BR112017023707B1 - Composição, uso de uma composição, vetor recombinante, microrganismo transgênico, e polipeptídeo recombinante - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE. Métodos e composições compreendendo peptídeos de hogocidina (lantibióticos SH), derivados e variantes são providos. Também são providos métodos e composições compreendendo composições probióticas utilizando cepas de S. hominis e S. epidermidis que produzem hogocidina, peptídeos semelhantes à hogocidina ou outros inibidores de patógenos de pele. Métodos para tratamento de infecções microbianas da pele e dermatite atópica também são providos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade sob o 35 U.S.C. §119 do Pedido Provisório n° de Série 62/157.248, depositado em 5 de maio de 2015 e Pedido Provisório n° de série 62/300.274, depositado em 26 de fevereiro de 2016, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

DECLARAÇÃO REFERENTE A PESQUISA E DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO DO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob Concessão n° R01AI083358, Concessão n° AR067547 e Concessão n° HHSN- 272201000020C, todas concedidas pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é provida como um arquivo intitulado Sequence_ST25.txt, criado em 4 de maio de 2016, com um tamanho de 45 Kb. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[004] A descrição refere-se a métodos e composições para tratamento de infecção e modulação de microflora de pele e mucosa para tratar doenças ou distúrbios que estão relacionados à ou exacerbados pela disbiose.

FUNDAMENTOS

[005] Pequenos peptídeos antimicrobianos catiônicos (PAMs) são antibióticos de ocorrência natural do sistema imune inato. Os PAMs são amplamente distribuídos em animais e plantas e estão entre os mais antigos fatores de defesa do hospedeiro. Seu espectro de atividade inclui bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem como fungos e certos agentes infecciosos. À medida que a resistência dos micróbios patogênicos a antibióticos convencionais aumenta, os pesquisadores estão explorando esses antibióticos endógenos como uma fonte potencial ou novas terapias contra a variedade de doenças infecciosas.

[006] Pacientes com dermatite atópica (DA) apresentam infecções cutâneas recorrentes por Staphylococcus aureus (SA) e disbiose do microbioma cutâneo. A susceptibilidade aumentada à SA tem sido associada à defesa imune inata diminuída, incluindo função de barreira anormal e diminuição da indução de peptídeos antimicrobianos (PAMs), como catelicidina e β-defensinas.

[007] Os sintomas da dermatite atópica, também denominados eczema ou eczema atópico incluem: pele seca que forma uma erupção cutânea; pele escamosa, inchada e vermelha; erupção cutânea no rosto, ou dentro dos joelhos, cotovelos ou pulsos; bolhas que exsudam; alterações na cor da pele após episódios repetidos; pele espessada, rachada, seca, escamosa ou pele que parece coriácea em manchas; e coceira grave (prurido), especialmente à noite, juntamente com a pele ferida, sensível e inchada de coçar. Os sinais e sintomas de dermatite atópica (eczema) variam muito de pessoa para pessoa e podem incluir adicionalmente: manchas vermelhas a acastanhadas, especialmente nas mãos, nos pés, nos tornozelos, nos pulsos, no pescoço, no tórax, nas pálpebras, dentro da curva dos cotovelos e joelhos e, em crianças, no rosto, no couro cabeludo, atrás da cabeça, nas orelhas, nas pernas, nos pés, nos braços, nas mãos e nas nádegas; pequenas protuberâncias elevadas, que podem vazar fluidos e descascar quando são coçadas. A dermatite atópica mais frequentemente começa antes dos 5 anos e pode persistir na adolescência e na idade adulta. Para algumas pessoas, surge periodicamente e depois melhora por um tempo, mesmo por vários anos. As alterações cutâneas provocadas pela dermatite atópica podem facilitar a alta susceptibilidade desses pacientes à colonização e infecções por Staphylococcus aureus.

[008] A disbiose compreende um desequilíbrio na flora cutânea ou mucosa, incluindo a flora intestinal nasal, oral, oftálmica, urogenital, em que espécies como S. aureus ficam sobrerrepresentadas e outras espécies ficam sub-representadas. Geralmente, em uma flora saudável, as bactérias não patogênicas podem secretar inibidores ou simplesmente ocupar todos os nichos disponíveis, assim inibindo diretamente ou excluindo indiretamente os agentes patogênicos que de outra forma seriam capazes de estabelecer estados infecciosos ou promover o desenvolvimento de doenças ou estados semelhantes a doenças, tais como dermatite atópica.

SUMÁRIO

[009] A descrição provê composições e métodos para o tratamento de distúrbios relacionados à disbiose da pele. Esses distúrbios, associados a desequilíbrios na flora normal da pele e crescimento excessivo de agentes patogênicos da pele, como S. aureus, resultam em infecções cutâneas, dermatite atópica e psoríase, entre outras condições. A descrição provê composições e métodos para tratar esses distúrbios restaurando a flora cutânea saudável utilizando peptídeos antimicrobianos derivados de residentes da flora cutânea saudável ou administrando diretamente composições probióticas contendo cepas derivadas de uma flora cutânea saudável ou como a flora sobrevivente rara cultivada a partir da pele de pacientes diagnosticados com uma disbiose floral e que são capazes de matar ou inibir o crescimento de espécies patogênicas na pele ou espécies associadas a um desequilíbrio microbiano semelhante a doenças.

[0010] Especificamente, a descrição provê uma composição tópica espessada compreendendo uma ou mais cepas bacterianas probióticas, preferivelmente do gênero Staphylococcus, e mais preferivelmente compreendendo as cepas descritas de Staphylococcus hominis e Staphylococcus epidermidis. Essas cepas podem ser isoladas a partir de flora cutânea saudável ou como a flora sobrevivente cultivada a partir da pele de pacientes diagnosticados com uma disbiose floral, pelos métodos aqui descritos, e podem ser identificadas pelas sequências peptídicas secretadas, perfis de éster metílico de ácido graxo e/ou organizações de códons de peptídeos antimicrobianos aqui descritas. As cepas probióticas da descrição podem ser providas em forma viva, em forma liofilizada, ou em uma forma reconstituível. A descrição provê adicionalmente uma composição que compreende cepas de Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus hominis como aqui descrita, que pode ser formulada para administração tópica na pele, no couro cabeludo ou na mucosa. A descrição provê adicionalmente uma composição em que as cepas bacterianas probióticas compreendem um ou mais das cepas de S. epidermidis, cepas de Staphylococcus epidermidis MO34, MO38, A11, AMT1, AMT5-C5, e/ou AMT5-G6 e/ou cepas de Staphylococcus hominis A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, e/ou AMT4-D12.

[0011] As composições da descrição podem também compreender meio de cultura condicionado, ou compostos antimicrobianos isolados derivados das cepas aqui descritas, tais como os peptídeos designados aqui como Hogocidinas. A descrição contempla o uso de hogocidinas expressas de modo heterólogo ou sintéticas, derivados de hogocidina ou peptídeos semelhantes a hogocidina. A descrição também provê uma composição que compreende um peptídeo, derivado ou variante de hogocidina e um peptídeo, derivado ou variante de catelicidina. A descrição provê adicionalmente uma composição de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o peptídeo compreende um ou mais D-aminoácidos, um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural e/ou uma ou mais modificações pós-tradução. A descrição provê uma composição de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o peptídeo é substancialmente purificado a partir de outros peptídeos. A descrição provê uma composição de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o peptídeo é parcialmente purificado a partir de outros peptídeos. A descrição provê uma composição em que o peptídeo está presente em um extrato bruto. A descrição provê uma composição de qualquer uma das modalidades anteriores em uma formulação para administração tópica.

[0012] A descrição provê uma composição de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a formulação compreende uma loção, pomada ou spray ou suspensão em creme ou óleo, mas não limitada a esses formatos.

[0013] A descrição provê uma composição de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o peptídeo, derivado ou variante de hogocidina compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 ou 4 compreendendo um aminoácido não natural, SEQ ID NO:2 ou 4 compreendendo um D-aminoácido, ou SEQ ID NO:2 ou 4 compreendendo uma construção de fusão.

[0014] A descrição também provê um método para inibir a propagação e/ou reduzir o risco de infecção com um micróbio compreendendo o contato do micróbio com uma quantidade eficaz de uma composição da descrição. Em uma modalidade, o contato é in vivo. Em uma outra modalidade, o contato in vivo é por administração tópica. A descrição provê adicionalmente um método de tratamento de infecções cutâneas ou mucosas, dermatite atópica, psoríase, acne ou outros distúrbios relacionados à disbiose da pele, aplicando uma quantidade eficaz das composições aqui descritas sobre a pele ou mucosa de um indivíduo em necessidade das mesmas.

[0015] A descrição provê um método de tratamento de dermatite atópica compreendendo o contato de um indivíduo que tem ou suspeita de ter dermatite atópica com uma quantidade eficaz de uma composição probiótica compreendendo uma ou mais das cepas bacterianas aqui descritas. A descrição provê um método de tratamento de dermatite atópica compreendendo o contato de um indivíduo que tem ou suspeita de ter dermatite atópica com uma quantidade eficaz de um peptídeo, derivado ou variante de hogocidina.

[0016] A descrição provê um método de tratamento de dermatite atópica ou disbiose da pele por contato da área afetada com uma composição que compreende cepas bacterianas que secretam hogocidina, firmocidina, peptídeo lantibiótico SH, antimicrobiano SH, peptídeo lantibiótico SE ou antimicrobiano SE, como cepa A9 de Staphylococcus hominis, cepa C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT3 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-G1 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-D12 de Staphylococcus hominis, cepa AMT1 de Staphylococcus epidermidis, cepa SE-A11 de Staphylococcus epidermidis, cepa AMT5-C5 de Staphylococcus epidermidis, e cepa AMT5-G6 deStaphylococcus epidermidis. A descrição provê métodos e composições como descritos acima que compreendem adicionalmente um peptídeo de catelicidina.

[0017] A descrição provê uma composição que compreende uma formulação tópica espessada de uma ou mais cepas bacterianas probióticas e, opcionalmente, um composto prebiótico, um protetor, um umectante, um emoliente, um abrasivo, um sal e/ou um tensoativo; em que a uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem uma ou mais cepas bacterianas do gênero Staphylococcus; e em que a composição é formulada para o tratamento tópico de distúrbios da disbiose da pele, do couro cabeludo ou da mucosa. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis ou uma combinação de Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus hominis. Em uma modalidade adicional, a uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem cepas de Staphylococcus epidermidis MO34, MO38, A11, AMT1, AMT5-C5, e/ou AMT5-G6. Em uma outra modalidade, a uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem cepas de Staphylococcus hominis A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, e/ou AMT4-D12. Ainda em uma outra modalidade, cada cepa bacteriana probiótica demonstra um perfil de éster metílico de ácido graxo correspondente a um dos mostrados em qualquer uma das Figuras 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19. Em uma outra modalidade, uma ou mais cepas bacterianas probióticas produzem um peptídeo com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, e 55 e qualquer combinação das mesmas e em que tal peptídeo é opcionalmente modificado pós-tradução. Em uma outra modalidade, a uma ou mais cepas bacterianas probióticas são providas em uma forma viva. Ainda em uma outra modalidade, as uma ou mais cepas bacterianas probióticas são providas em uma forma liofilizada ou seca por congelamento ou seca por pulverização. Em uma modalidade adicional, a bactéria probiótica pode ser reconstituída em uma forma viva.

[0018] A descrição também provê um método de tratamento de infecções cutâneas ou mucosas, dermatite atópica, psoríase, mastite, acne ou outros distúrbios relacionados à disbiose da pele em humanos ou outros mamíferos, aplicando sobre a pele ou mucosa uma quantidade efetiva de uma composição como descrita aqui e no parágrafo anterior. Em uma modalidade, a composição é aplicada topicamente. Em uma modalidade adicional, a composição é formulada como um creme, pomada, unguento, spray, pó, óleo, formulação espessada ou cataplasma.

[0019] A descrição também provê uma composição que compreende um ou mais de um peptídeo, derivado ou variante de hogocidina, um peptídeo lantibiótico SH, um antimicrobiano SH, um peptídeo lantibiótico SE e/ou um antimicrobiano SE; e que compreende adicionalmente um ou mais espessantes, solventes, emulsificantes ou carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, a composição compreende adicionalmente um peptídeo, derivado ou variante de catelicidina. Ainda em uma modalidade adicional ou alternativa, o peptídeo, derivado ou variante de hogocidina, o peptídeo lantibiótico SH e/ou o péptido lantibiótico SE compreendem um ou mais D-aminoácidos ou aminoácidos de ocorrência não natural. Ainda em uma modalidade adicional, o peptídeo de hogocidina, o peptídeo lantibiótico SH, o antimicrobiano SH, o peptídeo lantibiótico SE ou o antimicrobiano SE é produzido in situ por uma ou mais de cepa A9 de Staphylococcus hominis, cepa C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT3 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-G1 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-D12 de Staphylococcus hominis, cepa AMT1 de Staphylococcus epidermidis, cepa SE-A11 de Staphylococcus epidermidis, cepa AMT5-C5 de Staphylococcus epidermidis, cepa AMT5-G6 de Staphylococcus epidermidis e cepa MO34 de Staphylococcus epidermidis. Ainda em uma outra modalidade de qualquer dos anteriores, o peptídeo é formulado para administração tópica. Ainda em uma outra modalidade, a formulação compreende uma loção, creme de pomada, pó, unguento, óleo ou spray. Em uma outra modalidade de qualquer um dos anteriores, o peptídeo, derivado ou variante de hogocidina compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 ou um fragmento ativo da mesma com atividade antimicrobiana (por exemplo, uma forma madura). Ainda em uma outra modalidade, o um ou mais de um peptídeo, derivado ou variante de hogocidina, um peptídeo lantibiótico SH, um antimicrobiano SH, um peptídeo lantibiótico SE, um antimicrobiano SE e um peptídeo, derivado ou variante de catelicidina é provido como um extrato ou lisado de cepa A9 de Staphylococcus hominis, cepa C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT3 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-G1 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-D12 de Staphylococcus hominis, cepa AMT1 de Staphylococcus epidermidis, cepa SE-A11 de Staphylococcus epidermidis, cepa AMT5-C5 de Staphylococcus epidermidis, cepa AMT5-G6 de Staphylococcus epidermidis e cepa MO34 de Staphylococcus epidermidis.

[0020] A descrição também provê um método para tratar infecção cutânea ou mucosa ou dermatite atópica em um indivíduo que compreende o contato do indivíduo com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um ou mais de um peptídeo, derivado ou variante de hogocidina, um peptídeo lantibiótico SH, um antimicrobiano SH, um peptídeo lantibiótico SE e, opcionalmente, um peptídeo, derivado ou variante de catelicidina. Em uma modalidade, o contato é por administração tópica ou, opcionalmente, contato do indivíduo com um ou mais de lantibiótico SH ou cepas A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, AMT4-D12 de Staphylococcus hominis produtoras de bacteriocina e cepas AMT5-G6 e MO34 de Staphylococcus epidermidis.

[0021] A descrição também provê um vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:2 ou 4, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma com atividade antimicrobiana. Em uma modalidade, o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou 4. Ainda em uma outra modalidade, o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:2 desde cerca do aminoácido 32 até cerca do aminoácido 61. Em uma modalidade adicional, o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:4 desde cerca do aminoácido 29 até cerca do aminoácido 66. Em uma outra modalidade, o vetor compreende um polinucleotídeo que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:1 ou 3 e codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou 4, respectivamente. Ainda em outra modalidade das modalidades anteriores, o vetor compreende um fragmento de SEQ ID NO:1 ou 3. Ainda em outra modalidade de qualquer uma das anteriores, o vetor é um vetor de expressão.

[0022] A descrição também provê uma célula hospedeira projetada para expressar um vetor recombinante da descrição. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira atenuada não patogênica.

[0023] A descrição também provê um polipeptídeo recombinante produzido pela célula hospedeira da descrição. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo recombinante é purificado a partir de uma cultura de células hospedeiras.

[0024] A descrição também provê uma composição compreendendo a célula hospedeira da descrição.

[0025] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e a descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] Figura 1A-D. A razão de Staphylococcus cultivável em relação ao DNA de Staphylococcus é maior na pele lesional da dermatite atópica. Fig. 1A: O total de Staphylococcus spp. cultivável foi contado em uma placa seletiva de ágar de sal de manitol de 49 indivíduos com dermatite atópica (DA) e 30 indivíduos sem DA. Fig. 1B: Os resultados de UFC para o crescimento de S. aureus são mostrados a partir de 30 indivíduos não atópicos e 49 pacientes com dermatite atópica. Fig. 1C: A abundância de DNA de Staphylococcus spp. total foi determinada por PCR quantitativa (qPCR) em DNA de 14 indivíduos não atópicos e 37 atópicos. A UFC relativa (UFCr) foi determinada por comparação com um padrão de UFCs conhecidas de S. epidermidis (ATCC12228). Fig. 1D: A razão de UFC de Staphylococcus spp. vivo para a abundância relativa de Staphylococcus determinada pelo DNA foi calculada em cada local de pele correspondente.

[0027] Figura 2A-C. A pele da dermatite atópica é colonizada por estafilococos coagulase-negativa com baixa frequência de atividade antimicrobiana. Fig. 2A: Estafilococos coagulase-negativa (ECN) com atividade antimicrobiana contra S. aureus foram determinados por um ensaio de alto rendimento de isolados de cultura individual e a proporção (%) de colônias totais que inibiu o crescimento de S. aureus foi determinada. Fig. 2B: A proporção de ECN com atividade antimicrobiana foi determinada a partir dos mesmos indivíduos no dia 1, dia 7 e dia 14. Fig. 2C: A razão de Staphylococcus spp. vivo para a abundância de DNA de Staphylococcus foi determinada a partir dos mesmos indivíduos como na Fig. 2B. *P<0,05, ****P<0,0001. 11 indivíduos atópicos e 11 não atópicos foram selecionados aleatoriamente para análise nos painéis B e C.

[0028] Figura 3A-B. Estafilococos coagulase-negativa antimicrobiano correlacionam-se com a ausência de colonização de S. aureus. Fig. 3A: A proporção de ECN antimicrobiano em cada amostra é plotada contra a abundância de S. aureus cultivada de cada indivíduo. Quadrantes são divididos com base na frequência de ECN antimicrobianos (>50% ou <50%) e detecção de S. aureus viva (<1 UFC/cm2 ou >1 UFC/cm2). A proporção (%) de indivíduos em cada quadrante para o total de indivíduos é mostrada. Fig. 3B: A frequência de ECN antimicrobianos em indivíduos negativos de cultura de S. aureus (branco) e indivíduos positivos de cultura de S. aureus (sólido) é mostrada. Os dados são média ± EP para 29 indivíduos não atópicos e 41 locais não lesionais ou 40 locais lesionais de indivíduos atópicos.

[0029] Figura 4A-B. Diversas espécies bacterianas têm atividade antimicrobiana. As espécies de ECN antimicrobianos ou não antimicrobianos foram identificadas por sequenciamento de DNA de rRNA 16S de comprimento total de colônias isoladas aleatoriamente com e sem atividade antimicrobiana. Fig. 4A: Proporções de espécies de ECN identificadas com atividade antimicrobiana de 5 indivíduos não atópicos. Fig. 4B: Proporções de espécies de ECN identificadas a partir de colônias antimicrobianas e não antimicrobianas isoladas de indivíduos com dermatite atópica. Foram isolados até 48 isolados de ECN de cada indivíduo. A proporção relativa de colônias com ECN antimicrobianos (sólido) e não antimicrobianos (branco) de cada indivíduo com DA é mostrada por gráfico de torta.

[0030] Figura 5A-B. Identificação de peptídeos antimicrobianos de uma cepa de estafilococos coagulase-negativa dentro do microbioma da pele (SH-A9). Fig. 5A. Sequência de aminoácidos e ligações de mono e dissulfeto previstas a partir de dois peptídeos antimicrobianos purificados a partir de S. hominis isolada de pele não atópica. Os peptídeos são denominados Hogocidina-α (SEQ ID NO:2 de aa 32-61) e Hogocidina-β (SEQ ID NO:4 aa 29-66)(lantibiótico SH □ e □). Os pesos moleculares calculados de uma hipotética forma madura de Hogocidina-α [3152,52 (M+H)] e Hogocidina-β [3548,04 (M+H)] são idênticos às massas moleculares observadas [m/z 3152,22 e 3547,71 (M+H), respectivamente]. Fig. 5B mostra curvas de dose- resposta para a atividade antimicrobiana de Hogocidina-α e Hogocidina-β contra S. aureus. A coincubação com um peptídeo antimicrobiano produzido por pele humana (LL-37) mostra atividade sinérgica. Os dados representam a média ± EP dos ensaios em triplicado. A seta mostra concentração inibitória mínima (CIM) de cada PAM, definida como redução de 3 log de bactérias viáveis em comparação com o controle. Dha, 2,3-didesidroalanina; Dhb, (Z)- 2,3-didesidrobutirina.

[0031] Figura 6. Abundância de DNA de S. aureus em pele não atópica, local não lesional e lesional de pele atópica. Foram coletados catorze e 37 suabes de DNA de 30 pacientes normais e 50 com dermatite atópica recrutados, respectivamente. A abundância de DNA de S. aureus foi determinada por qPCR com iniciadores específicos de espécies alvejando o gene femA específico de S. aureus. A UFC relativa (UFCr) de DNA de S. aureus foi determinada por comparação com UFCs conhecidas de S. aureus (ATCC35556). A densidade de bactérias vivas ou DNA bacteriano foi normalizada na área esfregada. DA: dermatite atópica.

[0032] Figura 7A-B. Análise de purificação e espectrometria de PAMs produzidos por S. hominis isolada de pele não atópica (SH-A9). Os PAMs foram purificados por HPLC usando a coluna CapcelPac C8 a partir do sobrenadante de cultura de um isolado antimicrobiano representativo de S. hominis (Fig. 7A). A última etapa de 5 etapas de purificação é mostrada. O painel de inserção representa a atividade antimicrobiana de cada fração no ensaio de difusão radial contra S. aureus. As frações com atividade antimicrobiana foram caracterizadas por MALDI-TOF-MS (Fig. 7B).

[0033] Figura 8. Representação de perdas de aminoácidos na análise MALDI-TOF/TOF guiada por genoma para Hogocidina-β (lantibiótico SH- □ ). A sequência de aminoácidos de Hogocidina-β purificada foi obtida a partir de perdas de aminoácidos no espectro de fragmentação MS/MS da massa precursora 3547,7 m/z. Dha, 2,3-didesidroalanina; Dhb, (Z)-2,3- didesidrobutirina.

[0034] Figura 9A-B. Organização de agrupamentos de genes que codificam precursores de Hogocidina e genes biossintéticos lantibióticos em uma cepa de S. hominis isolada de pele não atópica (SH-A9). Fig. 9A mostra a ordem de precursores lantibióticos (A1 e A2; lantibiótico SH-^ e □) e genes biossintéticos (C, T e M) no genoma S. hominis SH-A9. Fig. 9B lista o gene hipotético, locus do gene e função putativa. Essa cepa de S. hominis contém múltiplas cópias dos agrupamentos de genes relacionados a lantibióticos.

[0035] Figura 10 mostra a metodologia de alto rendimento usada na descrição.

[0036] Figura 11A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. epidermidis MO-34 e MO-38, que foram identificadas pelos métodos dados na presente descrição.

[0037] Figura 12A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. hominis A9 e C2, que foram identificadas pelos métodos dados na presente descrição.

[0038] Figura 13A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. epidermidis A11 e AMT1-A9, que foram identificadas pelos métodos dados na presente descrição.

[0039] Figura 14A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. hominis AMT2-A11 e AMT3-A12, que foram identificadas pelos métodos dados na presente descrição.

[0040] Figura 15A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. hominis AMT4-C2 e AMT4-G1, que foram identificadas pelos métodos dados na presente descrição.

[0041] Figura 16A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. hominis AMT4-D12 e S. epidermidis AMT5-C5, que foram identificadas pelos métodos dados na presente descrição.

[0042] Figura 17A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepa de S. epidermidis AMT5-G6, que foi identificada pelos métodos dados na presente descrição, e cepa de S. hominis C4, que não produz hogocidina.

[0043] Figura 18A-B. Cromatogramas mostrando resultados da análise com FAME de cepas de S. hominis C5 e C6, que não produzem hogocidina.

[0044] Figura 19A. Cromatograma mostrando resultados da análise com FAME de cepa de S. epidermidis MO1, que não produz lantibiótico SE ou antimicrobiano SE.

[0045] Figura 20A-E. O transplante de ECN antimicrobianos reduz a sobrevivência de S. aureus na pele. Fig. 20A: Efeito de S. hominis na sobrevivência de S. aureus em pele de porco. S. hominis A9 viva que produz hogocidina (1x105UFC/cm2) foi comparada aos controles, incluindo a cepa A9 exterminada com UV e lavada, cepas de live S. hominis que não produzem atividade de PAM (C4, C5 e C6) ou creme veículo sozinhas com o ensaio de pele de porco. Os dados representam a média ± EPM de cinco ensaios independentes. Fig. 20B: Efeito do transplante bacteriano na sobrevivência de S. aureus em pele de camundongo. S. aureus foi aplicada a 1x105UFC/cm2 na pele dorsal raspada de camundongos. Após duas horas, o controle (veículo sozinho), cepas ativas de S. hominis (A9), ou inativas (C4, C5 e C6) foram aplicadas em concentrações iguais (1x105UFC/cm2). A recuperação de S. aureus 20 horas após a aplicação de ECN ou controles é mostrada. Os dados representam a média ± EPM de seis camundongos. Fig. 20C: Fluxo de trabalho para transplante autólogo de microbioma humano (AMT) em indivíduos com DA colonizados com S. aureus. Fig. 20D: Caracterização de clones de ECN usados para AMT. A classe antimicrobiana de cada clone foi identificada pelo sequenciamento do genoma integral. Fig. 20E: Efeito do transplante de ECN antimicrobianos na sobrevivência de S. aureus na pele de indivíduos com DA. A sobrevivência de S. aureus foi medida pela contagem de suabes tomados antes do transplante (linha de base) e 24 horas após o tratamento. A diferença em S. aureus entre o veículo e os braços AMT é mostrada como Δ% de UFC de S. aureus. Cepas inativas não têm efeito.

[0046] Figura 21A-C: Genes antimicrobianos hipotéticos identificados em cepas de anti-S. aureus AMT1-A9 (Fig. 21A), AMT2-A12 (Fig. 21B), e AMT3-A12 (Fig. 21C) usados para transplante autólogo de microbioma. O sequenciamento do genoma integral de clones de ECN ativos foi obtida por miSeq e analisada no servidor RAST (rast.nmpdr.org) para identificar a classe antimicrobiana.

[0047] Figura 22A-B: Genes antimicrobianos hipotéticos identificados em cepas de anti-S. aureus AMT4-C2 (Fig. 22A) e AMT4-G1 (Fig. 22B) usados para transplante autólogo de microbioma. O sequenciamento do genoma integral de clones de ECN ativos foi obtida por miSeq e analisada no servidor RAST (rast.nmpdr.org) para identificar a classe antimicrobiana.

[0048] Figura 23A-C: Genes antimicrobianos hipotéticos identificados em cepas de anti-S. aureus AMT4-D12 (Fig. 23A), AMT5-C5 (Fig. 23B), e AMT5-G6 (Fig. 23C) usados para transplante autólogo de microbioma. O sequenciamento do genoma integral de clones de ECN ativos foi obtida por miSeq e analisada no servidor RAST (rast.nmpdr.org) para identificar a classe antimicrobiana.

[0049] Figura 24 mostra a curva de morte dose-dependente do peptídeo antimicrobiano purificado a partir de sobrenadante de cultura de cepa de Staphylococcus epidermidis A11 isolada de pele normal. As espécies bacterianas indicadas (1x105UFC/mL) foram incubadas com várias concentrações de peptídeo antimicrobiano de Staphylococcus epidermidis A11 purificado (compreendendo SEQ ID NO:55) em 50% de caldo Muller- Hinton/50% de PBS a 37°C durante 24 horas. Propionibacterium acnes foram incubadas em 100% de meio clostridial reforçado sob uma condição anaeróbica. S. epiA11, cepa de Staphylococcus epidermidis A11; S. epi12228, cepa de Staphylococcus epidermidis ATCC12228; S. homA9, cepa de Staphylococcus hominis A9; S. aur113, cepa de Staphylococcus aureus 113; P.ac, cepa de Propionibacterium acnes ATCC6919; E.coli, Escherichia coli ATCC25922; P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa ATCC14213.

[0050] Figura 25A-B mostra dados relacionados a um peptídeo antimicrobiano purificado a partir de sobrenadante de cultura de uma cepa de isolado clínico de Staphylococcus epidermidis (cepa A11) por HPLC (A). A fração ativa (Fração 33-34) foi analisada pela massa MALDO-TOF para estimar o peso molecular do peptídeo antimicrobiano ativo (B). O peso molecular observado foi de 3484,90 (m/z). O sequenciamento N-terminal do peptídeo é provido na SEQ ID NO:55.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0051] Como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a “uma sonda” inclui uma pluralidade de tais células e a referência à “célula” inclui referência a uma ou mais células e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica e assim por diante.

[0052] Além disso, o uso de “ou” significa “e/ou”, salvo indicação em contrário. Da mesma forma, “compreendem”, “compreende”, “compreendendo”, “incluem”, “inclui” e “incluindo” são intercambiáveis e não pretendem ser limitativos.

[0053] Deve ser adicionalmente compreendido que, quando as descrições de várias modalidades usam o termo “compreendendo”, os versados na técnica compreenderão que, em alguns casos específicos, uma modalidade pode ser descrita alternativamente usando a expressão “consistindo essencialmente em” ou “consistindo em”.

[0054] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que os entendidos por um versado na técnica à qual pertence esta descrição. Embora quaisquer métodos e reagentes semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática dos métodos e composições descritos, os métodos e materiais exemplificativos são agora descritos.

[0055] Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência na íntegra com o objetivo de descrever e divulgar as metodologias, que são descritas nas publicações, que podem ser usadas em conexão com a descrição aqui contida. Em relação a qualquer termo que seja apresentado em uma ou mais publicações que seja semelhante ou seja idêntico a um termo que tenha sido expressamente definido nesta descrição, a definição do termo expressamente provida nesta descrição controlará em todos os aspectos.

[0056] A dermatite atópica é uma doença de pele crônica comum caracterizada por disfunção da barreira epidérmica e inflamação da pele recorrente. A gravidade desta doença está associada à disbiose do microbioma da pele e à alta susceptibilidade desses pacientes à colonização e infecções por Staphylococcus aureus.

[0057] Um modelo unificador para a etiologia da dermatite atópica surgiu com reconhecimento de que a imunidade é codependente das funções providas pelo epitélio. Por exemplo, a produção de peptídeos antimicrobianos (PAMs) provê atividade desinfetante direta contra patógenos invasores. Na pele saudável, PAMs como catelicidinas e β-defensinas são aumentados após lesão. No entanto, a pele de pacientes com dermatite atópica tem uma capacidade diminuída para produzir certos PAMs e isso está associado a uma taxa aumentada de infecção por S. aureus, um patógeno que deve ser morto por esses PAMs. S. aureus exacerba ainda mais os sintomas de dermatite atópica e leva à disfunção imune, como distorção dos linfócitos TH2, PAMs reduzidos, reações alérgicas exacerbadas e ruptura da barreira da pele.

[0058] Estudos prévios de pacientes com dermatite atópica mostraram que a flora bacteriana presente nesses pacientes é diferente da bactéria encontrada na pele de indivíduos não atópicos. O microbioma de pacientes com dermatite atópica é menos diversificado e tipicamente tem maior abundância de espécies de Staphylococcus. Sem pretender se vincular a qualquer teoria particular, existe a hipótese de que a disbiose do microbioma da pele poderia contribuir para a fisiopatologia dessa doença. Especificamente, sugeriu-se que a diversa comunidade de microrganismos que normalmente compõem o microbioma contribui com a homeostase cutânea. Por exemplo, em camundongos, Staphylococcus epidermidis pode controlar a inflamação após lesões, influenciar o desenvolvimento de células T e induzir a expressão de PAMs. Além disso, o microbioma pode produzir seus próprios PAMs que poderiam sinergizar com os PAMs produzidos pelas células hospedeiras. Portanto, além dos efeitos deletérios da colonização por S. aureus, a disbiose do microbioma na dermatite atópica pode contribuir para a doença por perda de suas funções benéficas.

[0059] Terapias antibióticas existentes não especificamente matam bactérias, o que afeta a homeostase da microflora residente. A microflora desequilibrada contribui para a patogênese de doenças inflamatórias da pele, como dermatite atópica, rosácea e acne vulgar, etc. Esta descrição provê composições e formulações para desinfecção de superfícies ou tratamento de infecções, mas não representa os riscos de segurança de antibióticos não específicos. Além disso, a descrição provê abordagens probióticas em que os indivíduos podem ser providos com cepas vivas de S. hominis ou S. epidermidis que podem produzir os compostos antimicrobianos necessários in situ ao mesmo tempo em que restaura as características de uma flora cutânea saudável.

[0060] Staphylococcus hominis (S. hominis) é um dos principais constituintes da microflora de pele humana saudável. Estudos recentes indicam que S. epidermidis protege a pele humana prevenindo infecções patogênicas, produzindo modulinas solúveis em fenol (PSMs) e antibióticos de moléculas pequenas, denominados “Firmocidina”, que funcionam como compostos antimicrobianos adicionais em pele humana normal (ver, por exemplo, Publ. Pat. U.S. n° 2013/0331384A1, cuja descrição está aqui incorporada por referência). Além disso, o ácido lipoteicoico produzido por S. epidermidis beneficia a pele humana pela supressão da inflamação da pele durante o reparo da ferida. A presente descrição provê o uso de células ou culturas S. epidermidis e/ou S. hominis para restaurar ou intensificar a flora cutânea normal para apoiar a cicatrização de feridas e prevenir a infecção e restaurar a função de barreira da pele.

[0061] Uma limitação do sequenciamento de DNA é que não é possível distinguir entre organismos viáveis e organismos mortos, nos métodos da descrição a abundância microbiana foi avaliada diretamente em indivíduos atópicos e não atópicos por técnicas de quantificação e cultura de DNA. Surpreendentemente, a capacidade relativa de cultivar bactérias vivas em comparação com as medidas de DNA diferiu muito entre os pacientes com dermatite não atópica e atópica. Aproximadamente 10 vezes mais DNA bacteriano relativo às UFCs de bactérias cultivadas foi detectado na pele não atópica em comparação com a pele lesional atópica. Essas observações sugeriram uma menor taxa de sobrevivência de bactérias na pele não atópica do que a pele lesional atópica.

[0062] Uma explicação para a menor taxa de sobrevivência de bactérias na pele não atópica é uma atividade antimicrobiana superficial mais eficaz. PAMs como LL-37 e hBDs-2 e -3 têm níveis mais baixos de expressão na pele inflamada de pacientes atópicos do que a pele inflamada de indivíduos normais, mas essas expressões de PAM são baixas em pele não inflamada. Portanto, a capacidade aumentada da pele normal não inflamada para matar bactérias não é provável devido à expressão desses PAMs de hospedeiro. A alta frequência de ECN antimicrobianos observada na pele não atópica sugere que essas bactérias residentes são importantes para resistir à colonização por patógenos. Sustentando isso, a colonização de S. aureus só foi detectada em indivíduos com baixa frequência de cepas de ECN com atividade antimicrobiana. ECN que poderiam inibir a formação de biofilmes também foram observados na mucosa nasal e inibiram a colonização nasal por S. aureus. A observação da falta de atividade antimicrobiana direta derivada da comunidade de bactérias que reside na pele de pacientes com dermatite atópica define um defeito previamente desconhecido no sistema de defesa inato desses indivíduos.

[0063] Uma tela de alto rendimento para a atividade antimicrobiana em mais de 7500 isolados individuais de estafilococos coagulase-negativa (ECN) cultivados a partir dos suabes de pele de 30 indivíduos controle saudáveis e 50 locais lesionais e não lesionais de pacientes com Dermatite Atópica (DA) identificou vários isolados de ECN com atividade antimicrobiana. Os indivíduos saudáveis apresentaram alta frequência de isolados de ECN com atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (75,26 ± 6,59%), enquanto as bactérias isoladas da pele não lesional e lesional com DA apresentaram significativamente menos atividade [22,83 ± 5,10%, 15,76 ± 4,10%, respectivamente (p<0,0001)]. Notavelmente, indivíduos com baixa frequência de isolados de ECN antimicrobianos também foram colonizados por SA. O sequenciamento de rRNA 16S revelou que a atividade antimicrobiana foi detectada em diversas cepas de ECN, como S. epidermidis, S. hominis, S. warneri, e S. capitis. Dois PAMs procarióticos com pesos moleculares de 3152,2 Da e 3550,7 Da foram identificados usando HPLC, sequenciamento de proteínas por MALDI-TOF-MS2 e sequenciamento do genoma. Adicionalmente, como mostrado em Nakatsuji, T. et al. (2016), Nature Medicine Submitted Manuscript No. NMED-A78395A, apresentado em 29 de março de 2016, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade, ao aplicar isolados funcionais de ECN a sistemas modelo ex vivo, modelos animais e através de transplantes autólogos em seres humanos, mostrou-se que a aplicação de cepas de ECN produz redução em níveis de S. aureus em pele infectada. Por exemplo, a aplicação deste isolado de ECN antimicrobianos à pele de camundongo colonizada por SA foi eficaz na redução da sobrevida de SA em > 90% acima da observada quando foram aplicadas as cepas de ECN com DA. Esses achados sugerem que o microbioma é a primeira linha de defesa contra a SA e que a disbiose na DA tem uma associação funcional importante à colonização de SA.

[0064] Foram identificadas várias espécies de ECN que produziram atividade antimicrobiana contra S. aureus. Algumas cepas laboratoriais de S. epidermidis e S. warneri foram descritas anteriormente para produzir lantibióticos que poderiam inibir o crescimento de outras bactérias, mas não foram detectadas na população em questão. Além disso, várias das espécies de ECN isoladas com base em sua atividade antimicrobiana não foram previamente suspeitas de ter função antimicrobiana. Para compreender melhor estes, identificaram-se dois lantibióticos anteriormente desconhecidos que tiveram atividade potente contra S. aureus e foram altamente sinérgicos com os PAMs LL-37 hospedeiros. O gene que codifica esses lantibióticos era prevalente em indivíduos não atópicos. Essa verificação ilustra o potencial em uma análise posterior da função de defesa do hospedeiro do microbioma saudável da pele humana e pode prover uma abordagem genética para prever a atividade do microbioma. O sequenciamento metagenômico e a correlação com triagem funcional do microbioma podem ser de grande benefício no tratamento de pacientes com dermatite atópica e outras doenças da pele.

[0065] A descrição provê evidências de que a comunidade de bactérias que reside em pele humana normal provê um escudo importante contra S. aureus. Novamente, sem pretender se vincular a qualquer teoria particular, a disfunção neste sistema de defesa antimicrobiana mediado por microbioma pode permitir a colonização da pele por S. aureus em dermatite atópica e exacerbação adicional da doença. Essa observação sugere que as estratégias de bacterioterapia da pele podem ser úteis como método para suprimir S. aureus sem uso de antibióticos farmaceuticamente derivados. Dada a natureza complexa desta doença, a abordagem terapêutica ideal para a dermatite atópica deve incluir direcionar o reparo da barreira epidérmica intrínseca e otimizar as funções de defesa imunológica providas pelo microbioma.

[0066] A descrição também descreve novos peptídeos antimicrobianos (PAMs) a partir de sobrenadante de cultura de um isolado clínico de S. hominis. Esses PAMs são chamados aqui de Hogocidina-α e Hogocidina-β. As hogocidinas exercem atividade antimicrobiana e bactericida contra Staphylococcus aureus (S. aureus), mas não inibem o crescimento de bactérias comensais na pele, como S. epidermidis. Portanto, a descrição provê antibióticos com atividade potente, mas seletiva contra patógenos, e alto perfil de segurança como são encontrados normalmente no microbioma da pele humana, bem como abordagens probióticas para tratar essas condições.

[0067] O termo “antimicrobiano”, tal como aqui usado, significa que o peptídeo destrói, ou inibe ou impede o crescimento ou proliferação de um micróbio (por exemplo, uma bactéria, um fungo e/ou vírus). De modo semelhante, o termo “antiviral”, tal como aqui usado, significa que um peptídeo destrói, ou inibe ou impede o crescimento ou proliferação de um vírus ou uma célula infectada com um vírus. O termo “antitumoral”, tal como aqui usado, significa que um peptídeo impede, inibe o crescimento ou destrói uma célula(s) tumoral(is). Da mesma forma, o termo “antifúngico” significa que um peptídeo impede, destrói ou inibe o crescimento de um fungo.

[0068] Tal como aqui usado, “probiótico” refere-se ao processo de prover culturas microbianas vivas ou atenuadas, ou lisados, liófilos ou extratos de tais culturas, a fim de complementar ou substituir elementos de uma flora cutânea ou mucosa saudável. Um vetor atenuado para dispensação na pele pode incluir um vírus ou bactéria geneticamente modificada para (a) tornar o vetor não patogênico, (b) ter uma patogenicidade reduzida, (c) ser defeituoso na replicação ou (d) ser não antigênico. Outra atenuação é conhecida na técnica. A atenuação é tipicamente realizada eliminando um gene ou interrompendo uma sequência de codificação de gene ou elemento de controle de expressão, de modo que a atenção de (a)-(c) ou (d) seja realizada. Tais técnicas são conhecidas na técnica e inúmeros desses vetores bacterianos e virais atenuados são conhecidos.

[0069] As “hogocidinas” são compostas por dois domínios distintos: um domínio “pró-sequência” N-terminal e o domínio C-terminal da hogocidina madura. A hogocidina-α madura compreende uma sequência de SEQ ID NO:2 desde cerca do aminoácido 32 até cerca do aminoácido 61 (por exemplo, começando em cerca do aminoácido 30, 31, 32 ou 33 da SEQ ID NO:2 e estendendo-se até cerca do aminoácido 59, 60 ou 61 da SEQ ID NO:2). Será prontamente evidente para um versado na técnica que a forma pré-pro de hogocidina-α tem cerca de 61 aminoácidos de comprimento e é processada pós-traducionalmente para prover a forma madura. Com base no sistema de expressão e no organismo, a forma madura pode ser processada de forma ligeiramente diferente dependendo das proteases presentes. Além disso, também será prontamente evidente que a forma pré-pro de hogocidina-α pode ser usada nos métodos, composições e kits da descrição, em que antes ou depois da administração a forma pré-pro pode ser processada in vitro ou in vivo.

[0070] De modo similar, a forma madura de hogocidina-β compreende uma sequência de SEQ ID NO:4 desde cerca do aminoácido 29 até cerca do aminoácido 66 (por exemplo, começando em cerca do aminoácido 27, 28, 29 ou 30 da SEQ ID NO:4 e estendendo-se até cerca do aminoácido 64, 65 ou 66 da SEQ ID NO:4). Será prontamente evidente para um versado na técnica que a forma pré-pro de hogocidina-β tem cerca de 66 aminoácidos de comprimento e é processada pós-traducionalmente para prover a forma madura. Com base no sistema de expressão e no organismo, a forma madura pode ser processada de forma ligeiramente diferente dependendo das proteases presentes. Além disso, também será prontamente evidente que a forma pré-pro de hogocidina-β pode ser usada nos métodos, composições e kits da descrição, em que antes ou depois da administração a forma pré-pro pode ser processada in vitro ou in vivo.

[0071] O polipeptídeo que compreende SEQ ID NO:2 é tipicamente clivado após o aminoácido número 31 de SEQ ID NO:2, no entanto, um versado na técnica reconhecerá que dependendo da enzima usada, do sistema de expressão usado e/ou das condições sob as quais ocorre a clivagem proteolítica do polipeptídeo, o local de clivagem pode variar de 1 a 3 aminoácidos em qualquer direção do aminoácido número 31 de SEQ ID NO:2.

[0072] O polipeptídeo que compreende SEQ ID NO:4 é tipicamente clivado após o aminoácido número 28 de SEQ ID NO:4, no entanto, um versado na técnica reconhecerá que dependendo da enzima usada, do sistema de expressão usado e/ou das condições sob as quais ocorre a clivagem proteolítica do polipeptídeo, o local de clivagem pode variar de 1 a 3 aminoácidos em qualquer direção do aminoácido número 31 de SEQ ID NO:4.

[0073] Embora o código genético seja bem compreendido por um versado na técnica e seja rotina na geração de polinucleotídeos que codificam uma sequência de polipeptídeos desejada, a descrição também provê polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos da descrição. Por exemplo, a descrição provê SEQ ID NO:1 e 3, que codificam os polipeptídeos de SEQ ID NO:2 e 4.

[0074] Tal como aqui usado, o termo “peptídeo de hogocidina” refere-se à forma madura de hogocidinas compreendendo uma cadeia de aminoácidos com cerca de 30 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento e compreende uma sequência como estabelecida nas SEQ ID NO:2 ou 4 ou versões modificadas pós-tradução: SEQ ID NO:2 (do aa 32 ao aa 61) - KCSWWNASCHLGNNGKICTVSHECAAGCNL SEQ ID NO:4 (do aa 29 ao aa 66) - ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK.

[0075] Em uma modalidade, o método provê derivados de hogocidina compreendendo (a) peptídeos que são pelo menos 90% idênticos a um peptídeo de hogocidina de SEQ ID NO:2 ou 4 e com atividade antimicrobiana; (b) formas maduras de (a) que foram processadas pós- tradução; (c) fragmentos de peptídeos de hogocidina com cerca de 15 a 40 aminoácidos de comprimento e com atividade antimicrobiana; (d) proteínas de fusão compreendendo (a)-(c) acima e com atividade antimicrobiana; (e) peptídeos compreendendo qualquer (a), (b), (c) ou (d) em que um ou mais aminoácidos compreendem um D-aminoácido e o peptídeo tem atividade antimicrobiana; e (f) peptídeos retroinversores de qualquer um dos anteriores e com peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades adicionais, o método provê derivados de hogocidina compreendendo resíduos de lantonina ou de metilantionina, ou derivados de hogocidina modificados de tal modo que contenham resíduos de lantonina ou metilantionina. Não é necessário que o análogo, o derivado, a variação ou a variante tenham uma atividade idêntica à atividade do peptídeo de hogocidina a partir do qual o análogo, o derivado, a variação conservativa ou a variante é derivada, desde que tenha alguma atividade antimicrobiana. Em uma outra modalidade, a descrição provê um polipeptídeo de hogocidina compreendendo pelo menos uma diferença de aminoácidos conservadoros em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou 4.

[0076] A descrição também provê um polipeptídeo compreendendo uma sequência de SEQ ID NO:55 na extremidade N-terminal e em que o polipeptídeo tem atividade antimicrobiana e o peso molecular observado foi de 3484,90 (m/z). Em uma outra modalidade, o polipeptídeo é produzido por S. epidermidis A11.

[0077] A descrição também provê composições compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e compreendendo um peptídeo ou derivado de hogocidina substancialmente puro. A descrição também provê composições compreendendo uma formulação probiótica que inclui uma ou mais cepas bacterianas produtoras de hogocidina ou de firmocidina.

[0078] O termo “purificado” tal como aqui usado refere-se a um peptídeo que está substancialmente isento de outras proteínas, lipídios e polinucleotídeos (por exemplo, componentes celulares com os quais um peptídeo produzido in vivo se associaria naturalmente). Tipicamente, o peptídeo é pelo menos 70%, 80% ou, mais comumente, 90% puro em peso. Conforme descrito mais completamente abaixo, a composição pode compreender adicionalmente um peptídeo de catelicidina ou derivado do mesmo.

[0079] Uma “variante” é um peptídeo antimicrobiano (por exemplo, um peptídeo de hogocidina da descrição) que é uma forma alterada de um peptídeo antimicrobiano referenciado. Por exemplo, o termo “variante” inclui um peptídeo antimicrobiano produzido pelo método aqui descrito, no qual pelo menos um aminoácido (por exemplo, de cerca de 1 a 10 aminoácidos) de um peptídeo de referência é substituído por outro aminoácido. O termo peptídeo de “referência” significa qualquer dos peptídeos antimicrobianos da descrição (por exemplo, um polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO:2 e 4 ou uma forma madura do mesmo), a partir do qual uma variante, um derivado, um análogo ou uma variação conservativa é derivada. É incluído no termo “derivado” um peptídeo híbrido que inclui pelo menos uma porção de cada um dos dois peptídeos antimicrobianos de hogocidina. Os derivados podem ser produzidos por adição de um ou alguns (por exemplo, 1 a 5) aminoácidos a um peptídeo antimicrobiano sem inibir completamente a atividade antimicrobiana do peptídeo. Além disso, derivados de C-terminais, por exemplo, ésteres de metila C-terminais, podem ser produzidos e são abrangidos pela descrição.

[0080] A descrição também inclui peptídeos que são variações conservativas desses peptídeos como aqui exemplificado. O termo “variação conservativa”, tal como aqui usado, indica um polipeptídeo no qual pelo menos um aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente, quimicamente ou estruturalmente semelhante. Exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina, norleucina ou metionina por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina e similares. Os aminoácidos hidrófilos neutros que podem ser substituídos um pelo outro incluem asparagina, glutamina, serina e treonina. As variações estruturalmente conservativas incluem a substituição de alanina por serina (e vice-versa), isoleucina por treonina (e vice-versa), arginina por lisina (e vice- versa) e a substituição de qualquer um de tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina por qualquer outro membro desse grupo. O termo “variação conservativa” abrange também um peptídeo com um aminoácido substituído em vez de um aminoácido parental não substituído; tipicamente, os anticorpos criados para o polipeptídeo substituído também se ligam especificamente ao polipeptídeo não substituído.

[0081] Tal como aqui usado, um “lantibiótico SH” refere-se a um composto que compreende um peptídeo modificado pós-tradução produzido por S. hominis que contém opcionalmente uma ou mais porções de lantionina ou metilantionina, e mostra atividade antimicrobiana contra uma ou mais espécies não S. hominis.

[0082] Tal como aqui usado, um “antimicrobiano SH” refere-se a um composto que compreende um composto não lantibiótico produzido ou secretado por S. hominis, que pode opcionalmente compreender um peptídeo não lantibiótico, e que mostra atividade antimicrobiana contra uma ou mais espécies não S. hominis .

[0083] Tal como aqui usado, um “lantibiótico SE” refere-se a um composto que compreende um peptídeo modificado pós-tradução produzido por S. epidermidis que contém opcionalmente uma ou mais porções de lantionina ou metilantionina, e mostra atividade antimicrobiana contra uma ou mais espécies não S. epidermidis. Em uma modalidade, o peptídeo compreende uma sequência de SEQ ID NO:55.

[0084] Tal como aqui usado, um “antimicrobiano SE” refere-se a um composto que compreende um composto não lantibiótico produzido ou secretado por S. epidermidis, que pode opcionalmente compreender um peptídeo não lantibiótico, e que mostra atividade antimicrobiana contra uma ou mais espécies não S. epidermidis.

[0085] As variantes do peptídeo de Hogocidina da descrição podem ser identificadas através da triagem de uma grande coleção, ou biblioteca, de peptídeos aleatórios ou peptídeos de interesse usando, por exemplo, um número de modelos animais, tais como camundongos knockout CRAMP que apresentam susceptibilidade aumentada a infecções cutâneas. As variantes de peptídeo de Hogocidina podem ser, por exemplo, uma população de peptídeos relacionados na sequência de aminoácidos a SEQ ID NO:2 e 4 por terem várias substituições baseadas nessas sequências.

[0086] As bibliotecas de peptídeos incluem, por exemplo, bibliotecas químicas marcadas que compreendem peptídeos e moléculas peptidomiméticas. As bibliotecas de peptídeos também compreendem as geradas pela tecnologia de exibição de fagos. A tecnologia de exibição de fagos inclui a expressão de moléculas peptídicas na superfície do fago, bem como outras metodologias pelas quais um ligante proteico é ou pode ser associado ao ácido nucleico, que o codifica. Os métodos para a produção de bibliotecas de exibição de fagos, incluindo vetores e métodos de diversificação da população de peptídeos, que são expressos, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Smith e Scott, Methods Enzymol. 217:228 257 (1993); Scott and Smith, Science 249:386 390 (1990); e Huse, WO 91/07141 e WO 91/07149). Esses ou outros métodos conhecidos podem ser usados para produzir uma biblioteca de exibição de fagos, que mostra os peptídeos clivados e ensaiados quanto à atividade antibacteriana. Se desejado, a população de peptídeos pode ser testada quanto à atividade e uma população ativa pode ser subdividida e testada para isolar um peptídeo ativo da população. Outros métodos para a produção de peptídeos úteis na descrição incluem, por exemplo, projeto racional e mutagênese com base nas sequências de aminoácidos de um peptídeo de hogocidina como apresentado na SEQ ID NO:2 ou 4, por exemplo.

[0087] Uma variante peptídica quimérica pode ser um mimético peptídico, que é uma estrutura química não aminoácida que imita a estrutura de, por exemplo, um peptídeo de hogocidina de SEQ ID NO:2 ou 4 (ou uma sua forma madura), mas mantém atividade antimicrobiana/antibacteriana. Tal mimético geralmente é caracterizado como apresentando características físicas semelhantes, tais como tamanho, carga ou hidrofobicidade no mesmo arranjo espacial encontrado na contrapartida do peptídeo de hogocidina. Um exemplo específico de um mimético peptídico é um composto em que a ligação amida entre um ou mais dos aminoácidos é substituída, por exemplo, por uma ligação carbono-carbono ou outra ligação bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washington (1995)).

[0088] Os aminoácidos de um peptídeo de hogocidina, variante ou peptidomimético da descrição são selecionados a partir dos vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente, incluindo, a menos que indicado de outra forma, L-aminoácidos e D-aminoácidos. O uso de D-aminoácidos é particularmente útil para aumentar a vida de uma proteína ou peptídeo. Os polipeptídeos que incorporam D-aminoácidos são resistentes à digestão proteolítica. O termo aminoácido também se refere a compostos tais como aminoácidos modificados quimicamente, incluindo análogos de aminoácidos, aminoácidos que ocorrem naturalmente que normalmente não são incorporados em proteínas tais como norleucina e compostos sintetizados quimicamente com propriedades conhecidas na técnica para serem características de um aminoácido, desde que o composto possa ser substituído dentro de um peptídeo de tal modo que retenha a sua atividade biológica. Por exemplo, a glutamina pode ser um análogo de aminoácidos da asparagina, desde que possa ser substituído dentro de um fragmento ativo de um peptídeo de hogocidina, variante e semelhante, de modo que ele retenha sua atividade antimicrobiana/antibacteriana. Outros exemplos de aminoácidos e análogos de aminoácidos estão listados em Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983). Um aminoácido também pode ser um mimético de aminoácidos, que é uma estrutura que apresenta substancialmente o mesmo arranjo espacial de grupos funcionais como um aminoácido, mas não tem necessariamente ambos os grupos “amino” e “-carboxila” característicos de um aminoácido.

[0089] Os polipeptídeos e os peptídeos da descrição podem ser sintetizados por métodos comumente usados tais como aqueles que incluem a proteção de t-BOC ou FMOC de grupos alfa-amino. Ambos os métodos envolvem síntese passo a passo em que um único aminoácido é adicionado em cada etapa a partir do terminal C do polipeptídeo ou peptídeo (Ver, Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). O polipeptídeo e os peptídeos da descrição também podem ser sintetizados pelos métodos bem conhecidos de síntese de peptídeos em fase sólida tais como os descritos por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1962) e Stewart and Young, Solid Phase Peptides Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969, pp. 27 62). Se desejado, os peptídeos podem ser quantificados pela degradação de Edman de fase sólida.

[0090] Usando um sintetizador, um peptídeo de hogocidina (isto é, a forma madura de SEQ ID NO:2 ou 4 pode ser gerado especificamente sem a necessidade de processamento pós-tradução.

[0091] A descrição também inclui polinucleotídeos isolados (por exemplo, DNA, DNAc ou RNA) que codificam o polipeptídeo e os peptídeos da descrição. São incluídos polinucleotídeos que codificam análogos, mutantes, variações conservativas e variantes dos polipeptídeos e peptídeos aqui descritos. O termo “isolado” tal como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente livre de proteínas, lipídeos e outros polinucleotídeos aos quais um polinucleotídeo produzido in vivo é naturalmente associado. Tipicamente, o polinucleotídeo é pelo menos 70%, 80% ou 90% isolado de outra matéria, e métodos convencionais para sintetizar polinucleotídeos in vitro podem ser usados em vez de métodos in vivo.

[0092] Tal como aqui usado, “polinucleotídeo” refere-se a um polímero de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos na forma de um fragmento separado ou como um componente de uma construção genética maior (por exemplo, ligando operacionalmente um promotor a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo da descrição). Inúmeras construções genéticas (por exemplo, plasmídeos e outros vetores de expressão) são conhecidas na técnica e podem ser usadas para produzir os peptídeos da descrição em sistemas isentos de células ou células procarióticas ou eucarióticas (por exemplo, leveduras, insetos ou mamíferos). Tendo em conta a degeneração do código genético, um versado na técnica pode facilmente sintetizar polinucleotídeos que codificam os peptídeos da descrição. Os polinucleotídeos da descrição podem ser facilmente usados em métodos convencionais de biologia molecular para produzir os peptídeos da descrição.

[0093] DNA que codifica os peptídeos de hogocidina, os derivados das variantes dos mesmos podem ser inseridos num “vetor de expressão”. O termo “vetor de expressão” refere-se a uma construção genética tal como um plasmídeo, vírus ou outro veículo conhecido na técnica que pode ser engenheirado para conter um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da descrição. Tais vetores de expressão são tipicamente plasmídeos que contêm uma sequência de promotores que facilita a transcrição da sequência genética inserida em uma célula hospedeira. O vetor de expressão contém tipicamente uma origem de replicação e um promotor, bem como genes que permitem a seleção fenotípica das células transformadas (por exemplo, um gene de resistência aos antibióticos). Vários promotores, incluindo promotores induzíveis e constitutivos, podem ser utilizados na descrição. Tipicamente, o vetor de expressão contém um site de replicon e sequências de controle derivadas de uma espécie compatível com a célula hospedeira.

[0094] A transformação ou transfecção de uma célula hospedeira com um polinucleotídeo da descrição pode ser realizada usando técnicas convencionais bem conhecidas dos versados na técnica. Por exemplo, onde a célula hospedeira é E. coli, as células competentes que são capazes de absorção de DNA podem ser preparadas usando os métodos de CaCl2, MgCl2 ou RbCl conhecidos na técnica. Alternativamente, podem ser usados meios físicos, como eletroporação ou microinjeção. A eletroporação permite a transferência de um polinucleotídeo para uma célula por impulso elétrico de alta tensão. Adicionalmente, os polinucleotídeos podem ser introduzidos em células hospedeiras por fusão de protoplastos, usando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos adequados para a transformação de células eucarióticas, tais como eletroporação e lipofecção, também são conhecidos.

[0095] As “células hospedeiras” englobadas pela descrição são quaisquer células nas quais os polinucleotídeos da descrição podem ser usados para expressar os peptídeos, derivados ou variantes de hogocidina da descrição. O termo também inclui qualquer progênie de uma célula hospedeira. As células hospedeiras, que são úteis, incluem células bacterianas, células fúngicas (por exemplo, células de levedura), células vegetais e células animais. Por exemplo, as células hospedeiras podem ser uma célula eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero, ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução da construção na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano ou eletroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, pode-se indicar: células fúngicas, como levedura; células de insetos, como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais, como CHO, COS ou melanoma de Bowes; células de plantas e similares. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada como compreendida no escopo daqueles com prática na técnica a partir dos ensinamentos aqui oferecidos. Em uma modalidade, uma célula hospedeira pode compreender uma célula bacteriana presente em uma flora bacteriana normal da pele que foi manipulada para expressar ou sobre-expressar um peptídeo de hogocidina ou outro peptídeo antimicrobiano da descrição. Essas células bacterianas projetadas podem então ser usadas como probióticas, de modo que são aplicadas na pele.

[0096] As células hospedeiras podem ser células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, células de mamífero). Em uma modalidade, as células hospedeiras são células de produção de mamíferos adaptadas para crescer em cultura de células. Exemplos de tais células comumente usadas na indústria são células CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluindo Cos; Cos-7), MDCK, 293, 3T3, C127, linhagens celulares de mieloma (especialmente murino), células PC12 e W138. As células de ovário de hamster chinês (CHO) são amplamente usadas para a produção de várias proteínas recombinantes complexas, por exemplo, citocinas, fatores de coagulação e anticorpos (Brasel et al., Blood 88:2004 2012 (1996); Kaufman et al., J. Biol Chem 263: 6352 6362 (1988); McKinnon et al., J Mol Endocrinol 6:231 239 (1991); Wood et al., J. Immunol 145:3011 3016 (1990)). As linhagens celulares mutantes deficientes em di-hidrofolato redutase (DHFR) (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 4220 (1980)) são as linhagens celulares do hospedeiro CHO comumente usadas porque o eficiente sistema de expressão de genes selecionável e amplificável de DHFR permite a expressão de proteína recombinante de alto nível nessas células (Kaufman, Meth Enzymol 185:527 566 (1990)). Além disso, essas células são fáceis de manipular como culturas aderentes ou em suspensão e apresentam uma estabilidade genética relativamente boa. As células CHO e as proteínas recombinantes expressas nelas foram amplamente caracterizadas e aprovadas para uso em indústria clínica por agências reguladoras.

[0097] Os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo e os peptídeos da descrição podem ser isolados a partir de uma célula (por exemplo, uma célula cultivada), ou podem ser produzidos in vitro. Uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de hogocidina de interesse pode ser obtida por: 1) isolamento de uma sequência de DNA de cadeia dupla do DNA genômico; 2) fabricação química de um polinucleótideo de tal modo que codifique o peptídeo de hogocidina de interesse; ou 3) síntese in vitro de uma sequência de DNA de cadeia dupla por transcrição reversa de RNAm isolado de uma célula doadora (isto é, para produzir DNAc). Entre os procedimentos padrão para isolar sequências de DNAc de interesse está a formação de bibliotecas de DNAc contendo plasmídeos ou fagos que são derivadas da transcrição reversa de RNAm em células doadoras que têm um alto nível de expressão genética. Quando usada em combinação com a tecnologia de reação em cadeia da polimerase, mesmo produtos genéticos raros podem ser clonados.

[0098] Qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica para a purificação de proteínas pode ser usado para isolar os peptídeos da descrição. Por exemplo, podem ser usadas separações cromatográficas preparativas e separações imunológicas (tais como aqueles que empregam anticorpos monoclonais ou policlonais). Os peptídeos carreadores podem facilitar o isolamento de proteínas de fusão que incluem os peptídeos da descrição. As etiquetas de purificação podem ser operativamente ligadas a um peptídeo de hogocidina da descrição. Por exemplo, a glutationa-S-transferase (GST) permite a purificação com uma coluna de afinidade com glutationa agarose. Quando a Proteína A ou o domínio ZZ de Staphylococcus aureus é usado como o marcador, a purificação pode ser realizada em uma única etapa usando uma coluna de afinidade IgG-sefarose. O peptídeo pOprF, que é a metade N-terminal da proteína F de membrana externa de P. aeruginosa, pode ser facilmente purificado porque é a proteína proeminente em preparações de membrana externa. Se desejado, os peptídeos de fusão podem ser purificados usando reagentes que são especificamente reativos com (por exemplo, ligam especificamente) o peptídeo de hogocidina do peptídeo de fusão. Por exemplo, anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente ao peptídeo de hogocidina podem ser usados em métodos convencionais de purificação. As técnicas para produzir tais anticorpos são bem conhecidas na técnica.

[0099] Uma construção de fusão compreendendo um polipeptídeo ligado a um peptídeo de hogocidina da descrição pode ser ligada no terminal amino ou carbóxi do peptídeo. Tipicamente, o polipeptídeo que está ligado ao peptídeo de hogocidina é suficientemente aniônico de modo que o peptídeo de hogocidina tenha uma carga líquida neutra ou negativa. O polipeptídeo aniônico pode corresponder em sequência a uma proteína de ocorrência natural ou pode ser totalmente artificial em projeto. Funcionalmente, o polipeptídeo ligado a um peptídeo de hogocidina (o “polipeptídeo carreador”) pode ajudar a estabilizar o peptídeo de hogocidina e protegê-lo de proteases, embora o polipeptídeo carreador não precise mostrar servir tal propósito. De modo semelhante, o polipeptídeo carreador pode facilitar o transporte do peptídeo de fusão. Exemplos de polipeptídeos carreadores que podem ser utilizados incluem peptídeos pré-pro aniônicos e peptídeos de membrana externa aniônica. Exemplos de polipeptídeos carreadores incluem glutationa- S-transferase (GST), proteína A de Staphylococcus aureus, dois domínios sintéticos de ligação a IgG (ZZ) da proteína A, proteína F de membrana externa de Pseudomonas aeruginosa, domínios de transdução de proteína e semelhantes. A descrição não está limitada ao uso desses polipeptídeos; outros polipeptídeos carreadores adequados são conhecidos dos versados na técnica. Em um outro aspecto, uma porção de ligação que compreende um local de clivagem de protease pode estar operacionalmente ligada a um peptídeo de hogocidina ou a uma variante da descrição. Por exemplo, o ligante pode ser operável entre domínios de uma proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo de hogocidina e um polipeptídeo carreador). Uma vez que as sequências de reconhecimento de clivagem de protease geralmente têm apenas alguns aminoácidos de comprimento, a porção de ligação pode incluir a sequência de reconhecimento dentro de sequências de aminoácidos espaçadores flexíveis, tais como GGGGS (SEQ ID NO: 6). Por exemplo, uma porção de ligação incluindo uma sequência de reconhecimento de clivagem para endopeptidase de adenovírus poderia ter a sequência GGGGGGSMFGGAKKRSGGGGGG (SEQ ID NO: 7). Se desejado, a sequência de DNA espaçador pode codificar um local de reconhecimento de proteína para clivagem do polipeptídeo carreador a partir do peptídeo de hogocidina. Exemplos de tais sequências de DNA espaçador incluem, mas não estão limitados a sequências de clivagem de protease, tais como aquela para a protease Fator Xa, as sequências de códon de metionina, triptofano e ácido glutâmico e a sequência pré-pro defensina. O fator Xa é usado para a clivagem proteolítica na sequência de clivagem da protease Fator Xa, enquanto a clivagem química por tratamento com brometo de cianogênio libera o peptídeo na metionina ou resíduos relacionados. Além disso, o produto fundido pode ser clivado por inserção de um códon para triptofano (clivável pelo ácido o-iodosobenzoico) ou ácido glutâmico (clivável por protease de Staphylococcus). A inserção de tais sequências de DNA espaçador não é um requisito para a produção de peptídeos funcionais de hogocidina, tais sequências podem intensificar a estabilidade do peptídeo de fusão. A sequência de pré-pro defensina é carregada negativamente, portanto, de acordo com isso, está previsto dentro da descrição que outras sequências de DNA que codificam peptídeos carregados negativamente também podem ser usadas como sequências de DNA espaçador para estabilizar o peptídeo de fusão.

[00100] A descrição também provê um método para inibir o crescimento de uma bactéria por contato da bactéria com uma quantidade eficaz inibidora de um peptídeo da descrição. O termo “contactar” refere-se a expor a bactéria ao peptídeo para que o peptídeo possa inibir, matar ou lisar bactérias. A descrição também provê um método para inibir a doença ou distúrbio de pele e/ou infecção bacteriana compreendendo colocar sobre ou dentro de um indivíduo uma formulação probiótica compreendendo bactérias que secretam um peptídeo ou molécula antimicrobiana de tal modo que o crescimento do patógeno ou micróbio indesejável seja inibido ou impedido. O contato de um organismo com um peptídeo de hogocidina da descrição pode ocorrer in vitro, por exemplo, adicionando o peptídeo a uma cultura bacteriana para testar a susceptibilidade das bactérias ao peptídeo ou em contato com uma superfície bacteriana contaminada com o peptídeo. Alternativamente, o contato pode ocorrer in vivo, por exemplo, administrando o peptídeo a um indivíduo afetado por uma infecção bacteriana ou suscetível à infecção. Além disso, o contato pode ocorrer por exposição da bactéria a uma formulação probiótica compreendendo cepas bacterianas que produzem o peptídeo de hogocidina ou outros inibidores peptídicos ou não peptídicos do crescimento bacteriano. O contato in vivo inclui tanto parenteral quanto tópico. “Inibir” ou “inibir quantidade eficaz” refere-se à quantidade de peptídeo que é suficiente para causar, por exemplo, um efeito bacteriostático ou bactericida. As bactérias que podem ser afetadas pelos peptídeos da descrição incluem bactérias gram-negativas e gram-positivas. Por exemplo, as bactérias que podem ser afetadas incluem Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes (grupo A), Streptococcus sp. (grupo viridans), Streptococcus agalactiae (grupo B), S. bovis, Streptococcus (espécie anaeróbica), Streptococcus pneumoniae, e Enterococcus sp.; cocos Gram- negativos, tais como, por exemplo, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, e Branhamella catarrhalis; bacilos Gram-positivos tais como Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, P.acne Corynebacterium diphtheriae e espécies Corynebacterium que são difteroides (aeróbicas e anaeróbicas), Listeria monocytogenes, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Escherichia coli, espécies Enterobacter, Proteus mirablis e outras sp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Shigella, Serratia sp., e Campylobacter jejuni. A infecção com uma ou mais dessas bactérias pode resultar em doenças como bacteremia, pneumonia, meningite, osteomielite, endocardite, sinusite, artrite, infecções do trato urinário, tétano, gangrena, colite, gastroenterite aguda, impetigo, acne, rosácea, infecções de feridas, infecções nascidas, fascites, bronquite e uma variedade de abscessos, infecções nosocomiais e infecções oportunistas. Os organismos fúngicos também podem ser afetados pelos peptídeos de hogocidina da descrição e incluem dermatófitos (por exemplo, Microsporum canis e outros Microsporum sp.; e Trichophyton sp. tais como T. rubrum, e T. mentagrophytes), leveduras (por exemplo, Candida albicans, C. Tropicalis, ou outras espécies de Candida), Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis glabrata, Epidermophyton floccosum, Malassezia furfur (Pityropsporon orbiculare, ou P. ovale), Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, e outros Aspergillus sp., Zygomycetes (por exemplo, Rhizopus, Mucor), Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitides, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, e Sporothrix schenckii. O método para inibir o crescimento de bactérias também pode incluir o contato da bactéria com o peptídeo em combinação com um ou mais antibióticos.

[00101] Um peptídeo(s) da descrição pode(m) ser administrado(s) a qualquer hospedeiro, incluindo um animal humano ou não humano, em uma quantidade eficaz para inibir o crescimento de uma bactéria, vírus ou fungo. Assim, os peptídeos são úteis como agentes antimicrobianos, agentes antivirais e/ou agentes antifúngicos. As cepas bacterianas que produzem os peptídeos são úteis como agentes probióticos.

[00102] Qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica pode ser usado para administrar o peptídeo a um indivíduo. Por exemplo, o peptídeo da descrição pode ser administrado parenteralmente por injeção ou por infusão gradual ao longo do tempo. O peptídeo pode ser administrado por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intracavital, tópica ou transdérmica. Em uma outra modalidade, um peptídeo de hogocidina da descrição pode ser formulado para administração tópica (por exemplo, como uma loção, creme, spray, gel, suspensão de óleo ou pomada). Exemplos de formulações no mercado incluem loções tópicas, cremes, sabões, lenços, pós, dispositivos como gaze para cobrir feridas e similares. Pode ser formulado em lipossomas para reduzir a toxicidade ou aumentar a biodisponibilidade ou a estabilidade. Outros métodos para a dispensação do peptídeo incluem métodos orais que implicam a encapsulação do peptídeo em microesferas ou proteinoides, dispensação em aerossol (por exemplo, aos pulmões) ou dispensação transdérmica (por exemplo, por iontoforese ou eletroporação transdérmica). Outros métodos de administração serão conhecidos pelos versados na técnica.

[00103] As preparações para administração parenteral de um peptídeo da descrição incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais (por exemplo, azeite de oliva) e ésteres orgânicos injetáveis tais como o oleato de etila. Exemplos de carreadores aquosos incluem água, solução salina e meios tamponados, soluções alcoólicas/aquosas e emulsões ou suspensões. Exemplos de veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles com base na dextrose de Ringer) e similares. Podem também ser incluídos conservantes e outros aditivos tais como outros agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.

[00104] A descrição provê um método para inibir um distúrbio tópico bacteriano ou associado a fungos ao contactar ou administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ou probiótico da pele da descrição a um indivíduo que tem ou está em risco de ter tal distúrbio. O termo “inibição” significa prevenir ou melhorar um sinal ou sintomas de um distúrbio (por exemplo, uma erupção cutânea, ferida e semelhantes). Exemplos de sinais de doença que podem ser melhorados incluem um aumento no nível sanguíneo de TNF, febre, hipotensão, neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, coagulação intravascular disseminada, síndrome de dificuldade respiratória do adulto, choque e falência de órgãos. Exemplos de indivíduos que podem ser tratados na descrição incluem indivíduos humanos ou animais em risco de, ou aqueles que sofrem, uma toxemia, como endotoxemia resultante de uma infecção bacteriana gram-negativa, intoxicação por veneno ou insuficiência hepática. Outros exemplos incluem os indivíduos com dermatite, bem como aqueles com infecções cutâneas, tais como mastites e especialmente mastites bovinas, ou lesões sujeitas a infecção com bactérias Gram-positivas ou gram- negativas ou um fungo. Exemplos de pacientes candidatos incluem aqueles que sofrem de infecção com E. coli, Hemophilus influenza B, Neisseria meningitides, estafilococos ou pneumococos. Outros pacientes incluem aqueles que sofrem de ferimentos de bala, insuficiência renal ou hepática, trauma, queimaduras, infecções imunocomprometidas (por exemplo, infecções por HIV/SIV/FIV), neoplasias hematopoiéticas, mieloma múltiplo, doença de Castleman ou mixoma cardíaco. Os versados na técnica de medicina podem empregar prontamente critérios convencionais para identificar assuntos apropriados para tratamento de acordo com a descrição.

[00105] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” tal como aqui usado para o tratamento de um indivíduo afetado por uma doença ou distúrbio significa uma quantidade de peptídeo de hogocidina suficiente para melhorar um sinal ou sintoma da doença ou distúrbio. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser medida como a quantidade suficiente para diminuir os sintomas de dermatite ou erupção cutânea de um indivíduo, medindo a frequência de gravidade das feridas cutâneas. Tipicamente, o indivíduo é tratado com uma quantidade de peptídeo de hogocidina suficiente para reduzir um sintoma de uma doença ou distúrbio em pelo menos 50%, 90% ou 100%. Geralmente, a dosagem ideal do peptídeo dependerá do distúrbio e fatores como o peso do paciente, o tipo de infecção bacteriana ou fúngica, o peso, sexo e grau de sintomas. No entanto, as dosagens adequadas podem ser facilmente determinadas por um versado na técnica. Tipicamente, uma dosagem adequada é de 0,5 a 40 mg de peptídeo/kg de peso corporal, por exemplo, 1 a 8 mg de peptídeo/kg de peso corporal.

[00106] Se desejado, um regime de terapia adequado pode combinar a administração de um peptídeo(s) ou composição probiótica da descrição com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (por exemplo, um inibidor de TNF, um antibiótico e semelhantes). O(s) peptídeo(s), outros agentes terapêuticos e/ou antibiótico(s) podem ser administrados, simultaneamente, mas também podem ser administrados sequencialmente. Os antibióticos adequados incluem aminoglicosídeos (por exemplo, gentamicina), beta- lactamas (por exemplo, penicilinas e cefalosporinas), quinolonas (por exemplo, ciprofloxacina) e novobiocina. Geralmente, o antibiótico é administrado em uma quantidade bactericida. No entanto, o peptídeo proporciona um método para aumentar a atividade antibiótica. Tipicamente, o peptídeo de hogocidina e o antibiótico são administrados dentro de 48 horas um do outro (por exemplo, 2 a 8 horas, ou podem ser administrados simultaneamente). Uma “quantidade bactericida” é uma quantidade suficiente para atingir uma concentração sanguínea que cause morte de bactérias no indivíduo que recebe o tratamento. De acordo com a sua definição convencional, um “antibiótico”, tal como aqui usado, é uma substância química que, em soluções diluídas, inibe o crescimento ou mata microrganismos. Também abrangidos por este termo são antibióticos sintéticos (por exemplo, análogos) conhecidos na técnica.

[00107] Os peptídeos da descrição podem ser usados, por exemplo, como conservantes ou esterilizantes de materiais susceptíveis à contaminação microbiana ou viral. Por exemplo, os peptídeos podem ser usados como conservantes em alimentos processados (por exemplo, para inibir organismos como Salmonella, Yersinia, Listeria e Shigella). Se desejado, os peptídeos podem ser usados em combinação com aditivos alimentares antibacterianos, tais como lisozimas. Os peptídeos e/ou probióticos da descrição também podem ser usados como um agente tópico, por exemplo, para inibir Pseudomonas ou Streptococcus ou matar micróbios produtores de odor (por exemplo, Micrococos). A quantidade ideal de um peptídeo de hogocidina da descrição para qualquer aplicação dada pode ser prontamente determinada por um versado na técnica.

[00108] As hogocidinas e/ou probióticos da descrição também são úteis na promoção do reparo de feridas e regeneração de tecidos. As metaloproteinases de matriz (MMPS) são enzimas inflamatórias que degradam proteínas em vários tecidos. Pesquisas científicas recentes mostraram níveis elevados de proteases (por exemplo, MMPs) em exsudato de ferida crônica, o fluido que banha o leito da ferida. Essas proteases em excesso causam degradação de importantes proteínas da matriz extracelular e inativação de fatores vitais de crescimento que são essenciais no processo de cicatrização de feridas. Isso pode contribuir para um ambiente de cura subideal, resultando em cicatrização tardia de feridas.

[00109] As composições aqui providas podem ser usadas simultaneamente com outros agentes antibacterianos incluindo fármacos de sulfa tais como sulfametizol, sulfisoxazol, sulfamonometoxina, sulfametizol, salazosulfapiridina, sulfadiazina de prata e semelhantes; agentes antibacterianos de quinolina tais como ácido nalidíxico, tri-hidrato de ácido pipemídico, enoxacina, norfloxacina, ofloxacina, tosilato de tosufloxacina, cloridrato de ciprofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, esparfloxacina, fleroxacina e semelhantes; antituberculostáticos como isoniazid, etambutol (cloridrato de etambutol), ácido p-aminossalicílico (p-aminossalicilato de cálcio), pirazinamida, etionamida, protionamida, rifampicina, sulfato de estreptomicina, sulfato de canamicina, cicloserina e semelhantes; fármacos de bactérias anti-ácido-álcool resistentes tais como diafenilsulfona, rifampicina e semelhantes; fármacos antivirais tais como idoxuridina, aciclovir, vidarabina, ganciclovir e semelhantes; agentes anti-HIV tais como zidovudina, didanosina, zalcitabina, etanolato de indinavir sulfato, ritonavir e semelhantes; antiespiroquetas; antibióticos como cloridrato de tetraciclina, ampicilina, piperacillina, gentamicina, dibecacina, canendomicina, lividomicina, tobramicina, amicacina, fradiomicina, sisomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, doxiciclina, ampicilina, piperacilina, ticarcilina, cefalotina, ceforfina, cefaloridina, cefaclor, cefloxina, cefroxadina, cefadroxil, cefamandol, cefotoam, cefuroxima, cefotiam, cefotiam hexetil, cefuroxima axetil, cefdinir, cefditoren pivoxil, ceftazidima, cefpiramida, cefsulodina, cefinenoxima, cefpodoxima proxetil, cefpirome, cefozopran, cefepima, cefsulodina, cefenoxima, cefinetazol, cefminox, cefoxitina, cefbuperazona, latamoxef, flomoxef, cefazolina, cefotaxima, cefoperazona, ceftizoxima, moxalactama, tienamicina, sulfazecina, aztreonam ou um sal do mesmo, griseofulvina, grupo lancacidina e semelhantes.

[00110] Em humanos, existem várias classes de peptídeos antimicrobianos conhecidos (PAMs) incluindo α-defensinas, β-defensinas e catelicidinas. As catelicidinas são encontradas em várias espécies de mamíferos. A produção de catelicidinas é induzida em resposta a ferimento epitelial ou desafio infeccioso, ou suprimida pelos mecanismos de virulência de certos patógenos bacterianos, por exemplo, Shigella dysenteriae. A expressão de catelicidina também é efetuada diferencialmente em certos distúrbios inflamatórios crônicos. Na psoríase, os níveis de catelicidina são elevados e a infecção secundária é rara, enquanto que na dermatite atópica, a expressão de catelicidina é deficiente e a superinfecção bacteriana ou viral é comum. Os benefícios terapêuticos da catelicidina foram demonstrados experimentalmente, incluindo a diminuição da colonização bacteriana de feridas cutâneas após a administração tópica e melhoramento da depuração bacteriana pulmonar com sobre-expressão de catelicidina através de transferência de genes virais. Os peptídeos de hogocidina da descrição mostram um efeito sinérgico com catelicidinas. Dessa forma, em algumas modalidades, uma formulação, composição e método compreendem tanto a hogocidina como a catelicidina. Em algumas modalidades, uma formulação tópica (por exemplo, uma loção, pomada ou spray de aerossol) pode compreender tanto um peptídeo de catelicidina como o de hogocidina (ou derivados do mesmo).

[00111] As proteínas de catelicidina são compostas por dois domínios distintos: um domínio “tipo catelina” ou “pró-sequência” N-terminal e o domínio C-terminal do PAM maduro. Os domínios C-terminais das catelicidinas estavam entre os primeiros PAMs de mamíferos para mostrar atividade de morte potente, rápida e de amplo espectro. O termo “tipo catelina” deriva da similaridade da sequência N-terminal com a da catelina, uma proteína de 12 kDa isolada de neutrófilos porcinos que compartilha similaridade com a superfamília de cistatina de inibidores da protease de cisteína.

[00112] As catelicidinas são expressas em neutrófilos e células da medula óssea mieloide e na maioria das fontes epiteliais, e foram os primeiros PAM descobertos em pele de mamífero devido à sua presença no fluido da ferida. No neutrófilo, as catelicidinas são sintetizadas como precursor de comprimento total e direcionadas aos grânulos secundários onde são armazenados. Após a estimulação, a proteína de catelicidina de comprimento total é processada proteoliticamente para desencadear a atividade microbicida do peptídeo C-terminal do domínio tipo catelina.

[00113] Foram caracterizados os 37 aminoácidos C-terminais da catelicidina humana (LL-37). LL-37 foi originalmente chamado de FALL39, denominado para os primeiros 4 aminoácidos N-terminais deste domínio e o número total de resíduos (isto é, 39). O LL-37 é um peptídeo previsto para conter uma hélice alfa anfipática e não tem cisteína, tornando-o diferente de todos os outros antibióticos peptídicos humanos previamente isolados da família defensina, cada um dos quais contém 3 pontes dissulfeto. A catelicidina humana de comprimento total (às vezes chamada de LL-37 de comprimento total) compreende a proteína precursora tipo catelina e o peptídeo LL-37 C-terminal, compreendendo assim 170 aminoácidos (SEQ ID NO:5).

[00114] O polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:5 tem uma série de domínios distintos. Por exemplo, está presente um domínio de sinal que compreende uma sequência apresentada de cerca de 1 a cerca de 29 a 31 de SEQ ID NO:5. O domínio de sinal é tipicamente clivado após o aminoácido número 30 de SEQ ID NO:5, no entanto, um versado na técnica reconhecerá que dependendo da enzima usada, o sistema de expressão usado e/ou as condições sob as quais a clivagem proteolítica do o polipeptídeo ocorre, o local de clivagem pode variar de 1 a 3 aminoácidos em qualquer direção do aminoácido número 30 da SEQ ID NO:5. Outro domínio compreende o domínio N-terminal, chamado de domínio tipo catelina. O domínio tipo catelina compreende a partir aproximadamente do aminoácido 29 (por exemplo, 29 a 31) até cerca do aminoácido 128 (por exemplo, 128 a 131) de SEQ ID NO:5. Ainda outro domínio de SEQ ID NO:5 compreende o domínio C-terminal chamado de LL-37. O domínio LL-37 compreende desde aproximadamente o aminoácido 128 (por exemplo, 128 a 134) até o aminoácido 170 de SEQ ID NO:5. LL-37 compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:5. MKTQRNGHSLGRWSLVLLLLGLVMPLAIIAQVLSYKEAVLRAIDGIN QRSSDANLYRLLDLDPRPTMDGDPDTPKPVSFTVKETVCPRTTQQSPE DCDFKKDGLVKRCMGTVTLNQARGSFDISCDKDNKRFALLGDFFRKS KEKIGKEFKRIVQRIDDFLRNLVPRTES (SEQ ID NO:5)

[00115] Os mecanismos pelos quais os peptídeos antimicrobianos humanos catiônicos matam bactérias e fungos são geralmente através da ligação do peptídeo à membrana celular microbiana, após o que o gradiente e a integridade do próton da membrana são perdidos.

[00116] A vitamina D3 (ou seus análogos) com hogocidina (e em algumas modalidades em combinação com uma catelicidina) pode ser administrada sistematicamente para tratar infecções sistêmicas, em particular pneumonia, sepse e TB. Também pode ser aplicada topicamente para tratar distúrbios infecciosos da pele. Pode ser usada em terapia combinada com antibióticos ou para tratar pacientes imunocomprometidos, como indivíduos HIV positivos. Em combinação com abordagens estimulantes imunológicas, pode tratar terapeuticamente o câncer.

[00117] As composições e os métodos da descrição também podem compreender o tratamento de distúrbios da disbiose da pele mediante a administração de um composto antimicrobiano ou um organismo que secreta um composto antimicrobiano ou a administração de uma composição probiótica compreendendo organismos que suportam a saúde da pele. Em algumas modalidades, a composição inclui um segundo agente ativo (por exemplo, um antibiótico, vitamina D3, catelicidina, etc.).

[00118] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas compreendem um organismo probiótico. Em outras modalidades, o organismo probiótico é uma bactéria. Em outras modalidades, a bactéria compreende um componente da flora da pele normal. Em modalidades adicionais, a bactéria compreende uma cepa de Staphylococcus hominis. Em outras modalidades, a bactéria compreende uma cepa de Staphylococcus epidermidis. Em outras modalidades, o organismo probiótico compreende uma mistura de cepas. Em algumas modalidades, a mistura de cepas compreende múltiplas cepas de S. hominis. Em outras modalidades, a mistura de cepas compreende múltiplas cepas de S. epidermidis. Em outras modalidades, a mistura de cepas compreende uma ou mais cepas de S. hominis e uma ou mais cepas de S. epidermidis. Em algumas modalidades, a composição compreende uma ou mais cepas em adição a S. hominis e/ou S. epidermidis. Em algumas modalidades adcionais, a cepa ou cepas adicional(is) compreende(m) uma ou mais cepas do gênero Staphylococcus, Lactobacillus ou Lactococcus. Por exemplo, formulações específicas podem compreender Staphylococcus hominis ou Staphylococcus epidermidis, em particular, cepa A9 de Staphylococcus hominis , cepa C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT3 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-C2 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-G1 de Staphylococcus hominis, cepa AMT4-D12 de Staphylococcus hominis, cepa AMT1 de Staphylococcus epidermidis, cepa SE-A11 de Staphylococcus epidermidis, cepa AMT5-C5 de Staphylococcus epidermidis, e/ou cepa AMT5-G6 de Staphylococcus epidermidis. Tais formulações tipicamente compreendem quantidades suficientes de células bacterianas para prover uma densidade final de 103-106 CFU/cm2 quando aplicadas à pele de um indivíduo. Tais formulações podem compreender concentrações de cerca de 104 a cerca de 107 CFU/g, ou alternativamente, de 10 a cerca de 105 CFU/g, ou alternativamente, de cerca de 105 a cerca de 109 CFU/g. Tais formulações podem compreender múltiplas cepas de S. hominis e/ou S. epidermidis, e podem compreender adicionalmente Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, e/ou outras espécies ou cepas tais como são conhecidos na técnica para formar uma parte da flora normal saudável cutânea ou mucosa. Em algumas modalidades, as cepas de S. hominis como descritas acima compreendem 100% das células bacterianas em uma formulação. Em algumas modalidades adicionais, S. hominis compreende 90 a 100%, 85 a 95%, 70 a 80%, 75 a 85%, 60 a 70%, 65 a 75%, 50 a 60%, 55 a 65%, 40 a 50%, 45 a 55%, 30 a 40%, 35 a 45%, 20 a 30%, 25 a 35%, 10 a 20%, 15 a 20%, 1 a 10%, 5 a 15%, ou menos de 1% das células bacterianas em uma dada formulação, em que o restante das unidades formadoras de colônias é provido por S. epidermidis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, e/ou outras tais cepas como são conhecidas na técnica para formar uma parte da flora normal saudável cutânea ou mucosa. Em algumas modalidades, as cepas de S. epidermidis como descritas acima compreendem 100% das células bacterianas em uma formulação. Em algumas modalidades adicionais, S. epidermidis compreende 90 a 100%, 85 a 95%, 70 a 80%, 75 a 85%, 60 a 70%, 65 a 75%, 50 a 60%, 55 a 65%, 40 a 50%, 45 a 55%, 30 a 40%, 35 a 45%, 20 a 30%, 25 a 35%, 10 a 20%, 15 a 20%, 1 a 10%, 5 a 15%, ou menos de 1% das células bacterianas em uma dada formulação, em que o restante das unidades formadoras de colônias é provido por S. hominis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, e/ou outras tais cepas como são conhecidas na técnica para formar uma parte da flora normal saudável cutânea ou mucosa. Em algumas modalidades, bactérias diferentes de S. hominis ou S. epidermidis compreendem cerca de 50% ou menos das células bacterianas na formulação. Em algumas modalidades, as ditas bactérias compreendem menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% das células bacterianas dentro de uma dada formulação. Em algumas modalidades, bactérias diferentes de S. hominis e/ou S. epidermidis podem compreender Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, e/ou outras espécies ou cepas tais como são conhecidos na técnica para formar uma parte da flora normal saudável cutânea ou mucosa. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 60% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 40% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 50% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 50% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 40% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 60% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 70% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 30% de S. epidermidis. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 30% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 70% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 80% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 20% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 20% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 80% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem cerca de 90% de S. hominis das cepas listadas acima e cerca de 10% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem mais que cerca de 90% de S. hominis das cepas listadas acima e menos que cerca de 10% de S. epidermidis das cepas listadas acima. Em algumas modalidades, as formulações compreendem menos que cerca de 10% de S. hominis das cepas listadas acima e mais que cerca de 90% de S. epidermidis das cepas listadas acima.

[00119] Tal como aqui usado, um transplante autólogo refere-se ao transplante de cepas bacterianas de um local para outro no mesmo indivíduo ou no mesmo local, independentemente de as cepas serem cultivadas antes da administração ou não. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas obtidas do indivíduo são expandidas em cultura e depois transplantadas de volta ao indivíduo.

[00120] Tal como aqui usado, um transplante alogênico refere-se ao transplante de cepas bacterianas de um indivíduo para outro indivíduo, ou à administração a um indivíduo de uma composição que compreende cepas bacterianas que não foram coletadas sobre ou dentro de seu próprio corpo.

[00121] Essa coleta pode ser realizada com suabe, ppor raspagem, limpeza ou corte e remoção de tecido no qual reside uma das cepas bacterianas como aqui descrito; cultivando e isolando opcionalmente colônias únicas a partir de placas de ágar ou de outro modo usando métodos conhecidos na técnica; cultivando opcionalmente culturas expandidas das bactérias isoladas ou suabes brutos, lenços, raspados, tecidos ou outros isolados em cultura líquida ou sólida de acordo com métodos conhecidos na técnica; colhendo opcionalmente bactérias a partir da dita cultura expandida por centrifugação, filtração, assentamento por gravidade, raspagem ou por outros meios conhecidos na técnica; formulando a bactéria ou o isolado bruto com um espessante, carreador ou excipiente; e contactando o indivíduo com a dita formulação em uma área determinada em necessidade do transplante.

[00122] Tal como aqui usado, um composto prebiótico compreende um polissacarídeo, hidrolisado, sal, extrato de ervas ou qualquer outro composto suficiente para promover o crescimento de uma cepa probiótica associada quando usado em combinação com essa cepa, tal como hidrolisado de levedura em concentrações inferiores a aproximadamente 40% (p/p), celulose microcristalina em concentrações inferiores a cerca de 10% (p/p) e/ou sacarose em concentrações inferiores a cerca de 10% (p/p). Outros exemplos de prebióticos que podem ser adaptados para uso com bactérias cutâneas incluem inulina, glico-oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, lactossacarose, polidextrose, oligossacarídeos de soja e xilo-oligossacarídeos, e os descritos em Gibson, G.R. e Roberfroid, M, (Eds.) Handbook of Prebiotics, CRC press (2008); Roberfroid, M., J. Nutr. 137(3):830S-837 (2007) e Slavin, J. Nutrients 5(4):1417-1435 (2013), cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

[00123] Em algumas modalidades, o método compreende contactar um indivíduo com uma composição probiótica e/ou prebiótica como aqui descrito. Em algumas modalidades, esse contato compreende um transplante autólogo. Em algumas modalidades, esse contato compreende um transplante alogênico, em que os elementos da flora cutânea ou mucosa são transplantados de um segundo indivíduo (o doador) para um primeiro indivíduo em necessidade dos mesmos. Por exemplo, em algumas modalidades, as cepas bacterianas como descritas acima são identificadas e isoladas a partir de um segundo indivíduo, amplificadas em um meio de cultura apropriado em condições tais como são conhecidas na técnica para conduzir ao crescimento bacteriano, seguido pela colheita das células bacterianas, mistura das células colhidas a uma concentração predeterminada de acordo com a descrição com uma formulação predeterminada e aplicação da mistura na área afetada do primeiro indivíduo. Em algumas modalidades, essa composição compreende uma formulação padronizada, tal como uma formulação na qual as concentrações de ingredientes são fixadas e não variam de indivíduo para indivíduo. Em algumas modalidades, a formulação é desenvolvida individualmente para cada indivíduo, com base em critérios que incluem, mas não se limitam a: composição da própria flora cutânea ou mucosa do indivíduo; estado da doença do indivíduo e história de tratamento; natureza e gravidade da condição do indivíduo; natureza e gravidade das infecções simultâneas cutâneas ou mucosas; presença de outros compostos antimicrobianos, incluindo antibióticos sistêmicos no corpo do indivíduos; e outros critérios tais como são conhecidos ou seriam facilmente evidentes para os versados na técnica.

[00124] Em algumas modalidades, a composição compreende um creme, pomada, suspensão de óleo ou unguento em que a bactéria probiótica como descrita acima é incorporada dentro de um hidratante ou emulsão tal como os descritos abaixo e em Nakatsuji, T. et al. (2016), Nature Medicine Submitted Manuscript No. NMED-A78395A, apresentado em 29 de março de 2016. Em algumas modalidades, a composição compreende um emplastro ou cataplasma em que as bactérias são combinadas com um excipiente adequado e são incorporadas dentro de um tecido, matriz de gel ou folha de polímero. Os excipientes e carreadores adequados para administração tópica são conhecidos na técnica e incluem espessantes, emulsificantes, ácidos graxos, polissacarídeos, polióis e polímeros e copolímeros, incluindo, sem limitação, alginato, celulose microcristalina, ácido poliláctico, ácido poliláctico-co-glicólico, petrolato e muitos outros conhecidos na técnica.

[00125] Em algumas modalidades, a composição compreende um meio de cultura bacteriano, um meio de cultura bacteriano condicionado e/ou uma cultura bacteriana. Em algumas modalidades, a composição compreende um filtrado ou sobrenadante de um meio de cultura bacteriano. Em algumas modalidades, a composição compreende um meio de cultura liofilizado. Em algumas modalidades, a composição compreende um meio de cultura condicionado liofilizado produzido a partir de um filtrado ou sobrenadante de um meio de cultura bacteriano.

[00126] Em algumas modalidades, o método como aqui descrito compreende o suporte da saúde da pele de um indivíduo. Em outras modalidades, o método compreende prover um tratamento para a disbiose da pele e distúrbios derivados da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende prover um tratamento para a infecção bacteriana da pele. Em algumas modalidades, o tratamento compreende as etapas de: identificar um indivíduo com disbiose da pele, infecção bacteriana, mastite, queimadura ou outra ferida, dermatite atópica, psoríase ou outra condição crônica da pele; e administrar ao local da condição que necessita de tratamento as composições probióticas como aqui descritas. A determinação do modo apropriado de administração de uma dada formulação (pomada, gel, emplastro, etc.) pode ser feita por um versado na técnica de tratamento de infecções de pele. Em algumas outras modalidades, as composições probióticas são reaplicadas em intervalos programados regularmente. Em algumas modalidades, as composições probióticas são reaplicadas a cada três dias. Em algumas modalidades, as composições probióticas são reaplicadas a cada dois dias. Em algumas modalidades, as composições probióticas são reaplicadas a cada dois dias. Em algumas modalidades, as composições probióticas são reaplicadas todos os dias. Em algumas modalidades, as composições probióticas são reaplicadas mais de uma vez por dia. Em algumas modalidades, as composições probióticas são reaplicadas semanalmente. Em algumas modalidades, as composições probióticas são aplicadas apenas uma única vez.

[00127] Em algumas modalidades, o método compreende prover um tratamento para Staphylococcus aureus, incluindo infecções com S. aureus resistente à meticilina ou oxacilina. Em algumas modalidades adicionais, o método compreende as etapas de: diagnosticar uma infecção com S. aureus; e aplicar ao local da infecção as composições probióticas e/ou prebióticas tal como aqui descritas, em que tais composições são capazes de matar ou inibir o crescimento de S. aureus, seja pela produção de compostos antimicrobianos, pela competição por recursos dentro da biota cutânea ou mucosa, ou por outros meios. A determinação do modo apropriado de administração de uma dada formulação (pomada, gel, emplastro, etc.) pode ser feita por um versado na técnica de tratamento de infecções de pele. Em algumas modalidades adicionais, as composições probióticas são reaplicadas em intervalos programados regularmente (por exemplo, diariamente, a cada dois dias, a cada três dias, semanalmente, etc.). Será evidente para um versado na técnica que, em outras modalidades, podem ser aplicadas etapas semelhantes ou idênticas para prover um tratamento para infecções com Pseudomonas aeruginosa ou infecções derivadas de bactérias do gênero Pseudomonas, Staphylococcus, Propionibacterium, Streptococcus, ou Vibrio, ou patógenos não caracterizados. Em algumas modalidades, o método compreende prover um tratamento para infecções com patógenos desconhecidos ou não caracterizados. Em algumas modalidades, o método compreende prover um tratamento para infecções polimicrobianas. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de tal tratamento a uma queimadura ou ferida. Em algumas modalidades, o método compreende prover um tratamento para uma condição de pele crônica. Em algumas modalidades, a condição é dermatite atópica, psoríase ou outra condição crônica da pele.

[00128] Os exemplos a seguir têm como objetivo ilustrar, mas não limitar a descrição. Embora sejam típicos daqueles que possam ser usados, outros procedimentos conhecidos pelos versados na técnica podem alternativamente ser usados.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00129] Isolamento de cepas ECN e peptídeos antimicrobianos. Foram recrutados pacientes adultos com dermatite atópica e indivíduos não atópicos com idade correspondente. Os dados demográficos são apresentados na Tabela 1. Todas os experimentos envolvendo indivíduos humanos foram realizados de acordo com os protocolos IRB aprovados pela instalação. Tabela 1: Características clínicas de indivíduos com dermatite atópica e indivíduos não atópicos.

*Nenhum DNA vivo de Staphylococcus e Staphylococcus foi detectado em 1 indivíduo com dermatite atópica dentre 50 pacientes recrutados. Portanto, os dados são relatados para 49 indivíduos atópicos. IMC, índice de massa corporal; EASI, área do eczema e índice de gravidade; NJH, National Jewish Health; DP, desvio padrão

[00130] Medições de abundância bacteriana. A coleta de bactérias da superfície viva e DNA bacteriano foi feita a partir de uma área pré-medida (~3*10cm) de pele lesionai na fossa antecubital e a pele não lesionai da parte superior do braço pelo menos 2 cm separada do local lesional. Coleções similares foram obtidas de indivíduos não atópicos em locais de pele idênticos. A pele foi esfregada com suabes pré-umedecidos com caldo de soja tríptico (TSB) para coletar bactérias vivas ou com tampão Tris-EDTA para coletar DNA bacteriano. As amostras de bactérias vivas foram inoculadas em um ágar de sal manitol com gema de ovo para distinguir estafilococos coagulase-negativa (ECN). O DNA genômico total foi extraído com micro kit QIAamp DNA (Qiagen) e a abundância de DNA determinada pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR) com iniciadores específicos de espécies ou gêneros. Nenhum DNA vivo de Staphylococcus e Staphylococcus foi detectado em 1 indivíduo com dermatite atópica dentre 50 pacientes recrutados. Portanto, os dados são relatados para 49 indivíduos com DA.

[00131] Quantificação de DNA bacteriano. Para coletar DNA bacteriano, as áreas pré-medidas similares às usadas para cultura bacteriana foram esfregadas com um suabe pré-umedecido com tampão Tris-EDTA contendo 0,1% de TritonX-100 e 0,05% de Tween-20 (p/v). As células bacterianas foram lisadas pela proteinase K, seguida de acromopeptidase purificada (Wako Chemical) e Ready-Lyse® (epicenter Inc.). O DNA genômico total foi purificado com micro kit QIAamp DNA (Qiagen) e eluído com 50 μL de tampão de eluição. A abundância de DNA bacteriano foi determinada por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) com iniciadores específicos de espécies ou gêneros (Tabela 2). Para determinar a UFC relativa (UFCr) de DNA de Staphylococcus spp., uma curva padrão foi gerada com DNA genômico extraído de padrões derivados de UFC conhecida de S. epidermidis (ATCC12228). A especificidade de todos os pares de iniciadores foi confirmada pela análise da curva de fusão e comparação com curvas padrão. Tabela 2: Sequências de iniciadores de PCR

[00132] Triagem para atividade antimicrobiana. Até 84 colônias individuais de isolados de ECN de cada local da pele foram coletadas aleatoriamente e transferidas para um tubo de agrupamento de 96 poços contendo TSB. Cada placa também recebeu uma cepa não antimicrobiana de S. epidermidis (ATCC1457) como controle negativo, uma cepa antimicrobiana conhecida de Staphylococcus hominis (ver abaixo) como controle positivo e poços em branco sem bactérias. Os ECN foram cultivados a 37°C durante a noite com agitação. O crescimento foi avaliado por OD600. As bactérias foram removidas por centrifugação seguida por filtração estéril com uma membrana de 0,22 μm. A atividade antimicrobiana liberada de cada colônia foi avaliada pela mistura com 1x104 unidades formadoras de colônias (CFU) de S. aureus (ATCC35556). As cepas antimicrobianas foram definidas como as que suprimiram o crescimento de S. aureus após 22 horas para menos de 50% (I50) de crescimento visto em controles negativos. As colônias de ECN insuficientes foram cultivadas a partir de alguns dos indivíduos recrutados. Portanto, dados são relatados para 29 indivíduos não atópicos e 41 locais não lesionais e 40 locais lesionais de indivíduos atópicos. Todos os isolados de ECN foram armazenados congelados para identificação de espécies. Os genes de rRNA 16S de comprimento total foram amplificados a partir de 48 colônias representativas com iniciadores 16S universais, 27-F e 1525-R. Os amplicons foram sequenciados a partir de ambas as extremidades pelo método de Sanger.

[00133] Purificação de PAMs produzidos por S. hominis. O meio condicionado estéril de uma cepa antimicrobiana de S. hominis representativa isolada de um indivíduo saudável foi usado para identificar adicionalmente moléculas com atividade antimicrobiana em pele normal que estavam em baixa abundância em atópicos. A atividade foi precipitada por sulfato de amônio (70% de saturação), dissolvida em H2O e aplicada em um cartucho Sep-Pak (Waters Co). As frações ativas foram eluídas com 30% de acetonitrila em H2O e submetidas à separação em HiTrap® SP (GE Healthcare Life Sciences) e atividade eluída em NaCl 125 mM. A purificação por HPLC de terceira etapa foi feita com CapCel Pak C8 (5 μm, 300 Â, 4,6 x 250 mm) (Shiseido Co.) com um gradiente linear de acetonitrila de 5% a 50% em TFA a 0,1% (v/v) a 0,8 mL/min.

[00134] Identificação de PAMs produzidos por S. hominis. A atividade antimicrobiana foi purificada a partir de meio condicionado estéril de uma cepa antimicrobiana de S. hominis representativa isolada de um indivíduo não atópico. A estrutura secundária das moléculas ativas purificadas foi determinada por MALDI-TOF/TOF, sequenciamento do terminal Edman e sequenciamento do genoma.

[00135] Espectrometria de massa. Espectros de massa de PAMs purificados por HPLC de S. hominis foram gravados usando um instrumento MALDI-TOF/TOF Bruker Autoflex™ Speed (Bruker Daltonics) controlado pelo software flexcontrol (Bruker Daltonics). As análises de espectrometria de massa foram realizadas no modo de refletor de íon positivo usando ácido ciano-4-hidroxicinâmico como uma matriz (CHCA) de 10 mg/mL (Sigma- Aldrich) dissolvida em 50% de acetonitrila (ACN) e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). Os espectros de massa de varredura completa foram adquiridos no modo de refletor de íon positivo para o intervalo de massa de 1000 a 4000 m/z. Cada espectro de massa é o resultado de 750 disparos de laser esperados com a intensidade do laser ajustada em torno de 65% da intensidade total do laser e um ganho do detector intensificado em 8x 4GS/s (conforme selecionado no software Bruker Flex Control). Os espectros MALDI-MS/MS do íon selecionado manualmente m/z 3547, com uma faixa de janela de 5Da, foram adquiridos usando a dissociação induzida por colisão TOF/TOF. Cada espectro de MS/MS é o resultado de 1000 disparos de laser esperados com a intensidade do laser ajustada em torno de 60% selecionada dentro do software e um ganho do detector intensificado em 10x 4GS/s. Os espectros de massa resultantes foram analisados usando o software de análise flexível (Bruker Daltonics). Os espectros foram calibrados para as soluções padrão internas de PepMix.

[00136] Sequenciamento de proteína N-terminal. A sequência de aminoácidos N-terminal de Hogocidina-α purificada (Fração 30, Fig. 7A) foi analisada por 15 ciclos de degradação de Edman no sistema de sequência de proteína Procise® 494HT (Applied Biosystems). Uma forma madura prevista de Hogocidina-α é mostrada na Fig. 5A.

[00137] Sequenciamento de proteínas por análise MALDI-TOF/TOF. Como a região N-terminal de Hogocidina-β de S. hominis (Fração 32, Fig. 8) contém aminoácidos modificados, a sequência não pode ser obtida pela degradação de Edman. Por conseguinte, a sequência de proteína completa desse PAM foi obtida com base na análise MALDI-TOF/TOF guiada pelo genoma. A análise da sequência de nucleotídeos de S. hominis foi realizada em antibióticos e invólucro de análise de metabólitos secundários - plataforma AntiSMASH para identificar agrupamentos de genes de biossíntese de metabólitos secundários. Os resultados do AntiSMASH forneceram um agrupamento de genes para lantipeptídeos com potencial candidato no locus 2050 - 2250 (Fig. 9A). As análises NCBI BlastP de genes envolvidos na síntese e modificação mostram alta homologia com o lantipeptídeo de classe 2. Um peptídeo central com sequência ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK (SEQ ID NO:4 do aa 29 a 66) clivado do peptídeo líder com um local de clivagem GG, comum para lantibióticos de tipo 2. Combinar mineração de genoma e fragmentação MS/MS previu uma forma madura de Hogocidina-β (Fig. 5A).

[00138] Sequenciamento de genoma. Como as sequências de proteínas de PAMs de S. hominis não corresponderam a nenhuma molécula encontrada no banco de dados de genoma existente, foi realizada a sequência de genoma inteiro da cepa antimicrobiana de S. hominis. O DNA genômico foi purificado usando o kit de isolamento de DNA Microbiano UltraClean® (MO Bio). As bibliotecas de sequenciamento de DNA do genoma inteiro foram construídas usando o kit de preparação de amostra de DNA Nextera-XT (Illumina) seguindo o protocolo do fornecedor. A biblioteca final foi sequenciada por sequenciamento final pareado (300 x 300) em um Illumina MiSeq™. As leituras sequenciadas foram novamente montadas usando SPAdes 2.5.1 com k-meros de comprimentos 21, 33, 55, 77 e 127 e a sinalização para “cuidado” ativada. Em todas as estruturas produzidas, uma tradução de seis quadros foi realizada usando o translate Whole Genome Multi Chromosome.pl ([http://] proteomics.ucsd.edu/Downloads/). Esta saída foi então consultada para uma correspondência com o fragmento peptídico identificado através da espectrometria de massa.

[00139] Ensaios antimicrobianos. O ensaio de difusão radial foi realizado usando cepa de S. aureus (ATCC35556) para testar a atividade antimicrobiana de frações purificadas. Resumidamente, o ágar TSB derretido (10 mL) foi misturado com S. aureus (1x106 UFC) e despejado em uma placa de Petri de 10 cm. Dois a quatro μL de amostras de teste foram aplicados em um pequeno poço perfurado na placa de ágar. As placas foram incubadas a 37°C durante a noite para permitir o crescimento visível das bactérias. A atividade antibacteriana foi indicada pela zona limpa (sem crescimento bacteriano) ao redor do poço. A atividade antimicrobiana de Hogocidinas foi avaliada pela incubação de S. aureus (1x105 UFC/mL) com diluições em série de 2 vezes de Hogocidinas purificadas em caldo Mueller-Hinton de meia força (MHB) em PBS a 37 oC durante 24 h. Após a incubação, o número de bactérias viáveis foi medido contando UFC depois de espalhar diluições em série de bactérias 10 vezes em placas de ágar TSB. O MBC foi determinado como uma redução de 3 log (99,9%) de bactérias viáveis após 24 horas de incubação.

[00140] Análise estatística. Os testes t pareados foram usados para comparar amostras lesionais a não lesionais em indivíduos atópicos e testes t independentes foram usados para comparar amostras não atópicas a atópicas. Os modelos mistos longitudinais de frequência de ECN antimicrobianos e a razão de estafilococos vivos para DNA de estafilococos ao longo do tempo também foram adequados. Cada modelo incluiu tipo de lesão, visita e seu período de interação como efeitos fixos, enquanto uma estrutura de simetria composta foi usada para explicar a correlação entre as amostras obtidas do mesmo indivíduo em vários pontos de tempo. A frequência de ECN antimicrobianos usou um link de log cumulativo e distribuição multinomial de porcentagens categorizadas (<= 20, 21-79,>= 80) para representar uma distribuição bimodal. As análises estatísticas foram realizadas usando o software SAS (versão 9.3).

[00141] Sobrevivência de estafilococos é aumentada em dermatite atópica. Para avaliar a relação entre a quantidade de Staphylococcus spp. cultivável/vivo e Staphylococcus spp. incultivável/morto, a densidade bacteriana foi medida tanto pela contagem manual de colônias quanto pela qPCR para o DNA ribossomal 16S específico do gênero. Em consonância com relatórios anteriores, mais Staphylococcus spp. e S. aureus poderiam ser cultivados a partir de pele lesional nos antebraços de pacientes com dermatite atópica do que na pele não lesional desses pacientes ou indivíduos não atópicos (Figuras 1A e 1B). As medidas de abundância de DNA revelaram uma tendência similar (Fig. 1C e 6). Entretanto, os resultados dessas duas técnicas independentes diferiram significativamente entre a pele lesional atópica e a pele não atópica. Na pele lesional de indivíduos com dermatite atópica, a cultura e os resultados baseados em DNA foram semelhantes (Fig. 1D). Em contraste, na pele não atópica, a razão de UFC cultivada para UFC relativa com base na abundância de DNA foi de aproximadamente 0,1, sugerindo uma menor taxa de sobrevivência de bactérias na pele de indivíduos não atópicos.

[00142] Atividade antimicrobiana do microbioma da pele. Os ECN vivos de 30 indivíduos não atópicos (2029 colônias) e 50 indivíduos atópicos (5695 colônias) foram isolados para caracterizar sua influência sobre a sobrevivência de S. aureus . Verificou-se que a maioria dos clones de ECN isolados de indivíduos não atópicos (75,26 ± 35,49%) inibe o crescimento de S. aureus (Fig. 2A). Em contraste, uma minoria de ECN encontrada na pele atópica possuía esta atividade [22,83 ± 32,64% (não lesional) e 15,76 ± 25,92% (lesional)]. Essa diferença na função antimicrobiana de ECN isolado de cada população foi estável e reprodutível ao longo do tempo como observado após suabes repetidos ao longo de um período de 2 semanas (Fig. 2B). A razão aumentada de Staphylococcus cultivável para DNA total de Staphylococcus também foi estável nessa coorte durante um período de 2 semanas (Fig. 2C). Esses dados sugerem que, embora a pele de pacientes com dermatite atópica suporte o crescimento de bactérias ECN, permite a sobrevivência de cepas que diferem na função antimicrobiana daquelas encontradas na pele não atópica.

[00143] Conforme mostrado na Fig. 1, apenas 3% dos indivíduos não atópicos foram positivos para a cultura de S. aureus (>1 UFC/cm2), enquanto 57% dos indivíduos atópicos tiveram cultura positiva para S. aureus. Para determinar se a atividade antimicrobiana detectada a partir de ECN estava relacionada à sobrevivência de S. aureus , a frequência de ECN antimicrobiano para medidas de S. aureus vivo foi comparada (Fig. 3A). Surpreendentemente, todos os pacientes com S. aureus vivo tiveram baixa frequência de ECN antimicrobianos. Além disso, a frequência foi menor no grupo de cultura positiva para S. aureus (>1UFC/cm2) do que no grupo negativo para S. aureus (Fig. 3B). Esses dados sugerem que o ECN antimicrobiano era protetor contra a colonização de S. aureus .

[00144] Identificação de espécies bacterianas antimicrobianas na pele. Para identificar adicionalmente as espécies de ECN com atividade antimicrobiana, um subconjunto aleatório de colônias bacterianas foi selecionado para sequenciamento do gene 16S rRNA de comprimento total. Na pele não atópica, as espécies predominantes de ECN antimicrobiano foram S. epidermidis ou S. hominis (Fig. 4A). Nos indivíduos atópicos, os membros de ECN antimicrobianos incluíram Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus warneri Staphylococcus capitis, S. epidermidis e S. hominis. No entanto, na maioria dos casos, espécies semelhantes foram identificadas dentro de grupos encontrados com função antimicrobiana e não antimicrobiana (Fig. 4B). Essas observações mostram que a atividade antimicrobiana não é previsível em nível de espécie. O crescimento excessivo de cepas de ECN funcionalmente inativas parece ocorrer em pacientes com dermatite atópica.

[00145] Peptídeos com atividade antimicrobiana produzidos pelo microbioma. Para determinar o que foi responsável pela atividade antimicrobiana detectada nas cepas de ECN foram usadas abordagens genéticas e bioquímicas. As bactérias são uma classe de PAMs produzidas por algumas espécies de ECN. No entanto, nenhum DNA que codifica as bacteriocinas conhecidas epiA, pepA, eciA e elkA, foi detectado na pele não atópica (n = 14) por PCR (Tabela 2, sequências de iniciadores). Consequentemente, foram realizados experimentos para purificar e identificar a origem da atividade de uma colônia representativa de S. hominis antimicrobiano isolada de um indivíduo não atópico. A cromatografia de fase reversa revelou dois picos independentes (3152,2 e 3547,7Da) associados à atividade antimicrobiana (Fig. 7). O sequenciamento de aminoácido N- terminal do peptídeo 3152,2Da foi KCSWWNAA. A sequência completa do peptídeo 3547,7Da foi obtida por análise MALDI-TOF/TOF guiada pelo genoma (Fig. 8). O alinhamento da massa e da sequência de aminoácidos à sequência do genoma dessa cepa de S. hominis revelou que esses PAMs novos foram codificados dentro do conjunto de genes de homólogos lanM, lanC e lanT (Fig. 9) e consistentes com identidades como lantibióticos. Como esses PAMs eram anteriormente desconhecidos, eles foram chamados de Hogocidina-α (3152,2Da) e -β (3547,7Da) do japonês “Hogo” que significa “Proteger”. Esses PAMs recém-descritos foram prontamente detectáveis por PCR em 50% de 14 indivíduos não atópicos. As estruturas secundárias previstas de Hogocidina-α e Hogocidina-β maduras são mostradas na Fig. 5A. A concentração bactericida mínima (> 99,9% de extermínio) de Hogocidina-α e -β purificadas contra S. aureus foi de 0,625 μM e 1,25 μM, respectivamente (Fig. 5B), uma atividade mais potente que os PAMs convencionais produzidos na pele humana. Importantemente, a coincubação de cada peptídeo de Hogocidina com a catelicidina de pele humana AMP LL-37 mostrou forte atividade antimicrobiana sinérgica contra S. aureus (Fig. 5B), sugerindo que PAMs derivados de microbioma intensificam a capacidade de defesa imune inata do hospedeiro para resistir a S. aureus.

Exemplo 2

[00146] Análise FAME de cepas bacterianas. Uma vez que a composição lipídica de células bacterianas inteiras (predominantemente as membranas celulares), que pode ser representada pela abundância relativa de ésteres metílicos de ácidos graxos presentes em uma amostra saponificada e metilada de extratos de células bacterianas, é quase exclusiva para cada cepa, as cepas identificadas foram submetidas a análises de Éster Metílico de Ácido Graxo (FAME). As cepas bacterianas foram cultivadas e colhidas de acordo com técnicas padrão. As células foram submetidas a saponificação e metilação antes de serem extraídas para o solvente de fase móvel para cromatografia gasosa. As amostras foram carregadas e executadas de acordo com as instruções do fabricante do instrumento. Os cromatogramas resultantes são mostrados nas Figuras 11 a 19.

Exemplo 3

[00147] Bactérias comensais protegem a pele da colonização por S. aureus. Tendo estabelecido uma associação entre o ECN comensal produtor de PAM e a colonização com S. aureus e tendo identificado peptídeos ativos produzidos por essas cepas, foram realizados experimentos para testar se a presença dessas bactérias reduziria a colonização por S. aureus. Os isolados de ECN clínicos foram aplicados na superfície de pele de porco higienizada em que quantidades definidas de S. aureus foram aplicadas pela primeira vez. Observou-se uma diminuição significativa na sobrevivência de S. aureus após uma única aplicação de S. hominis A9 em uma densidade consistente com estimativas da densidade de bactérias na pele humana normal (1x105UFC/cm2) (Fig. 20A). A aplicação de S. hominis A9 que foi exterminado e enxaguado antes da aplicação, ou o uso de outras cepas de S. hominis que não apresentaram atividade antimicrobiana em cultura não afetou a sobrevivência de S. aureus. Da mesma forma, uma única aplicação de S. hominis ativo nas costas de camundongos em que as quantidades definidas de S. aureus foram aplicadas reduziu a sobrevivência de S. aureus na pele (Fig. 20B). Em contraste, a aplicação de cepas inativas na densidade similar não inibiu S. aureus.

[00148] Finalmente, para testar diretamente a capacidade de bactérias comensais funcionalmente selecionadas e isoladas para inibir S. aureus em humanos, foram realizados experimentos para testar o efeito da aplicação dessas bactérias na pele de indivíduos com DA. Conforme demonstrado anteriormente, as cepas com atividade antimicrobiana eram raras na comunidade total de ECN desses indivíduos, mas poderiam ser identificadas se colônias suficientes fossem triadas. Foram recrutados 5 pacientes com DA que eram positivos para cultura de S. aureus para participar deste estudo. Os clones de ECN com atividade antimicrobiana foram identificados e expandidos para reaplicação planejada ao indivíduo (transplante autólogo). Cada clone selecionado foi sequenciado e grupos de genes relacionados a lantibióticos foram identificados em 5 cepas de S. epidermidis ou S. hominis e os genes de colicina V foram observados em 2 cepas de S. epidermidis e em 1 cepa de S. hominis (Fig. 21-23). De forma duplamente cega, o creme veículo sozinho ou as bactérias formuladas em creme foram aplicadas uma vez na pele de cada braço e, em seguida, S. aureus medido 24 horas depois. As cepas selecionadas foram aplicadas a uma concentração final total de 1 x 105 UFC/cm2, uma densidade semelhante às avaliações anteriores da abundância de bactérias na pele humana normal. Uma única aplicação dessa(s) cepa(s) de ECN definidas de forma funcional e autóloga reduziu significativamente as UFC de S. aureus dentro de 24 horas em comparação com a linha de base (Fig. 20E).

Exemplo 4

[00149] Transplante de ECN antimicrobiano em pele de porco ex vivo e camundongos. A folha de pele de porco congelada foi obtida da Loretta Tomlin Animal Technologies (Livermore, CA) e sanitizada por escova cirúrgica com 3% de cloroxilenol. A folha de pele foi cortada em 2,5 cm x 2,5 cm e enxaguada com PBS estéril mais de 20 vezes para remover o resíduo de cloroxilenol. A pele das costas de camundongos fêmeas C57BL6 de 6 semanas de idade selecionados aleatoriamente foi raspada, tratada com creme depilatório e enxaguada com água pelo menos 24 horas antes da aplicação das bactérias. A pele raspada foi limpa com suabe com álcool duas vezes para remover bactérias originalmente colonizadas. Todos os experimentos envolvendo trabalhos de animais vivos foram feitos de acordo com a aprovação das Diretrizes Institucionais de Cuidados e Uso de Animais.

[00150] S. aureus (ATCC35556) (1*105 UFC/cm2) foram desafiados epicutaneamente na pele de porco (2,5 x 2,5 cm) ou pele dorsal de camundongos (2x2 cm). A cepa de S. hominis A9 isolada de indivíduos sem DA, que produzem lantibióticos Sh (hogocidinas), ou cepas de S. hominis isoladas de pele lesional de indivíduo com DA, que não produziu atividade antimicrobiana em cultura, foi formulada em 1 x 107 UFC/g em hidratante para a pele que foi confirmado não afetar a viabilidade das bactérias. Cepa de S. hominis A9 com atividade anti-S. aureus, cepas de S. hominis A9 exterminado por UV, cepas inativas de S. hominis C4, C5 e C6 (1x105 UFC/10 μL), ou veículo foi subsequentemente aplicado na superfície da pele de porco ou da pele dorsal de camundongos durante 20 horas (Figura 20A e 20B). Lantibiótico purificado (0,5 nmol), meio condicionado de S. hominis A9 (50μL) foram aplicados na superfície da pele de porco sanitizada. A pele de porco foi incubada a 30oC em uma placa de 6 poços. As bactérias vivas foram colhidas com um suabe Catch-All pré-umedecido com TSB da superfície da pele como descrito acima. As bactérias foram suspensas vigorosamente pela cabeça do suabe submetido a vórtice em 1 mL de TSB. A diluição em série de dez vezes da suspensão de bactérias foi espalhada em um ágar Baird-Parker com telurita de gema de ovo para contagem seletiva de S. aureus.S. aureus. S. aureus (uma grande colônia negra com halo) foram distinguidos de S. hominis (uma pequena colônia cinza sem halo) na placa seletiva de ágar.

Exemplo 5

[00151] Transplante de microbioma autólogo. A abordagem do transplante de microbioma autólogo (AMT) para pacientes com DA foi oficialmente aprovada pela US Food and Drug Administration (FDA) e esse protocolo foi arquivado como um pedido de investigação de novo fármaco (IND) (aprovação UCSD n° 15786). Na visita de triagem, os pacientes com DA que são portadores de S. aureus nos locais lesionais da fossa antecubital foram triados. Entretanto, as bactérias da pele foram obtidas por suabe de pele não lesional da parte superior do braço do paciente com DA para testar a cepa de ECN produzindo atividade antimicrobiana contra S. aureus. As espécies de isolados de ECN antimicrobianos foram identificadas pelo sequenciamento de Sanger do gene 16S rRNA de comprimento completo. Os estoques de glicerol dos isolados de ECN foram armazenados a -80°C até a segunda visita quando os pacientes receberam terapia de transplante. Cada cepa de ECN foi expandida individualmente no TSB durante a noite. Cada cepa de ECN foi formulada em 1x107 UFC/g em hidratante para a pele que foi confirmado não afetar a viabilidade das bactérias. Apenas uma única cepa de S. epidermidis ou S. hominis com atividade antimicrobiana foi isolada de 3 pacientes. Nesses casos, foi formulada uma única cepa de ECN. Foram isoladas três e 2 cepas antimicrobianas de S. hominis ou S. epidermidis de 2 pacientes com DA (Figura 20D). Nesses casos, uma UFC igual de cada ECN foi formulada na concentração total de 107 UFC/g. Na segunda visita, a área envolvida foi medida e a UFC basal de S. aureus vivo em locais lesionais de ambos os antebraços foi quantificada como descrito acima. Um braço foi tratado com formulação AMT a 10 mg/cm2 para obter 1 x 105 UFC/cm2 de ECN. O outro braço recebeu apenas uma quantidade igual de hidratante. Todo o tratamento foi realizado de forma duplo cego e não cego após a análise de todos os resultados. Os indivíduos evitaram tomar banho, se molhar, exercitar ou aplicar qualquer produto tópico em seus braços e usar uma camisa limpa e de mangas compridas para evitar a contaminação cruzada do ECN aplicado ao outro braço até a próxima visita. Na terceira visita, a UFC de S. aureus na área envolvida foi medida. A diferença na sobrevivência de S. aureus entre o veículo e os braços com AMT foi calculada como [AMT (x h) - Veículo (% hrs)]/ AMT (Linha de base) para obter Δ% UFC S. aureus (% = 0 h ou 24 h) (Figura 20E).

[00152] Análise estatística. Para todos os experimentos, foram usadas pelo menos três ou mais repetições biológicas, e estas são indicadas nas legendas da Figura. Para todos os experimentos com camundongos, pelo menos seis camundongos foram usados por grupo de tratamento. Portanto, para as diferenças relatadas, o tamanho da amostra usada deu poder suficiente para a confiabilidade. Testes t pareados (bicaudais) foram usados para comparar amostras lesionais a não lesionais em indivíduos com DA e testes t independentes (bicaudais) foram usados para comparar amostras não DA com DA. Para variáveis não normalmente distribuídas, como ECN com Sh- antibiótico-a (%), foram usadas abordagens não paramétricas, como testes de Wilcoxon-Mann-Whitney para amostras não DA para DA e teste dos postos sinalizados de Wilcoxon para amostras lesionais a não lesionais dentro de indivíduos com DA. Os modelos mistos longitudinais de frequência de ECN antimicrobianos e a razão de estafilococos vivos para DNA de estafilococos ao longo do tempo também foram adequados. Cada modelo incluiu tipo de lesão, visita e seu período de interação como efeitos fixos, enquanto uma estrutura de simetria composta foi usada para explicar a correlação entre as amostras obtidas do mesmo indivíduo em vários pontos de tempo. A frequência de ECN antimicrobianos usou um link de log cumulativo e distribuição multinomial de porcentagens categorizadas (<= 20, 21-79,>= 80) para representar uma distribuição bimodal. As análises estatísticas foram realizadas com software SAS (versão 9.3) e software R (versão 3.1.1).

Exemplo 6

[00153] Transplante alogênico. 105 UFC/g de cepas SH-A9, SH-C2, SE-A11, AMT1, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4-G1, AMT4-D12, AMT5- C5, AMT5-G6 e/ou SE-MO34 são formulados em hidratante para a pele que é confirmado não afetar a viabilidade das bactérias. Os indivíduos para tratamento são identificados com base na existência de Dermatite Atópica e/ou infecção ativa de S. aureus. Os indivíduos são instruídos para evitar banhos, se molhar, exercício ou aplicação de produtos tópicos na área afetada por três dias. Os pacientes em conformidade apresentam reduções significativas nos níveis de S. aureus na área tratada após 7 dias (>/= 3 log de redução na contagem de colônias de S. aureus recuperável). Os pacientes em conformidade apresentam reduções clinicamente observáveis nos sintomas de infecção por S. aureus e/ou dermatite atópica que continuam pelo menos 14 dias após o tratamento inicial.

Exemplo 6

[00154] Purificação de PAMs produzidos por S. epidermidis. O meio condicionado estéril de uma cepa antimicrobiana de S. epidermidis A11 representativa foi usado para identificar adicionalmente moléculas com atividade antimicrobiana em pele normal que estavam em baixa abundância em atópicos. A atividade foi precipitada por sulfato de amônio (70% de saturação), dissolvida em H2O e aplicada em um cartucho Sep-Pak (Waters Co). As frações ativas foram eluídas com 40% de acetonitrila em H2O e submetidas à separação em HiTrap® SP (GE Healthcare Life Sciences) e atividade eluída em NaCl 500 mM. A purificação por HPLC de terceira etapa foi feita com CapCel Pak C8 (5 μm, 300 Â, 4,6 x 250 mm) (Shiseido Co.) com um gradiente linear de acetonitrila de 5% a 50% em TFA a 0,1% (v/v) a 0,8 mL/min.

[00155] Identificação de PAMs produzidos por S. epidermidis. A atividade antimicrobiana foi purificada a partir de meio condicionado estéril de uma cepa antimicrobiana de S. epidermidis A11 representativa isolada de um indivíduo não atópico. As características da molécula ativa purificada foram determinadas por MALDI-TOF/TOF e sequenciamento do terminal de Edman.

[00156] Espectrometria de massa. Espectros de massa de PAMs purificados por HPLC de S. epidermidis A11 foram gravados usando um instrumento MALDI-TOF/TOF Bruker Autoflex™ Speed (Bruker Daltonics) controlado pelo software flexcontrol (Bruker Daltonics). As análises de espectrometria de massa foram realizadas no modo de refletor de íon positivo usando ácido ciano-4-hidroxicinâmico como uma matriz (CHCA) de 10 mg/mL (Sigma-Aldrich) dissolvida em 50% de acetonitrila (ACN) e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). Os espectros de massa de varredura completa foram adquiridos no modo de refletor de íon positivo para o intervalo de massa de 1000 a 6000 m/z. Cada espectro de massa é o resultado de 750 disparos de laser esperados com a intensidade do laser ajustada em torno de 65% da intensidade total do laser e um ganho do detector intensificado em 8x 4GS/s (conforme selecionado no software Bruker Flex Control). Os espectros de massa resultantes foram analisados usando o software de análise flexível (Bruker Daltonics). Os espectros foram calibrados para as soluções padrão internas de PepMix.

[00157] Sequenciamento de proteína N-terminal. A sequência de aminoácidos N-terminal de Hogocidina-α purificada (Frações 33-34, Fig. 25A) foi analisada por 15 ciclos de degradação de Edman no sistema de sequência de proteína Procise® 494HT (Applied Biosystems). A sequência N-terminal é provida na SEQ ID NO:55.

[00158] Foram descritas várias modalidades da invenção. No entanto, será entendido que podem ser feitas várias modificações sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Consequentemente, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (22)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma formulação tópica espessada de uma ou mais cepas bacterianas probióticas e, opcionalmente, um composto prebiótico, um protetor, um umectante, emoliente, abrasivo, sal e/ou tensoativo; em que as uma ou mais cepas bacterianas probióticas produzem um peptídeo compreendendo a sequência de (i) SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido 32 até o aminoácido 61 e/ou (ii) SEQ ID NO: 4 desde o aminoácido 29 até o aminoácido 66; em que as uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem uma ou mais cepas bacterianas do gênero Staphylococcus; e em que a composição é formulada para o tratamento tópico de distúrbios da disbiose da pele, couro cabeludo ou mucosa.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis ou uma combinação de Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus hominis.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem cepas de Staphylococcus epidermidis MO34, MO38, A11, AMT1, AMT5-C5 e/ou AMT5-G6.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que uma ou mais cepas bacterianas probióticas compreendem as cepas A9, C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT2, AMT3, AMT4-C2, AMT4- G1 e/ou AMT4-D12 de Staphylococcus hominis.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo é modificado pós-translacionalmente.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais cepas bacterianas probióticas são providas em uma forma viva.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais cepas bacterianas probióticas são providas em uma forma liofilizada ou secada por pulverização ou por congelamento.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a bactéria probiótica pode ser reconstituída em uma forma viva.

9. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para tratar infecções de pele ou mucosas, dermatite atópica, psoríase, mastite, acne ou outros distúrbios relacionados à disbiose da pele em seres humanos ou outros mamíferos, em que o uso compreende aplicar à pele ou mucosa uma quantidade eficaz da composição.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada topicamente.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição é formulada como um creme, pomada, unguento, pulverização, pó, óleo, formulação espessada ou cataplasma.

12. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um peptídeo de catelicidina.

13. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo compreende um ou mais D- aminoácidos ou aminoácidos que não ocorrem naturalmente.

14. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da sequência de (i) SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido 32 até o aminoácido 61 e/ou (ii) SEQ ID NO: 4 desde o aminoácido 29 até o aminoácido 66.

15. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou 4.

16. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da sequência de (i) SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido 32 até o aminoácido 61 e/ou (ii) SEQ ID NO: 4 desde o aminoácido 29 até o aminoácido 66.

17. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de ser engenheirado para expressar um vetor recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 14-16.

18. Microrganismo transgênico de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o microrganismo transgênico é um microrganismo transgênico atenuado não patogênico.

19. Polipeptídeo recombinante, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo microrganismo transgênico como definido na reivindicação 17.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o microrganismo transgênico como definido na reivindicação 17.

21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o microrganismo transgênico como definido na reivindicação 18.

22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 19.

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