, 고래(우제류, Artiodactyla)의 CLD들은 함께 묶이고(clustered), 파충류와 양서류의 CLD들은 포유류 CLD와는 구별되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, Hg-CATH는 영장류(Primates) 및 설치류(Rodentia)와는 구별되게 진화되었을 수 있는데, 이것은 도 3에 나타난 바와 같이 Hg-CATH과 다른 포유류 카텔리시딘들의 전체 길이 아미노산 서열을 비교한 결과와 일치한다.
4. sHg-CATH의 항균 활성의 평가
화학적으로 합성된 Hg-CATH (sHg-CATH)의 항균 활성은 기준 박테리아의 패널에 대해 확인되었다. 본 발명에서는 대장균, 녹농균, 살모넬라 티피무리움, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스 및 스트렙토코커스 이니애로 이루어진 상기 박테리아 패널에 대한 최소 저해 농도(MIC) 시험을 수행하였다. sHg-CATH는 박테리아 패널 중에서 그람-음성 균주인 대장균, 녹농균 및 살모넬라 티피무리움에 대해서만 매우 강한 활성을 나타내며, MIC는 지금까지 AMP에 대해 보고된 것들 중 최고값인 0.75 ~ 5 ㎍/㎖였으며, 심지어 64 ㎍/㎖의 농도에서 그람-양성 균주들 (스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스 및 스트렙토코커스 이니애)에 대한 항균 활성은 매우 약하거나 없는 것으로 나타났다(표 2 참조). 종합하면, sHg-CATH는 그람-음성 박테리아에 특이적으로 항균 활성을 가질 수 있다. 최종적으로, 상기 펩티드는 임상적으로 분리된 항생제 저항성 균주인 대장균 및 폐렴간균에 대해 시험되었고, 이는 암피실린(ampicillin)에 대한 완전 저항성 및, 겐타마이신(gentamicin)에 대한 낮은 저항성을 나타내었다. 흥미롭게도, sHg-CATH는 각각 32 및 4 ㎍/㎖에서 이들 병원체에 대한 비교적 강한 효능을 나타내었다.
Figure PCTKR2018009577-appb-T000002
a대조군용 항생제
b임상 분리 균주
5. 혈청 중의 안정성 시험의 확인
본 발명자들은 혈청 중 AMP의 안정성이 신규한 임상 및 치료 제제에 AMP를 적용시키는데 가장 중요한 특징들 중 하나이므로, 상이한 배양 시간(0분 내지 1시간 40분) 동안 다양한 농도에서 Hg-CATH의 항균 활성에 대한 혈청의 영향을 평가하였다. 그 결과에서, 대장균의 생장에 대한 sHg-CATH의 항균 효과는 배양 시간이 경과함에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 이는 심지어 100분간 배양한 이후에도 5 ㎍/㎖의 농도에서 박테리아를 멸균시켰다(도 5 참조).
6. sHg-CATH의 낮은 용혈 활성
닭의 적혈구에 대한 sHg-CATH의 용혈 활성은 세포 독성을 측정치로서 계산되었다(표 3 참조). 표 3에 나타난 바와 같이, sHg-CATH는 양성 대조군으로서 벌독 유래의 AMP인 멜리틴(Melitin)과 비교하여, 용혈 활성이 낮은 것으로 나타났다. sHg-CATH의 용혈률은 50 ㎍/㎖에서 11%였으나, 멜리틴은 12.5 ㎍/㎖에서 완전 용혈성(100%)을 나타내었다.
Figure PCTKR2018009577-appb-T000003
7. sHg-CATH의 낮은 세포 독성
일반적으로, AMP의 세포 독성은 AMP를 약학적 제제에 적용할 때의 주요 문제점이다. sHg-CATHM의 세포 독성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상이한 농도들(5 ~ 20 ㎍/㎖)의 상기 펩티드를 처리한 5개의 포유류 세포주, 즉 HEK293T(인간 태아 신장 세포), HaCaT(인간 각질세포), PK15(돼지 신장 세포), ST ATCC CRL-1746(돼지 고환 섬유아세포), 및 3D4/2(돼지 폐의 대식세포)의 생존률을 측정하였다. 결과적으로, 펩티드 농도가 20 ㎍/㎖가 될 때까지 대부분의 세포에 대해 세포 독성은 탐지되지 않았다(도 6 참조).
8. sHg-CATH의 구멍 형성에 의한 박테리아 세포막에 대한 효과
Hg-CATH의 작용의 항균 기작을 연구하기 위하여, 주사현미경(SEM)을 사용하여, sHg-CATH을 처리한 후의 박테리아 세포를 관찰하였다. 그 결과, sHg-CATH를 갖는 대장균 ATCC 25922의 형태는 세포막 붕괴 및 구멍 형성에 의해 변형된 반면(도 6B), 상기 펩티드를 갖지 않는 대조군 세포는 세포막 완전성 및 박테리아 생장의 증거로서의 세포 분열을 나타내었다(도 7 참조).

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균성 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 벌거숭이두더지쥐의 게놈에서 유래한 것을 특징으로 하는 항균성 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, α-나선 구조를 가지며, 외측 표면상에 소수성 및 양전하성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 폴리펩티드.
  4. 제1항의 항균성 폴리펩티드를 포함하는 항균용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항균성 폴리펩티드가 그람-음성 박테리아에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항균성 폴리펩티드가 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피무리움(Samonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 그람-음성 박테리아에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 항균성 폴리펩티드가 1 ~ 1000 ㎍/㎖의 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 약학 조성물이 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 및 부형제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제1항의 항균성 폴리펩티드를 포함하는 식품 방부제.
  10. 제1항의 항균성 폴리펩티드를 포함하는 사료 첨가제.
PCT/KR2018/009577 2017-08-22 2018-08-21 그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물 WO2019039826A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170106311A KR101983668B1 (ko) 2017-08-22 2017-08-22 그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR10-2017-0106311 2017-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019039826A1 true WO2019039826A1 (ko) 2019-02-28

Family

ID=65438946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/009577 WO2019039826A1 (ko) 2017-08-22 2018-08-21 그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101983668B1 (ko)
WO (1) WO2019039826A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603748A (zh) * 2021-07-09 2021-11-05 东北农业大学 一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用
WO2022180498A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Intron Biotechnology, Inc. Antibacterial composition effective in treating gram negative bacterial infections and method for preparing the same
CN115927255A (zh) * 2021-08-19 2023-04-07 株式会社莱森科技 多肽和抗含有该多肽的革兰氏阴性菌的抗生素

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102296948B1 (ko) * 2019-09-30 2021-09-01 건국대학교 산학협력단 회색 짧은 꼬리 주머니쥐 유래의 광범위하고 강한 항균 활성을 갖는 항균성 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR102296950B1 (ko) * 2019-09-30 2021-09-01 건국대학교 산학협력단 회색 짧은 꼬리 주머니쥐 유래의 그람 음성균에 대한 강한 항균 활성을 갖는 항균성 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR102296949B1 (ko) * 2019-09-30 2021-09-01 건국대학교 산학협력단 회색 짧은 꼬리 주머니쥐 유래의 그람 양성균에 대한 강한 항균 활성 및 항바이러스 활성을 갖는 항미생물 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 항미생물 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160118994A (ko) * 2015-04-03 2016-10-12 건국대학교 글로컬산학협력단 Adk 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011109469A1 (en) * 2010-03-03 2011-09-09 Neocutis Sa Compositions and methods for treatment of skin diseases and disorders using antimicrobial peptide sequestering compounds

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160118994A (ko) * 2015-04-03 2016-10-12 건국대학교 글로컬산학협력단 Adk 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, Y.: "Role of peptide hydrophobicity in the mechanism of action of a-helical antimicrobial peptides", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 51, no. 4, April 2007 (2007-04-01), pages 1398 - 1406, XP008149445 *
CHO, H.-S.: "The novel cathelicidin of naked mole rats, Hg-CATH, showed potent antimicrobial activity and low cytotoxicity", GENE, vol. 676, 5 July 2018 (2018-07-05), pages 164 - 170, XP055578099 *
DATABASE GenBank 23 May 2017 (2017-05-23), "cathelicidin antimicrobial peptide [Heterocephalus glaber]", XP055578092, Database accession no. XP_004834996.1 *
DATABASE Protein 14 March 2015 (2015-03-14), XP055578057, Database accession no. EHB12560.1 *
LI, X.: "Solution structures of human LL-37 fragments and NMR-based identification of a minimal membrane-targeting antimicrobial and anticancer region", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 128, no. 17, 2006, pages 5776 - 5785, XP002410495 *
WANG, G.: "Structures of human host defense cathelicidin LL-37 and its smallest antimicrobial peptide KR -12 in lipid micelles", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 283, no. 47, 2008, pages 32637 - 23643, XP055577632 *
ZHANG, L.-J.: "Antimicrobial peptides", CURRENT BIOLOGY, 11 January 2016 (2016-01-11) *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022180498A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Intron Biotechnology, Inc. Antibacterial composition effective in treating gram negative bacterial infections and method for preparing the same
CN113603748A (zh) * 2021-07-09 2021-11-05 东北农业大学 一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用
CN115927255A (zh) * 2021-08-19 2023-04-07 株式会社莱森科技 多肽和抗含有该多肽的革兰氏阴性菌的抗生素
CN115927255B (zh) * 2021-08-19 2023-11-10 株式会社莱森科技 多肽和抗含有该多肽的革兰氏阴性菌的抗生素

Also Published As

Publication number Publication date
KR101983668B1 (ko) 2019-05-29
KR20190021126A (ko) 2019-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019039826A1 (ko) 그람 음성 박테리아에 대한 강한 항균 활성을 갖는 벌거숭이두더지쥐 유래의 항균성 폴리펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR102419616B1 (ko) 항균 요법
Basir et al. Multiple antimicrobial peptides and peptides related to bradykinin and neuromedin N isolated from skin secretions of the pickerel frog, Rana palustris
Mygind et al. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus
Goraya et al. Peptides with antimicrobial activity from four different families isolated from the skins of the North American frogs Rana luteiventris, Rana berlandieri and Rana pipiens
Lange et al. Galleria mellonella: a novel invertebrate model to distinguish intestinal symbionts from pathobionts
Sun et al. A novel cathelicidin from Bufo bufo gargarizans Cantor showed specific activity to its habitat bacteria
Conlon et al. The alyteserins: two families of antimicrobial peptides from the skin secretions of the midwife toad Alytes obstetricans (Alytidae)
US11548916B2 (en) Anti-infective compound
JP2010207227A (ja) 新規な抗菌性ポリペプチド及び使用方法
KR101957266B1 (ko) 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 신규한 항균단백질 efal-2
Zhou et al. Molecular structure, expression and antibacterial characterization of a novel antimicrobial peptide NK-lysin from the large yellow croaker Larimichthys crocea
US20080234188A1 (en) Antimicrobial Peptides
JP2002522556A (ja) アメリカカエルの皮膚から単離された抗菌性ペプチド
Cho et al. The novel cathelicidin of naked mole rats, Hg-CATH, showed potent antimicrobial activity and low cytotoxicity
CN116535481A (zh) 一种菲牛蛭抗菌肽rk22及其前体蛋白和应用
BRPI0619512A2 (pt) peptìdeos indutores de bacteriocina, bem como processo para estimular produção aumentada de bacteriocina
Huo et al. Molecular characterization, antibacterial activity and mechanism analyzation of three different piscidins from black rockfish, Sebastes schlegelii
Giacometti et al. In vitro activity of the histatin derivative P-113 against multidrug-resistant pathogens responsible for pneumonia in immunocompromised patients
CN116813712B (zh) 一种富含Trp的α-螺旋结构抗菌肽W33及其制备方法和应用
Dorling et al. Recognition, survival and persistence of Staphylococcus aureus in the model host Tenebrio molitor
AU2003260224A2 (en) A genomic approach to identification of novel broad-spectrum antimicrobial peptides from bony fish
AU2002317071A1 (en) Antimicrobial peptides
WO2017188498A1 (ko) 병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물
Shen et al. Triintsin, a human pathogenic fungus-derived defensin with broad-spectrum antimicrobial activity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18849060

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18849060

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1