KR102419616B1 - 항균 요법 - Google Patents
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Abstract
호고시딘 (hogocidin) 펩티드 (SH-란티바이오틱), 유도체 및 변이체를 포함하는 방법 및 조성물이 제공된다. 호고시딘, 호고시딘-유사 펩티드, 또는 피부 병원체의 다른 억제제를 생산하는 에스. 호미니스 및 에스. 에피더미니스의 균주를 이용하는 프로바이오틱 조성물을 포함하는 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 미생물 피부 감염 및 아토피성 피부염의 치료 방법이 또한 제공된다.
Description
관련
출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에서, 참조로서 그의 기재가 본원에 포함되는, 2015년 5월 5일자로 출원된 가특허 출원 제62/157,248호, 및 2016년 2월 26일자로 출원된 가특허 출원 제62/300,274호로부터의 우선권을 주장한다.
연방 후원 R&D에 관한 진술
본 발명은 보조금 제R01AI083358호, 보조금 제AR067547호 및 보조금 제HHSN-272201000020C호에 의거하여 정부 지원으로 이루어졌으며, 이들은 모두 국립보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여되었다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 전자적 형태로 서열 목록과 함께 출원되었다. 서열목록은 2016년 5월 4일에 생성된, 45 Kb 크기의 Sequence_ST25.txt로 명명된 파일로서 제공된다. 전자적 형태의 서열목록의 정보는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 감염을 치료하고, 디스바이오시스 (dysbiosis)와 관련되거나 이로 인해 악화되는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 피부 및 점막 균총을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
작은, 양이온성 항균 펩티드 (AMP)는 선천적 면역체계의 자연 발생적인 항생제이다. AMP는 동식물에 광범위하게 분포하며 가장 고전적인 숙주 방어 요인 중 하나이다. 이들의 활성 스펙트럼은 그람-양성 및 그람-음성 세균뿐만 아니라 진균 및 특정 감염성 제제를 포함한다. 기존 항생제에 대한 병원성 미생물의 내성이 증가함에 따라서, 연구자들은 다양한 감염성 질환에 대한 잠재적 공급원 또는 새로운 요법으로서 이들 내인성 항생제를 탐구하고 있다.
아토피성 피부염 (AD) 환자는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, SA)에 의한 재발성 피부 감염 및 이들의 피부 마이크로비옴 (microbiome)의 미생물 불균형을 갖는다. SA에 대한 증가된 감수성은 비정상적인 장벽 기능을 비롯한 선천적 면역 방어의 감소 및 카텔리시딘 (cathelicidin) 및 β-디펜신 (β-defensin)과 같은 항균 (antimicrobial) 펩티드 (AMP)의 감소된 유도와 관련이 있다.
습진 또는 아토피성 습진으로도 불리는, 아토피성 피부염의 증상은: 발진을 형성하는 건조한 피부; 비늘 모양의, 부풀어 오른, 붉은 피부; 얼굴에의 발진, 또는 무릎, 팔꿈치 또는 손목 안쪽에의 발진; 흘러 나오는 물집; 반복된 에피소드 후의 피부색 변화; 두꺼워지고, 갈라지고, 건조하고, 비늘 모양의 피부 또는 패치 내 가죽처럼 보이는 피부; 및 특히 밤에, 긁기로부터의 쓰라리고, 민감한, 부풀어 오른 피부를 동반하는, 심한 가려움 (소양증)을 포함한다. 아토피성 피부염 (습진) 징후 및 증상은 사람마다 매우 다양하고 추가로: 특히 손, 발, 발목, 손목, 목, 상측 흉부, 눈꺼풀, 팔꿈치와 무릎의 굽음 안쪽, 및, 유아에서, 얼굴, 두피, 뒤통수, 눈, 다리, 발, 팔, 손 및 둔부 상의 적색 내지 갈색-회색 패치; 긁힐 때 체액과 껍질이 누출될 수 있는, 작은, 돌출된 혹을 포함할 수 있다. 아토피성 피부염은 대부분 5세 이전에 시작되며 청소년기와 성인기까지 지속될 수 있다. 일부 사람들의 경우에, 이는 주기적으로 발병한 후에 일시적으로, 심지어는 수년간 치유된다. 아토피성 피부염에 의해 초래되는 피부 변화는 스타필로코커스 아우레우스에 의한 집락화 (colonization) 및 감염에 대한 이들 환자들의 높은 감수성을 촉진할 수 있다.
디스바이오시스는 에스. 아우레우스와 같은 종은 과다 존재하게 되고 다른 종은 과소 존재하게 되는 코, 입, 눈, 비뇨생식기, 장내 균총을 비롯한, 피부 또는 점막 균총에서의 불균형을 포함한다. 일반적으로, 건강한 균총에서는, 비병원성 세균이 억제제를 분비하거나 단순히 모든 가능한 기생위치 (niche)를 점유할 수 있고, 그로써 감염 상태를 확립하거나 아토피성 피부염과 같은 질환 또는 질환-유사 상태의 발병을 촉진할 수 있는 병원균을 직접적으로 억제하거나 간접적으로 배제할 수 있다.
본 발명은 피부의 디스바이오시스와 관련된 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 정상적 피부 균총에서의 불균형 및 에스. 아우레우스와 같은 피부 병원균의 과성장과 관련된, 이들 장애는 다른 상태들 중에서도 피부 감염, 아토피성 피부염, 및 건선을 초래한다. 본 발명은 건강한 피부 균총의 토착 세균으로부터 유래한 항균 펩티드를 사용하여 건강한 피부 균총을 회복시키거나, 또는 건강한 피부 균총으로부터 유래한 균주를 함유하는 프로바이오틱 조성물을 직접적으로 투여하거나, 또는 균총 디스바이오시스로 진단된 환자의 피부로부터 배양되고, 피부 상의 병원성 종 또는 질환-유사 미생물 불균형과 연관된 종을 사멸하거나 또는 억제할 수 있는, 드문 생존 균총으로서 이들 장애를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주, 바람직하게는 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속의 균주, 및 더욱 바람직하게는 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis) 및 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis)의 기술된 균주를 포함하는 증점화 (thickened) 국소 조성물을 제공한다. 이들 균주는 건강한 피부 균총으로부터 분리되거나, 또는 본원에 기술된 방법에 의해, 균총 디스바이오시스로 진단된 환자의 피부로부터 배양된 생존하는 균총일 수 있고, 본원에 기술된 분비된 펩티드 서열, 지방산 메틸 에스테르 프로파일, 및/또는 항균 펩티드 코돈 조직화에 의해 동정될 수 있다. 본 발명의 프로바이오틱 균주는 살아 있는 형태, 냉동-건조된 형태, 또는 재구성 가능한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명은 피부, 두피 또는 점막의 국소 투여용으로 제제화될 수 있는, 본원에 기술된 바와 같은 스타필로코커스 에피더미디스 및 스타필로코커스 호미니스의 균주를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 프로바이오틱 세균 균주가 스타필로코커스 에피더미디스 균주 MO34, MO38, A11, AMT1, AMT5-C5, 및/또는 AMT5-G6 및/또는 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, 및/또는 AMT4-D12의 하나 이상을 포함하는, 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명의 조성물은 또한 조건화 배양 배지, 또는 본원에 기술된 균주로부터 유래한 단리된 항균 화합물, 예컨대 본원에서 호고시딘으로 명명된 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명은 이종 발현되거나 합성된 호고시딘, 호고시딘 유도체, 또는 호고시딘-유사 펩티드의 사용을 고려한다. 본 발명은 또한 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체 및 카텔리시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 펩티드가 하나 이상의 D-아미노산, 하나 이상의 비-자연 발생적인 아미노산, 및/또는 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는, 전술한 실시양태의 임의의 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 펩티드가 다른 펩티드로부터 실질적으로 정제되는, 전술한 실시양태의 임의의 조성물을 제공한다. 본 발명은 펩티드가 다른 펩티드로부터 부분적으로 정제되는, 전술한 실시양태의 임의의 조성물을 제공한다. 본 발명은 펩티드가 조 추출물 내에 존재하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 국소 투여용 제제로서 전술한 실시양태의 임의의 조성물을 제공한다.
본 발명은, 이들 형태로 제한되는 것은 아니지만, 제제가 로숀, 연고 또는 스프레이 또는 크림 또는 오일 현탁액을 포함하는, 전술한 실시양태의 임의의 조성물을 제공한다.
본 발명은 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체가 서열번호 2, 서열번호 4, 비-천연 아미노산을 포함하는 서열번호 2 또는 4, D-아미노산을 포함하는 서열번호 2 또는 4, 또는 융합 컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2 또는 4로부터 선택되는 서열을 포함하는, 전술한 실시양태의 임의의 조성물을 제공한다
본 발명은 또한 미생물을 본 발명의 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 미생물에의 감염의 확산을 억제하고/하거나 이의 위험성을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 접촉은 생체 내에서이다. 다른 실시양태에서, 생체 내 접촉은 국소 투여에 의한 것이다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체에 본원에 기술된 조성물의 유효량을 피부 또는 점막에 적용함으로써 피부 또는 점막 감염, 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 또는 피부 디스바이오시스와 관련된 다른 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 아토피성 피부염을 앓거나 의심되는 개체를 본원에 기술된 세균성 균주의 하나 이상을 포함하는 프로바이오틱 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는 아토피성 피부염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 아토피성 피부염을 앓거나 의심되는 개체를 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는 아토피성 피부염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 호고시딘, 퍼모시딘 (firmocidin), SH-란티바이오틱 펩티드, SH-항균제, SE-란티바이오틱 펩티드, 또는 SE 항균제를 분비하는 세균 균주, 예컨대 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, 스타필로코커스 호미니스 균주 C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT3, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-G1, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-D12, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT1, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 SE-A11, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-C5, 및 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-G6을 포함하는 조성물을 이환된 부위와 접촉시킴으로써 아토피성 피부염 또는 피부의 디스바이오시스를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 카텔리시딘 펩티드를 추가로 포함하는 상기에 기술된 바와 같은 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주의 증점화 국소 제제 및 선택적으로, 프리바이오틱 화합물, 보호제 (protectant), 습윤제 (humectant), 연화제 (emollient), 연마제 (abrasive), 염, 및/또는 계면활성제를 포함하는 조성물을 제공하고; 상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 하나 이상의 스타필로코커스 속의 세균 균주를 포함하며; 상기 조성물은 피부, 두피, 또는 점막의 장애 또는 디스바이오시스의 국소 치료용으로 제제화된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 호미니스 또는 스타필로코커스 에피더미디스와 스타필로코커스 호미니스의 조합을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 스타필로코커스 에피더미디스 균주 MO34, MO38, A11, AMT1, AMT5-C5, 및/또는 AMT5-G6을 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, 및/또는 AMT4-D12를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 프로바이오틱 세균 균주는 도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19의 어느 하나에 나타난 것들 중 하나에 대응하는 지방산 메틸 에스테르 프로파일 (Fatty Acid Methyl Ester profile)을 입증한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 서열번호 2, 4, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 및 55 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드를 생산하고, 이러한 펩티드는 선택적으로 번역-후 변형된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 살아 있는 형태로 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주는 동결건조 또는 냉동-건조 또는 분무 건조된 형태로 제공된다. 추가의 실시양태에서, 프로바이오틱 세균은 살아 있는 형태로 재구성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서 및 앞선 단락에 기술된 바와 같은 조성물의 유효량을 피부 또는 점막에 적용함으로써 인간 또는 다른 포유류에서 피부 또는 점막 감염, 아토피성 피부염, 건선, 유선염, 여드름, 또는 피부 디스바이오시스와 관련된 다른 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 조성물은 국소적으로 적용된다. 추가의 실시양태에서, 조성물은 크림, 연고, 고약 (unguent), 스프레이, 분말, 오일, 증점화 제제 또는 또는 습포제 (poultice)로 제제화된다.
본 발명은 또한 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체, SH-란티바이오틱 펩티드, SH-항균제, SE-란티바이오틱 펩티드, 및/또는 SE 항균제의 하나 이상을 포함하고; 하나 이상의 증점제, 용매, 유화제, 또는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 조성물은 카텔리시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체를 추가로 포함한다. 또 다른 또는 대안적인 실시양태에서, 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체, SH-란티바이오틱 펩티드, 및/또는 SE-란티바이오틱 펩티드는 하나 이상의 D-아미노산 또는 비-자연 발생적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 호고시딘 펩티드, SH-란티바이오틱 펩티드, SH-항균제, SE-란티바이오틱 펩티드, 또는 SE 항균제는 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, 스타필로코커스 호미니스 균주 C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT3, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-G1, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-D12, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT1, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 SE-A11, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-C5, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-G6 및 스타필로코커스 에피더미디스 균주 MO34의 하나 이상에 의해 인 시츄로 (in situ) 생산된다. 전술한 임의의 또 다른 실시양태에서, 펩티드는 국소 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 로숀, 연고 크림, 분말, 고약, 오일, 또는 스프레이를 포함한다. 전술한 임의의 다른 실시양태에서 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 4 또는 항균 활성을 갖는 이의 활성 형태 (예컨대, 성숙한 형태)로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체, SH-란티바이오틱 펩티드, SH-항균제, SE-란티바이오틱 펩티드, SE 항균제, 및 카텔리시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체의 하나 이상은 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, 스타필로코커스 호미니스 균주 C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT3, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-G1, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-D12, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT1, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 SE-A11, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-C5, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-G6 및 스타필로코커스 에피더미디스 균주 MO34의 추출물 또는 용해물로서 제공된다.
본 발명은 또한 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체, SH-란티바이오틱 펩티드, SH-항균제, SE-란티바이오틱 펩티드, 및 선택적으로, 카텔리시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체의 하나 이상의 유효량을 개체와 접촉시키는 것을 포함하는, 개체에서 피부 또는 점막 감염 또는 아토피성 피부염을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 접촉은 국소 투여에 의한 것이거나 선택적으로 SH-란티바이오틱 또는 박테리오신-생산 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, AMT4-D12 및 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-G6 및 MO34의 하나 이상을 개체와 접촉시킴에 의한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 2 또는 4와 적어도 95% 동일한 폴리펩티드, 또는 항균 활성을 갖는 이의 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일 실시양태에서, 벡터는 서열번호 2 또는 4의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 서열번호 2의 약 아미노산 32 내지 약 아미노산 61의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 벡터는 서열번호 4의 약 아미노산 29 내지 약 아미노산 66의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.다른 실시양태에서, 벡터는 서열번호 1 또는 3과 적어도 95% 동일하고 각각 서열번호 2 또는 4의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 벡터는 서열번호 1 또는 3의 단편을 포함한다. 또 전술한 임의의 다른 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 비-병원성 약독화된 숙주 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 폴레펩티드를 제공한다. 다른 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 숙주 세포 배양으로부터 정제된다.
본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에 개시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1A-D. 스타필로코커스 DNA에 비해 배양 가능한 스타필로코커스의 비율은 아토피성 피부염의 병변 피부에서 더 높다. 도 1A: C배양 가능한 총 스타필로코커스 spp.를 아토피성 피부염 (AD)을 갖는 49명의 개체 및 AD를 갖지 않는 30명의 개체로부터 선택적 만니톨 염 아가 플레이트 상에서 계수하였다. 도 1B: 30명의 비-아토피성 개체 및 49명의 아토피성 피부염 환자로부터의 에스. 아우레우스의 성장에 대한 CFU 결과를 나타낸다. 도 1C: 총 스타필로코커스 spp. DNA 존재량을 14명의 비-아토피성 및 37명의 아토피성 개체로부터의 DNA에 대한 정량적 PCR (qPCR)로 결정하였다. 상대적 CFU (rCFU)를 에스. 에피더미디스 (ATCC12228)의 공지된 CFU의 표준과 비교하여 결정하였다. 도 1D: DNA에 의해 결정된 스타필로코커스의 존재량에 대한 살아 있는 스타필로코커스 spp. CFU의 비율을 각각의 대응하는 피부 부위에서 계산하였다.
도 2A-C. 낮은 빈도의 항균 활성을 갖는 응고효소 (coagulase)-음성 스타필로코커스가 아토피성 피부염 피부에 집락화된다. 도 2A: 에스. 아우레우스에 대해 항균 활성을 갖는 응고효소-음성 스타필로코커스 (CoNS)를 개별적 배양 분리물의 고성능 분석에 의해 결정하고 에스. 아우레우스의 성장을 억제하는 총 콜로니의 비율 (%)을 결정하였다. 도 2B: 항균 활성을 갖는 CoNS의 비율을 1일차, 7일차 및 14일차에 동일한 개체로부터 결정하였다. 도 2C: 스타필로코커스 DNA의 존재량에 대한 살아 있는 스타필로코커스 spp.의 비율을 도 2B에서와 같이 동일한 개체로부터 결정하였다. *P<0.05, ****P<0.0001. 11명의 아토피성 및 11명의 비-아토피성 개체를 패널 B 및 C에서의 분석을 위해 무작위로 선택하였다.
도 3A-B. 항균 응고효소-음성 스타필로코커스는 에스. 아우레우스 집락화의 부재와 연관된다. 도 3A: 각 시료에서 항균 CoNS의 비율을 각 개체로부터 배양된 에스. 아우레우스의 존재량에 대해 플롯팅한다. 사분면을 항균 CoNS의 빈도 (>50% 또는 <50%) 및 살아 있는 에스. 아우레우스의 검출에 기초하여 분할한다 (<1 CFU/cm2 또는 >1 CFU/cm2). 총 개체에 대한 각 사분면에서 개체의 비율 (%)을 나타낸다. 도 3B: 에스. 아우레우스-배양 음성 개체 (백색) 및 에스. 아우레우스-배양 양성 개체 (solid)에서 항균 CoNS의 빈도를 나타낸다. 데이터는 29명의 비-아토피성 개체 및 아토피성 개체의 41개의 비병변 또는 40개의 변병 부위에 대한 평균 ± SE이다.
도 4A-B. 다양한 세균 종이 항균 활성을 갖는다. 항균 또는 비-항균 CoNS의 종을 항균 활성 존재 및 부재인 무작위로 단리된 콜로니로부터의 전장 16S rRNA의 DNA 서열분석에 의해 동정하였다. 도 4A: 5명의 비-아토피성 개체로부터 항균 활성을 갖는 것으로 동정된 CoNS 종의 비율. 도 4B: 아토피성 피부염을 갖는 개체로부터 단리된 항균 및 비-항균 콜로니로부터 단리된 CoNS의 비율. 최대 48개의 CoNS 단리물의 서열을 각 개체로부터 분석하였다. 각각의 AD 개체로부터 항균 (solid) 및 비-항균 CoNS (백색)를 갖는 콜로니의 상대적 비율이 원형 차트로 표시된다.
도 5A-B. 피부 마이크로비옴 (SH-A9) 내부의 응고효소-음성 스타필로코커스 균주로부터 항균 펩티드의 동정. 도 5A. 비-아토피성 피부로부터 단리된 에스. 호미니스로부터 정제된 2개의 항균 펩티드의 아미노산 서열 및 예측된 모노 및 다이-설파이드 결합. 펩티드를 호고시딘-α (서열번호 2, aa 32-61) 및 호고시딘-β (서열번호 4, aa 29-66) (SH-란티바이오틱 α 및 β)로 명명한다. 호고시딘-α [3152.52 (M+H)] 및 호고시딘-β [3548.04 (M+H)]의 가상의 성숙한 형태의 계산된 분자량은 관찰된 분자 질량과 동일하다 [각각 m/z 3152.22 및 3547.71 (M+H)]. 도 5B는 에스. 아우레우스에 대한 호고시딘-α 및 호고시딘-β의 항균 활성에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. 인간 피부에 의해 생산된 항균 펩티드와의 동시-인큐베이션 (LL-37)은 상승적 활성을 나타낸다. 데이터는 3중 분석의 평균 ± SE를 나타낸다. 화살표는 대조군 대비 생존하는 세균의 3-log 감소로 정의된, 각 AMP의 최소 억제 농도 (MIC)를 나타낸다. Dha, 2,3-다이데히드로알라닌; Dhb, (Z)-2,3-다이데히드로부티린.
도 6. 비-아토피성 피부, 아토피성 피부의 비병변 및 병변 부위 상의 에스. 아우레우스 DNA의 존재량. 14개 및 37개 DNA 면봉 (swab)을 각각 모집된 30명의 정상인 및 50명의 아토피성 피부염 환자로부터 입수하였다. 에스. 아우레우스 DNA의 존재량을 에스. 아우레우스-특이적 femA 유전자를 표적하는 종-특이적 프라이머를 사용한 qPCR로 결정하였다. 에스. 아우레우스 DNA의 상대적 CFU (rCFU)를 에스. 아우레우스 (ATCC35556)의 공지의 CFU와의 비교에 의해 결정하였다. 살아 있는 세균 또는 세균 DNA의 밀도를 면봉으로 채취된 영역으로 표준화하였다. AD: 아토피성 피부염.
도 7A-B. 비-아토피성 피부로부터 단리된 에스. 호미니스 (SH-A9)에 의해 생산된 AMP의 정제 및 질량 분광학적 분석법. AMP를 에스. 호미니스의 대표적인 항균 분리물의 배양 상청액으로부터 CapcelPac C8 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 정제하였다 (도 7A). 5개 정제 단계의 마지막 단계를 나타낸다. 삽입 패널은 에스. 아우레우스에 대한 방사상 확산 분석 상의 각 분획의 항균 활성을 나타낸다. 항균 활성을 갖는 분획의 특징을 MALDI-TOF-MS로 분석하였다 (도 7B).
도 8. 호고시딘-β (SH-란티바이오틱-β)에 대한 게놈-안내 (genome-guided) MALDI-TOF/TOF 분석에서 아미노산 손실의 표현. 정제된 호고시딘-β의 아미노산 서열을 전구체 질량 3547.7 m/z의 MS/MS 단편화 스펙트럼에서의 아미노산 손실로부터 입수하였다. Dha, 2,3-다이데히드로알라닌; Dhb, (Z)-2,3-다이데히드로부티린.
도 9A-B. 비-아토피성 피부로부터 단리된 에스. 호미니스 균주 (SH-A9)에서 호고시딘 전구체 및 란티바이오틱 생합성 유전자를 인코딩하는 유전자 클러스터의 구성. 도 9A는 에스. 호미니스 SH-A9 게놈 상에서 란티바이오틱 전구체 (A1 및 A2; SH-란티바이오틱-α 및 β) 및 생합성 유전자 (C, T 및 M)의 순서를 나타낸다. 도 9B는 가상 유전자, 유전자좌 및 추정 기능을 열거한다. 이 에스. 호미니스 균주는 란티바이오틱-관련 유전자 클러스터의 다중 카피를 함유한다.
도 10은 본 발명에 사용된 고성능 방법론을 나타낸다.
도 11A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 에피더미디스 균주 MO-34 및 MO-38의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 12A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 A9 및 C2의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 13A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 에피더미디스 균주 A11 및 AMT1-A9의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 14A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 AMT2-A11 및 AMT3-A12의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 15A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 AMT4-C2 및 AMT4-G1의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 16A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 AMT4-D12 및 에스. 에피더미디스 AMT5-C5의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 17A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 에피더미디스 균주 AMT5-G6, 및 호고시딘을 생산하지 않는 에스. 호미니스 균주 C4의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 18A-B. 호고시딘을 생산하지 않는 에스. 호미니스 균주 C5 및 C6의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 19A. SE-란티바이오틱 또는 SE-항균제를 생산하지 않는 에스. 에피더미디스 균주 MO1의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 20A-E. 항균 CoNS의 이식은 피부 상의 에스. 아우레우스의 생존을 감소시킨다. 도 20A: 돼지 피부 상의 에스. 아우레우스의 생존에 대한 에스. 호미니스의 효과. 호고시딘 (1×105 CFU/cm2)을 생산하는 살아 있는 에스. 호미니스 A9를 돼지 피부 분석을 이용해 UV-사멸되고 세척된 A9 균주, AMP 활성을 나타내지 않는 살아 있는 에스. 호미니스 균주 (C4, C5 및 C6) 또는 비히클 크림 단독을 포함하는 대조군과 비교하였다. 데이터는 5회 개별 분석의 평균 ± s.e.m.을 나타낸다. 도 20B: 마우스 피부 상에서 에스. 아우레우스의 생존에 대한 세균 이식의 효과. 에스. 아우레우스를 마우스의 면도한 등 피부 상에 1×105 CFU/cm2으로 적용하였다. 2시간 후 대조군 (비히클 단독), 활성 에스. 호미니스 (A9), 또는 비활성 균주 (C4, C5 및 C6)를 동일한 농도 (1×105 CFU/cm2)로 적용하였다. CoNS 또는 대조군의 적용 20시간 후 에스. 아우레우스 회복을 나타낸다. 데이터는 6마리 마우스의 평균 ± s.e.m.을 나타낸다. 도 20C: 에스. 아우레우스로 집락화된 AD 개체 상에의 자가 (autologous) 인간 마이크로비옴 이식 (AMT)의 작업 흐름도. 도 20D: AMT에 사용된 CoNS 클론의 특징 분석. 각 클론의 항균 분류를 전체 게놈 서열분석으로 확인하였다. 도 20E: AD 개체의 피부 상에서 에스. 아우레우스의 생존에 대한 항균 CoNS의 이식 효과. 에스. 아우레우스 생존을 이식 전 (기저선) 및 처리 24시간 후에 취해진 면봉의 콜로니를 계수하여 측정하였다. 비히클 및 AMT 암 (arm) 사이의 에스. 아우레우스 차이는 Δ% 에스. 아우레우스 CFU로서 표시된다. 비활성 균주는 효과를 갖지 않는다.
도 21A-C: 자가 마이크로비옴 이식에 사용된 항-에스. 아우레우스 균주 AMT1-A9 (도 21A), AMT2-A12 (도 21B), 및 AMT3-A12 (도 21C)에서 동정된 가상의 항균 유전자. 활성 CoNS 클론의 전체 게놈 서열을 miSeq에 의해 수득하고 RAST 서버 (rast.nmpdr.org) 상에서 분석하여 항균 분류를 확인하였다.
도 22A-B: 자가 마이크로비옴 이식에 사용된 항-에스. 아우레우스 균주 AMT4-C2 (도 22A) 및 AMT4-G1 (도 22B)에서 동정된 가상의 항균 유전자. CoNS 클론의 전체 게놈 서열을 miSeq에 의해 수득하고 RAST 서버 (rast.nmpdr.org) 상에서 분석하여 항균 분류를 확인하였다.
도 23A-C: 자가 마이크로비옴 이식에 사용된 항-에스. 아우레우스 균주 AMT4-D12 (도 23A), AMT5-C5 (도 23B), 및 AMT5-G6 (도 23C)에서 동정된 가상의 항균 유전자. CoNS 클론의 전체 게놈 서열을 miSeq에 의해 수득하고 RAST 서버 (rast.nmpdr.org) 상에서 분석하여 항균 분류를 확인하였다.
도 24는 정상 피부로부터 단리된 스타필로코커스 에피더미디스 A11 균주의 배양 상청액으로부터 정제된 항균 펩티드의 용량-의존적 사멸 곡선을 나타낸다. 표시된 세균 종 (1×105 CFU/mL)을 50% 뮬러-힌톤 브로쓰 (Muller-Hinton Broth)/50% PBS 중에서 다양한 농도의 정제된 스타필로코커스 에피더미디스 A11 항균 펩티드 (서열번호 55 포함)와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes)를 혐기성 조건하에서 100% 레인포스트-클로스트리디알 (Reinforsed-Clostridial) 배지에서 인큐베이션하였다. S. epiA11, 스타필로코커스 에피더미디스 A11 균주; S. epi12228, 스타필로코커스 에피더미디스 ATCC12228 균주; S. homA9, 스타필로코커스 호미니스 A9 균주; S. aur113, 스타필로코커스 아우레우스 113 균주; P.ac, 프로피오니박테리움 아크네스 ATCC6919 균주; E. coli, 에스케리치아 콜라이 ATCC25922; P. 아에루지노사, 슈도모나스 아에루지노사 ATCC14213.
도 25A-B는 HPLC에 의해 스타필로코커스 에피더미디스의 임상적 단리 균주 (A11 균주)의 배양 상청액으로부터 분리된 항균 펩티드와 관련된 데이터를 보여준다 (A). 활성 분획 (분획 33-34)을 MALDO-TOF 매스로 분석하여 활성 항균 펩티드의 분자량을 평가하였다 (B). 관찰된 분자량은 3484.90 (m/z)이었다. 펩티드의 N-말단 서열분석은 서열번호 55로 제공된다.
도 2A-C. 낮은 빈도의 항균 활성을 갖는 응고효소 (coagulase)-음성 스타필로코커스가 아토피성 피부염 피부에 집락화된다. 도 2A: 에스. 아우레우스에 대해 항균 활성을 갖는 응고효소-음성 스타필로코커스 (CoNS)를 개별적 배양 분리물의 고성능 분석에 의해 결정하고 에스. 아우레우스의 성장을 억제하는 총 콜로니의 비율 (%)을 결정하였다. 도 2B: 항균 활성을 갖는 CoNS의 비율을 1일차, 7일차 및 14일차에 동일한 개체로부터 결정하였다. 도 2C: 스타필로코커스 DNA의 존재량에 대한 살아 있는 스타필로코커스 spp.의 비율을 도 2B에서와 같이 동일한 개체로부터 결정하였다. *P<0.05, ****P<0.0001. 11명의 아토피성 및 11명의 비-아토피성 개체를 패널 B 및 C에서의 분석을 위해 무작위로 선택하였다.
도 3A-B. 항균 응고효소-음성 스타필로코커스는 에스. 아우레우스 집락화의 부재와 연관된다. 도 3A: 각 시료에서 항균 CoNS의 비율을 각 개체로부터 배양된 에스. 아우레우스의 존재량에 대해 플롯팅한다. 사분면을 항균 CoNS의 빈도 (>50% 또는 <50%) 및 살아 있는 에스. 아우레우스의 검출에 기초하여 분할한다 (<1 CFU/cm2 또는 >1 CFU/cm2). 총 개체에 대한 각 사분면에서 개체의 비율 (%)을 나타낸다. 도 3B: 에스. 아우레우스-배양 음성 개체 (백색) 및 에스. 아우레우스-배양 양성 개체 (solid)에서 항균 CoNS의 빈도를 나타낸다. 데이터는 29명의 비-아토피성 개체 및 아토피성 개체의 41개의 비병변 또는 40개의 변병 부위에 대한 평균 ± SE이다.
도 4A-B. 다양한 세균 종이 항균 활성을 갖는다. 항균 또는 비-항균 CoNS의 종을 항균 활성 존재 및 부재인 무작위로 단리된 콜로니로부터의 전장 16S rRNA의 DNA 서열분석에 의해 동정하였다. 도 4A: 5명의 비-아토피성 개체로부터 항균 활성을 갖는 것으로 동정된 CoNS 종의 비율. 도 4B: 아토피성 피부염을 갖는 개체로부터 단리된 항균 및 비-항균 콜로니로부터 단리된 CoNS의 비율. 최대 48개의 CoNS 단리물의 서열을 각 개체로부터 분석하였다. 각각의 AD 개체로부터 항균 (solid) 및 비-항균 CoNS (백색)를 갖는 콜로니의 상대적 비율이 원형 차트로 표시된다.
도 5A-B. 피부 마이크로비옴 (SH-A9) 내부의 응고효소-음성 스타필로코커스 균주로부터 항균 펩티드의 동정. 도 5A. 비-아토피성 피부로부터 단리된 에스. 호미니스로부터 정제된 2개의 항균 펩티드의 아미노산 서열 및 예측된 모노 및 다이-설파이드 결합. 펩티드를 호고시딘-α (서열번호 2, aa 32-61) 및 호고시딘-β (서열번호 4, aa 29-66) (SH-란티바이오틱 α 및 β)로 명명한다. 호고시딘-α [3152.52 (M+H)] 및 호고시딘-β [3548.04 (M+H)]의 가상의 성숙한 형태의 계산된 분자량은 관찰된 분자 질량과 동일하다 [각각 m/z 3152.22 및 3547.71 (M+H)]. 도 5B는 에스. 아우레우스에 대한 호고시딘-α 및 호고시딘-β의 항균 활성에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. 인간 피부에 의해 생산된 항균 펩티드와의 동시-인큐베이션 (LL-37)은 상승적 활성을 나타낸다. 데이터는 3중 분석의 평균 ± SE를 나타낸다. 화살표는 대조군 대비 생존하는 세균의 3-log 감소로 정의된, 각 AMP의 최소 억제 농도 (MIC)를 나타낸다. Dha, 2,3-다이데히드로알라닌; Dhb, (Z)-2,3-다이데히드로부티린.
도 6. 비-아토피성 피부, 아토피성 피부의 비병변 및 병변 부위 상의 에스. 아우레우스 DNA의 존재량. 14개 및 37개 DNA 면봉 (swab)을 각각 모집된 30명의 정상인 및 50명의 아토피성 피부염 환자로부터 입수하였다. 에스. 아우레우스 DNA의 존재량을 에스. 아우레우스-특이적 femA 유전자를 표적하는 종-특이적 프라이머를 사용한 qPCR로 결정하였다. 에스. 아우레우스 DNA의 상대적 CFU (rCFU)를 에스. 아우레우스 (ATCC35556)의 공지의 CFU와의 비교에 의해 결정하였다. 살아 있는 세균 또는 세균 DNA의 밀도를 면봉으로 채취된 영역으로 표준화하였다. AD: 아토피성 피부염.
도 7A-B. 비-아토피성 피부로부터 단리된 에스. 호미니스 (SH-A9)에 의해 생산된 AMP의 정제 및 질량 분광학적 분석법. AMP를 에스. 호미니스의 대표적인 항균 분리물의 배양 상청액으로부터 CapcelPac C8 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 정제하였다 (도 7A). 5개 정제 단계의 마지막 단계를 나타낸다. 삽입 패널은 에스. 아우레우스에 대한 방사상 확산 분석 상의 각 분획의 항균 활성을 나타낸다. 항균 활성을 갖는 분획의 특징을 MALDI-TOF-MS로 분석하였다 (도 7B).
도 8. 호고시딘-β (SH-란티바이오틱-β)에 대한 게놈-안내 (genome-guided) MALDI-TOF/TOF 분석에서 아미노산 손실의 표현. 정제된 호고시딘-β의 아미노산 서열을 전구체 질량 3547.7 m/z의 MS/MS 단편화 스펙트럼에서의 아미노산 손실로부터 입수하였다. Dha, 2,3-다이데히드로알라닌; Dhb, (Z)-2,3-다이데히드로부티린.
도 9A-B. 비-아토피성 피부로부터 단리된 에스. 호미니스 균주 (SH-A9)에서 호고시딘 전구체 및 란티바이오틱 생합성 유전자를 인코딩하는 유전자 클러스터의 구성. 도 9A는 에스. 호미니스 SH-A9 게놈 상에서 란티바이오틱 전구체 (A1 및 A2; SH-란티바이오틱-α 및 β) 및 생합성 유전자 (C, T 및 M)의 순서를 나타낸다. 도 9B는 가상 유전자, 유전자좌 및 추정 기능을 열거한다. 이 에스. 호미니스 균주는 란티바이오틱-관련 유전자 클러스터의 다중 카피를 함유한다.
도 10은 본 발명에 사용된 고성능 방법론을 나타낸다.
도 11A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 에피더미디스 균주 MO-34 및 MO-38의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 12A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 A9 및 C2의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 13A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 에피더미디스 균주 A11 및 AMT1-A9의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 14A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 AMT2-A11 및 AMT3-A12의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 15A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 AMT4-C2 및 AMT4-G1의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 16A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 호미니스 균주 AMT4-D12 및 에스. 에피더미디스 AMT5-C5의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 17A-B. 본 발명에서 제공된 방법에 의해 동정된, 에스. 에피더미디스 균주 AMT5-G6, 및 호고시딘을 생산하지 않는 에스. 호미니스 균주 C4의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 18A-B. 호고시딘을 생산하지 않는 에스. 호미니스 균주 C5 및 C6의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 19A. SE-란티바이오틱 또는 SE-항균제를 생산하지 않는 에스. 에피더미디스 균주 MO1의 FAME 분석 결과를 나타내는 크로마토그램.
도 20A-E. 항균 CoNS의 이식은 피부 상의 에스. 아우레우스의 생존을 감소시킨다. 도 20A: 돼지 피부 상의 에스. 아우레우스의 생존에 대한 에스. 호미니스의 효과. 호고시딘 (1×105 CFU/cm2)을 생산하는 살아 있는 에스. 호미니스 A9를 돼지 피부 분석을 이용해 UV-사멸되고 세척된 A9 균주, AMP 활성을 나타내지 않는 살아 있는 에스. 호미니스 균주 (C4, C5 및 C6) 또는 비히클 크림 단독을 포함하는 대조군과 비교하였다. 데이터는 5회 개별 분석의 평균 ± s.e.m.을 나타낸다. 도 20B: 마우스 피부 상에서 에스. 아우레우스의 생존에 대한 세균 이식의 효과. 에스. 아우레우스를 마우스의 면도한 등 피부 상에 1×105 CFU/cm2으로 적용하였다. 2시간 후 대조군 (비히클 단독), 활성 에스. 호미니스 (A9), 또는 비활성 균주 (C4, C5 및 C6)를 동일한 농도 (1×105 CFU/cm2)로 적용하였다. CoNS 또는 대조군의 적용 20시간 후 에스. 아우레우스 회복을 나타낸다. 데이터는 6마리 마우스의 평균 ± s.e.m.을 나타낸다. 도 20C: 에스. 아우레우스로 집락화된 AD 개체 상에의 자가 (autologous) 인간 마이크로비옴 이식 (AMT)의 작업 흐름도. 도 20D: AMT에 사용된 CoNS 클론의 특징 분석. 각 클론의 항균 분류를 전체 게놈 서열분석으로 확인하였다. 도 20E: AD 개체의 피부 상에서 에스. 아우레우스의 생존에 대한 항균 CoNS의 이식 효과. 에스. 아우레우스 생존을 이식 전 (기저선) 및 처리 24시간 후에 취해진 면봉의 콜로니를 계수하여 측정하였다. 비히클 및 AMT 암 (arm) 사이의 에스. 아우레우스 차이는 Δ% 에스. 아우레우스 CFU로서 표시된다. 비활성 균주는 효과를 갖지 않는다.
도 21A-C: 자가 마이크로비옴 이식에 사용된 항-에스. 아우레우스 균주 AMT1-A9 (도 21A), AMT2-A12 (도 21B), 및 AMT3-A12 (도 21C)에서 동정된 가상의 항균 유전자. 활성 CoNS 클론의 전체 게놈 서열을 miSeq에 의해 수득하고 RAST 서버 (rast.nmpdr.org) 상에서 분석하여 항균 분류를 확인하였다.
도 22A-B: 자가 마이크로비옴 이식에 사용된 항-에스. 아우레우스 균주 AMT4-C2 (도 22A) 및 AMT4-G1 (도 22B)에서 동정된 가상의 항균 유전자. CoNS 클론의 전체 게놈 서열을 miSeq에 의해 수득하고 RAST 서버 (rast.nmpdr.org) 상에서 분석하여 항균 분류를 확인하였다.
도 23A-C: 자가 마이크로비옴 이식에 사용된 항-에스. 아우레우스 균주 AMT4-D12 (도 23A), AMT5-C5 (도 23B), 및 AMT5-G6 (도 23C)에서 동정된 가상의 항균 유전자. CoNS 클론의 전체 게놈 서열을 miSeq에 의해 수득하고 RAST 서버 (rast.nmpdr.org) 상에서 분석하여 항균 분류를 확인하였다.
도 24는 정상 피부로부터 단리된 스타필로코커스 에피더미디스 A11 균주의 배양 상청액으로부터 정제된 항균 펩티드의 용량-의존적 사멸 곡선을 나타낸다. 표시된 세균 종 (1×105 CFU/mL)을 50% 뮬러-힌톤 브로쓰 (Muller-Hinton Broth)/50% PBS 중에서 다양한 농도의 정제된 스타필로코커스 에피더미디스 A11 항균 펩티드 (서열번호 55 포함)와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes)를 혐기성 조건하에서 100% 레인포스트-클로스트리디알 (Reinforsed-Clostridial) 배지에서 인큐베이션하였다. S. epiA11, 스타필로코커스 에피더미디스 A11 균주; S. epi12228, 스타필로코커스 에피더미디스 ATCC12228 균주; S. homA9, 스타필로코커스 호미니스 A9 균주; S. aur113, 스타필로코커스 아우레우스 113 균주; P.ac, 프로피오니박테리움 아크네스 ATCC6919 균주; E. coli, 에스케리치아 콜라이 ATCC25922; P. 아에루지노사, 슈도모나스 아에루지노사 ATCC14213.
도 25A-B는 HPLC에 의해 스타필로코커스 에피더미디스의 임상적 단리 균주 (A11 균주)의 배양 상청액으로부터 분리된 항균 펩티드와 관련된 데이터를 보여준다 (A). 활성 분획 (분획 33-34)을 MALDO-TOF 매스로 분석하여 활성 항균 펩티드의 분자량을 평가하였다 (B). 관찰된 분자량은 3484.90 (m/z)이었다. 펩티드의 N-말단 서열분석은 서열번호 55로 제공된다.
본원 및 첨부의 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "프로브"에 대한 언급은 그러한 다수의 세포를 포함하고 "세포"에 대한 언급은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 하나 이상의 세포 및 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다.
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다양한 실시양태에 대한 설명이 용어 "포함하는"을 사용하는 경우, 당업자는 몇몇 특정 예에서 실시양태가 "본질적으로 이루어진" 또는 "구성된"이라는 용어를 사용하여 대안적으로 설명될 수 있음을 이해할 것으로 더욱 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 시약이 개시된 방법 및 조성물의 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 이하에서 서술된다
본원에 언급된 모든 간행물은 본원의 설명과 관련하여 사용될 수 있는, 간행물에 기술된 방법론을 설명하고 공개하기 위한 목적으로 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명에서 명시적으로 정의된 용어와 유사하거나 이와 동일한 하나 이상의 간행물에 제시된 임의의 용어와 관련하여, 본 발명에 명시적으로 제공된 바와 같은 용어의 정의가 모든 측면에 적용될 것이다.
아토피성 피부염은 표피 장벽의 기능장애 및 재발성 피부 염증을 특징으로 하는 일반적인 만성 피부 질환이다. 이 질환의 중증도는 피부 마이크로비옴의 디스바이오시스(dysbiosis) 및 스타필로코커스 아우레우스에 의한 집락화 및 감염에 대한 이들 환자의 높은 감수성과 관련이 있다.
아토피성 피부염의 병인에 대한 통합 모델은 면역이 상피에 의해 제공되는 기능에 동시-의존한다는 인식과 함께 부상하였다. 예를 들어, 항균 펩티드 (AMP)의 생산은 침입하는 병원체에 대한 직접적인 소독 활성을 제공한다. 건강한 피부에서, 카텔리시딘 및 β-디펜신과 같은 AMP는 손상 후 증가된다. 그러나, 아토피성 피부염 환자의 피부는 특정 AMP를 생산하는데 감소된 능력을 가지며, 이는 이들 AMP에 의해 사멸되어야만 하는 병원체인 에스. 아우레우스에 의한 감염의 증가된 비율과 연관된다. 에스. 아우레우스는 아토피성 피부염의 증상을 더욱 악화시키고 TH2 림프구 비대 (skewing), AMP 감소, 악화된 알레르기 반응 및 피부 장벽 파괴와 같은 면역 기능 장애를 초래한다.
아토피성 피부염 환자의 이전 연구는 이들 환자에게 존재하는 세균 균총이 비-아토피성 개체의 피부에서 발견되는 세균과 상이함을 나타내었다. 아토피성 피부염 환자의 마이크로비옴은 다양성이 적으며 전형적으로 스타필로코커스 종의 더 높은 존재량을 갖는다. 임의의 특정 이론에 구속되려는 의도는 아니지만, 피부 마이크로비옴의 디스바이오시스가 이 질환의 병리생리학에 기여할 수 있음을 가정하였다. 구체적으로, 일반적으로 마이크로비옴을 포함하는 미생물의 다양한 공동체가 피부의 항상성에 기여하는 것으로 제안되어 왔다. 예를 들어, 마우스에서, 스타필로코커스 에피더미디스는 손상 후 염증을 제어하고, T-세포 발달에 영향을 미치며 AMP의 발현을 유도할 수 있다. 나아가, 마이크로비옴은 숙주 세포에 의해 생산된 AMP와 함께 상승 작용할 수 있는 그 자신의 AMP를 생산할 수 있다. 따라서, 에스. 아우레우스에 의한 집락화의 유해한 효과 이외에도, 아토피성 피부염에서 마이크로비옴의 디스바이오시스는 이들의 유익한 기능을 상실함으로써 질환에 기여할 수 있다.
기존의 항생제 요법은 세균을 비특이적으로 죽이며, 이는 상주하는 미생물상의 항상성에 영향을 미친다. 불균형 미생물상은 아토피성 피부염, 사마귀 및 보통 여드름 (acne vulgaris) 등과 같은 피부 염증성 질환의 병인에 기여한다. 본 발명은 표면을 소독하거나 감염을 치료하기 위한 조성물 및 제제를 제공하지만, 비-특이적 항생제의 안전성 위험을 제기하지는 않는다. 또한, 본 발명은 개체에게, 건강한 피부 균총의 특징을 동시에 회복시키면서 인 시츄에서 필요한 항균 화합물을 생성할 수 있는, 살아 있는 에스. 호미니스 또는 에스. 에피더미디스 균주를 제공할 수 있는 프로바이오틱 접근법을 제공한다
스타필로코커스 호미니스 (에스. 호미니스)는 건강한 인간 피부의 미생물상의 주요 구성원이다. 최근 연구에 따르면 에스. 에피더미디스가 정상의 인간 피부 상에서 추가적인 항균 화합물로서 기능하는, 페놀-용해성 모듈린 (phenol-soluble modulin, PSM), 및 "퍼모시딘 (Firmocidin)"으로 명명된, 작은 소분자 항생제를 생산하여 병원성 감염을 예방함으로써 인간 피부를 보호한다고 보고되었다 (예컨대, 그의 기재가 참조로서 본원에 포함되는, 미국특허공개 제2013/0331384 A1호 참조). 또한, 에스. 에피더미디스에 의해 생산된 지질테이코산 (lipoteichoic acid)은 상처 치유 중 피부 염증을 억제하여 인간 피부에 도움이 된다. 본 발명은 상처 치유를 지지하고 감염을 예방하고 피부 장벽 기능을 회복시켜 정상적인 피부 균총을 회복 또는 강화하기 위한 살아 있는 에스. 에피더미디스 및/또는 에스. 호미니스 세포 또는 배양액의 용도를 제공한다.
DNA 서열분석의 한계는 생존 가능한 유기체와 죽은 유기체를 구별할 수 없다는 것이고, 본 발명의 방법에서 미생물 존재량은 배양 및 DNA 정량 기법 둘 다에 의해 아토피성 및 비-아토피성 개체에서 직접적으로 평가될 수 있다. 놀랍게도, DNA의 측정 대비 살아 있는 세균을 배양하는 상대적 능력은 비-아토피성 환자와 아토피성 피부염 환자 사이에서 상당히 달랐다. 배양된 세균의 CFU에 비해 대략 10배 이상의 세균 DNA가 아토피성 병변 피부와 비교하여 비-아토피성 피부에서 검출되었다. 이러한 관찰 결과는 아토피성 병변 피부보다 비-아토피성 피부 상의 세균이 더 낮은 생존률을 가짐을 제안하였다.
비-아토피성 피부 상의 더 낮은 세균 생존률에 대한 한 가지 설명은 더욱 효과적인 표면 항균 활성이다. LL-37과 hBDs-2 및 -3과 같은 AMP는 정상 개체의 염증 (inflamed) 피부보다 아토피성 환자의 염증 피부에서 더 낮은 수준의 발현을 갖지만, 이들 AMP 발현은 비-염증 피부에서 낮다. 따라서, 세균을 사멸시키는 비-염증 피부의 증가된 능력은 이들 숙주 AMP의 발현에 기인한 것 같지는 않다. 비-아토피성 피부 상에서 관찰된 높은 빈도의 항균 CoNS는 이들 상주 세균이 병원체에 의한 집락화를 저지하는데 중요하다는 것을 제안한다. 에스. 아우레우스 집락화가 항균 활성을 갖는 CoNS 균주의 빈도가 낮은 개체에서만 검출되었음이 이를 뒷받침한다. 생물막 (biofilm) 형성을 억제할 수 있는 CoNS가 또한 코 점막에서도 관찰되었고 에스. 아우레우스에 의한 코 집락화를 억제하였다. 아토피성 피부염 환자의 피부에 존재하는 세균 공동체로부터 유래한 직접적인 항균 활성의 결여에 대한 관찰은 이들 개인의 선천적 방어 체계에서 이전에는 알려지지 않았던 결함을 정의한다.
30명의 건강한 대조군 개체 및 아토피성 피부염 (AD) 환자의 50개 병변 및 비병변 부위의 피부 면봉 (swab)으로부터 배양된 응고효소-음성 스타필로코커스 (CoNS)의 7500종 초과의 개별 단리물에 대한 항균 활성 고-처리량 스크린은 항균 활성을 갖는 수개의 CoNS 단리물을 동정하였다. 건강한 개체는 스타필로코커스 아우레우스에 대해 항균 활성을 갖는 높은 빈도의 CoNS 단리물을 갖는 반면 (75.26±6.59%), AD 비병변 및 병변 피부로부터 단리된 세균은 현저히 약한 활성을 가졌다 [각각 22.83±5.10%, 15.76±4.10%, (p<0.0001)]. 특히, 낮은 빈도의 항균 CoNS 단리물을 갖는 개체는 또한 SA에 의해 집락화가 이루어졌다. 16S rRNA 서열분석은 에스. 에피더미디스, 에스. 호미니스, 에스. 와르네리 (S. warneri), 및 에스. 카피티스 (S. capitis)와 같은 CoNS의 다양한 균주에서 항균 활성이 검출되었음을 나타내었다. 3152.2 Da 및 3550.7 Da의 분자량을 갖는 2종의 원핵 AMP를 HPLC, MALDI-TOF-MS2에 의한 단백질 서열분석 및 게놈 서열분석을 이용해 동정하였다. 또한, 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 문헌 [Nakatsuji, T. et al. (2016), Nature Medicine Submitted Manuscript No. NMED-A78395A, submitted March 29, 2016]에 나타난 바와 같이, 생체 외 모델 시스템, 동물 모델에의 기능적 CoNS 단리물의 적용에 의해, 그리고 인간 개체에서 자가 이식을 통해 CoNS 균주의 적용이 감염 피부에서 에스. 아우레우스 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, SA에 의해 집락화가 이루어진 마우스 피부에의 이 항균 CoNS 단리물의 적용은 AD CoNS 균주가 적용되었을 때 보여지는 것보다 SA 생존을 >90%로 감소시키는데 효과적이었다. 이 관찰 결과는 마이크로비옴이 SA에 대한 제일선의 방어이며 AD에서의 디스바이오시스가 SA 집락화에 대해 주된 기능적 연관성을 가짐을 제안한다.
에스. 아우레우스에 대해 항균 활성을 나타내는 몇몇 CoNS 종이 확인되었다. 에스. 에피더미디스 및 에스. 와르네리의 일부 실험실 균주는 다른 세균의 성장을 억제할 수 있는 란티바이오틱스를 생산하는 것으로 이전에 기술되었지만, 이들은 개체 집단에서 검출되지 않았다. 나아가, 이들의 항균 활성을 토대로 분리된 몇몇 CoNS 종은 이전에는 항균 기능을 갖는 것으로 생각되지 않았다. 이를 더 잘 이해하기 위하여, 이전에는 알려지지 않았던 2종의 란티바이오틱스가 에스. 아우레우스에 대해 강력한 활성을 갖고 숙주 AMP LL-37과 높은 시너지 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이들 란티바이오틱스를 인코딩하는 유전자는 비-아토피성 개인에서 우세하였다. 이 발견은 숙주-방어 기능의 추가 분석에 있어서 건강한 인간 피부 마이크로비옴의 가능성을 설명하고 마이크로비옴의 활성을 예측하는 유전적 접근법을 제공할 수 있다. 메타게놈 서열분석 (metagenomic sequencing) 및 마이크로비옴의 기능적 스크리닝과의 상관관계는 아토피성 피부염 환자 및 기타 피부 질환 환자의 치료에 큰 도움이 될 수 있다.
본 발명은 정상적인 인간 피부에 상주하는 세균 공동체가 에스. 아우레우스에 대한 중요한 방패를 제공한다는 증거를 제공한다. 다시 말해, 임의의 특정 이론에 의해 구속되려는 의도 없이, 이 마이크로비옴-매개 항균 방어 체계의 기능부전은 아토피성 피부염에서 에스. 아우레우스에 의한 피부의 집락화를 가능케 하고 질환을 더욱 악화시킬 수 있다. 이 관찰 결과는 피부의 세균요법 (bacteriotherapy)의 전략이 약제학적으로 유도된 항생제를 사용하지 않고도 에스. 아우레우스를 억제하는 방법으로서 유용할 수 있음을 제안한다. 이 질환의 복잡한 성질을 고려할 때, 아토피성 피부염에 대한 이상적인 치료적 접근법은 내재적 표지 장벽의 회복과 마이크로비옴에 의해 제공되는 면역 방어 기능의 최적화 둘 다를 표적하는 것을 포함해야만 한다.
본 발명은 또한 에스. 호미니스의 임상적 단리물의 배양 상청액 유래의 신규한 항균 펩티드 (AMP)를 기술한다. 이들 AMP는 본원에서 호고시딘-α 및 호고시딘-β로서 언급된다. 호고시딘은 스타필로코커스 아우레우스 (에스. 아우레우스)에 대해 항균 및 살균 활성을 나타내지만, 에스. 에피더미디스와 같은 피부 상의 공생 세균의 성장을 억제하지 않는다. 따라서, 본 발명은 병원체에 대해 강력하지만 선택적인 활성을 갖고, 인간 피부 마이크로비옴에서 일반적으로 발견되는 바와 같은 높은 안정성 프로파일을 갖는 항생제뿐만 아니라 이들 상태를 치료하기 위한 프로바이오틱 접근법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "항균"은 펩티드가 미생물 (예컨대, 세균, 진균, 및/또는 바이러스)의 성장 또는 증식을 파괴하거나 또는 억제 또는 예방하는 것을 의미한다. 유사하게, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "항바이러스"는 펩티드가 바이러스 또는 바이러스-감염 세포의 성장 또는 증식을 파괴하거나 또는 억제 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "항-종양"은 종양 세포(들)을 예방하고, 이의 성장을 억제하거나, 또는 이를 파괴하는 것을 의미한다. 유사하게, 용어 "항진균"은 펩티드가 진균의 성장을 예방하고, 파괴하거나 또는 억제하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로바이오틱"은 건강한 피부 또는 점막 균총의 성분을 보충하거나 대체하기 위해, 살아 있는 또는 약독화된 세균 배양액, 또는 이러한 배양액의 용해물, 동결건조물 또는 추출물을 제공하는 과정을 지칭한다. 피부에 전달하기 위한 약독화된 벡터는 (a) 벡터를 비-병원성으로 만들거나, (b) 병원성을 감소시키거나, (c) 복제 결함이 되거나, 또는 (d) 비-항원성이 되도록 유전적으로 변형된 바이러스 또는 세균을 포함할 수 있다. 다른 약독화가 당해 분야에 공지되어 있다. 약독화는 전형적으로 상기 항목 (a)-(c) 또는 (d)가 달성되도록 유전자를 넉아웃시키거나 유전자 코딩 서열 또는 발현 조절 요소를 파괴함으로써 수행된다. 이러한 기법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 수많은 이러한 약독화된 세균 및 바이러스 벡터가 알려져 있다.
"호고시딘 (hogocidin)"은 2개의 별개 도메인으로 구성된다: 성숙 호고시딘의 N-말단 "프로서열 (prosequence)" 도메인 및 C-말단 도메인. 성숙 호고시딘-α는 서열번호 2의 약 아미노산 32 내지 약 아미노산 61의 서열 (예컨대, 서열번호 2의 약 아미노산 30, 31, 32 또는 33에서 시작하여 서열번호 2의 약 아미노산 59, 60 또는 61로 연장됨)을 포함한다. 호고시딘-α의 프리-프로 (pre-pro) 형태가 약 61개 아미노산 길이이고 번역 후 처리되어 (post-translationally processed) 성숙한 형태를 제공함이 당업자에게는 용이하게 명백해질 것이다. 발현 시스템 및 유기체에 따라서, 성숙한 형태는 프로테아제의 존재 여부에 따라서 약간 다르게 처리될 수 있다. 나아가, 호고시딘-α의 프리-프로 형태가, 상기 프리-프로 형태의 투여 전 또는 투여 후에 시험관 내 또는 생체 내에서 처리될 수 있는, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 사용될 수 있음이 또한 당업자에게는 용이하게 명백해질 것이다.
유사하게, 호고시딘-β의 성숙한 형태는 서열번호 4의 약 아미노산 29 내지 약 아미노산 66의 서열 (예컨대, 서열번호 4의 약 아미노산 27, 28, 29 또는 30에서 시작하여 서열번호 4의 약 아미노산 64, 65, 또는 66으로 연장됨)을 포함한다. 호고시딘-β의 프리-프로 형태가 약 66개 아미노산 길이이고 번역 후 처리되어 성숙한 형태를 제공함이 당업자에게는 용이하게 명백해질 것이다. 발현 시스템 및 유기체에 따라서, 성숙한 형태는 프로테아제의 존재 여부에 따라서 약간 다르게 처리될 수 있다. 나아가, 호고시딘-β의 프리-프로 형태가, 상기 프리-프로 형태의 투여 전 또는 투여 후에 시험관 내 또는 생체 내에서 처리될 수 있는, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 사용될 수 있음이 또한 당업자에게는 용이하게 명백해질 것이다.
서열번호 2를 포함하는 폴리펩티드는 전형적으로 서열번호 2의 아미노산 번호 31 이후에 절단되지만, 당업자는 사용된 효소, 사용된 발현 시스템 및/또는 폴리펩티드의 단백질분해 절단이 일어나는 조건에 따라서, 절단 부위가 서열번호 2의 아미노산 번호 31의 양방향으로 1 내지 3개의 아미노산이 달라질 수 있음을 인식할 것이다.
서열번호 4를 포함하는 폴리펩티드는 전형적으로 서열번호 4의 아미노산 번호 28 이후에 절단되지만, 당업자는 사용된 효소, 사용된 발현 시스템 및/또는 폴리펩티드의 단백질분해 절단이 일어나는 조건에 따라서, 절단 부위가 서열번호 4의 아미노산 번호 31의 양방향으로 1 내지 3개의 아미노산이 달라질 수 있음을 인식할 것이다.
유전자 코드가 당업자에 의해 충분히 이해되고 원하는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 것이 통상적이긴 하지만, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 2 및 4의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열번호 1 및 3을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "호고시딘 펩티드"는 약 30개 내지 약 50개 아미노산 길이인 아미노산 사슬을 포함하는 호고시딘의 성숙한 형태를 지칭하고 서열번호 2 또는 4로 표시되는 서열 또는 이의 번역-후 변형된 형태를 포함한다:
서열번호 2 (aa 32 내지 aa 61) - KCSWWNASCHLGNNGKICTVSHECAAGCNL (서열번호 56)
서열번호 4 (aa 29 내지 aa 66) - ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK (서열번호 57).
일 실시양태에서, 방법은 (a) 서열번호 2 또는 4의 호고시딘 펩티드와 적어도 95% 동일하고 항균 활성을 갖는 펩티드; (b) 번역-후 처리된 (a)의 성숙한 형태; (c) 약 15-40개 아미노산 길이이고 항균 활성을 갖는 호고시딘 펩티드의 단편; (d) 상기 (a)-(c)를 포함하고 항균 활성을 갖는 융합 단백질; (e) 하나 이상의 아미노산이 D-아미노산을 포함하고 펩티드가 항균 활성을 갖는 (a), (b), (c) 또는 (d)의 어느 하나를 포함하는 펩티드; 및 (f) 항균 펩티드를 갖는 전술한 어느 하나의 역반대 (retroinverso) 펩티드를 포함하는 호고시딘 유도체를 제공한다. 일부 추가의 실시양태에서, 방법은 란티오닌 (lanthionine) 또는 메틸란티오닌 잔기를 포함하는 호고시딘 유도체, 또는 이들이 란티오닌 또는 메틸란티오닌 잔기를 함유하도록 변형된 호고시딘 유도체를 제공한다. 유사체, 유도체, 변형 또는 변이체는 이들이 일부 항균 활성을 갖는 한, 그로부터 유사체, 유도체, 보존적 변형 또는 변이체가 유도되는 호고사딘 펩티드의 활성과 동일한 활성을 가질 필요는 없다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 4의 폴리펩티드에 비해 적어도 하나의 보존적 아미노산 차이를 포함하는 호고시딘 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 M-말단에 서열번호 55의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 상기 폴리펩티드는 항균 활성을 가지며 관찰된 분자량은 3484.90 (m/z)이었다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 에스. 에피더미디스 A11에 의해 생산된다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고 실질적으로 순수한 호고시딘 펩티드 또는 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 호고시딘- 또는 퍼모시딘-생산 세균 균주를 포함하는 프로바이오틱 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "정제된"은 다른 단백질, 지질, 및 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 생체 내 생산된 펩티드와 자연적으로 연합되는 세포성 성분)가 실질적으로 없는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 펩티드는 중량 기준으로 적어도 70%, 80%, 또는 가장 일반적으로는 90% 순수하다. 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 조성물은 카텔리시딘 펩티드 또는 이의 유도체를 추가로 포함할 수 있다.
"변이체"는 참조된 항균 펩티드로부터의 변형된 형태인 항균 펩티드 (예컨대, 본 발명의 호고시딘 펩티드)이다. 예를 들어, 용어 "변이체"는 참조 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 (예컨대, 약 1개 내지 10개 아미노산)이 또 다른 아미노산으로 대체되는 본원에 기술된 방법에 의해 생산되는 항균 펩티드를 포함한다. 용어 "참조" 펩티드는 그로부터 변이체, 유도체, 유사체, 또는 보존적 변이체가 유래하는, 본 발명의 임의의 항균 펩티드 (예컨대, 서열번호 2 및 4로 이루어진 폴리펩티드 또는 이의 성숙한 형태)를 의미한다. 2종의 항균 호고시딘 펩티드 각각의 적어도 일부분을 포함하는 하이브리드 펩티드가 용어 "유도체"의 범위에 포함된다. 유도체는 펩티드의 항균 활성을 완전히 억제하지 않으면서 항균 펩티드에 하나 또는 수개 (예컨대, 1개 내지 5개)의 아미노산을 부가함으로써 생산될 수 있다. 또한, C-말단 유도체, 예컨대 C-말단 메틸 에스테르가 생산될 수 있고 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 본원에 예시된 바와 같은 그러한 펩티드의 보존적 변형인 펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "보존적 변형"은 적어도 하나의 아미노산이 또 다른, 생물학적, 화학적, 또는 구조적으로 유사한 잔기로 대체되는 폴리펩티드를 지칭한다. 보존적 변형의 예시에는 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 예컨대 리신에 대한 아르기닌의 치환, 아스파르트산에 대한 글루탐산의 치환, 또는 아르기닌에 대한 글루타민의 치환 등이 포함된다. 하나의 또 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있는 중성의 친수성 아미노산에는 아스파리긴, 글루타민, 세린 및 쓰레오닌이 포함된다. 구조적으로 보존적인 변형에는 세린에 대한 알라닌의 치환 (및 그 반대), 쓰레오닌에 대한 이소류신의 치환 (및 그 반대), 리신에 대한 아르기닌의 치환 (및 그 반대), 및 상기 그룹의 임의의 다른 멤버에 대한 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 히스티틴 중 하나의 대체가 포함된다. 용어 "보존적 변형"은 또한 비치환된 모체 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 갖는 펩티드를 포함하고; 전형적으로, 치환된 폴리펩티드에 대해 제기된 항체는 또한 비치환된 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, "SH-란티바이오틱 (SH-lantibiotic)"은 선택적으로 하나 이상의 란티오닌 또는 메틸란티오닌 모이어티를 함유하고, 하나 이상의 비-에스. 호미니스 종에 대해 항균 활성을 나타내는 에스. 호모니스에 의해 생산되는 번역-후 변형된 펩티드를 포함하는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "SH-항균제 (SH-antimicrobial)"는 선택적으로 비-란티바이오틱 펩티드를 포함할 수 있고, 하나 이상의 비-에스. 호미니스 종에 대해 항균 활성을 나타내는 에스. 호모니스에 의해 생산되거나 분비되는 비-란티바이오틱 화합물을 포함하는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "SE-란티바이오틱"은 선택적으로 하나 이상의 란티오닌 또는 메틸란티오닌 모이어티를 함유하고, 하나 이상의 비-에스. 에피더미디스 종에 대해 항균 활성을 나타내는 에스. 에피더미디스에 의해 생산된 번역-후 변형된 펩티드를 포함하는 화합물을 지칭한다. 일 실시양태에서, 펩티드는 서열번호 55의 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "SE-항균제"는 선택적으로 비-란티바이오틱 펩티드를 함유하고, 하나 이상의 비-에스. 에피더미디스 종에 대해 항균 활성을 나타내는 에스. 에피더미디스에 의해 생산되거나 분비되는 비-란티바이오틱 화합물을 포함하는 화합물을 지칭한다.
본 발명의 호고시딘 펩티드 변이체는, 예를 들어 피부 감염에 대해 증가된 감수성을 나타내는 CRAMP 넉아웃 마우스와 같은 다수의 동물 모델 중 하나를 사용하여 무작위 펩티드 또는 관심 펩티드의 거대 집합 또는 라이브러리를 스크리닝하여 동정될 수 있다. 호고시딘 펩티드 변이체는, 예를 들어 이러한 서열을 기초로 한 다양한 치환을 갖게 함으로써 아미노산 서열에서 서열번호 2 및 4와 관련된 펩티드의 집단일 수 있다.
펩티드 라이브러리는, 예를 들어 펩티드 및 펩티드모방체 (peptidomimetic) 분자를 포함하는 태그된 화학적 라이브러리를 포함한다. 펩티드 라이브러리는 또한 파아지 디스플레이 기법에 의해 생성된 것들을 포함한다. 파아지 디스플레이 기법은 파아지의 표면 상에서 펩티드 분자의 발현뿐만 아니라 단백질 리간드가 이를 인코딩하는 핵산과 연관되거나 연관될 수 있는 다른 방법론을 포함한다. 발현되는, 펩티드의 집단을 다양화하는 벡터 및 방법을 비롯한, 파아지 디스플레이 라이브러리의 생산 방법이 당해 분야에 공지되어 있다 [예를 들어, 문헌 (Smith and Scott, Methods Enzymol. 217: 228 257, 1993; Scott and Smith, Science 249: 386 390, 1990; 및 Huse, WO 91/07141 및 WO 91/07149 참조). 이들 또는 다른 공지의 방법이 파아지 디스플레이 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있고, 그로부터 디스플레이된 펩티드를 절단하고 항세균 (antibacterial) 활성에 대해 분석할 수 있다. 바람직하다면, 펩티드의 집단을 활성에 대해 분석할 수 있고, 활성 집단을 세분화할 수 있으며 집단으로부터 활성 펩티드를 분리하기 위해 분석을 반복할 수 있다. 본 발명에 유용한 펩티드를 생산하는 다른 방법에는, 예를 들어 서열번호 2 또는 4에 개시된 바와 같은 호고시딘 펩디드의 아미노산 서열을 기초로 한 합리적인 설계 및 돌연변이 유발이 포함된다.
호고시딘 펩티드 변이체는, 예를 들어 서열번호 2 또는 4의 호고시딘 펩티드 (또는 이의 성숙한 형태)의 구조를 모방하지만 여전히 항균/항세균 (antimicrobial/antibacterial) 활성을 보유하는 비-아미노산 화학적 구조인, 펩티드 모방체일 수 있다. 이러한 모방체는 일반적으로 호고시딘 펩티드 대응물에서 발견되는 동일한 공간 배열로 크기, 전하 또는 소수성과 같은 유사한 물리적 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 펩티드 모방체의 특이적 예시는 하나 이상의 아미노산 사이의 아미드 결합이, 예를 들어 탄소-탄소 결합 또는 당해 분야에 익히 알려진 다른 결합으로 대체되는 화합물이다 [예를 들어, 문헌 (Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washington, 1995) 참조].
본 발명의 호고시딘 펩티드, 변이체 또는 펩티드모방체의 아미노산은, 달리 언급되지 않는 한, L-아미노산 및 D-아미노산을 포함하는, 20개의 자연 발생적인 아미노산으로부터 선택된다. D-아미노산의 사용은 단백질 또는 펩티드의 수명을 증가시키는데 특히 유용하다. D-아미노산을 혼입하는 폴리펩티드는 단백질분해 용해에 내성이 있다. 용어 아미노산은 또한, 화합물이 그의 생물학적 활성을 유지하도록 펩티드 내에서 치환될 수 있다면, 아미노산 유사체, 노르류신과 같이 일반적으로 단백질 내에 혼입되지 않는 자연 발생적인 아미노산, 및 그 아미노산의 특징인 것으로 당해 분야에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물과 같은 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 글루타민은, 그의 항균/항세균 활성을 유지하도록 호고시딘 펩티드, 변이체 등의 활성 단편 내부에서 치환될 수 있다면, 아스파라긴의 아미노산 유사체일 수 있다. 아미노산 및 아미노산 유사체의 다른 예시가 문헌 [Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983)]에 열거된다. 아미노산은 또한 아미노산 모방체일 수 있고, 이는 아미노산과 동일한 작용기의 공간적 배열을 나타내지만, 반드시 아미노산의 특징인 "-아미노기" 및 "-카르복실기" 둘 다를 가질 필요는 없는 구조이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 알파-아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호를 포함하는 것과 같이 통상적으로 사용되는 방법에 의해 합성될 수 있다. 두 방법 모두 단일 아미노산이 폴리펩티드 또는 펩티드의 C 말단으로부터 시작되는 각 단계에서 단일 아미노산이 부가되는 단계적 합성을 포함한다 [문헌 (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9) 참조]. 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1962 및 Stewart and Young, Solid Phase Peptides Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969, pp. 27 62]에 기술된 것들과 같이 익히 알려진 고체상 펩티드 합성 방법에 의해 합성될 수 있다. 바람직하다면, 펩티드는 고체상 에드만 분해 (Edman degradation)에 의해 정량화될 수 있다.
합성기 (synthesizer)를 사용하여 호고시딘 펩티드 (즉, 서열번호 2 또는 4의 성숙한 형태)가 번역-후 처리를 요구하지 않으면서 구체적으로 생성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (예컨대, DNA, cDNA, 또는 RNA)를 포함한다. 본원에 기술된 폴리펩티드 및 펩티드의 유사체, 돌연변이체, 보존적 변형, 및 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 단백질, 지질, 및 생체 내에서 생산된 폴리뉴클레오티드와 자연적으로 연합되는 다른 폴리뉴클레오티드를 실질적으로 함유하지 않는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 다른 물질로부터 적어도 70%, 80%, 또는 90% 단리되고, 시험관 내에서 폴리뉴클레오티드를 합성하는 통상적인 방법이 생체 내 방법 대신에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"는 별개의 단편의 형태로서 또는 더 큰 유전자 작제물로서 (예컨대, 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 프로모터를 작동 가능하게 연결함에 의함), 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 수많은 유전자 작제물 (예컨대, 플라스미드 및 기타 발현 벡터)이 당해 분야에 공지되어 있으며 무세포 시스템 또는 원핵 또는 진핵 (예컨대, 효모, 곤충 또는 포유류) 시스템에서 본 발명의 펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 코드의 축퇴성을 고려하여, 당업자는 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 합성할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 생산하기 위해 통상적인 분자생물학 방법에 용이하게 사용될 수 있다.
본 발명의 호고시딘 펩티드, 이의 유도체 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 "발현 벡터" 내로 삽입될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 조작될 수 있는 당해 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 비히클과 같은 유전자 작제물을 지칭한다. 이러한 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 삽입된 유전자 서열의 전사를 촉진하는 프로모터를 함유하는 플라스미드이다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 기원, 및 프로모터뿐만 아니라 형질전환된 세포의 표현형적 선택을 가능케 하는 유전자 (예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유한다. 유도성 및 구성적 프로모터를 비롯한 다양한 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 숙주 세포와 양립 가능한 종으로부터 유래한 레플리콘 (replicon) 부위 및 조절 서열을 함유한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용한 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염은 당업자에게 익히 알려진 통상적인 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 E. coli인 경우, DNA를 섭취할 수 있는 적격 세포를 당해 분야에 공지된 CaCl2, MgCl2 또는 RbCl 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 전기천공 (electroporation) 또는 미세주입 (microinjection)과 같은 물리적 수단이 사용될 수 있다. 전기천공은 높은 전압의 전기적 충격에 의해 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 전달을 가능케 한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 이용하여 원형질체 (protoplast) 융합에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 전기천공 및 리포펙션 (lipofection)과 같이, 진핵 세포를 형질전환하는 적합한 방법이 또한 알려져 있다.
본 발명에 의해 포함되는 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 호고시딘 펩티드, 유도체 또는 변이체를 발현하도록 사용될 수 있는 임의의 세포이다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 유용한 숙주 세포에는 세균 세포, 진균 세포 (예컨대, 효모 세포), 식물 세포 및 동물 세포가 포함된다. 예를 들어, 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있고, 또는 숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 숙주 세포 내로 작제물의 도입은 칼슘 포스페이트 형질감염 (calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 (DEAE-Dextran) 매개 형질감염, 또는 전기천공에 의해 달성될 수 있다 (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). 적합한 숙주의 대표적인 예시로서, 다음의 세포가 언급될 수 있다: 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 Bowes 흑색종과 같은 동물 세포; 식물 세포 등. 적합한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당업자의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 호고시딘 펩티드 또는 다른 항균 펩티드를 발현하거나 과발현하도록 조작된, 피부의 정상 세균 균총에 존재하는 세균 세포를 포함할 수 있다. 이렇게 조작된 세균 세포는 그 후에 이들이 피부에 적용되도록 프로바이오틱으로 사용될 수 있다.
숙주 세포는 진핵 숙주 세포 (예컨대, 포유류 세포)일 수 있다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 세포 배양으로 성장하기에 적합한 포유류 생산 세포이다. 업계에서 일반적으로 사용되는 이러한 세포의 예시는 CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1 (Cos; Cos-7 포함), MDCK, 293, 3T3, C127, 골수종 (myeloma) 세포주 (특히, 쥣과), PC12 및 W138 세포이다. 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포는 몇몇 복합 재조합 단백질, 예컨대 사이토카인, 응고 인자 및 항체의 생산에 광범위하게 사용된다 (Brasel et al., Blood 88: 2004-2012 (1996); Kaufman et al., J. Biol Chem 263: 6352-6362 (1988); McKinnon et al., J Mol Endocrinol 6: 231-239 (1991); Wood et al., J. Immunol 145: 3011-3016 (1990)). 디하이드로폴레이트 리덕타제 (dihydrofolate reductase, DHFR)-결핍 돌연변이 세포주 (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220 (1980))는, 효율적인 DHFR 선택가능 및 증폭가능 유전자 발현 시스템이 이들 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 가능하게 하기 때문에 일반적으로 사용되는 CHO 숙주 세포주이다 (Kaufman, Meth Enzymol 185: 527-566 (1990)). 또한, 이들 세포는 부착 또는 현탁 배양으로 조작하기가 용이하고 상대적으로 우수한 유전적 안정성을 나타낸다. CHO 세포 및 이들에서 발현된 재조합 단백질의 특성이 광범위하게 규명되었으며 규제 당국에 의한 임상 제조에서의 사용이 승인되었다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 (예컨대, 배양된 세포)로부터 분리될 수 있거나, 또는 이들은 시험관 내에서 생산될 수 있다. 관심의 호고시딘 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열은: 1) 게놈 DNA로부터 이중-가닥 DNA 서열의 분리; 2) 관심의 호고시딘 펩티드를 인코딩하도록 폴리뉴클레오티드의 화학적 제조; 또는 3) 공여자 세포로부터 단리된 mRNA의 역전사에 의한 이중-가닥 DNA 서열의 시험관 내 합성 (즉, cDNA를 생산)에 의해 수득될 수 있다. 관심 cDNA 서열을 단리하기 위한 표준 절차 중에는, 높은 수준의 유전적 발현을 갖는 공여자 세포에서 mRNA의 역전사로부터 유래하는 cDNA 라이브러리를 함유하는 플라스미드 또는 파지의 형성이 있다. 중합효소 연쇄 반응과 함께 사용되는 경우, 희귀 유전자 산물조차 클로닝될 수 있다.
당해 분야에 공지된 다양한 단백질 정제 방법 중 임의의 것이 본 발명의 펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분취 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리 (예컨대, 단일클론 또는 다중클론 항체를 사용하는 것들)가 사용될 수 있다. 캐리어 (carrier) 펩티드는 본 발명의 펩티드를 포함하는 융합 단백질의 단리를 촉진할 수 있다. 정제 태그가 본 발명의 호고시딘 펩티드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST)는 글루타치온 아가로스 친화성 칼럼을 이용한 정제를 가능하게 한다. 스타필로코커스 아우레우스로부터의 단백질 A (Protein A) 또는 ZZ 도메인 중 하나가 태그로 사용되는 경우에, IgG-세파로스 친화성 칼럼을 사용하는 단일 단계로 정제를 수행할 수 있다. P. 아에루지노사 (P. aeruginosa) 외막 단백질 F의 N-말단 절반인, pOprF-펩티드는 외막 제조물에서 주요한 단백질 종이기 때문에, 이는 쉽게 정제될 수 있다. 바람직하다면, 융합 단백질의 호고시딘 펩티드와 특이적으로 반응하는 (예컨대, 특이적으로 결합하는) 시약을 사용하여 융합 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 호고시딘 펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 또는 다중클론 항체가 통상적인 정제 방법에 사용될 수 있다. 이러한 항체를 생산하는 기법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
본 발명의 호고시딘 펩티드에 연결된 폴리펩티드를 포함하는 융합 작제물은 상기 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단 중 하나에 연결될 수 있다. 전형적으로, 호고시딘 펩티드에 연결되는 폴리펩티드는 호고시딘 펩티드가 중성 또는 음성인 총 전하 (net charge)를 갖도록 충분히 음이온성이다. 음이온성 폴리펩티드는 서열 상에서 자연 발생적인 단백질에 대응할 수 있거나 또는 완전히 인공적으로 설계될 수 있다. 기능적으로, 호고시딘 펩티드에 연결되는 폴리펩티드 ("캐리어 폴리펩티드")는 호고시딘 펩티드의 안정화를 보조할 수 있고 이를 프로테아제로부터 보호할 수 있지만 캐리어 폴리펩티드가 이러한 목적을 위해 제공될 필요는 없다. 유사하게, 캐리어 폴리펩티드는 융합 단백질의 수송을 촉진할 수 있다. 사용될 수 있는 캐리어 폴리펩티드의 예시에는 음이온성 프리-프로 펩티드 및 음이온성 외막 펩티드가 포함된다. 캐리어 폴리펩티드의 예시에는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST), 스타필로코커스 아우레우스의 단백질 A, 단백질 A의 2종의 합성 IgG-결합 도메인 (ZZ), 슈도모나스 아에루지노사의 외막 단백질 F, 단백질 전달 도메인 등이 포함된다. 본 발명은 이들 폴리펩티드의 사용으로 제한되지 않으며; 다른 적합한 캐리어 폴리펩티드가 당업자에게 공지되어 있다. 다른 측면에서, 프로테아제 절단 부위를 포함하는 링커 모이어티가 본 발명의 호고시딘 펩티드 또는 변이체에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 링커는 융합 단백질 (예컨대, 호고시딘 펩티드 및 캐리어 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질)의 도메인들 사이에서 작동 가능할 수 있다. 프로테아제 절단 인식 서열은 일반적으로 단지 수개 길이의 아미노산이기 때문에, 링커 모이어티는 GGGGS (서열번호 6)와 같은 가요성 스페이서 아미노산 서열 내부에 인식 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 엔도펩티다제에 대한 절단 인식 서열을 포함하는 링커 모이어티는 서열 GGGGGGSMFGGAKKRSGGGGGG (서열번호 7)을 가질 수 있다. 바람직하다면, 스페이서 DNA 서열은 호고시딘 펩티드로부터 캐리어 폴리펩티드의 절단을 위한 단백질 인식 부위를 인코딩할 수 있다. 이러한 스페이서 DNA 서열의 예시에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 프로테아제 절단 서열, 예컨대 인자 Xa (Factor Xa) 프로테아제에 대한 것, 메티오닌, 트립토판 및 글루탐산 코돈 서열, 및 프리-프로 디펜신 서열이 포함된다. 인자 Xa는 인자 Xa 프로테아제 절단 서열에서의 단백질분해 절단에 사용되는 반면, 브롬화 시안 (cyanogen bromide) 처리에 의한 화학적 절단은 메티오닌 또는 관련 잔기에서 펩티드를 방출한다. 또한, 융합 산물은 트립토판 (o-이오도벤조산 (o-iodosobenzoic acid)에 의해 절단 가능) 또는 글루탐산 (스타필로코커스 프로테아제에 의해 절단 가능)에 대한 코돈의 삽입에 의해 절단될 수 있다. 이러한 스페이서 DNA 서열의 삽입이 기능적 호고시딘 펩티드의 생산을 위한 필요조건은 아니며, 이러한 서열은 융합 단백질의 안정성을 증강시킬 수 있다. 프리-프로 디펜신 서열은 음으로 하전되고, 따라서, 음으로 하전된 펩티드를 인코딩하는 다른 DNA 서열이 또한 융합 펩티들 안정화시키기 위한 스페이서 DNA 서열로서 사용될 수 있음이 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 세균을 본 발명의 펩티드의 억제 유효량과 접촉시킴으로써 세균의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 용어 "접촉하는"은 펩티드가 세균을 억제하고, 사멸하거나 용해할 수 있도록 펩티드를 세균에 노출시키는 것을 지칭한다. 본 발명은 또한 병원체 또는 바람직하지 않은 미생물의 성장이 억제 또는 예방되도록 펩티드 또는 항균 분자를 분비하는 세균을 포함하는 프로바이오틱 제제를 개체 상에 또는 개체 내부에 위치시키는 것을 포함하는, 피부 질환 또는 장애 및/또는 세균 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 유기체와 본 발명의 호고시딘 펩티드의 접촉은 시험관 내에서, 예를 들어 펩티드를 세균 배양물에 첨가하여 펩티드에 대한 세균의 감수성을 시험하거나, 또는 세균으로 오염된 표면을 펩티드와 접촉시킴으로써 일어날 수 있다. 대안적으로, 접촉은 생체 내에서, 예를 들어 세균 감염에 걸렸거나 그에 걸리기 쉬운 개체에 펩티드를 투여함으로써 일어날 수 있다. 또한, 접촉은 세균을 호고시딘 펩티드, 또는 세균 성장의 다른 펩티드 또는 비-펩티드 억제제를 생산하는 세균 균주를 포함하는 프로바이오틱 제제에 노출시킴으로써 일어날 수 있다. 생체 내 접촉은 비경구뿐만 아니라 국소 둘 다를 포함한다. "억제하는" 또는 "억제 유효량"은, 예를 들어 정균 또는 살균 효과를 일으키기에 충분한 펩티드의 양을 지칭한다. 본 발명의 펩티드에 의해 영향을 받을 수 있는 세균에는 그람-음성 및 그람 -양성 세균 둘 다 포함된다. 예를 들어, 영향 받을 수 있는 세균에는 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)(그룹 A), 스트렙토코커스 sp. (비리단스 그룹), 스트렙토코커스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae)(그룹 B), 에스. 보비스, 스트렙토코커스 (혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 및 엔테로코커스 sp.; 예를 들어, 네이세리아 고노로이아에 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝지티스 (Neisseria meningitides), 및 브란하멜라 카타르할리스 (Branhamella catarrhalis)와 같은 그람-음성 콕싸이 (cocci); 바실러스 안트락시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ), P. 아크네 (P. acne), 코리네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diphtheriae) 및 유사 디프테리아균 (diptheroid) (호기성 및 혐기성)인 코리네박테리움 종, 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 클로스트리디움 디피시엘 (Clostridium difficile), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로박터 종 (Enterobacter species), 프로테우스 미라블리스 (Proteus mirablis) 및 기타 sp., 슈도모나스 아에루지노사, 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumonia), 살모넬라 (Salmonella), 쉬겔라 (Shigella), 세라티아 (Serratia) sp., 및 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)와 같은 그람-음성 바실리 (bacilli)가 포함된다. 하나 이상의 이들 세균으로의 감염은 폐렴, 수막염, 골수염, 심낭염, 부비동염, 관절염, 요로 감염, 파상품, 괴사, 대장염, 급성 위장염, 농가진, 여드름, 여드름 의심 (posacue), 상처 감염, 태아 감염, 근막염, 기관지염 및 다양한 농양, 원내 감염 및 기회 감염과 같은 질환을 초래할 수 있다. 진균 유기체가 또한 본 발명의 호고시딘 펩티드에 의해 영향 받을 수 있으며, 이는 피부사상균 (dermatophytes) (예컨대, 마이크로스포룸 카니스 (Microsporum canis) 및 기타 마이크로스포룸 sp.; 및 T. 루브럼 (T. rubrum) 및 T. 멘타그로파이테스 (T. mentagrophytes)와 같은 트리코파이톤 (Trichophyton) sp.), 효모 (예컨대, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), C. 트로피칼리스 (C. Tropicalis), 또는 기타 칸디다 종), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 토룰롭시스 글라브라타 (Torulopsis glabrata ), 에피터모파이톤 플록코섬 (Epidermophyton floccosum), 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur) (피티롭스포론 오르비큘라레 (Pityropsporon orbiculare), 또는 P. 오발레 (P. ovale)), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans ), 아스페르질러스 푸미가투스 ( Aspergillus fumigates), 아스페르질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 및 기타 아스페르질러스 sp., 자이고마이세테스 (Zygomycetes ) (예컨대, 리조퍼스 무코르 (Rhizopus, Mucor)), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 블라스토마이세스 더마티티데스 (Blastomyces dermatitides), 히스토플라스마 캅슐라툼 (Histoplasma capsulatum), 콕시디오데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 및 스포로트릭스 스켄키 (Sporothrix schenckii)를 포함한다. 세균의 성장을 억제하는 방법은 또한 하나 이상의 항생제와 조합하여 펩티드를 세균과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 펩티드(들)은 세균, 바이러스 또는 진균의 성장을 억제하는데 효과적인 양으로, 인간 또는 비-인간 동물을 비롯한 임의의 숙주에 투여될 수 있다. 따라서, 펩티드는 항균제, 항바이러스제, 및/또는 항진균제로 유용하다. 펩티드를 생산하는 세균 균주는 프로바이오틱 제제로 유용하다.
당해 분야에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법이 개체에 펩티드를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 주사에 의해 또는 시간의 경과에 따른 점진적인 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 펩티드는 정맥 내로, 복강 내로, 근육 내로, 피하로, 공동 내로 (intracavity), 국소로, 또는 경피로 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 호고시딘 펩티드는 국소 투여용으로 (예컨대, 로숀, 크림, 스프레이, 겔, 오일 현탁액, 또는 연고로서) 제제화될 수 있다. 시판되는 제제의 예시에는 국소 로숀, 크림, 비누, 물티슈 (wipes), 분말, 상처를 덮기 위한 거즈 패드와 같은 장치 등이 포함된다. 이는 독성을 감소시키거나 생체이용성 또는 안정성을 증가시키기 위해 리포좀 내로 제제화될 수 있다. 펩티드의 전달을 위한 다른 방법에는 마이크로스피어 또는 프로테이노이드 (proteinoid) 내로의 펩티드의 캡슐화, 에어로졸 전달 (예컨대, 폐로의), 또는 경피 전달 (예컨대, 이온삼투요법 (iontophoresis) 또는 경피 전기천공에 의한)을 수반하는 경구 방법이 포함된다. 투여의 다른 방법은 당업자에게 공지될 것이다.
본 발명의 펩티드의 비경구 투여를 위한 조제물에는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 (예컨대, 올리브 오일), 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능 유기 에스테르이다. 수성 담체의 예시에는 물, 식염수, 및 완충된 배지, 알코올성/수성 용액, 및 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클의 예시에는 소듐 클로라이드, 링거 덱스트로스 (Ringer's dextrose) 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링거액 (lactated Ringer's), 및 불휘발성유 (fixed oils)가 포함된다. 정맥 내 비히클에는 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대, 링거 덱스트로스에 기반한 것들) 등이 포함된다. 다른 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 기타 첨가제가 또한 포함될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 피부-프로바이오틱의 치료학적 유효량을 그러한 장애가 있거나 이를 가질 위험이 있는 개체와 접촉시키거나 그에 투여함으로써 국소 세균 또는 진균-관련 장애를 억제하는 방법을 제공한다. 용어 "억제하는"은 장애의 징후 또는 증상 (예컨대, 발진, 염증 (sore) 등)을 예방하거나 개선하는 것을 의미한다. 개선될 수 있는 질환 징후의 예시에는 개체의 혈액 내 TNF 수준의 증가, 열, 저혈압, 호중구 감소증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 파종 혈관 내 응고 (idisseminated ntravascular coagulation), 성인 호흡 곤란 증후군, 쇼크, 및 장기 부전이 포함된다. 본 발명에서 치료된 수 있는 개체의 예시에는 그람-음성 세균 감염, 독 중독, 또는 간 기능부전으로 인한 내독소혈증과 같은 독혈증에 걸릴 위험이 있거나 그에 걸린 인간 또는 동물 개체가 포함된다. 다른 예시에는 피부염을 가진 개체뿐만 아니라 유선염 및 특히 소의 유방염과 같은 피부 감염 또는 그람-양성 또는 그람-음성 세균 또는 진균에 감염되기 쉬운 손상을 갖는 개체가 포함된다. 후보 환자의 예시에는 E. coli, 헤모필러스 인플루엔자 B (Hemophilus influenza B), 네이세리아 메닝지티데스 (Neisseria meningitides), 스타필로콕싸이, 또는 뉴모콕싸이 (pneumococci)에 의한 감염을 앓고 있는 사람들이 포함된다. 다른 환자에는 총상, 신장 또는 간 기능부전, 외상, 화상, 면역손상 (immunocompromising) 감염 (예컨대, HIV/SIV/FIV 감염), 조혈성 신생물 (hematopoietic neoplasias), 다발성 골수종, 캐슬만병 (Castleman's disease) 또는 심장점액종을 앓고 있는 사람들이 포함된다. 의학 분야의 당업자는 본 발명에 따른 치료에 적합한 개체를 확인하기 위해 통상적인 기준을 용이하게 이용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체의 치료를 위한 용어 "치료학적 유효량"은 이 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 개선하기에 충분한 호고시딘 펩티드의 양을 의미한다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 피부 염증의 중증도의 빈도를 측정함으로써 개체의 피부염 또는 발진 증상을 감소시키기에 충분한 양으로 측정될 수 있다. 전형적으로, 개체는 질환 또는 장애의 증상을 적어도 50%, 90% 또는 100% 감소시키기에 충분한 호고시딘 펩티드의 양으로 치료된다. 일반적으로, 펩티드의 최적 투여량은 환자의 체중, 세균 또는 진균 감염의 유형, 체중, 성별, 및 증상의 정도와 같은 장애 및 요인에 좌우될 것이다. 그럼에도 불구하고, 적합한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 적합한 투여량은 0.5 내지 40 mg 펩티드/kg 체중, 예컨대 1 내지 8 mg 펩티드/kg 체중이다.
바람직하다면, 적합한 요법 레지멘 (regime)은 하나 이상의 추가적인 치료제 (예컨대, TNF의 억제제, 항생제 등)와 본 발명의 펩티드(들) 또는 프로바이오틱 조성물의 투여를 조합할 수 있다. 펩티드(들), 다른 치료제, 및/또는 항생제(들)은 동시에 투여될 수 있지만, 또한 연속적으로 투여될 수도 있다. 적합한 항생제에는 아미노글리코시드 (예컨대, 겐타마이신), 베타-락탐 (예컨대, 페니실린 및 세팔로스포린), 퀴놀론 (예컨대, 시프로플록삭신), 및 노보비오신이 포함된다. 일반적으로, 항생제는 살균 용량으로 투여된다. 그러나, 펩티드는 항균 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 전형적으로, 호고시딘 펩티드 및 항생제는 서로의 48시간 이내에 투여된다 (예컨대, 2 내지 8시간, 또는 동시에 투여될 수 있음). "살균 용량 (bactericidal amount)"은 치료를 받는 개체에서 세균-사멸 혈액 농도를 달성하기에 충분한 양이다. 이의 통상적인 정의에 따르면, 본원에 사용된 바와 같이, "항생제"는, 희석 용액 중에서, 미생물의 성장을 억제하거나 이를 사멸하는 화학적 물질이다. 당해 분야에 공지된 합성적 항생제 (예컨대, 유사체)가 또한 이 용어에 포함된다.
본 발명의 펩티드는, 예를 들어 미생물 또는 바이러스 오염에 취약한 재료의 방부제 또는 살균제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 가공 식품에서 (예컨대, 살모넬라, 예르시니아, 리스테리아 및 쉬겔라와 같은 유기체를 억제하기 위해) 방부제로 사용될 수 있다. 바람직하다면, 펩티드는 리소자임과 같은 항세균 식품 첨가제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및/또는 프로바이오틱은 또한, 예를 들어 슈도모나스 또는 스트렙토코커스를 억제하거나 냄새-생성 미생물 (예컨대, 마이크로콕싸이)을 사멸하기 위한 국소 제제로 사용될 수 있다. 임의의 주어진 적용을 위한 본 발명의 호고시딘 펩티드의 최적의 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 호고시딘 및/또는 프로바이오틱은 또한 상처 회복 및 조직 재생을 촉진하는데 유용하다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinases, MMPS)는 다양한 조직에서 단백질을 분해하는 염증성 효소이다. 최근의 과학적 연구에 따르면, 상처 부위를 감싸는 체액인, 만성 외상 삼출액에서 프로테아제 (예컨대, MMPs)의 수준이 상승된 것으로 나타났다. 이러한 과량의 프로테아제는 중요한 세포외 기질 단백질의 분해 및 상처 치유 과정에 필수적인 중요한 성장 인자의 불활성화를 초래한다. 이는 최적 이하의 치유 환경을 조성하여 상처 치유를 지연시킬 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 설파메티졸, 설피속사졸, 설파모노메톡신, 설파메티졸, 살라조설파피리딘, 실버 설파디아진 등과 같은 설파제 (sulfa drugs); 날리딕산, 피페미드산 삼수화물, 에녹산신, 노르플록삭신, 오플록삭신, 토수플록산신 토실레이트, 시프로플록산신 염산염, 로메플록산신 염산염, 스파르플록산신, 플레록산신 등과 같은 퀴놀린 항세균제; 이소니아지드, 에탐부톨 (에탐부톨 염산염), p-아미노살리실산 (칼슘 p-아미노살리실레이트), 피라지나미드, 에티오나미드, 프로티오나미드, 리팜피신, 스트렙토마이신 설페이트, 카나마이신 설페이트, 사이클로세린 등과 같은 항폐결핵제 (antiphthisics); 디아페닐설폰, 리팜피신 등과 같은 항-항산균 약물 (antiacidfast bacterium drugs); 이독수리딘, 아시클로비르, 비다라빈, 간시클로비르 등과 같은 항바이러스 약물; 지도부딘, 디다노신, 잘시타빈, 인디나비르 설페이트 에타놀레이트, 리토나비르 등과 같은항-HIV 제제; 항스피로헤타제 (antispirocheteles); 테트라사이클린 염산염, 암피실린, 피페라실린, 겐타마이신, 디베카신, 카넨도마이신, 리비도마이신, 토브라마이신, 아미카신, 프라디오마이신, 시소마이신, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 롤리테트라사이클린, 독시사이클린, 암피실린, 피페라실린, 티카르실린, 세팔로틴, 세팔로피린, 세팔로리딘, 세파클로르, 세팔렉신, 세프록사딘, 세파드록실, 세파만돌, 세포토암, 세푸록심, 세포티암, 세포티암 헥세틸, 세푸록심 악세틸, 세프디니르, 세프디토렌 피복실, 세프타지딤, 세프피라미드, 세프술로딘, 세피네녹심, 세프포독심 프록세틸, 세프피롬, 세포조프란, 세페핌, 세프솔로딘, 세피네녹심, 세피네타졸, 세프미녹스, 세폭시틴, 세프부페라존, 라타목세프, 플로목세프, 세파졸린, 세포탁심, 세포페라존, 세프티족심, 목살락탐, 티에나마이신, 설파제신, 아즈트레오남 또는 이의 염, 그리세오풀빈, 란카시딘-그룹 등과 같은 항생제를 포함하는 다른 항세균제와 동시에 사용될 수 있다.
인간에게는, α-디펜신, β-디펜신, 및 카텔리시딘을 비롯한 몇 가지 부류의 항균 펩티드 (AMP)가 공지되어 있다. 카텔리시딘은 몇몇 포유류 종에서 발견된다. 카텔리시딘의 생산은 상피의 상체 또는 감염성 시험감염에 대하여 유도되거나 또는 특정 세균성 병원체, 예컨대 쉬겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae)의 독성 기전에 의해 억제된다. 카텔리시딘 발현은 또한 특정한 만성 염증 장애에서 차별적으로 영향을 받는다. 건선에서는, 카텔리시딘 수준이 상승하고 이차 감염이 드문 반면, 아토피성 피부염에서는, 카텔리시딘 발현이 불충분하고 세균 또는 바이러스 중복감염 (superinfection)이 일반적이다. 국소 투여 후 피부 상처의 감소된 세균 집락화 및 바이러스 유전자 전달을 통한 카텔리시딘 과발현에 의한 개선된 폐 세균의 제거를 포함하는, 카텔리시딘의 치료적 이점이 실험적으로 입증되었다. 본 발명의 호고시딘 펩티드는 카텔리시딘과 함께 상승적 효과를 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제제, 조성물 및 방법은 호고시딘 및 카텔리시딘 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 국소 제제 (예컨대, 로숀, 연고 또는 에어로졸 스프레이)는 카텔리시딘 및 호고시딘 (또는 이의 유도체) 둘 다를 포함할 수 있다.
카텔리시딘 단백질은 2개의 별개 도메인으로 구성된다: N-말단 "카텔린-유사 (cathelin-like)" 또는 "프로시퀀스 (prosequence)" 도메인 및 성숙한 AMP의 C-말단 도메인. 카텔리시딘의 C-말단 도메인은 강력하고, 신속하며, 광범위한 스펙트럼의 사멸 활성을 나타내는 최초의 포유류 AMP 중 하나였다. 용어 "카텔린-유사"는 시스테인 프로테아제 억제제의 시스타틴 수퍼패밀리와 유사성을 갖는 돼지 호중구로부터 분리된 12 kDa 단백질인, 카텔린의 것과 N-말단 서열의 유사성으로부터 유래한다.
카텔리시딘은 호중구 및 골수성 골수 세포와 대부분의 상피 공급원에서 발현되고, 상처 유체에 존재하기 때문에 포유류 피부에서 최초로 발견된 AMP였다. 호중구에서, 카텔리시딘은 전장의 전구체로 합성되고 이들이 저장되는 이차 과립을 목표로 한다. 자극 시, 전장의 카텔리시딘 단백질은 단백질분해적으로 처리되어 카텔린-유사 도메인으로부터 C-말단 펩티드의 살미생물성 (microbiocidal) 활성을 방출한다.
인간 카텔리시딘의 C-말단 37개 아미노산 (LL-37)의 특징이 규명되었다. LL-37은 원래 이 도메인의 처음 4개 N-말단 아미노산과 잔기의 총 개수 (즉, 39개)에 대해 명명된, FALL39로 불렸다. LL-37은 양친매성 알파 헬릭스를 함유하고 시스텐인이 결여된 것으로 예측되는 펩티드로서, 이는 이들 각각이 3개 이황화 다리를 함유하는, 다른 이전에 분리된 디펜신 패밀리의 모든 인간 펩티드 항생제와 LL-37을 구별한다. 전장의 인간 카텔리시딘 (때로 전장 LL-37로도 언급됨)은 카텔린-유사 전구체 단백질 및 C-말단 LL-37 펩티드를 포함하고, 따라서 170개 아미노산 (서열번호 5)을 포함한다.
서열번호 5를 포함하는 폴리펩티드는 다수의 별개 도메인을 갖는다. 예를 들어, 서열번호 5의 약 1 내지 약 29-31에 개시된 바와 같은 서열을 포함하는 시그널 도메인이 존재한다. 시그널 도메인은 전형적으로 서열번호 5의 아미노산 번호 30 이후에 절단되지만, 당업자는 사용된 효소, 사용된 발현 시스템 및/또는 폴리펩티드의 단백질분해 절단이 일어나는 조건에 따라서, 절단 부위가 서열번호 5의 아미노산 번호 30의 양방향 중 하나에서 1개 내지 3개 아미노산이 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 다른 도메인은 카텔린-유사 도메인으로 불리는, N-말단 도메인을 포함한다. 카텔린-유사 도메인은 서열번호 5의 약 아미노산 29 (예컨대, 29-31) 내지 약 아미노산 128 (예컨대, 128-131)을 포함한다. 서열번호 5의 또 다른 도메인은 LL-37로 불리는 C-말단 도메인을 포함한다. LL-37 도메인은 서열번호 5의 약 아미노산 128 (예컨대, 128-134) 내지 아미노산 170을 포함한다. LL-37은 서열번호 5에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
MKTQRNGHSLGRWSLVLLLLGLVMPLAIIAQVLSYKEAVLRAIDGINQRSSDANLYRLLDLDPRPTMDGDPDTPKPVSFTVKETVCPRTTQQSPEDCDFKKDGLVKRCMGTVTLNQARGSFDISCDKDNKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIDDFLRNLVPRTES (서열번호 5)
양이온성 인간 항균 펩티드가 세균 및 진균을 사멸하는 기전은 일반적으로 미생물 세포막에 대한 펩티드의 결합을 통해서이고, 그 후에 막의 양성자 구배 및 무결성 (integrity)이 상실된다.
호고시딘 (및 일부 실시양태에서는 카텔리시딘과 조합하여)과 함께 비타민 D3 (또는 그의 유사체)가 전신적으로 투여되어 전신 감염, 특히 폐렴, 폐혈증 및 TB를 치료할 수 있다. 이는 또한 국소적으로 적용되어 감염성 피부 장애를 치료할 수 있다. 이는 항생제와의 병용 요법에 사용되거나 HIV 양성 개인과 같이 면역손상된 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 면역 자극 접근법과 병용하여, 이는 암을 치료적으로 다룰 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 항균 화합물 또는 항균 화합물을 분비하는 유기체의 투여, 또는 피부 건강을 지원하는 유기체를 포함하는 프로바이오틱 조성물의 투여에 의해 피부 디스바이오시스의 장애를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제2 활성제 (예컨대, 항생제, 비타민 D3, 카텔리시딘 등)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 프로바이오틱 유기체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 프로바이오틱 유기체는 세균이다. 추가 실시양태에서, 세균은 정상적인 피부 균총의 성분을 포함한다. 추가 실시양태에서, 세균은 스타필로코커스 호미니스 균주를 포함한다. 다른 실시양태에서, 세균은 스타필로코커스 에피더미디스 균주를 포함한다. 다른 실시양태에서, 프로바이오틱 유기체는 균주 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 균주 혼합물은 다수의 에스. 호미니스 균주를 포함한다. 다른 실시양태에서, 균주 혼합물은 다수의 에스. 에피더미디스 균주를 포함한다. 다른 실시양태에서, 균주 혼합물은 하나 이상의 에스. 호미니스 균주 및 하나 이상의 에스. 에피더미디스 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 에스. 호미니스 및/또는 에스. 에피더미디스 이외에 하나 이상의 균주를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 추가의 균주 또는 균주들은 스타필로코커스 속, 락토바실러스 속 또는 락토코커스 속으로부터의 하나 이상의 균주를 포함한다. 예를 들어, 특정 제제는 스타필로코커스 호미니스 또는 스타필로코커스 에피더미디스, 구체적으로, 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, 스타필로코커스 호미니스 균주 C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT3, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-C2, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-G1, 스타필로코커스 호미니스 균주 AMT4-D12, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT1, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 SE-A11, 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-C5, 및/또는 스타필로코커스 에피더미디스 균주 AMT5-G6을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 전형적으로 개체의 피부에 적용되는 경우 103-106 CFU/cm2의 최종 농도를 제공하기에 충분한 세균 세포의 양을 포함한다. 이러한 제제는 약 104 내지 약 107 CFU/g, 또는 대안적으로, 10 내지 약 105 CFU/g, 또는 대안적으로, 약 105 내지 약 109 CFU/g의 농도를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 다수의 에스. 호미니스 및/또는 에스. 에피더미디스 균주를 포함할 수 있고, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 아시도필러스, 및/또는 정상적인 건강한 피부 또는 점막 균총의 일부를 형성하는 것으로 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 이러한 종 또는 균주를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기에 기술된 바와 같은 에스. 호미니스 균주는 제제 내 세균 세포의 100%를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 에스. 호미니스는 주어진 제제 내 세균 세포의 90-100%, 85-95%, 70-80%, 75-85%, 60-70%, 65-75%, 50-60%, 55-65%, 40-50%, 45-55%, 30-40%, 35-45%, 20-30%, 25-35%, 10-20%, 15-20%, 1-10%, 5-15%, 또는 1% 미만을 포함하고, 이때 콜로니 형성 단위의 나머지는 에스. 에피더미디스, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 아시도필러스, 및/또는 정상적인 건강한 피부 또는 점막 균총의 일부를 형성하는 것으로 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 이러한 균주에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기에 기술된 바와 같은 에스. 에피더미디스 균주는 제제 내 세균 세포의 100%를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 에스. 에피더미디스는 주어진 제제 내 세균 세포의 90-100%, 85-95%, 70-80%, 75-85%, 60-70%, 65-75%, 50-60%, 55-65%, 40-50%, 45-55%, 30-40%, 35-45%, 20-30%, 25-35%, 10-20%, 15-20%, 1-10%, 5-15%, 또는 1% 미만을 포함하고, 이때 콜로니 형성 단위의 나머지는 에스. 호미니스, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 아시도필러스, 및/또는 정상적인 건강한 피부 또는 점막 균총의 일부를 형성하는 것으로 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 이러한 균주에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 에스. 호미니스 또는 에스. 에피더미디스 이외의 세균은 제제 내 세균 세포의 약 50% 이하를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세균은 주어진 제제 내 세균 세포의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에스. 호미니스 또는 에스. 에피더미디스 이외의 세균은 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 아시도필러스, 및/또는 정상적인 건강한 피부 또는 점막 균총의 일부를 형성하는 것으로 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 이러한 종 또는 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 60%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 40%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 50%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 50%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 40%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 60%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 70%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 30%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 30%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 70%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 80%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 20%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 20%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 80%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 90%의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 10%의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 90% 초과의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 10% 미만의 에스. 에피더미디스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기에 열거된 균주 중 약 10% 미만의 에스. 호미니스 및 상기에 열거된 균주 중 약 90% 초과의 에스. 에피더미디스를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 자가 이식은 균주가 투여되기 전에 배양되는지 여부와 상관없이, 동일한 개체 또는 동일한 부위의 한 부위에서 다른 부위로 세균 균주를 이식하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 개체로부터 수득된 세균 균주는 배양으로 증폭한 후 다시 개체에 이식된다.
본원에 사용된 바와 같이, 동종 이식은 한 개체로부터 다른 개체로의 세균 균주의 이식, 또는 자신의 신체 상에서 또는 그 내부에서 수집되지 않은 세균 균주를 포함하는 조성물의 개체에의 투여를 지칭한다.
이러한 수집은 본원에 기술된 바와 같은 세균 균주 중 하나가 상주하는 조직을 면봉으로 닦거나, 긁거나, 닦아내거나, 또는 잘라내고 제거하고; 선택적으로 아가 플레이트로부터 단일 콜로니를 성장시키고 분리하거나 또는 다르게는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하고; 선택적으로 단리된 세균 또는 조잡한 면봉, 물티슈, 긁힌 자국, 조직 또는 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 액체 또는 고체 배양액 중의 기타 단리물의 증폭된 배양물을 성장시키고; 선택적으로 원심분리, 여과, 중력 침강 (gravity settling), 스크래핑 (scraping)에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 수단에 의해 상기 증폭된 배양물로부터 세균을 수확하고; 세균 또는 조 단리물을 증점제, 담체, 또는 부형제와 함께 제제화하고; 이식이 요구되는 것으로 결정된 영역에서 개체를 상기 제제와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 프리바이오틱스 화합물은 다당류, 가수분해물, 염, 허브 추출물, 또는 그 균주와 함께 사용되는 경우 관련된 프로바이오틱 균주의 성장을 증진하기에 충분한 임의의 화합물, 예컨대 약 40% (w/w) 미만의 농도로 효모 가수분해물, 약 10% (w/w) 미만의 농도로 미세결정 셀룰로스, 및/또는 약 10% (w/w) 미만의 농도로 수크로스를 포함한다. 피하 세균과 함께 사용하기에 적합할 수 있는 프리바이오틱스의 다른 예시에는 이눌린, 글루코올리고당, 이소말토올리고당, 락토수크로스, 폴리덱스트로스, 대두 올리고당, 및 자일로올리고당 및 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는 문헌 [Gibson, G.R. and Roberfroid, M, (Eds.) Handbook of Prebiotics, CRC press (2008); Roberfroid, M., J. Nutr. 137 (3): 830S-837 (2007) and Slavin, J. Nutrients 5 (4): 1417-1435 (2013)]에 기술된 것들이 포함된다.
일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기술된 바와 같은 프로바이오틱 및/또는 프로바이오틱 조성물을 개체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 접촉은 자가 이식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 접촉은, 피부 또는 점막 균총의 요소가 제2 개체 (공여자)로부터 이를 필요로 하는 제1 개체로 이식되는, 동종 이식을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기에 기술된 바와 같은 세균 균주는 제2 개체로부터 동정되고 단리되며, 세균 성장에 도움이 되는 것으로 당해 분야에 공지된 바와 같은 그러한 조건하에서 적합한 배양 배지 중에서 중폭시키고, 이어서 세균 세포를 수확하고, 본 발명에 따른 소정 농도의 수확된 세포를 소정의 제제와 혼합하고, 이 혼합물을 제1 개체의 이환된 영역에 적용한다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은, 성분들의 농도가 고정되고 개체마다 달라지지 않는 제제와 같은 표준화된 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 다음과 같은 기준을 토대로 각 개체에 대해 개별적으로 개발된다: 개체 자신의 피부 또는 점막 균총의 조성; 개체의 질환 상태 및 치료 내력; 개체 상태의 특성 및 중증도; 병발하는 피부 또는 점막 감염의 특성 및 중증도; 개체 신체 내부의 전신 항생제를 비롯한 다른 항균 화합물의 존재; 및 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 용이하게 인식될 수 있는 것과 같은 다른 기준.
일부 실시양태에서, 조성물은 상기에 기술된 바와 같은 프로바이오틱 세균이 하기 및 문헌 [Nakatsuji, T. et al. (2016), Nature Medicine Submitted Manuscript No. NMED-A78395A, submitted March 29, 2016]에 기술된 바와 같은 보습제 또는 에멀젼 내로 통합되는, 크림, 연고, 오일 현탁액 또는 고약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세균이 적합한 부형제와 결부되고 패브릭, 겔 매트릭스, 또는 중합체 시트 내부에 혼입되는 패치 또는 습포제를 포함한다. 국소 적용을 위한 적합한 부형제 및 담체는 당해 분야에 공지되어 있고 증점제, 유화제, 지방산, 다당류, 폴리올, 및 중합체 및 공중합체를 포함하며, 이에는 제한 없이, 알지네이트, 미세결정 셀룰로스, 폴리락트산, 폴리락트-코-글리콜산, 바셀린 (petrolatum), 및 당해 분야에 공지된 다수의 기타가 포함된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 세균 배양 배지, 조건화된 세균 배양 배지, 및/또는 세균 배양액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세균 배양 배지의 여과액 또는 상청액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 동결건조된 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세균 배양 배지의 여과액 또는 상청액으로부터 생산된 동결건조된 조건화된 배양 배지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 개체의 피부 건강을 지원하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 방법은 피부 디스바이오시스 및 이로부터 유래된 장애의 치료를 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 피부의 세균 감염에 대한 치료를 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는: 피부 디스바이오시스, 세균 감염, 유선염, 화상 또는 다른 상처, 아토피성 피부염, 건선, 또는 기타 만성 피부 상태를 갖는 개체를 확인하는 단계; 및 치료를 필요로 하는 상태의 부위에 본원에 기술된 바와 같은 프로바이오틱 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 주어진 제제 (연고, 겔, 패치 등)의 적합한 투여 방식의 결정은 피부 감염을 치료하는 당해 분야의 숙련자에 의해 수행될 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 정기적인 시간 간격으로 재-적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 3일마다 다시 적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 2일마다 다시 적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 2일마다 다시 적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 매일 다시 적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 하루에 1회 초과로 다시 적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 매주 다시 적용된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 단 1회만 적용된다.
일부 실시양태에서, 방법은 메티실린 또는 옥사실린 저항성인 에스. 아우레우스를 비롯한 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대한 치료를 제공한다. 일부 추가 실시양태에서, 방법은 에스. 아우레우스 감염을 진단하는 단계; 및 감염 부위에 본원에 기술된 바와 같은 프로바이오틱 및/또는 프로바이오틱 조성물을 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 이러한 조성물은 항균 화합물의 생산에 의해, 피부 또는 점막 생물상 (biota) 내부의 자원에 대한 경쟁에 의해, 또는 다른 수단에 의해, 에스. 아우레우스의 성장을 사멸하거나 억제할 수 있다. 주어진 제제 (연고, 겔, 패치 등)의 적합한 투여 방식의 결정은 피부 감염을 치료하는 당해 분야의 숙련자에 의해 수행될 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 프로바이오틱 조성물은 정기적인 시간 간격 (예컨대, 매일, 2일마다, 3일마다, 매주 등)으로 다시 적용된다. 다른 실시양태에서, 슈도모나스 아에루지노사 감염 또는 슈도모나스 속, 스타필로코커스 속, 프로피오니박테리움 속, 스트렙토코커스 속, 또는 비브리오 속 또는 특정되지 않은 병원체의 세균으로부터 유래된 감염에 대한 치료를 제공하기 위해 유사하거나 동일한 단계가 적용될 수 있음이 당해 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 불명의 또는 특정되지 않은 병원체의 치료를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 다균 (polymicrobial) 감염에 대한 치료를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 화상 또는 상처에 대한 이러한 치료의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 만성 피부 상태에 대한 치료 제공을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상태는 아토피성 피부염, 건선, 또는 다른 만성 피부 상태이다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이들이 사용될 수 있는 전형적인 것들이지만, 당업자에게 공지된 다른 절차들이 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예
1
CoNS
균주 및 항균 펩티드의 단리
아토피성 피부염 성인 환자 및 연령이 일치하는 비-아토피성 개체를 모집하였다. 인구통계학적 데이터를 표 1에 나타내었다. 인간 개체를 포함하는 모든 실험은 시설에서 승인한 IRB 프로토콜에 따라수 수행하였다.
| 아토피성 개체 (N=50)* | 비-아토피성 개체 (N=30) | ||
| 시설 (%) | 1 | 54.00 | 63.33 |
| 2 | 46.00 | 36.67 | |
| 연령 | 평균±SD | 33.80±2.02 | 33.87±1.49 |
| BMI | 평균 ±SD | 25.10±1.55 | 23.40±1.15 |
| 기록하지 않음 (%) | 30.00 | 63.33 | |
| 성별 (%) | 남성 | 42.00 | 56.67 |
| 여성 | 58.00 | 43.33 | |
| 인종 (%) | 백인 | 50.00 | 60.00 |
| 아시아인 | 32.00 | 33.33 | |
| 히스패닉계 | 6.00 | 6.67 | |
| 아프리카계 미국인 | 8.00 | 0.00 | |
| 기타 | 4.00 | 0.00 | |
| EASI 점수 (%) | <=6 | 26.00 | N/A |
| >6 | 48.00 | N/A | |
| 기록하지 않음 | 26.00 | N/A |
*모집된 50명의 환자 중에서 1명의 개체에서 살아 있는 스타필로코커스 및 스타필로코커스 DNA가 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 이 데이터는 49명의 아토피성 개체에 대해 보고되었다. BMI, 신체 용적 지수; EASI, 습진 부위 및 중증도 지수; NJH, 국립 유대인 건강원 (National Jewish Health); SD, 표준 편차
세균 존재량의 측정
살아 있는 표면 세균 및 세균 DNA를 전주와 (antecubital fossa) 상의 병변 피부, 및 병변 부위로부터 적어도 2 cm 떨어진 상완의 비병변 피부의 미리 측정된 영역 (~3×10 cm)으로부터 수집하였다. 유사한 수집을 동일한 피부 부위에서 비-아토피성 개체로부터 수득하였다. 살아 있는 세균을 수집하기 위해 피부를 TSB (tryptic soy broth)로 미리 적시거나 세균 DNA를 수집하기 위해 트리스-EDTA로 미리 적신 면봉으로 피부를 문질렀다. 살아 있는 세균 샘플을 응고효소 음성 스타필로코커스 (CoNS)를 구별하기 위해 노른자위 함유 만니톨 염 아가 위에 접종하였다. 총 게놈 DNA를 QIAamp DNA 마이크로 키트 (Qiagen)로 추출하고 DNA 존재량을 종-특이적 및 속-특이적 프라이머를 사용한 정량적 실시간 PCR (qPCR)로 결정하였다. 모집된 50명의 환자 중에서 아토피성 피부염을 갖는 1명의 개체에서는 살아 있는 스타필로코커스 및 스타필로코커스 DNA가 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 데이터는 49명의 아토피성 개체에 대해 보고되었다
세균 DNA의 정량분석
세균 DNA를 수집하기 위해, 세균 배양을 위해 사용된 것과 유사한 미리 측정된 영역을 0.1% 트리톤X-100 및 0.05% 트윈-20 (w/v) 함유 트리스-EDTA 완충제로 미리 적신 면봉으로 문질렀다. 세균 세포를 프로테이나제 K로 용해시키고, 이어서 정제된 아크로모펩티다제 (achromopeptidase) (Wako Chemical) 및 Ready-Lyse® (epicenter Inc.)로 용해시켰다. 총 게놈 DNA를 QIAamp DNA 마이크로 키트 (Qiagen)로 정제하고 50 μl의 용출 완충제로 용출하였다. 세균 DNA의 존재량을 종-특이적 또는 속-특이적 프라이머를 사용한 정량적 실시간 PCR (qPCR)로 결정하였다 (표 2). 스타필로코커스 spp.의 상대적 CFU (rCFU)를 결정하기 위해, 에스. 에피더미디스 (ATCC12228)의 공지의 CFU로부터 유래된 표준품으로부터 추출된 게놈 DNA로 표준 곡선을 작성하였다. 모든 프라이머 쌍의 특이성을 용융 곡선 분석 및 표준 곡선과의 비교에 의해 확인하였다.
| 프라이머 명칭 | 서열 (5'→3') | 표적 유전자 | 참조 또는 등재번호# |
| 에스. 아우레우스 -femA-2F | AACTGTTGGCCACTATGAGT (서열번호 8) | 에스. 아우레우스 -특이적 서열 | |
| 에스. 아우레우스 -femA-2R | CCAGCATTACCTGTAATCTCG (서열번호 9) | ||
| 에스. 에피더미디스 -sodA-F | TCAGCAGTTGAAGGACAGAT (서열번호 10) | 에스. 에피더미디스 -특이적 서열 | |
| 에스. 에피더미디스 -sodA-R | CCAGAACAATGAATGGTTAAGG (서열번호 11) |
||
| g-Staph-F | TTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA (서열번호 12) | 스타필로코커스 -속 특이적 16S 서열 | |
| g-Staph-R | AACAACTTTATGGGATTTGCWTGA (서열번호 13) | ||
| Univ16S-27-F | AGAGTTTGGATCMTGGCTCAG (서열번호 14) | 세균 16S rRNA의 보편적 서열 | |
| Univ16S-1525-R | AAGGAGGTGWTCCARCC (서열번호 15) | ||
| 에스. 에피더미디스 -epiA-F | GATTCAGGAGCTGAACCAAGA (서열번호 16) | 에스. 에피더미디스 에피더민 (epidermin) | X07840 |
| 에스. 에피더미디스 -epiA-R | TTGAAGCCCTGCCAATCTAA (서열번호 17) | ||
| 에스. 에피더미디스 -pepA-F | CTGATGAACTTGAACCTCAAACTG (서열번호 18) | 에스. 에피더미디스 pep5 | L23967 |
| 에스. 에피더미디스 -pepA-R | GACACTGTAAATAAACGCGTAGC (서열번호 19) | ||
| 에스. 에피더미디스 -eciA-F | GCAACTAGACAGGTATGTCCTAAA (서열번호 20) | 에스. 에피더미디스 에피시딘 (epicidin) 280 | Y14023 |
| 에스. 에피더미디스 -eciA-R | CATCTAAGATTAAATGAGGGTGGTT (서열번호 21) | ||
| 에스. 에피더미디스 -elkA-F | TAAGTCCGCAATCTGCTAGTG (서열번호 22) | 에스. 에피더미디스 에필란신 (epilancin) K7 | U20348 |
| 에스. 에피더미디스 -elkA-R | CAGTAATATTGCAACCGCATGT (서열번호 23) | ||
| 호고시딘 -α-F | ATGAGTAAATTAGAACTACTTAATG (서열번호 24) | 에스. 호미니스 호고시딘-α | 본 발명 |
| 호고시딘 -α-R | TTATAAATTACATCCTGCTGCACAC (서열번호 25) |
항균 활성의 스크리닝
각 피부 부위로부터의 CoNS 단리물의 최대 84개 개별 콜로니를 무작위로 골라내어 TSB 함유 96-웰 클러스터 튜브로 옮겼다. 각 플레이트에 또한 음성 대조군으로서 에스. 에피더미디스 (ATCC1457)의 비-항균 균주, 양성 대조군으로서 스타필로코커스 호미니스의 공지의 항균 균주 (하기 참조), 및 세균 부재의 블랭크 웰을 부여하였다. CoNS를 교반 하에 37℃에서 밤새 배양하였다. OD600에서 성장을 평가하였다. 세균을 원심분리에 의해 제거한 후 이어서 0.22 μm 막으로 멸균 여과하였다. 각 콜로니로부터 방출된 항균 활성을 에스. 아우레우스 (ATCC35556)의 1×104 콜로니-형성 유닛 (colony-forming units) (CFU)와 혼합함으로써 평가하였다. 22시간 후에 에스. 아우레우스의 성장을 음성 대조군에서 나타난 성장의 50% (I50) 미만으로 억제하는 것들을 항균 균주로 정의하였다. 불충분한 CoNS 콜로니를 모집된 일부 개체로부터 성장시켰다. 따라서, 29명의 비-아토피성 개체 및 아토피성 개체의 41개의 비병변 및 40개의 병변 부위에 대해 데이터를 보고하였다. 모든 CoNS 단리물을 종 동정을 위해 냉동 보관하였다. 전장의 16S rRNA 유전자를 보편적 16S 프라이머인 27-F 및 1525-R을 사용하여 48개의 대표적인 콜로니로부터 증폭하였다. 앰플리콘의 서열을 Sanger 방법에 의해 양 말단으로부터 분석하였다.
에스.
호미니스에
의해 생산된 AMP의 정제
건강한 개체로부터 단리된 대표적인 항균 에스. 호미니스 균주로부터의 멸균 조건화된 배지를 아토피성 피부에서는 존재량이 더 적었던 정상 피부에서 항균 활성을 갖는 분자를 더욱 동정하는데 사용하였다. 활성을 암모늄 설페이트 (70% 포화)로 침전시키고, H2O에 용해시킨 후 Sep-Pak 카트리지 (Waters Co)에 적용하였다. 활성 분획을 H2O 중의 30% 아세토니트릴로 용출시키고 HiTrap® SP (GE Healthcare Life Sciences) 분리에 적용한 후 활성을 125 mM NaCl로 용출하였다. 0.8 mL/분으로 0.1% (v/v) TFA 중에서 5% 내지 50%의 아세토니트릴 선형 구배로 CapCel Pak C8 (5 μm, 300 Å, 4.6×250 mm) (Shiseido Co.)을 이용한 3단계 HPLC 정제를 수행하였다.
에스.
호미니스에
의해 생산된 AMP의 동정
비-아토피성 개체로부터 단리된 대표적인 항균 에스. 호미니스 균주의 멸균 조건화된 배지로부터 항균 활성을 정제하였다. 정제된 활성 분자의 이차 구조를 MALDI-TOF/TOF, Edman 말단 서열분석 (Edman terminal sequencing), 및 게놈 서열분석으로 결정하였다.
질량 분광 분석
에스. 호미니스로부터 HPLC-정제된 AMP의 질량 스펙트럼을 Flex Control 소프트웨어 (Bruker Daltonics)에 의해 제어되는 MALDI-TOF/TOF Bruker Autoflex™ Speed 장치 (Bruker Daltonics)를 사용하여 기록하였다. 질량 분광학적 분석을 매트릭스로서 50% 아세토니트릴 (ACN) 및 0.1% 트리플루오르아세트산 (TFA) 중에 용해된 시아노-4-히드록시신남산 (CHCA) 10 mg/mL (Sigma-Aldrich)을 사용하여 양이온 반사 모드로 수행하였다. 완전 주사 질량 스펙트럼 (Full scan mass spectra)을 질량 범위 1000-4000 m/z에 대한 양이온 반사 모드에서 획득하였다. 각각의 질량 스펙트럼은 전체 레이저 강도의 약 65%로 설정된 레이저 강도 및 8x 4GS/s로 증강된 검출기 이득 (detector gain)을 이용해 750회의 평균 레이저 샷의 결과이다 (Bruker Flex Control 소프트웨어 내에서 선택되는 바와 같음). 5 Da의 윈도우 범위로, 수동 선택된 이온 m/z 3547의 MALDI-MS/MS 스펙트럼을 TOF/TOF 충돌-유도 해리를 이용해 획득하였다. 각각의 MS/MS 스펙트럼은 소프트웨어 내에서 선택된 약 60%로 설정된 레이저 강도 및 10x 4GS/s로 증강된 검출기 이득을 이용해 1000회의 평균 레이저 샷의 결과이다. 결과의 질량 스펙트럼을 Flex 분석 소프트웨어 (Bruker Daltonics)를 이용해 분석하였다. 스펙트럼을 PepMix 내부 표준 용액에 대해 보정하였다.
N-말단 단백질 서열분석
정제된 호고시딘-α의 N-말단 아미노산 서열 (분획 30, 도 7A)을 Procise® 494HT Protein Sequence 시스템 (Applied Biosystems) 상에서 Edman 분해의 15회 주기에 의해 분석하였다. 호고시딘-α의 예측된 성숙 형태를 도 5A에 나타내었다.
MALDI
-
TOF
/
TOF
분석에 의한 단백질 서열분석
에스. 호미니스로부터의 호고시딘-β의 N-말단 영역 (분획 32, 도 8)은 변형된 아미노산을 함유하고 있기 때문에, Edman 분해에 의해 서열을 수득할 수 없다. 따라서, 이 AMP의 전체 단백질 서열은 게놈 안내된 MALDI-TOF/TOF 분석을 토대로 수득하였다. 이차 대사산물 생합성 유전자 클러스터를 동정하기 위해 에스. 호미니스의 뉴클레오티드 서열의 분석을 항생제 및 이차 대사산물 분석 쉘 (shell) - AntiSMASH 플랫폼 상에서 수행하였다. AntiSMASH 결과는 유전자좌 2050 - 2250에서 잠재적 후보와 함께 란티펩티드에 대한 하나의 유전자 클로스터를 제공하였다 (도 9A). 합성 및 변형에 관여하는 유전자의 NCBI BlastP 분석은 클래스 2 란티펩티드에 대해 높은 상동성을 보인다. 서열 ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK (서열번호 4의 aa 29 내지 66)를 갖는 코어 펩티드를 타입 2 란티바이오틱스에 공통인, GG 절단 부위를 갖는 리더 펩티드로부터 절단하였다. 게놈 마이닝 (mining) 및 MS/MS 단편화를 조합하여 호고시딘-β의 성숙한 형태를 예측하였다 (도 5A).
게놈 서열분석
에스. 호미니스로부터의 AMP의 단백질 서열은 기존의 게놈 데이터베이스에서 발견되는 임의의 분자와 일치하지 않기 때문에, 에스. 호미니스의 항균 균주의 전체 게놈 서열분석을 수행하였다. 게놈 DNA를 UltraClean® Microbial DNA 단리 키트 (MO Bio)를 사용하여 정제하였다. 전체 게놈 DNA 서열분석 라이브러리를 제조사의 프로토콜에 따라서 Nextera-XT DNA Sample Prep 키트 (Illumina)를 사용하여 구축하였다. 최종 라이브러리의 서열을 Illumina MiSeq™ 상에서 짝맞춤 말단 (paired end) 서열분석 (300×300)으로 분석하였다. 서열분석된 결과를 길이 21, 33, 55, 77, 및 127의 k-머 (k-mer)를 갖는 SPAdes 2.5.1을 사용하여 "주의" 플래그를 켜고 de novo로 조립하였다. 생산된 모든 스캐폴드 상에서, 6-프레임 (six-frame) 번역을 전체 게놈 다중 염색체 (Whole Genome Multi Chromosome.pl) 번역을 사용하여 수행하였다 ([http://]proteomics.ucsd.edu/Downloads/). 그 후에 이 출력은 질량 분광 분석을 통해 동정된 펩티드 단편에 대한 일치를 위해 조회되었다.
항균 분석
정제된 분획의 항균 활성을 시험하기 위해 에스. 아우레우스 (ATCC35556) 균주를 사용하여 방사상 확산 분석을 수행하였다. 간략히는, 용융된 TSB 아가 (10 mL)를 에스. 아우레우스 (1×106 CFU)와 혼합하고 10 cm 페트리 디쉬에 부었다. 2 내지 4 μL의 시험 샘플을 아가 플레이트 상에 천공된 작은 웰에 적용하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 세균의 가시적인 성장을 허용하였다. 웰 주변의 투명한 구역 (비 세균 성장)에 의해 항세균 활성이 표시되었다. 에스. 아우레우스 (1×105 CFU/mL)를 PBS 중의 절반 강도의 Muller-Hinton 브로쓰 (MHB)에서의 2-배 연속 희석액과 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 호고시딘의 항균 활성을 평가하였다. 인큐베이션 후, TSB 아가 플레이트 상에 10-배 연속 희석액의 도말 후 CFU를 계수하여 생존 세균의 수를 측정하였다. 24시간 인큐베이션 후 생존 세균의 3-로그 감소 (99.9%)로서 MBC를 결정하였다.
통계학적 분석
아토피성 개체 내부에서 병변 내지 비-병변 샘플을 비교하기 위해 대응표본 t-검정 (paired t-test)을 사용하고, 비-아토피성 내지 아토피성 샘플을 비교하기 위해 독립적 t-검정을 사용하였다. 항균 CoNS의 빈도 및 시간의 경과에 따른 살아 있는 스타필로코커스 대 스타필로코커스 DNA의 비율의 종형 혼합 모델 (longitudinal mixed model)이 또한 적합하였다. 각각의 모델은 병변 유형, 방문, 및 고정 효과로서 이들의 상호작용 기간을 포함하는 반면, 여러 시점에서 동일한 개체로부터 수득된 샘플들 사이의 관계를 설명하기 위해 복합 대칭 구조를 사용하였다. 항균 CoNS의 빈도는 분류된 백분율 (<=20, 21-79, >=80)의 누적 로짓 링크 (logit link) 및 다항 분포를 사용하여 이중-모드 분포 (bi-modal distribution)를 설명하였다. SAS (버전 9.3) 소프트웨어를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
아토피성 피부염에서 증가하는
스타필로코커스
생존율
배양 가능/살아 있는 스타필로코커스 spp.의 양과 배양 불가능/죽은 스타필로코커스 spp.의 양 사이의 관계를 평가하기 위하여, 세균 밀도를 수동 콜로니 계수 및 속-특이적 16S 리보좀 DNA에 대한 qPCR 둘 다에 의해 측정하였다. 이전 보고와 일치하게, 더 많은 스타필로코커스 spp. 및 에스. 아우레우스가 이들 환자의 비병변 피부 또는 비-아토피성 개체로부터보다 아토피성 피부염 환자의 팔뚝 위 병변 피부로부터 배양될 수 있다 (도 1A 및 1B). DNA 존재량의 측정은 유사한 경향을 나타내었다 (도 1C 및 6). 그러나, 이들 2종의 독립된 기법의 결과는 아토피성 병변 피부와 비-아토피성 피부 사이에서 유의미하게 달랐다. 아토피성 피부염 개체의 병변 피부에서는, 배양 및 DNA 기초 결과가 유사하였다 (도 1D). 반면, 비-아토피성 피부에서 DNA 존재량에 기초한 상대적 CFU 대비 배양된 CFU의 비는 대략 0.1이었는데, 이는 비-아토피성 개체의 피부에서 더 낮은 세균의 생존률을 시사한다.
피부
마이크로비옴의
항균 활성
30명의 비-아토피성 개체 (2029개 콜로니) 및 50명의 아토피성 개체 (5695개 콜로니)로부터 살아 있는 CoNS를 단리하여 에스. 아우레우스 생존에 미치는 이들의 영향을 특성화하였다. 비-아토피성 개체로부터 단리된 대부분의 CoNS 클론 (75.26±35.49%)은 에스. 아우레우스 성장을 억제하는 것으로 관찰되었다 (도 2A). 반면, 아토피성 피부 상에서 발견된 소수의 CoNS가 이 활성을 보유하였다 [22.83±32.64% (비병변) 및 15.76±25.92% (병변)]. 각각의 집단으로부터 단리된 CoNS의 항균 기능의 이러한 차이는 2주의 기간에 걸친 하기의 반복된 면봉 실험에서 나타난 바와 같이 안정하고 시간의 경과에 따라 재현가능하였다 (도 2B). 총 스타필로코커스 DNA에 대한 배양 가능한 스타필로코커스의 증가된 비율 역시 2주의 기간에 걸쳐 이 코호트에서 안정하였다 (도 2C). 이들 결과는 아토피성 피부염 환자의 피부가 CoNS 세균의 성장을 지지하지만, 비-아토피성 피부에서 발견되는 것과 항균 기능이 다른 균주의 생존을 가능케 한다.
도 1에 나타난 바와 같이, 비-아토피성 개체의 단 3%만이 에스. 아우레우스 배양-양성 (>1 CFU/cm2)인 반면, 57%의 아토피성 개체는 에스. 아우레우스에 대해 양성 배양되었다. CoNS로부터 검출된 항균 활성이 에스. 아우레우스 생존과 관련이 있는지를 결정하기 위해, 살아 있는 에스. 아우레우스의 측정 값에 대한 항균 CoNS의 빈도를 비교하였다 (도 3A). 놀랍게도, 살아 있는 에스. 아우레우스를 갖는 모든 환자는 낮은 빈도의 항균 CoNS를 갖고 있었다. 또한, 에스. 아우레우스-음성 그룹보다 에스. 아우레우스 배양-양성 그룹에서 빈도가 더 낮았다 (>1 CFU/cm2)(도 3B). 이들 결과는 항균 CoNS가 에스. 아우레우스 집락화에 대해 보호적이었음을 시사한다.
피부 상에서 항균 세균 종의 동정
항균 활성을 갖는 CoNS 종을 추가로 동정하기 위해, 세균 콜로니의 무작의 소그룹 (subset)을 전장의 16S rRNA 유전자 서열분석을 위해 선택하였다. 비-아토피성 피부에서, 항균 CoNS의 우세한 종은 에스. 에피더미디스 또는 에스. 호미니스였다 (도 4A). 아토피성 개체에서, 항균 CoNS 멤버는 스타필로코커스 파스테우리 (Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 아루네리 (Staphylococcus warneri), 스타필로커커스 카피티스 (Staphylococcus capitis), 에스. 에피더미디스 및 에스. 호미니스를 포함하였다. 그러나, 대부분의 개체에서, 항균 및 비-항균 기능을 갖는 것으로 발견된 그룹 내에서 유사한 종이 동정되었다 (도 4B). 이러한 관찰은 항균 활성이 종 수준에서 예측 가능하지 않음을 보여준다. 기능적으로 비활성인 CoNS 균주의 과성장이 아토피성 피부염 환자에서 발생하는 것으로 보인다.
마이크로비옴에
의해 생산된 항균 활성을 갖는 펩티드
CoNS 균주에서 검출된 항균 활성을 담당하는 것이 무엇인지 결정하기 위해, 유전적 및 생화학적 접근법을 사용하였다. 박테리오신 (bacteriocin)은 일부 CoNS 종에 의해 생산된 일종의 AMP이다. 그러나, 공지의 박테리오신 epiA, pepA, eciA 및 elkA을 인코딩하는 어떠한 DNA도 PCR에 의해 비-아토피성 피부에서 검출되지 않았다 (n=14) (표 2, 프라이머 서열). 따라서, 비-아토피성 개체로부터 단리된 항균 에스. 호미니스의 대표적 콜로니로부터의 활성 공급원을 정제하고 동정하기 위해 실험을 실시하였다. 역-전사 크로마토그래피는 항균 활성과 연관된 2개의 독립적 피크 (3152.2 및 3547.7Da)를 나타내었다 (도 7). 3152.2 Da 펩티드의 N-말단 아미노산 서열분석은 KCSWWNAA였다. 게놈-안내된 MALDI-TOF/TOF 분석에 의해 3547.7 Da 펩티드의 전체 서열을 수득하였다 (도 8). 이 에스. 호미니스 균주의 게놈 서열에 대한 질량 및 아미노산 서열의 정렬은, 이들 신규한 AMP가 lanM, lanC 및 lanT 동족체의 유전자 클러스터 내에서 인코딩되었고 (도 9), 란티바이오틱스로서의 정체성과 일치함을 나타내었다. 이들 AMP는 이전에 알려진 바 없기 때문에, 이들을 "보호"를 의미하는 일본어 "호고 (Hogo)"로부터 호고시딘-α (3152.2 Da) 및 -β (3547.7 Da)로 명명하였다. 이렇게 새롭게 기술된 AMP를 14명의 비-아토피성 개인의 50%에서 PCT에 의해 용이하게 검출 가능하였다. 성숙한 호고시딘-α 및 호고시딘-β의 예측된 이차 구조를 도 5A에 나타내었다. 에스. 아우레우스에 대한 정제된 호고시딘-α 및 -β의 최소한의 실균 농도 (>99.9% 사멸)는 각각 0.625 μM 및 1.25 μM이었고 (도 5B), 이 활성은 인간 피부에서 생산된 통상적인 AMP보다 더 강력하였다. 중요하게는, 호고시딘 펩티드와 인간 피부 카텔리시딘 AMP LL-37의 동시-인큐베이션은 에스. 아우레우스에 대한 강력한 상승작용적 항균 활성을 나타내었는데 (도 5B), 이는 마이크로비옴으로부터 유래한 AMP가 에스. 아우레우스에 저항하는 숙주의 선천적 면역 방어의 능력을 증강시킴을 시사한다.
실시예
2
세균 균주의 FAME 분석
세균 세포 추출물의 사포닌화 및 메틸화된 샘플 내 존재하는 지방산 메틸 에스테르의 상대적 존재량으로 표시될 수 있는, 전체 세균 세포 (주로 세포 막)의 지질 조성은 각 균주에 대해 매우 독특하기 때문에, 동정된 균주를 지방산 메틸 에스트르 (FAME) 분석에 적용하였다. 세균 균주를 표준 기법에 따라서 배양하고 수확하였다. 세포를 가스 크로마토그래피용 이동상 용매 내로 추출하기 전에 사포닌화 및 메틸화에 적용하였다. 샘플을 장치 제조사의 지침에 따라서 로우딩하고 작동시켰다. 결과의 크로마토그램을 도 11 내지 19에 나타내었다.
실시예
3
에스.
아우레우스에
의한
집락화로부터
피부를 보호하는 공생 세균
이들 세균의 존재가 에스. 아우레우스에 의한 집락화를 감소시킬지 여부를 시험하기 위해 AMP-생산 공생 CoNS와 에스. 아우레우스와의 집락화 사이의 연관성을 확립하고, 이들 균주에 의해 생산된 활성 펩티드를 동정하는 실험을 실시하였다. 임상적 CoNS 단리물을 정의된 양의 에스. 아우레우스가 처음 적용되었던 위생 처리된 돼지 피부의 표면에 적용하였다. 에스. 아우레우스 생존의 유의미한 감소가 정상적인 인간 피부 상의 세균 밀도의 추정치와 일치하는 밀도 (1×105 CFU/cm2)로 에스. 호미니스 A9의 단일 적용 후에 나타났다 (도 20A). 사멸되고 적용 전에 세척된 에스. 호미니스 A9의 적용, 또는 배양 중에 항균 활성을 나타내지 않는 다른 에스. 호미니스 균주의 사용은 에스. 아우레우스 생존에 영향을 미치지 않았다. 유사하게, 정의된 양의 에스. 아우레우스가 적용된 마우스의 등에 활성 에스. 호미니스의 단일 적용은 피부 상의 에스. 아우레우스의 생존을 감소시켰다 (도 20B). 반면, 유사한 밀도에서 비활성 균주의 적용은 에스. 아우레우스를 억제하지 않았다.
마지막으로, 인간에서 에스. 아우레우스를 억제하는 기능적으로 스크리닝되고 단리된 공생 세균의 능력을 직접적으로 시험하기 위해, AD 개체의 피부에 이들 세균의 적용 효과를 시험하기 위해 실험을 실시하였다. 이전에 나타난 바와 같이, 항균 활성을 갖는 균주가 이들 개체의 전체 CoNS 공동체 내에서는 드물었지만, 충분한 콜로니를 스크리닝하였다면 동정될 수 있을 것이다. 에스. 아우레우스-배양 양성이었던 5명의 AD 환자가 본 연구에 참여하도록 모집되었다. 항균 활성을 갖는 CoNS 클론을 동정하였고 개체에의 계획된 재적용을 위해 증폭되었다 (자가 이식). 각각의 선택된 클론을 서열분석하고 란티바이오틱스-관련 유전자의 클러스터를 5종의 에스. 에피더미디스 또는 에스. 호미니스 균주에서 동정하였으며, 콜리신 (colicin) V 유전자가 2종의 에스. 에피더미디스 균주 및 1종의 에스. 호미니스 균주에서 나타났다 (도 21-23). 이중-맹검 방식으로, 비히클 크림 단독 또는 크림으로 제제화된 세균을 각 팔의 피부에 1회씩 적용하고 24시간 후에 에스. 아우레우스를 측정하였다. 선택된 균주를 정상 인간 피부 상의 세균 존재량의 이전 평가량과 유사한 밀도인, 1×105 CFU/cm2의 총 최종 농도로 적용하였다. 이렇게 기능적으로 정의되고 자가 유래된 CoNS 균주(들)의 단일 적용은 기저선 대비 24시간 이내에 에스. 아우레우스 CFU를 유의미하게 감소시켰다 (도 20E).
실시예
4
생체 외 돼지 피부 및 마우스에의 항균
CoNS의
이식
냉동된 돼지 피부 시트를 Loretta Tomlin Animal Technologies사 (Livermore, CA)로부터 입수하고 3% 클로로자일레놀 (chloroxylenol)을 이용해 수술용 브러시로 살균 처리하였다. 피부 시트를 2.5 cm × 2.5 cm 크기로 절단하고 멸균 PBS로 20회 이상 세척하여 클로로자일레놀 잔여물을 제거하였다. 무작위로 선택된 C57BL6 암컷, 6주령 마우스의 등 피부의 털을 면도하고, 탈모제 크림을 처리하고 세균 적용 적어도 24시간 전에 물로 세정하였다. 면도된 피부를 알코올 면봉으로 2회 세정하여 원래 집락화된 세균을 제거하였다. 살아 있는 동물 실험을 포함한 모든 실험은 동물 관리 및 사용 지침 협회 (Institutional Animal Care and Use Guidelines)의 승인에 따라 이루어졌다.
에스. 아우레우스 (ATCC35556) (1×105 CFU/cm2)를 돼지 피부 (2.5×2.5 cm) 또는 마우스의 배면 피부 (2×2 cm) 상에 피내로 (epicutaneously) 시험 감염시켰다. SH-란티바이오틱 (호고시딘)을 생산하는 비-AD 개체로부터 단리된 에스. 호미니스 A9 균주, 또는 배양 중에 항균 활성을 나타내지 않는 AD 개체의 병변 피부로부터 단리된 에스. 호미니스 균주를 세균 생존능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 피부 보습제 내에 1×107 CFU/g로 제제화하였다. 항-에스. 아우레우스 활성을 갖는 에스. 호미니스 A9 균주, UV-사멸된 에스. 호미니스 A9, 에스. 호미니스 C4, C5 및 C6의 비활성 균주 (1×105 CFU/10 μL), 또는 비히클 중의 어느 하나를 돼지 피부 또는 마우스 점막 피부의 표면 상에 20시간 동안 연속적으로 적용하였다 (도 20A 및 20B). 정제된 란티바이오틱 (0.5 nmol), 에스. 호미니스 A9의 조건화된 배지 (50 μL)를 살균 처리된 돼지 피부의 표면에 적용하였다. 돼지 피부를 6-웰 플레이트 내에서 30℃로 인큐베이션하였다. 살아 있는 세균을 상기에 기술된 바와 같은 피부 표면으로부터 TSB로 미리 적셔진 Catch-All 면봉으로 수확하였다. 세균을 1 mL TSB 중에서 강력하게 면봉 두부를 볼텍싱하여 현탁하였다. 세균 현탁액의 10-배 연속 희석액을 에스. 아우레우스의 선택적 계수를 위해 노른자위 텔룰루산염 (tellurite) 함유 Baird-Parker 아가 상에 도말하였다. 에스. 아우레우스 (후광을 갖는 큰 흑색 콜로니)는 선택적 아가 플레이트 상에서 에스. 호미니스 (후광 부재의 작은 회색 콜로니)와 구별되었다.
실시예
5
자가
마이크로비옴
이식
AD 환자를 위한 자가 마이크로비옴 이식 (AMT) 접근법은 US 식품의약국 (FDA)에 의해 공식적으로 승인되었고, 이 프로토콜은 임상시험신청 (investigational new drug application, IND) (UCSD 승인 #15786)으로 제출되었다. 스크리닝 방문에서, 양쪽 전주와의 병변 부위에 에스. 아우레우스 보유자인 AD 환자를 선별하였다. 그 사이에, 에스. 아우레우스에 대해 항균 활성을 생산하는 CoNS 균주를 선별하기 위해 AD 환자의 상완의 비병변 피부로부터 면봉으로 긁어서 피부 세균을 수득하였다. 항균 CoNS 단리물의 종을 전장 16S rRNA 유전자의 Sanger 서열분석으로 동정하였다. CoNS 단리물의 글리세롤 스톡을 환자가 이식 요법을 받게 되는 이차 방분 전까지 -80oC에 보관하였다. 각각의 CoNS 균주를 개별적으로 TSB 중에서 밤새 증폭시켰다. 각각의 CoNS 균주를 세균 생존능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 피부 보습제에 1×107 CFU/g으로 제제화하였다. 항균 활성을 갖는 단 1종의 에스. 에피더미디스 또는 에스. 호미니스 균주가 3명의 환자로부터 단리되었다. 이들 경우에, CoNS의 단일 균주를 제제화하였다. 3종 및 2종의 항균 에스. 호미니스 또는 에스. 에피더미디스 균주를 2명의 AD 환자로부터 단리하였다 (도 20D). 이들 경우에, 각 CoNS의 동일한 CFU를 107 CFU/g의 총 농도로 제제화하였다. 두 번째 방문에서, 관련 부위를 측정하고 양쪽 전완의 병변 부위 상의 살아 있는 에스. 아우레우스의 기저선 CFU를 상기에 기술된 바와 같이 정량하였다. 한쪽 팔을 10 mg/cm2으로 AMT 제제로 처리하여 1×105 CFU/cm2의 CoNS를 수득하였다. 다른 쪽 팔에는 동일한 양의 보습제만을 처리하였다. 모든 처리를 이중-맹검 방식으로 수행하였고 모든 결과가 분석된 후에 공개하였다. 개체는 입욕, 샤워, 운동 또는 자신의 팔에 임의의 국소 제품을 적용하는 것이 금지되었으며, 다음 방문 전까지 다른 쪽 팔에 적용된 CoNS의 교차 오염을 피하기 위해 깨끗한 긴팔 셔츠를 착용하였다. 세 번째 방문 시, 관련 부위에서 에스. 아우레우스 CFU를 측정하였다. 비히클과 AMT 팔 사이에서 에스. 아우레우스 생존률의 차이를 [AMT (×시간) - 비히클 (×시간)]/ AMT (기저선)에 따라 계산하여 Δ% 에스. 아우레우스 CFU (×=0시간 또는 24시간)를 수득하였다 (도 20E).
통계학적 분석
모든 실험에 대해, 적어도 3개 이상의 생물학적 복제물이 사용되었고, 이들을 도면의 범례에 표시하였다. 모든 마우스 실험의 경우, 적어도 6마리의 마우스를 처리군 당 사용하였다. 따라서, 보고된 차이에 대해서, 사용된 샘플 크기는 신뢰성에 충분한 힘을 실어 주었다. 대응표본 t-검정 (양측 검정, two-tailed)을 사용하여 AD 개체 내부에서 병변과 비병변 샘플을 비교하였고 독립적 t-검정 (양측 검정)을 사용하여 비-AD와 AD 샘플을 비교하였다. Sh-안티바이오틱-α를 이용한 CoNS와 같은 비-정상적으로 분포된 변수의 경우 (%), 비-AD와 AD 샘플에 대해서는 Wilcoxon-Mann-Whitney 검정 및 AD 개체 내부에서의 병변과 비병변 샘플에 대해서는 Wilcoxon signed rank 검정과 같은 비-매개변수 접근법을 사용하였다. 항균 CoNS의 빈도 및 시간의 경과에 따른 살아 있는 스타필로코커스 대 스타필로코커스 DNA의 비율의 종형 혼합 모델이 또한 적합하였다. 각각의 모델은 병변 유형, 방문, 및 고정 효과로서 이들의 상호작용 기간을 포함하는 반면, 여러 시점에서 동일한 개체로부터 수득된 샘플들 사이의 관계를 설명하기 위해 복합 대칭 구조를 사용하였다. 항균 CoNS의 빈도는 이중-모드 분포를 설명하기 위해 분류된 백분율 (<=20, 21-79, >=80)의 누적 로짓 링크 및 다항 분포를 사용하였다. SAS (버전 9.3) 소프트웨어 및 R 소프트웨어 (버전 3.1.1)를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
실시예
6
동종 이식
105 CFU/g의 균주 SH-A9, SH-C2, SE-A11, AMT1, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, AMT4-D12, AMT5-C5, AMT5-G6 및/또는 SE-MO34를 세균 생존능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 피부 보습제 내로 제제화한다. 치료를 위한 개체는 아토피성 피부염 및/또는 활성 에스. 아우레우스 감염의 존재를 기준으로 동정되었다. 개체는 3일간 입욕, 샤워, 운동 또는 이환된 부위에 임의의 국소 제품의 적용을 피하도록 지시되었다. 순응하는 환자는 7일 후 처리된 영역에서 에스. 아우레우스 수준의 유의미한 감소를 나타낸다 (회복 가능한 에스. 아우레우스 콜로니 계수에서의 >/= 3 감소). 순응하는 환자는 초기 처리 후 적어도 14일간 지속되는 에스. 아우레우스 감염 및/또는 아토피성 피부염의 증상에 있어서 임상적으로 관찰 가능한 감소를 나타낸다.
실시예
6
에스.
에피더미디스에
의해 생산된 AMP의 정제
대표적인 항균 에스. 에피더미디스 A11 균주로부터의 멸균 조건화된 배지를 사용하여 아토피성 피부에서 존재량이 더 낮았던 정상 피부에서 항균 활성을 갖는 분자를 추가로 동정하였다. 활성을 암모늄 설페이트 (70% 포화)로 침전시키고, H2O에 용해시킨 후 Sep-Pak 카트리지 (Waters Co)에 적용하였다. 활성 분획을 H2O 중의 40% 아세토니트릴로 용출시키고 HiTrap® SP (GE Healthcare Life Sciences) 분리에 적용한 후 활성을 500 mM NaCl로 용출하였다. 0.8 mL/분으로 0.1% (v/v) TFA 중에서 5% 내지 50%의 아세토니트릴 선형 구배로 CapCel Pak C8 (5 μm, 300 Å, 4.6 × 250 mm) (Shiseido Co.)을 이용한 3단계 HPLC 정제를 수행하였다.
에스.
에피더미디스에
의해 생산된 AMP의 동정
항균 활성을 비-아토피성 개체로부터 단리된 대표적인 항균 에스. 에피더미디스 A11 균주의 멸균 조건화된 배지로부터 정제하였다. 정제된 활성 분자의 특성을 MALDI-TOF/TOF 및 Edman 말단 서열분석에 의해 결정하였다.
질량 분광 분석
에스. 에피더미디스 A11로부터 HPLC-정제된 AMP의 질량 스펙트럼을 Flex Control 소프트웨어 (Bruker Daltonics)에 의해 제어되는 MALDI-TOF/TOF Bruker Autoflex™ Speed 장치 (Bruker Daltonics)를 사용하여 기록하였다. 질량 분광학적 분석을 매트릭스로서 50% 아세토니트릴 (ACN) 및 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 중에 용해된 시아노-4-히드록시신남산 (CHCA) 10 mg/mL (Sigma-Aldrich)을 사용하여 양성 이온 반사 모드로 수행하였다. 완전 주사 질량 스펙트럼을 질량 범위 1000-6000 m/z에 대한 양이온 반사 모드에서 획득하였다. 각각의 질량 스펙트럼은 전체 레이저 강도의 약 65%로 설정된 레이저 강도 및 8x 4GS/s로 증강된 검출기 이득을 이용해 750회의 평균 레이저 샷의 결과이다 (Bruker Flex Control 소프트웨어 내에서 선택되는 바와 같음). 결과의 질량 스펙트럼을 Flex 분석 소프트웨어 (Bruker Daltonics)를 이용해 분석하였다. 스펙트럼을 PepMix 내부 표준 용액에 대해 보정하였다.
N-말단 단백질 서열분석
정제된 N-말단 아미노산 서열 (분획 33-34, 도 25A)을 Procise® 494HT Protein Sequence 시스템 (Applied Biosystems) 상에서 15회 주기의 Edman 분해로 분석하였다. N-말단 서열은 서열번호 55로 제공된다.
본 발명의 다수의 실시양태가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시양태가 하기 청구항의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> ANTIMICROBIAL THERAPY
<130> IPA171180-US
<140> PCT/US2016/031067
<141> 2016-05-05
<150> US 62/157,248
<151> 2015-05-05
<150> US 62/300,274
<151> 2016-02-26
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 186
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(186)
<400> 1
atg agt aaa tta gaa cta ctt aat gaa tct aaa gca aat tat ctt gaa 48
Met Ser Lys Leu Glu Leu Leu Asn Glu Ser Lys Ala Asn Tyr Leu Glu
1 5 10 15
aaa ctt act gat gaa aaa att gaa gaa acg gaa gca tac ggc ggt aaa 96
Lys Leu Thr Asp Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Ala Tyr Gly Gly Lys
20 25 30
tgt tct tgg tgg aat gca tca tgt cat tta gga aat aat ggg aaa att 144
Cys Ser Trp Trp Asn Ala Ser Cys His Leu Gly Asn Asn Gly Lys Ile
35 40 45
tgt aca gtt tct cat gag tgt gca gca gga tgt aat tta taa 186
Cys Thr Val Ser His Glu Cys Ala Ala Gly Cys Asn Leu
50 55 60
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 2
Met Ser Lys Leu Glu Leu Leu Asn Glu Ser Lys Ala Asn Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Thr Asp Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Ala Tyr Gly Gly Lys
20 25 30
Cys Ser Trp Trp Asn Ala Ser Cys His Leu Gly Asn Asn Gly Lys Ile
35 40 45
Cys Thr Val Ser His Glu Cys Ala Ala Gly Cys Asn Leu
50 55 60
<210> 3
<211> 201
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(201)
<400> 3
atg ttt agt aaa aat ttc caa aga aat gaa aag atg gaa aat act ttg 48
Met Phe Ser Lys Asn Phe Gln Arg Asn Glu Lys Met Glu Asn Thr Leu
1 5 10 15
aaa aag gta agt tca gct aat gat gtg aat gga gga gct aca ccg act 96
Lys Lys Val Ser Ser Ala Asn Asp Val Asn Gly Gly Ala Thr Pro Thr
20 25 30
att act aca tct tca gca act tgt ggt ggt att att gtt gcg gca agt 144
Ile Thr Thr Ser Ser Ala Thr Cys Gly Gly Ile Ile Val Ala Ala Ser
35 40 45
gct gct cag tgt ccg aca tta gct tgc tct tct aga tgt gga aaa aga 192
Ala Ala Gln Cys Pro Thr Leu Ala Cys Ser Ser Arg Cys Gly Lys Arg
50 55 60
aaa aaa taa 201
Lys Lys
65
<210> 4
<211> 66
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 4
Met Phe Ser Lys Asn Phe Gln Arg Asn Glu Lys Met Glu Asn Thr Leu
1 5 10 15
Lys Lys Val Ser Ser Ala Asn Asp Val Asn Gly Gly Ala Thr Pro Thr
20 25 30
Ile Thr Thr Ser Ser Ala Thr Cys Gly Gly Ile Ile Val Ala Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Gln Cys Pro Thr Leu Ala Cys Ser Ser Arg Cys Gly Lys Arg
50 55 60
Lys Lys
65
<210> 5
<211> 170
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Lys Thr Gln Arg Asn Gly His Ser Leu Gly Arg Trp Ser Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Met Pro Leu Ala Ile Ile Ala Gln Val
20 25 30
Leu Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile Asn Gln
35 40 45
Arg Ser Ser Asp Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Asp Leu Asp Pro Arg
50 55 60
Pro Thr Met Asp Gly Asp Pro Asp Thr Pro Lys Pro Val Ser Phe Thr
65 70 75 80
Val Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Thr Gln Gln Ser Pro Glu Asp
85 90 95
Cys Asp Phe Lys Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Cys Met Gly Thr Val
100 105 110
Thr Leu Asn Gln Ala Arg Gly Ser Phe Asp Ile Ser Cys Asp Lys Asp
115 120 125
Asn Lys Arg Phe Ala Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu
130 135 140
Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Asp Asp Phe
145 150 155 160
Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
165 170
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic linker
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic linker
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Met Phe Gly Gly Ala Lys Lys Arg Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus aureus-specific PCR primer
<400> 8
aactgttggc cactatgagt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus aureus-specific PCR primer
<400> 9
ccagcattac ctgtaatctc g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis-specific PCR primer
<400> 10
tcagcagttg aaggacagat 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis-specific PCR primer
<400> 11
ccagaacaat gaatggttaa gg 22
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus-genus specific 16S sequence PCR primer
<400> 12
tttgggctac acacgtgcta caatggacaa 30
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus-genus specific 16S sequence PCR primer
<400> 13
aacaacttta tgggatttgc wtga 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal sequence of bacterial 16S rRNA PCR primer
<400> 14
agagtttgga tcmtggctca g 21
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal sequence of bacterial 16S rRNA PCR primer
<400> 15
aaggaggtgw tccarcc 17
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis epidermn PCR primer
<400> 16
gattcaggag ctgaaccaag a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis epidermn PCR primer
<400> 17
ttgaagccct gccaatctaa 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis pep5 PCR primer
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ctgatgaact tgaacctcaa actg 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis pep5 PCR primer
<400> 19
gacactgtaa ataaacgcgt agc 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis epicidin280 PCR primer
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gcaactagac aggtatgtcc taaa 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis epicidin280 PCR primer
<400> 21
catctaagat taaatgaggg tggtt 25
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis epilancin K7 PCR primer
<400> 22
taagtccgca atctgctagt g 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus epidermidis epilancin K7 PCR primer
<400> 23
cagtaatatt gcaaccgcat gt 22
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus hominis Hogocidin-alpha PCR primer
<400> 24
atgagtaaat tagaactact taatg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus hominis Hogocidin-alpha PCR primer
<400> 25
ttataaatta catcctgctg cacac 25
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 26
Lys Cys Ser Asp Asp Asn Ala Ala
1 5
<210> 27
<211> 138
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(138)
<400> 27
atg gat att ata aaa gta aat aaa aca gaa aga atg aat gat aat aga 48
Met Asp Ile Ile Lys Val Asn Lys Thr Glu Arg Met Asn Asp Asn Arg
1 5 10 15
aaa att gta atg att ttt tct tta tac gat aca ttt ttt aac gct act 96
Lys Ile Val Met Ile Phe Ser Leu Tyr Asp Thr Phe Phe Asn Ala Thr
20 25 30
aat aca cat aag cta aag agt atg aag ctt aat gcg aaa taa 138
Asn Thr His Lys Leu Lys Ser Met Lys Leu Asn Ala Lys
35 40 45
<210> 28
<211> 45
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 28
Met Asp Ile Ile Lys Val Asn Lys Thr Glu Arg Met Asn Asp Asn Arg
1 5 10 15
Lys Ile Val Met Ile Phe Ser Leu Tyr Asp Thr Phe Phe Asn Ala Thr
20 25 30
Asn Thr His Lys Leu Lys Ser Met Lys Leu Asn Ala Lys
35 40 45
<210> 29
<211> 168
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(168)
<400> 29
atg gta tgg atc cat ggt ggt ggt aac tta ggt ggt gct ggc tta gaa 48
Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Asn Leu Gly Gly Ala Gly Leu Glu
1 5 10 15
gat gct ttt gat ggt aat act tta gct aaa cat aca tca aaa att aaa 96
Asp Ala Phe Asp Gly Asn Thr Leu Ala Lys His Thr Ser Lys Ile Lys
20 25 30
tat gtt ttt gga aat ttg caa cct gaa aac cat tat gat gat att gat 144
Tyr Val Phe Gly Asn Leu Gln Pro Glu Asn His Tyr Asp Asp Ile Asp
35 40 45
ata ata atc tca aaa caa tta taa 168
Ile Ile Ile Ser Lys Gln Leu
50 55
<210> 30
<211> 55
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 30
Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Asn Leu Gly Gly Ala Gly Leu Glu
1 5 10 15
Asp Ala Phe Asp Gly Asn Thr Leu Ala Lys His Thr Ser Lys Ile Lys
20 25 30
Tyr Val Phe Gly Asn Leu Gln Pro Glu Asn His Tyr Asp Asp Ile Asp
35 40 45
Ile Ile Ile Ser Lys Gln Leu
50 55
<210> 31
<211> 207
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(207)
<400> 31
atg att tca gtg ata ctg ccg atg gaa gaa ata att att gca ata ata 48
Met Ile Ser Val Ile Leu Pro Met Glu Glu Ile Ile Ile Ala Ile Ile
1 5 10 15
aat aac gac tta ggc cat tta att ttt gag aat aaa aaa aat agt ggg 96
Asn Asn Asp Leu Gly His Leu Ile Phe Glu Asn Lys Lys Asn Ser Gly
20 25 30
ttt tct ttt ttc ata ata aaa cct ttc ata act aat att tat ttt cta 144
Phe Ser Phe Phe Ile Ile Lys Pro Phe Ile Thr Asn Ile Tyr Phe Leu
35 40 45
tca ggt att aaa aaa att tta caa aaa cag aga aaa tat tat acg atg 192
Ser Gly Ile Lys Lys Ile Leu Gln Lys Gln Arg Lys Tyr Tyr Thr Met
50 55 60
cta ata aaa gta taa 207
Leu Ile Lys Val
65
<210> 32
<211> 68
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 32
Met Ile Ser Val Ile Leu Pro Met Glu Glu Ile Ile Ile Ala Ile Ile
1 5 10 15
Asn Asn Asp Leu Gly His Leu Ile Phe Glu Asn Lys Lys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Ser Phe Phe Ile Ile Lys Pro Phe Ile Thr Asn Ile Tyr Phe Leu
35 40 45
Ser Gly Ile Lys Lys Ile Leu Gln Lys Gln Arg Lys Tyr Tyr Thr Met
50 55 60
Leu Ile Lys Val
65
<210> 33
<211> 210
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(210)
<400> 33
atg aac ata tac tta aaa gta att tta act tct tta ttt ttt gct tta 48
Met Asn Ile Tyr Leu Lys Val Ile Leu Thr Ser Leu Phe Phe Ala Leu
1 5 10 15
ata att ttt att gta act tat ata acg act aag caa tgg gga aca tcg 96
Ile Ile Phe Ile Val Thr Tyr Ile Thr Thr Lys Gln Trp Gly Thr Ser
20 25 30
tta ggt ttt tca tct tta tca ttt atc ggt aac ttt att tac gat tat 144
Leu Gly Phe Ser Ser Leu Ser Phe Ile Gly Asn Phe Ile Tyr Asp Tyr
35 40 45
tca acg aaa tta agt gat aaa aaa tat gaa aaa aga ata aat agc aac 192
Ser Thr Lys Leu Ser Asp Lys Lys Tyr Glu Lys Arg Ile Asn Ser Asn
50 55 60
aaa aaa gat aaa ctt tag 210
Lys Lys Asp Lys Leu
65
<210> 34
<211> 69
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 34
Met Asn Ile Tyr Leu Lys Val Ile Leu Thr Ser Leu Phe Phe Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ile Phe Ile Val Thr Tyr Ile Thr Thr Lys Gln Trp Gly Thr Ser
20 25 30
Leu Gly Phe Ser Ser Leu Ser Phe Ile Gly Asn Phe Ile Tyr Asp Tyr
35 40 45
Ser Thr Lys Leu Ser Asp Lys Lys Tyr Glu Lys Arg Ile Asn Ser Asn
50 55 60
Lys Lys Asp Lys Leu
65
<210> 35
<211> 183
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(183)
<400> 35
atg aaa aat aac aaa aat tta ttt gat tta gaa att aaa aaa gaa aca 48
Met Lys Asn Asn Lys Asn Leu Phe Asp Leu Glu Ile Lys Lys Glu Thr
1 5 10 15
agt caa aac act gat gaa ctt gaa cct caa act gct gga cca gcg att 96
Ser Gln Asn Thr Asp Glu Leu Glu Pro Gln Thr Ala Gly Pro Ala Ile
20 25 30
aga gct tct gtg aaa caa tgt cag aaa act ttg aaa gct acg cgt tta 144
Arg Ala Ser Val Lys Gln Cys Gln Lys Thr Leu Lys Ala Thr Arg Leu
35 40 45
ttt aca gtg tct tgc aaa gga aaa aac gga tgt aaa tag 183
Phe Thr Val Ser Cys Lys Gly Lys Asn Gly Cys Lys
50 55 60
<210> 36
<211> 60
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 36
Met Lys Asn Asn Lys Asn Leu Phe Asp Leu Glu Ile Lys Lys Glu Thr
1 5 10 15
Ser Gln Asn Thr Asp Glu Leu Glu Pro Gln Thr Ala Gly Pro Ala Ile
20 25 30
Arg Ala Ser Val Lys Gln Cys Gln Lys Thr Leu Lys Ala Thr Arg Leu
35 40 45
Phe Thr Val Ser Cys Lys Gly Lys Asn Gly Cys Lys
50 55 60
<210> 37
<211> 171
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(171)
<400> 37
atg gaa aac aaa aaa gat tta ttt gat tta gaa atc aaa aaa gat aat 48
Met Glu Asn Lys Lys Asp Leu Phe Asp Leu Glu Ile Lys Lys Asp Asn
1 5 10 15
atg gaa aat aat aat gaa tta gaa gct caa tct ctt ggt cct gca att 96
Met Glu Asn Asn Asn Glu Leu Glu Ala Gln Ser Leu Gly Pro Ala Ile
20 25 30
aag gca act aga cag gta tgt cct aaa gca aca cgt ttt gtt aca gtt 144
Lys Ala Thr Arg Gln Val Cys Pro Lys Ala Thr Arg Phe Val Thr Val
35 40 45
tct tgt aaa aaa agt gat tgt caa tag 171
Ser Cys Lys Lys Ser Asp Cys Gln
50 55
<210> 38
<211> 56
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 38
Met Glu Asn Lys Lys Asp Leu Phe Asp Leu Glu Ile Lys Lys Asp Asn
1 5 10 15
Met Glu Asn Asn Asn Glu Leu Glu Ala Gln Ser Leu Gly Pro Ala Ile
20 25 30
Lys Ala Thr Arg Gln Val Cys Pro Lys Ala Thr Arg Phe Val Thr Val
35 40 45
Ser Cys Lys Lys Ser Asp Cys Gln
50 55
<210> 39
<211> 135
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(135)
<400> 39
atg aaa gtt gtt aaa gaa aag aaa gaa ctt ttt gat ctt gac gtt aaa 48
Met Lys Val Val Lys Glu Lys Lys Glu Leu Phe Asp Leu Asp Val Lys
1 5 10 15
gta aat gcg aga gac atg aat aat tca gaa tca ggt cca cct aat aca 96
Val Asn Ala Arg Asp Met Asn Asn Ser Glu Ser Gly Pro Pro Asn Thr
20 25 30
agt tta ata tgg tgt acg gat gga tgc gct aaa cgg taa 135
Ser Leu Ile Trp Cys Thr Asp Gly Cys Ala Lys Arg
35 40
<210> 40
<211> 44
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 40
Met Lys Val Val Lys Glu Lys Lys Glu Leu Phe Asp Leu Asp Val Lys
1 5 10 15
Val Asn Ala Arg Asp Met Asn Asn Ser Glu Ser Gly Pro Pro Asn Thr
20 25 30
Ser Leu Ile Trp Cys Thr Asp Gly Cys Ala Lys Arg
35 40
<210> 41
<211> 138
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(138)
<400> 41
atg gat att ata aaa gta aat aaa aca gaa aga atg aat gat aat aga 48
Met Asp Ile Ile Lys Val Asn Lys Thr Glu Arg Met Asn Asp Asn Arg
1 5 10 15
aaa att gta atg att ttt tct tta tac gat aca ttt ttt aac gct act 96
Lys Ile Val Met Ile Phe Ser Leu Tyr Asp Thr Phe Phe Asn Ala Thr
20 25 30
aat aca cat aag cta aag agt atg aag ctt aat gcg aaa taa 138
Asn Thr His Lys Leu Lys Ser Met Lys Leu Asn Ala Lys
35 40 45
<210> 42
<211> 45
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 42
Met Asp Ile Ile Lys Val Asn Lys Thr Glu Arg Met Asn Asp Asn Arg
1 5 10 15
Lys Ile Val Met Ile Phe Ser Leu Tyr Asp Thr Phe Phe Asn Ala Thr
20 25 30
Asn Thr His Lys Leu Lys Ser Met Lys Leu Asn Ala Lys
35 40 45
<210> 43
<211> 201
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(201)
<400> 43
atg agt aat aaa gat tta gaa tta ttt aat aca gcc ggt gat tta ata 48
Met Ser Asn Lys Asp Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ala Gly Asp Leu Ile
1 5 10 15
caa gaa tta aaa gat ggt gac cta aat atc cat tta tat ggt gaa tcg 96
Gln Glu Leu Lys Asp Gly Asp Leu Asn Ile His Leu Tyr Gly Glu Ser
20 25 30
gaa att aga aaa aaa tct ttc tct caa aaa aca ggg aat gat ggg aaa 144
Glu Ile Arg Lys Lys Ser Phe Ser Gln Lys Thr Gly Asn Asp Gly Lys
35 40 45
cat tgt aca att act tgg gaa tgt tct ata tgt cct act aaa act tgt 192
His Cys Thr Ile Thr Trp Glu Cys Ser Ile Cys Pro Thr Lys Thr Cys
50 55 60
tgg tgc taa 201
Trp Cys
65
<210> 44
<211> 66
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 44
Met Ser Asn Lys Asp Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ala Gly Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Glu Leu Lys Asp Gly Asp Leu Asn Ile His Leu Tyr Gly Glu Ser
20 25 30
Glu Ile Arg Lys Lys Ser Phe Ser Gln Lys Thr Gly Asn Asp Gly Lys
35 40 45
His Cys Thr Ile Thr Trp Glu Cys Ser Ile Cys Pro Thr Lys Thr Cys
50 55 60
Trp Cys
65
<210> 45
<211> 117
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(117)
<400> 45
atg gga act tca gag gta aga aaa gga aaa gga ggc ggt ttt agt acc 48
Met Gly Thr Ser Glu Val Arg Lys Gly Lys Gly Gly Gly Phe Ser Thr
1 5 10 15
gta acc gtt gta aca cca att gta ccg aca tcg aag tgt gcc tca att 96
Val Thr Val Val Thr Pro Ile Val Pro Thr Ser Lys Cys Ala Ser Ile
20 25 30
gta aaa cca tgt aac aaa taa 117
Val Lys Pro Cys Asn Lys
35
<210> 46
<211> 38
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 46
Met Gly Thr Ser Glu Val Arg Lys Gly Lys Gly Gly Gly Phe Ser Thr
1 5 10 15
Val Thr Val Val Thr Pro Ile Val Pro Thr Ser Lys Cys Ala Ser Ile
20 25 30
Val Lys Pro Cys Asn Lys
35
<210> 47
<211> 165
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(165)
<400> 47
atg act aaa ata act aaa gat gat ttg aaa aag att aca gaa aat cgt 48
Met Thr Lys Ile Thr Lys Asp Asp Leu Lys Lys Ile Thr Glu Asn Arg
1 5 10 15
att gaa gca cgt aca cat cca acc gtt gtt cct gta agt gct gct gta 96
Ile Glu Ala Arg Thr His Pro Thr Val Val Pro Val Ser Ala Ala Val
20 25 30
tgc gga gtt gct act aaa tta gta cca aca tcg aaa tgt gct tca att 144
Cys Gly Val Ala Thr Lys Leu Val Pro Thr Ser Lys Cys Ala Ser Ile
35 40 45
gta aaa cca tgt aat aaa taa 165
Val Lys Pro Cys Asn Lys
50
<210> 48
<211> 54
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 48
Met Thr Lys Ile Thr Lys Asp Asp Leu Lys Lys Ile Thr Glu Asn Arg
1 5 10 15
Ile Glu Ala Arg Thr His Pro Thr Val Val Pro Val Ser Ala Ala Val
20 25 30
Cys Gly Val Ala Thr Lys Leu Val Pro Thr Ser Lys Cys Ala Ser Ile
35 40 45
Val Lys Pro Cys Asn Lys
50
<210> 49
<211> 522
<212> DNA
<213> Staphylococcus hominis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(522)
<400> 49
atg act ata gat tta gta atg ata ctt att att ttg atg tat atg ata 48
Met Thr Ile Asp Leu Val Met Ile Leu Ile Ile Leu Met Tyr Met Ile
1 5 10 15
att ggt ttt aga aga ggc ctt tgg ctg aat agt ctt cat ttg tcg tct 96
Ile Gly Phe Arg Arg Gly Leu Trp Leu Asn Ser Leu His Leu Ser Ser
20 25 30
aca ctt gtc tca cta ttc att gcg cat cgt ttt tac caa tat ata tca 144
Thr Leu Val Ser Leu Phe Ile Ala His Arg Phe Tyr Gln Tyr Ile Ser
35 40 45
aaa caa atg att gtt ttt gtt cca ttt cct aaa aca gtt gct ttt gac 192
Lys Gln Met Ile Val Phe Val Pro Phe Pro Lys Thr Val Ala Phe Asp
50 55 60
acg cac ttc gca ttt caa tac cat gat gta caa caa cgt ttt gat act 240
Thr His Phe Ala Phe Gln Tyr His Asp Val Gln Gln Arg Phe Asp Thr
65 70 75 80
att gtg gca ttt tta tgt att gct ttt ata agt aag ttg ctt tta tat 288
Ile Val Ala Phe Leu Cys Ile Ala Phe Ile Ser Lys Leu Leu Leu Tyr
85 90 95
ctt att att gta act ttt gat aat ata gtg tca tat cat aat att cat 336
Leu Ile Ile Val Thr Phe Asp Asn Ile Val Ser Tyr His Asn Ile His
100 105 110
gtt aca agt cga ata ttg gga agc gta tta ggt agt att gca agt gtg 384
Val Thr Ser Arg Ile Leu Gly Ser Val Leu Gly Ser Ile Ala Ser Val
115 120 125
att gta ctg caa ctt gtt tta tat tta gta tct tta tat cct aat gaa 432
Ile Val Leu Gln Leu Val Leu Tyr Leu Val Ser Leu Tyr Pro Asn Glu
130 135 140
tgg att caa gaa agt tta aaa tac ggt tat tta agc cat att att cta 480
Trp Ile Gln Glu Ser Leu Lys Tyr Gly Tyr Leu Ser His Ile Ile Leu
145 150 155 160
ttt aag atg ccg ttt tta tca tct tat ata cta aat tta taa 522
Phe Lys Met Pro Phe Leu Ser Ser Tyr Ile Leu Asn Leu
165 170
<210> 50
<211> 173
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 50
Met Thr Ile Asp Leu Val Met Ile Leu Ile Ile Leu Met Tyr Met Ile
1 5 10 15
Ile Gly Phe Arg Arg Gly Leu Trp Leu Asn Ser Leu His Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Leu Val Ser Leu Phe Ile Ala His Arg Phe Tyr Gln Tyr Ile Ser
35 40 45
Lys Gln Met Ile Val Phe Val Pro Phe Pro Lys Thr Val Ala Phe Asp
50 55 60
Thr His Phe Ala Phe Gln Tyr His Asp Val Gln Gln Arg Phe Asp Thr
65 70 75 80
Ile Val Ala Phe Leu Cys Ile Ala Phe Ile Ser Lys Leu Leu Leu Tyr
85 90 95
Leu Ile Ile Val Thr Phe Asp Asn Ile Val Ser Tyr His Asn Ile His
100 105 110
Val Thr Ser Arg Ile Leu Gly Ser Val Leu Gly Ser Ile Ala Ser Val
115 120 125
Ile Val Leu Gln Leu Val Leu Tyr Leu Val Ser Leu Tyr Pro Asn Glu
130 135 140
Trp Ile Gln Glu Ser Leu Lys Tyr Gly Tyr Leu Ser His Ile Ile Leu
145 150 155 160
Phe Lys Met Pro Phe Leu Ser Ser Tyr Ile Leu Asn Leu
165 170
<210> 51
<211> 522
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(522)
<400> 51
atg ctc att gat ata gtt gtt ctt ctt att att tgt tac ttt ata gtg 48
Met Leu Ile Asp Ile Val Val Leu Leu Ile Ile Cys Tyr Phe Ile Val
1 5 10 15
ata ggg ttt cgt aga ggt att tgg tta tcg ata ttg cac ttt gct tct 96
Ile Gly Phe Arg Arg Gly Ile Trp Leu Ser Ile Leu His Phe Ala Ser
20 25 30
tca att gta tct tta tat att gcg tca caa cat tat caa tcg att gcg 144
Ser Ile Val Ser Leu Tyr Ile Ala Ser Gln His Tyr Gln Ser Ile Ala
35 40 45
caa cgt tta gtt gta ttt gtg cca ttt ccg aaa acg gtg gcg ttt gat 192
Gln Arg Leu Val Val Phe Val Pro Phe Pro Lys Thr Val Ala Phe Asp
50 55 60
atg gtc tat act ata cct tat gat cat ttg caa tac aga ttt gaa aaa 240
Met Val Tyr Thr Ile Pro Tyr Asp His Leu Gln Tyr Arg Phe Glu Lys
65 70 75 80
gtg ata gca ttt att ata ata ttt ggt atg tgt aag ctt att ttg tat 288
Val Ile Ala Phe Ile Ile Ile Phe Gly Met Cys Lys Leu Ile Leu Tyr
85 90 95
cta gtt gtt gtt aca ttt gat aat ata ata acg tat aaa aag ata cat 336
Leu Val Val Val Thr Phe Asp Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Lys Ile His
100 105 110
tta gta agt cgg ata tcg agt gtc gtt ttg agt atc ata tcg gtt ttt 384
Leu Val Ser Arg Ile Ser Ser Val Val Leu Ser Ile Ile Ser Val Phe
115 120 125
ata tat tta caa att gga ctt tat tta tta tcg cta tat ccg cat tca 432
Ile Tyr Leu Gln Ile Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Leu Tyr Pro His Ser
130 135 140
ttt ata cag tac caa tta tct caa tcg cta gta agt cga gtt gtg att 480
Phe Ile Gln Tyr Gln Leu Ser Gln Ser Leu Val Ser Arg Val Val Ile
145 150 155 160
gaa caa att cct tat tta tca caa ttt att tta aat tta taa 522
Glu Gln Ile Pro Tyr Leu Ser Gln Phe Ile Leu Asn Leu
165 170
<210> 52
<211> 173
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 52
Met Leu Ile Asp Ile Val Val Leu Leu Ile Ile Cys Tyr Phe Ile Val
1 5 10 15
Ile Gly Phe Arg Arg Gly Ile Trp Leu Ser Ile Leu His Phe Ala Ser
20 25 30
Ser Ile Val Ser Leu Tyr Ile Ala Ser Gln His Tyr Gln Ser Ile Ala
35 40 45
Gln Arg Leu Val Val Phe Val Pro Phe Pro Lys Thr Val Ala Phe Asp
50 55 60
Met Val Tyr Thr Ile Pro Tyr Asp His Leu Gln Tyr Arg Phe Glu Lys
65 70 75 80
Val Ile Ala Phe Ile Ile Ile Phe Gly Met Cys Lys Leu Ile Leu Tyr
85 90 95
Leu Val Val Val Thr Phe Asp Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Lys Ile His
100 105 110
Leu Val Ser Arg Ile Ser Ser Val Val Leu Ser Ile Ile Ser Val Phe
115 120 125
Ile Tyr Leu Gln Ile Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Leu Tyr Pro His Ser
130 135 140
Phe Ile Gln Tyr Gln Leu Ser Gln Ser Leu Val Ser Arg Val Val Ile
145 150 155 160
Glu Gln Ile Pro Tyr Leu Ser Gln Phe Ile Leu Asn Leu
165 170
<210> 53
<211> 1260
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1260)
<400> 53
atg att ggt aga aaa aaa gaa acc ctt tta aaa aac gaa gtt att tct 48
Met Ile Gly Arg Lys Lys Glu Thr Leu Leu Lys Asn Glu Val Ile Ser
1 5 10 15
gcg ttt act act ttt ttt acc tgc agt tat ata ata att gtt aat ggt 96
Ala Phe Thr Thr Phe Phe Thr Cys Ser Tyr Ile Ile Ile Val Asn Gly
20 25 30
ata ttg tta cat caa gca gga atg tct ttg tta tgg acg att ata gct 144
Ile Leu Leu His Gln Ala Gly Met Ser Leu Leu Trp Thr Ile Ile Ala
35 40 45
act act cta gtt tgt tgc att agt tgc atc ctt ctt ggt ata tat gct 192
Thr Thr Leu Val Cys Cys Ile Ser Cys Ile Leu Leu Gly Ile Tyr Ala
50 55 60
aat gtt cca cta att att ata cca gga atc ggt gaa act att ttt ttt 240
Asn Val Pro Leu Ile Ile Ile Pro Gly Ile Gly Glu Thr Ile Phe Phe
65 70 75 80
act tat aca atc att aaa agt cat tac tat aat tat cat gaa gcg cta 288
Thr Tyr Thr Ile Ile Lys Ser His Tyr Tyr Asn Tyr His Glu Ala Leu
85 90 95
gct att gtt ttg att tca ggt ttg att ttc act ttt att gca tac aca 336
Ala Ile Val Leu Ile Ser Gly Leu Ile Phe Thr Phe Ile Ala Tyr Thr
100 105 110
ccg ttt gct aga gtt cta gac aag tcc ata cca aag aat tta aaa gaa 384
Pro Phe Ala Arg Val Leu Asp Lys Ser Ile Pro Lys Asn Leu Lys Glu
115 120 125
gga ata act att ggt ata ggt ctg ttt atg gcg ttt gtt gga cta caa 432
Gly Ile Thr Ile Gly Ile Gly Leu Phe Met Ala Phe Val Gly Leu Gln
130 135 140
aac agc aaa ata att ata cca aac agg caa agt att gtt gag cta aac 480
Asn Ser Lys Ile Ile Ile Pro Asn Arg Gln Ser Ile Val Glu Leu Asn
145 150 155 160
cac ata aac att tat agt ggg tta gcg ata cta cta cta tta ttt gca 528
His Ile Asn Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Ile Leu Leu Leu Leu Phe Ala
165 170 175
att gtt ata ttt act tta ggg acc aag ttg gct ttc ttt tat aca gta 576
Ile Val Ile Phe Thr Leu Gly Thr Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Thr Val
180 185 190
att att ggt atc att ata tct ttt tta gct ggg att ata aag gtg aaa 624
Ile Ile Gly Ile Ile Ile Ser Phe Leu Ala Gly Ile Ile Lys Val Lys
195 200 205
tat cat ttt tat aat ttt agt ttg cga tca ata gta agc gag aat aat 672
Tyr His Phe Tyr Asn Phe Ser Leu Arg Ser Ile Val Ser Glu Asn Asn
210 215 220
att ttt agt tac agt ttt gat aaa ata ggt cat ttt tct ttt tgg tct 720
Ile Phe Ser Tyr Ser Phe Asp Lys Ile Gly His Phe Ser Phe Trp Ser
225 230 235 240
tta gtg ttc tca ctt act att ttg tta ctg ttt caa aat tta ggt aca 768
Leu Val Phe Ser Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Gln Asn Leu Gly Thr
245 250 255
tta cat gga ttg aaa att aat gat aaa gta aaa ttg tca aga att ttt 816
Leu His Gly Leu Lys Ile Asn Asp Lys Val Lys Leu Ser Arg Ile Phe
260 265 270
aaa atg gtc ggt att act aac ata att tca agc tta ttt ggt gtg agt 864
Lys Met Val Gly Ile Thr Asn Ile Ile Ser Ser Leu Phe Gly Val Ser
275 280 285
tct aca gtt att gca gtc gaa agt tct act gca act cat tca gga gct 912
Ser Thr Val Ile Ala Val Glu Ser Ser Thr Ala Thr His Ser Gly Ala
290 295 300
aaa aca gga aaa gta tct att ttt gta ggt ata atg ttt ctt tta tct 960
Lys Thr Gly Lys Val Ser Ile Phe Val Gly Ile Met Phe Leu Leu Ser
305 310 315 320
ttg ttg ata atg ccc gtt att ata gca ata cct agt tta gtt gta tca 1008
Leu Leu Ile Met Pro Val Ile Ile Ala Ile Pro Ser Leu Val Val Ser
325 330 335
cct atc tta ata att gtt ggc ggt tta atg ttt act aat att aaa gaa 1056
Pro Ile Leu Ile Ile Val Gly Gly Leu Met Phe Thr Asn Ile Lys Glu
340 345 350
tta gat ttt aat gat atg act gaa ttt att cct tgt tat ata aca att 1104
Leu Asp Phe Asn Asp Met Thr Glu Phe Ile Pro Cys Tyr Ile Thr Ile
355 360 365
ata atg ata cca ctt act ttt gat att gca act gga atg gga ttt gga 1152
Ile Met Ile Pro Leu Thr Phe Asp Ile Ala Thr Gly Met Gly Phe Gly
370 375 380
ttt att tca tat gtt cta att aat ttt gta tgc aaa aaa acc gaa cgt 1200
Phe Ile Ser Tyr Val Leu Ile Asn Phe Val Cys Lys Lys Thr Glu Arg
385 390 395 400
tta aat cca att tta ata att att gct tta ctt ttt aca ata aat tta 1248
Leu Asn Pro Ile Leu Ile Ile Ile Ala Leu Leu Phe Thr Ile Asn Leu
405 410 415
gtt tta caa taa 1260
Val Leu Gln
<210> 54
<211> 419
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 54
Met Ile Gly Arg Lys Lys Glu Thr Leu Leu Lys Asn Glu Val Ile Ser
1 5 10 15
Ala Phe Thr Thr Phe Phe Thr Cys Ser Tyr Ile Ile Ile Val Asn Gly
20 25 30
Ile Leu Leu His Gln Ala Gly Met Ser Leu Leu Trp Thr Ile Ile Ala
35 40 45
Thr Thr Leu Val Cys Cys Ile Ser Cys Ile Leu Leu Gly Ile Tyr Ala
50 55 60
Asn Val Pro Leu Ile Ile Ile Pro Gly Ile Gly Glu Thr Ile Phe Phe
65 70 75 80
Thr Tyr Thr Ile Ile Lys Ser His Tyr Tyr Asn Tyr His Glu Ala Leu
85 90 95
Ala Ile Val Leu Ile Ser Gly Leu Ile Phe Thr Phe Ile Ala Tyr Thr
100 105 110
Pro Phe Ala Arg Val Leu Asp Lys Ser Ile Pro Lys Asn Leu Lys Glu
115 120 125
Gly Ile Thr Ile Gly Ile Gly Leu Phe Met Ala Phe Val Gly Leu Gln
130 135 140
Asn Ser Lys Ile Ile Ile Pro Asn Arg Gln Ser Ile Val Glu Leu Asn
145 150 155 160
His Ile Asn Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Ile Leu Leu Leu Leu Phe Ala
165 170 175
Ile Val Ile Phe Thr Leu Gly Thr Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Thr Val
180 185 190
Ile Ile Gly Ile Ile Ile Ser Phe Leu Ala Gly Ile Ile Lys Val Lys
195 200 205
Tyr His Phe Tyr Asn Phe Ser Leu Arg Ser Ile Val Ser Glu Asn Asn
210 215 220
Ile Phe Ser Tyr Ser Phe Asp Lys Ile Gly His Phe Ser Phe Trp Ser
225 230 235 240
Leu Val Phe Ser Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Gln Asn Leu Gly Thr
245 250 255
Leu His Gly Leu Lys Ile Asn Asp Lys Val Lys Leu Ser Arg Ile Phe
260 265 270
Lys Met Val Gly Ile Thr Asn Ile Ile Ser Ser Leu Phe Gly Val Ser
275 280 285
Ser Thr Val Ile Ala Val Glu Ser Ser Thr Ala Thr His Ser Gly Ala
290 295 300
Lys Thr Gly Lys Val Ser Ile Phe Val Gly Ile Met Phe Leu Leu Ser
305 310 315 320
Leu Leu Ile Met Pro Val Ile Ile Ala Ile Pro Ser Leu Val Val Ser
325 330 335
Pro Ile Leu Ile Ile Val Gly Gly Leu Met Phe Thr Asn Ile Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Phe Asn Asp Met Thr Glu Phe Ile Pro Cys Tyr Ile Thr Ile
355 360 365
Ile Met Ile Pro Leu Thr Phe Asp Ile Ala Thr Gly Met Gly Phe Gly
370 375 380
Phe Ile Ser Tyr Val Leu Ile Asn Phe Val Cys Lys Lys Thr Glu Arg
385 390 395 400
Leu Asn Pro Ile Leu Ile Ile Ile Ala Leu Leu Phe Thr Ile Asn Leu
405 410 415
Val Leu Gln
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at 10 is V or L
<400> 55
Lys Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Xaa
1 5 10
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 56
Lys Cys Ser Trp Trp Asn Ala Ser Cys His Leu Gly Asn Asn Gly Lys
1 5 10 15
Ile Cys Thr Val Ser His Glu Cys Ala Ala Gly Cys Asn Leu
20 25 30
<210> 57
<211> 38
<212> PRT
<213> Staphylococcus hominis
<400> 57
Ala Thr Pro Thr Ile Thr Thr Ser Ser Ala Thr Cys Gly Gly Ile Ile
1 5 10 15
Val Ala Ala Ser Ala Ala Gln Cys Pro Thr Leu Ala Cys Ser Ser Arg
20 25 30
Cys Gly Lys Arg Lys Lys
35
Claims (34)
- 하나 이상의 프로바이오틱 (probiotic) 세균 균주의 증점화 국소 제제 및 선택적으로, 프리바이오틱 (prebiotic) 화합물, 보호제, 습윤제, 연화제, 연마제, 염, 및 계면활성제 중 하나 이상을 포함하는 조성물로서;
상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 KCSWWNASCHLGNNGKICTVSHECAAGCNL (서열번호 56) 또는 ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK (서열번호 57)의 서열을 포함하는 펩티드를 생산하고,
상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속의 하나 이상의 세균 균주를 포함하고;
상기 조성물이 피부 또는 점막 질환 또는 장애의 국소 치료를 위해 제제화되는 것이고,
상기 피부 또는 점막 질환 또는 장애가 피부 감염, 점막 감염, 모낭염, 아토피성 피부염, 건선, 유선염, 여드름 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 또는 스타필로코커스 에피더미디스와 스타필로코커스 호미니스의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 스타필로코커스 에피더미디스 균주 MO34, MO38, A11, AMT1, AMT5-C5, 및 AMT5-G6 중 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 스타필로코커스 호미니스 균주 A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, 및 AMT4-D12 중 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 각각의 프로바이오틱 세균 균주가 도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19 중의 어느 하나에 나타난 것들 중 하나에 대응하는 지방산 메틸 에스테르 프로파일 (Fatty Acid Methyl Ester profile)을 나타내는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 서열번호 2, 4, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 및 55 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드를 생산하고, 상기 펩티드가 선택적으로 번역-후 변형되는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 살아 있는 형태로 제공되는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로바이오틱 세균 균주가 동결건조 또는 냉동-건조 또는 분무 건조된 형태로 제공되는 것인, 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 프로바이오틱 세균이 살아 있는 형태로 재구성될 수 있는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는, 피부 또는 점막 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 국소적으로 적용되는, 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 크림, 연고 (ointment), 고약 (unguent), 스프레이, 분말, 오일, 증점화 제제 또는 또는 습포제로 제제화되는, 약학적 조성물.
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- (i) 서열번호 2의 32번 아미노산 내지 61번 아미노산까지의 서열 (KCSWWNASCHLGNNGKICTVSHECAAGCNL) 또는 (ii) 서열번호 4의 29번 아미노산 내지 66번 아미노산까지의 서열 (ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK)의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제23항에 있어서, 상기 벡터가 서열번호 2 또는 4의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 재조합 벡터.
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- 제23항 또는 제24항의 재조합 벡터를 발현하도록 조작된, 단리된 숙주 세포.
- 제28항에 있어서, 상기 숙주 세포가 비-병원성 약독화된 숙주 세포인 것인, 단리된 숙주 세포.
- 제28항의 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드.
- 제28항의 숙주 세포를 포함하는, 피부 또는 점막 질환 또는 장애의 치료용 조성물로서, 상기 피부 또는 점막 질환 또는 장애가 피부 감염, 점막 감염, 모낭염, 아토피성 피부염, 건선, 유선염, 여드름 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물.
- 제29항의 숙주 세포를 포함하는, 피부 또는 점막 질환 또는 장애의 치료용 조성물로서, 상기 피부 또는 점막 질환 또는 장애가 피부 감염, 점막 감염, 모낭염, 아토피성 피부염, 건선, 유선염, 여드름 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물.
- 제30항의 폴리펩티드를 포함하는, 피부 또는 점막 질환 또는 장애의 치료용 조성물로서, 상기 피부 또는 점막 질환 또는 장애가 피부 감염, 점막 감염, 모낭염, 아토피성 피부염, 건선, 유선염, 여드름 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 조성물.
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