CN111465401A - 使用人工细菌定殖来预防金黄色葡萄球菌的药物组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作药物，特别是用于预防金黄色葡萄球菌定殖的药物组合物，其包含至少一种棒状杆菌属物种、巴氏葡萄球菌和任选的表皮葡萄球菌。

Description

使用人工细菌定殖来预防金黄色葡萄球菌的药物组合物和 方法
技术领域
本发明涉及预防金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌定殖。
本发明还涉及包含棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)和葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)的至少一种的组合物(例如药物组合物)和相关方法，所述组合物和方法特别与预防金黄色葡萄球菌的细菌定殖相关。
背景技术
金黄色葡萄球菌是人感染的主要原因。它引起多种病理学，包括皮肤和软组织感染、心内膜炎和败血症。虽然金黄色葡萄球菌可以无症状地定殖在皮肤、粘膜和胃肠道，但无症状携带与内源性金黄色葡萄球菌感染的风险增加有关，特别是在外科手术和透析患者中。无症状携带者也是金黄色葡萄球菌传播的储存者，其增加了社区和医院感染的风险。事实上，在任何给定的时间，估计有30％的人群在前鼻孔携带金黄色葡萄球菌，这是金黄色葡萄球菌定殖的主要部位。
为了降低金黄色葡萄球菌传播和感染的风险，特别是在患者特别易感的医院环境中，许多医疗保健中心建议在入院前进行常规的患者筛查，同时消除金黄色葡萄球菌鼻腔携带，也就是所谓的“鼻腔去定殖”。因此，适当的鼻腔去定殖方法对于限制金黄色葡萄球菌的传播和感染至关重要。
迄今为止，已有多种方法用于鼻腔去定殖，其包括局部抗生素和/或抗菌剂的应用、全身抗生素的使用以及鼻孔的人工细菌定殖。然而，局部抗生素和抗菌剂治疗方法的效力较低，并导致金黄色葡萄球菌菌株中抗菌剂和抗生素抗性的快速出现。全身性抗生素的使用同样导致了抗生素抗性菌株的迅速出现，并伴随着不良副作用的出现。人工细菌定殖包括施用与金黄色葡萄球菌竞争的细菌物种和/或菌株。值得注意的是，在20世纪60年代，用金黄色葡萄球菌菌株502A对鼻孔进行的人工定殖被用于预防在暴发期间的新生儿中和在反复感染的患者中更具毒性的金黄色葡萄球菌菌株的定殖。然而，在发现菌株502A本身是几种金黄色葡萄球菌感染的原因，甚至与死亡有关后，这种方法被放弃了。最近，几项研究已经评估了其他细菌物种对金黄色葡萄球菌在鼻孔中定殖的影响，其结果各不相同且往往相互矛盾。例如，Uehara等人(2000年)已经表明，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)不能从鼻孔中消除金黄色葡萄球菌。相反，Iwase等人(2010年)已经报道了表皮葡萄球菌实际上可以消除金黄色葡萄球菌携带。类似地，虽然UEhara等人(2000年)已经表明，用棒状杆菌(Corynebacterium)进行人工定殖可消除金黄色葡萄球菌的携带，但Yan等人(2013年)最近已表明，拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens)在鼻孔中的存在与金黄色葡萄球菌的携带相关。Yan等人(2013年)进一步显示，拥挤棒状杆菌可以促进金黄色葡萄球菌的生长。
尽管局部抗生素施用存在已知的缺点，但目前鼻腔去定殖主要依赖于局部应用抗生素莫匹罗星(mupirocin)的使用。为了减缓金黄色葡萄球菌对莫匹罗星耐药性的发展，治疗仅限于严重感染，其中抗生素施用时间非常短(例如，对接受复苏或外科手术的患者进行为期五天的疗程)。然而，获得患者的依从性可能是困难的，因为莫匹罗星必须重复应用。此外，金黄色葡萄球菌在治疗后频繁重新定殖，表明莫匹罗星几乎没有长期治疗效果。事实上，尽管莫匹罗星疗效显著，但在开始治疗后五周，多达一半的患者仍被相同的金黄色葡萄球菌菌株定殖。此外，有报道称，对免于金黄色葡萄球菌定殖的个体进行莫匹罗星治疗可能是有害的，并导致他们成为携带者，因此有必要在治疗前进行携带筛查(Wertheim等人，2005年)。
尽管做出了这些努力，但目前在康复和长期护理机构中，高达50％的患者都检测到了金黄色葡萄球菌的耐抗生素菌株。在耐抗生素菌株中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是最普遍的，尽管已经报道了耐莫匹罗星的MRSA的案例。与甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)感染相比，由耐抗生素的金黄色葡萄球菌(如MRSA)引起的感染与增加的死亡率、发病率、住院时间和费用相关。
因此，需要用于预防金黄色葡萄球菌在皮肤和粘膜上定殖的新的产品和方法。特别地，需要预防金黄色葡萄球菌在鼻孔中定殖的新的产品和方法。还需要能够长时间(例如几周或几个月)施用的新的产品和方法，特别是在意外或手术伤口愈合期间。在整形外科和心脏外科手术的情况下，在携带植入装置的患者中，以及在居住在康复或长期护理机构中的患者中，这种需求尤其重要，在这些地方金黄色葡萄球菌的定殖和/或感染是时常发生的。鉴于金黄色葡萄球菌对抗生素和抗菌剂产生耐药性的习性，这些新的产品和方法不应基于使用抗生素或抗菌剂，而应特别用于预防MRSA。它们还应具有很少的副作用，并且价格合理。
发明内容
本发明涉及一种组合物，其包含至少一种棒状杆菌属物种和至少一种葡萄球菌属物种，优选地包含至少一种棒状杆菌属物种和至少巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)。根据本发明的组合物可以包含以下关于药物组合物描述的任何优选特征，所述药物组合物本身是组合物的优选实施方案。特别地，所述组合物包含至少一种棒状杆菌属物种和巴氏葡萄球菌，其中所述至少一种棒状杆菌属物种选自拥挤棒状杆菌(C.accolens)、丙酸棒状杆菌(C.propinquum)、假白喉棒状杆菌(C.pseudodiphtheriticum)、纹带棒状杆菌(C.striatum)、无枝菌酸棒状杆菌(C.amycolatum)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、黏金色棒状杆菌(C.aurimucosum)、结核硬脂酸棒状杆菌(C.tuberculostearicum)非发酵棒状杆菌(C.afermentans)，优选拥挤棒状杆菌和/或丙酸棒状杆菌。优选地，所述组合物还包含表皮葡萄球菌。优选地，所述组合物每剂量包含至少103CFU的棒状杆菌属物种、至少103CFU的巴氏葡萄球菌和任选的至少103CFU的表皮葡萄球菌。优选地，所述组合物包含总共至少103个细菌CFU/剂量，优选至少1.2x103，更优选至少1.4x103，甚至更优选至少3x103个细菌CFU/剂量。优选地，棒状杆菌属物种与巴氏葡萄球菌与表皮葡萄球菌的比率在1∶0.01∶0.01至1∶1∶1的范围内。优选地，所述组合物还包含至少一种赋形剂，优选药学上可接受的赋形剂。优选地，所述至少一种赋形剂包含至少一种冻干保护剂，优选选自蛋白胨、甘油、乳糖、明胶、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、麦芽糖糊精、阿东糖醇(adonitol)和谷氨酸钠。优选地，所述组合物是冻干的或冷冻干燥的。优选地，组合物还包含至少一种胶凝剂，优选药学上可接受的胶凝剂。
优选地，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种棒状杆菌属物种和至少一种葡萄球菌属物种，优选地包含至少一种棒状杆菌属物种和至少巴氏葡萄球菌。所述至少一种棒状杆菌属物种优选地选自拥挤棒状杆菌和丙酸棒状杆菌，或者包含拥挤棒状杆菌和丙酸棒状杆菌两者。本发明还涉及一种药物组合物，其包含至少一种棒状杆菌属物种、巴氏葡萄球菌和至少一种额外的葡萄球菌属物种，优选地为表皮葡萄球菌。因此，根据特别优选的实施方案，本发明还涉及一种药物组合物，其包含拥挤棒状杆菌和/或丙酸棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌。本发明进一步涉及用作药物的所述组合物，特别是用于预防金黄色葡萄球菌定殖的所述组合物。事实上，发明人惊奇地发现，包含至少一种棒状杆菌属物种和巴氏葡萄球菌的组合或至少一种棒状杆菌属物种、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的组合的组合物可以预防金黄色葡萄球菌的定殖。
这些细菌物种的组合是特别有利的，因为发明人已经令人惊讶地表明，所述三种细菌物种拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌分别抑制金黄色葡萄球菌的定殖，其中拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌具有强的协同作用，抑制金黄色葡萄球菌增长超过95％。发明人还令人惊讶地表明，其它棒状杆菌属物种，如丙酸棒状杆菌，类似地抑制金黄色葡萄球菌定殖，其中丙酸棒状杆菌和巴氏葡萄球菌具有特别强的协同作用，抑制金黄色葡萄球菌生长超过98％。此外，巴氏葡萄球菌促进了拥挤棒状杆菌的生长，因为在某些条件下，在没有巴氏葡萄球菌的情况下拥挤棒状杆菌不会生长。通过建立生物膜，巴氏葡萄球菌，或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者的存在提高了棒状杆菌属物种(如拥挤棒状杆菌或丙酸棒状杆菌)的持久性。此外，尽管拥挤棒状杆菌和表皮葡萄球菌的组合具有拮抗趋势，降低了单独使用表皮葡萄球菌所见到的对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用，但所有三种细菌物种的组合也具有令人惊讶的高的抗金黄色葡萄球菌活性，其抑制金黄色葡萄球菌生长超过95％。由于表皮葡萄球菌是鼻菌落的重要定殖者，因此优选地将其包含在药物组合中。表皮葡萄球菌可以显著地在体内提供保护性细菌层，有助于预防金黄色葡萄球菌的重建。因此，包含至少一种棒状杆菌属物种、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的药物组合物预防金黄色葡萄球菌定殖，并且是特别有利的。
本发明的药物组合物是有利的，因为该组合物不是基于抗生素或抗菌剂的施用，而是基于至少两种，优选三种细菌物种的施用，从而将出现进一步金黄色葡萄球菌耐药性的风险最小化。有利地，所述组合物可以比现有方法施用更长的时间。有利地，本发明的组合物可以预防患者中耐抗生素的金黄色葡萄球菌(例如MRSA)的定殖。本发明的组合物也是有利的，因为没有一种所选择的细菌物种具有毒力特征。甚至更有利地，所有选择的细菌物种通常在健康受试者的鼻微生物区系中和/或皮肤上检测到。
通过本发明的药物组合物预防定殖是特别有利的，因为定殖与内源性感染和传播的风险增加都相关。因此，预防金黄色葡萄球菌定殖是减少金黄色葡萄球菌感染总数的最有效方法。此外，目前用于治疗金黄色葡萄球菌的方法不建议用于预防性用途，因为可能会增加抗生素耐药性。相反，根据本发明的药物组合物可以预防性地向受试者施用。
术语“患者”或“受试者”在本文中被定义为任何人类个体，而与他们的年龄无关。在优选实施方案中，所述受试者是因任意原因住院的。在一个更优选的实施方案中，所述受试者住院进行心脏或整形外科手术，佩戴植入装置，或者居住在康复或长期护理机构中。在住院时所述受试者未被金黄色葡萄球菌定殖的情况下，可以将本发明的药物组合物预防性地使用，以预防后来被金黄色葡萄球菌定殖。
所述受试者可以是成人或儿童。术语“成人”在本文中是指至少16岁的个体。术语“儿童”包括0-1岁的婴儿和1-8岁、8-12岁和12-16岁的儿童。术语“儿童”还包括从出生至28天的新生儿和28至364天的满月后周岁内的婴儿。所述组合物可施用于成人或儿童，包括新生儿。本发明的药物组合物是特别有利的，因为使用抗生素的现有治疗方法由于不希望的副作用而在儿童中受到限制。
药学上可接受的组合物包含足够量的每种细菌菌株以达到治疗效果。作为非限制性实施例，所述药物组合物可包含至少102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或1012菌落形成单位(CFU)的每种细菌菌株的，或总计至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或1012CFU的所有细菌菌株。每种细菌菌株的数量不必相同。每种细菌菌株与其他一种或多种菌株的量之比也使得药学上可接受的组合物在治疗上有效。作为非限制性实施例，当在所述药物组合物中包含两种菌株时，一种菌株与另一种菌株的比率可以为1：0.01至1：2，包括例如1：0.02、1：0.04、1：0.2、1：0.4或1：1的比率。作为非限制性实施例，当在所述药物组合物中包含三种菌株时，一种菌株与其它每一种菌株的比率可以为1：0.01：0.01至1：1：1，包括例如1：0.02：0.02、1：0.1：0.1或1：0.2：0.2的比率。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物每剂量包含103-1012CFU的至少一种棒状杆菌属物种，103-1012CFU的巴氏葡萄球菌，以及任选的103-1012CFU的表皮葡萄球菌。更优选地，所述组合物每剂量包含104-1010CFU的至少一种棒状杆菌属物种，104-1010CFU的巴氏葡萄球菌，以及任选的104-1010CFU的表皮葡萄球菌。甚至更优选地，所述组合物每剂量包含105-109CFU的至少一种棒状杆菌属物种，105-109CFU的巴氏葡萄球菌，以及任选的105-109CFU的表皮葡萄球菌。
优选地，本发明的组合物每剂量包含至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或1012CFU的总细菌浓度，优选地，至少1.2、1.4、2或3x103CFU，至少5、5.02、5.04、5.2或5.4x103CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、1.5、2或3x104CFU，至少5、5.02、5.04、5.2或5.4x104CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、1.5、2或3x105CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、2或3x106CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、2或3x107CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、2、或3x108CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、2或3x109CFU，至少1010CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、2或3x1010CFU，至少1.02、1.04、1.2、1.4、2或3x1011CFU、或至少1.02、1.04、1.2、1.4、2或3x1012CFU。
术语“剂量”在本文中定义为在给定时间施用的药物组合物的量。优选地，施用的剂量是治疗有效的。所述剂量在本文中可以用所述药物组合物的重量、体积或CFU来表示。
术语“菌落形成单位”或“CFU”在本文中定义为用于指示样品中活细菌数量的单位，其中一个菌落形成单位对应于一个活细菌细胞。
在本发明的药物组合物中，所述至少一种棒状杆菌属物种与至少一种葡萄球菌属物种的的CFU的比率(例如至少一种棒状杆菌属物种(优选拥挤棒状杆菌)：巴氏葡萄球菌的比率)优选地在1：0.01至1：2的范围内，更优选地在1：0.01至1：1的范围内。在本发明的药物组合物中，所述至少一种棒状杆菌属物种与巴氏葡萄球菌与表皮葡萄球菌的CFU的比率优选地在1：0.01:0.01至1：1：1的范围内。有利地，所述至少一种棒状杆菌属物种(优选拥挤棒状杆菌)与巴氏葡萄球菌与表皮葡萄球菌的比率在1：0.02：0.02至1：1：1的范围内，优选地在1：0.1：0.1至1：1：1的范围内，甚至更优选地在1：0.2：0.2至1：1：1的范围内。
作为非限制性实施例，所述药物组合物中的所述至少一种棒状杆菌属物种可以选自拥挤棒状杆菌、丙酸棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黏金色棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌或非发酵棒状杆菌。特别地，上述物种都是从鼻孔和/或皮肤中分离出来的。不同棒状杆菌属物种的相似效果在实施例中有特别的说明。在某些情况下，所述药物组合物中可能存在两种或更多种棒状杆菌属物种。例如，拥挤棒状杆菌可以与至少一种其他棒状杆菌属物种组合，其例如选自上面列出的那些中的一种或多种，如丙酸棒状杆菌。
根据优选的实施方案，所述至少一种棒状杆菌属物种选自拥挤棒状杆菌、丙酸棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黏金色棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌和非发酵棒状杆菌。根据更优选的实施方案，所述至少一种棒状杆菌属物种包括拥挤棒状杆菌或丙酸棒状杆菌，或拥挤棒状杆菌和丙酸棒状杆菌的组合，根据本文所述的实施方案的任一个。在实施例中特别地说明了不同的拥挤棒状杆菌菌株的相似效果。
在药物组合物的情况下，可以使用表皮葡萄球菌的任何菌株。作为非限制性实施例，表皮葡萄球菌菌株可以选自从鼻孔分离的菌株。
在药物组合物的情况下，可以使用巴氏葡萄球菌物种的任何菌株。不同巴氏葡萄球菌菌株的相似效果在实施例中有特别说明。
所述药物组合物可以在没有检测到金黄色葡萄球菌的情况下预防性施用，优选地施用至皮肤和/或鼻孔，更优选地施用至前鼻孔。或者，可以将所述药物组合物在检测和消除皮肤或鼻孔中的金黄色葡萄球菌后施用。或者，所述药物组合物可以在没有测试的情况下施用。
所述组合物可以每天一次或多次(例如一、二、三或四次)施用于受试者，并且可以连续施用数天(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十天或更多天)、数周(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十周或更多周)、或数月(例如一、二、三、四、五、六个月或更多月)。在优选的实施方案中，所述组合物每天施用1-3次，持续8-12天，优选地在因心脏或整形外科手术住院的受试者中施用。在另一个优选的实施方案中，将所述组合物对携带植入装置或居住在康复或长期护理设施中的受试者施用数周或数月，或在意外或手术伤口愈合期间施用。在特别优选的实施方案中，所述组合物每天施用1-3次，持续1-4周，或1-6个月，用于携带植入装置、居住在康复或长期护理机构、或从意外或手术伤口愈合的受试者。在甚至更优选的实施方案中，所述组合物在住院期间、植入装置存在期间、在康复或长期护理设施中的停留期间、或在意外或手术伤口愈合期间施用，优选每天1-3次。
或者，该组合物可以间歇地(例如每隔一天、每隔两天或根据需要)或循环地(例如连续施用数天，然后不施用，或“停药”数天，之后重复该循环)施用给受试者。在优选的实施方案中，将所述组合物施用8-12天，然后停药一段时间。
或者，所述组合物可以按需施用。
如果在施用后观察到保护作用，则可适当地重复施用以维持所述保护作用。如果在施用所述组合物之后检测到金黄色葡萄球菌定殖，则应当重复施用方案。
所述组合物的施用持续时间和频率可由技术人员根据他们的一般知识进行调整。特别地，这些参数的调整可以取决于期望金黄色葡萄球菌在受试者的鼻孔中和/或皮肤上不存在的时间长度。例如，可能需要在住院期间不存在金黄色葡萄球菌定殖。
在本发明的优选实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
术语“药学上可接受的赋形剂”在本文中被定义为与药物组合物相容的成分或成分组合，在患者体内不产生不希望的副作用，并且通常被认为是无毒的。药学上可接受的赋形剂通常涉及促进组合物的施用、增加产品的保质期或功效、或改善组合物的溶解性或稳定性。药学上可接受的赋形剂通常被认为是无药理学活性的。然而，在某些情况下，赋形剂本身也可具有治疗效果，例如，通过使金黄色葡萄球菌更难在治疗部位(即施用部位)定殖。
药学上可接受的赋形剂或载体在现有技术中是众所周知的，并且可以容易地由技术人员根据组合物所需的盖仑制剂进行调整。盖仑制剂、施用方法和剂量还可以根据广泛接受的标准来确定，以适应患者的治疗，必要时包括他们的一般健康状况、年龄、体重、对治疗的耐受性等。
本发明的药物组合物可以外部(topically)施用于上皮(例如皮肤)和/或粘膜。优选地，本发明的药物组合物可以被施用到鼻孔、鼻窦、或腋窝、鼠蹊部(groin)、腹股沟(inguinal)和直肠周围区域、或皮肤或粘膜上的其它地方。根据优选的实施方案，所述组合物被施用到鼻孔。
本文定义的术语“鼻孔(nare)”包括前鼻孔或鼻子孔(nostril)和鼻腔。优选地，将本发明的药物组合物施用于前鼻孔或鼻子孔。
虽然金黄色葡萄球菌可以定殖在人体上的不同部位，但是应认识到，其主要生态位是前鼻孔，从那里可以扩散到其它组织或器官(Klugmans等人，1997)。与皮肤(如前臂皮肤)非常相似，前鼻孔衬有皮肤样的、完全角质化的鳞状上皮，带有毛发、皮脂腺和汗腺。此外，遗传学研究表明，这两个物理上不同的生态位的微生物群落共享相同的组成模式(Yan等人，2013年)。因此，金黄色葡萄球菌在皮肤和前鼻孔中的定殖是相似的，其中皮肤进一步代表了这两个部位的极好且容易得到的模型。
有利地，本发明的组合物包含用于施用至皮肤和/或粘膜的任何合适的药物制剂，例如贴剂、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、薄膜或药膏(salve)。有利地，所述组合物的粘度或质地被调节以改善应用或功效(例如接触时间)。有利地，所述组合物不会对鼻上皮造成不利影响。甚至更有利地，所述组合物的pH和/或渗透性与鼻孔的相似。
由于鼻上皮的pH通常在5.5至7.5的范围内，因此本发明的药物组合物有利地具有在所述范围内的pH。
包含在本发明组合物中的一种或多种药学上可接受的赋形剂可进一步包含一种或多种抗氧化剂、缓冲剂、填充物质、悬浮剂、增溶剂、冻干保护剂、基质形成添加剂、成膜剂、湿润剂、稀释剂、溶剂、增塑剂、油性/乳化/水性碱、胶凝剂、防腐剂、张力调节剂、媒介物和稳定剂。
作为非限制性实施例，本发明的组合物可包含至少一种本领域技术人员熟知的药学上可接受的赋形剂或载体。所述至少一种赋形剂可选自水、甘油、矿物油(例如凡士林、石蜡)、动物油或脂肪(例如蜂蜡或羊毛脂肪)、半固体烃(油质)或植物油(例如椰子油、芒果黄油、棕榈油、大豆油、橄榄油、乳木果油和可可脂)、甘油酯、黄原胶、乳糖、葡聚糖、甘露醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧丙基甲基纤维素、聚乙二醇、聚丙二醇、透明质酸、淀粉基可生物降解聚合物、黄蓍胶、果胶、几丁质和壳聚糖衍生物、角叉菜胶、瓜尔胶、琼脂、藻酸盐、明胶、纤维蛋白、白蛋白、磷酸盐缓冲盐水、聚卡波非(Polycarbophil)、氢化棕榈油、甘油酯、卡波姆934P、聚乙二醇(macrogol)、对羟基苯甲酸甲酯、聚甲基丙烯酸甘油酯、氰基丙烯酸酯、三乙醇胺、山梨酸、NaOH、卡波普(Carbopol)(例如卡波普974P)、重氮烷基脲、泊洛沙姆184、二甲硅油、纤维素胶、乳酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、与聚烯基聚醚交联的丙烯酸的均聚物和共聚物、氢氧化钠、氯化钠和氯化钾等。
在优选的实施方案中，药学上可接受的组合物是凝胶，优选生物粘附性或粘膜粘附性凝胶。术语“凝胶”在本文中被定义为与液体相互渗透以产生半固体材料的颗粒分散体。术语“生物粘附性凝胶”在本文中被定义为粘附到生物表面(例如，复层鳞状上皮，如皮肤或前鼻孔)的凝胶。术语“粘膜粘附性凝胶”在本文中被定义为粘附到粘液表层(例如粘膜)上的凝胶。
在优选的实施方案中，所述至少一种药学上可接受的赋形剂是胶凝剂，其选自羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、壳聚糖及其衍生物(例如几丁质)、角叉菜胶及其衍生物、藻酸盐及其衍生物、果胶及其衍生物、与聚烯基聚醚交联的丙烯酸的均聚物和共聚物或其混合物。
如果存在张力调节剂，则所述张力调节剂优选地选自氯化钾、甘露醇、右旋糖、甘油或氯化钠。
在优选的实施方案中，所述药物组合物包含至少一种胶凝剂和至少一种张力调节剂。在优选的实施方案中，氯化钠以等渗浓度存在于所述药物组合物中。
如果存在媒介物，则所述媒介物优选地选自水、水混溶性溶剂(例如甘油)或水不混溶性溶剂(例如植物油)。
如果存在防腐剂，则所述防腐剂优选地选自苯甲醇、甲酚、苯甲酸、苯酚、对羟基苯甲酸酯和山梨酸。
如果存在稳定剂，则所述稳定剂优选地选自表面活性剂、聚合物、多元醇、泊洛沙姆、白蛋白、明胶、海藻糖、蛋白质、糖、聚乙烯吡咯烷酮、N-乙酰基-色氨酸(“NAT”)、辛酸盐(即辛酸钠)、聚山梨醇酯(即P80)、氨基酸和二价金属阳离子(如锌)。
根据本发明的另一方面，细菌被冻干或冷冻干燥。“冻干”是本领域技术人员熟知的、通过减压升华从冷冻细菌培养物中除去水的方法。一般性方法描述于“Lyophilization:Introduction and Basic Principles”(Jennings，1999)。所述方法包括以下步骤：提供包含活细菌的水性制剂、冷冻、初次干燥(升华)和二次干燥(解吸)。从所述方法获得冻干的细菌。
根据优选的模式，在冻干保护剂的存在下将细菌冻干。冻干保护剂可以是细胞内的或细胞外的或两者的组合。优选地，所述冻干保护剂选自蛋白胨、甘油、乳糖、明胶、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、麦芽糖糊精、阿东糖醇和谷氨酸钠。
根据优选的模式，在基质形成添加剂存在下将细菌冻干。优选地，所述基质形成添加剂是甘露醇或脱脂乳。
优选地，冻干细菌储存在冷藏温度(例如+3至+6℃)或室温(例如20至25℃)下。
优选地，每种细菌物种被分别冻干。根据第一个优选实施方案，每种冻干细菌物种在使用前用至少一种药学上可接受的赋形剂分别进行重构。然后可以将重构的细菌在施用前单独或混合施用。根据第二个优选实施方案，将所有细菌物种在冻干后混合在一起。在此优选实施方案中，冻干细菌在使用前用至少一种药学上可接受的赋形剂一起进行重构。根据第三个优选实施方案，将所有细菌物种在冻干前混合在一起。在此优选实施方案中，所述混合物在使用前用至少一种药学上可接受的赋形剂进行重构。
冻干细菌组合物的“重构”在本文中定义为将组合物与特定量的至少一种药学上可接受的赋形剂(例如液体或凝胶)接触，所述赋形剂水合冻干物。优选地，搅动或搅拌混合物以确保完全水合。优选地，重构在17℃至37℃的范围内进行，更优选在室温或高于室温(20℃至25℃)，甚至更优选在室温下进行。
优选地，将所述组合物在即将使用前重构。如果重构的组合物不立即施用，则优选将重构的组合物冷藏直至施用。如果重构的组合物不立即施用并且不进行冷藏，则重构的组合物优选在重构当天施用。技术人员可以根据他的一般知识容易地选择合适的重构和储存条件。
根据第一个优选实施方案，分别重构的细菌被一个接一个地分别施用。根据第二个优选实施方案，在施用前混合分别重构的细菌以同时应用。根据第三个优选实施方案，将重构在一起的细菌同时施用。
或者，活细菌可以在约+4℃至+8℃的温度下储存(例如，储存数天)，在约-25℃至-40℃的温度下储存(例如，储存数周)，或者在约-72℃至-85℃的温度下储存(例如，储存数年)。冻干细菌也可以在重构后在+4℃和+8℃之间的温度下储存数天。在这些温度范围中的每一个温度范围下的适当储存条件是本领域技术人员所熟知的。
本发明还包含用于预防金黄色葡萄球菌定殖的药物组合物。所述用于预防金黄色葡萄球菌定殖的药物组合物包含本文所述的本发明药物组合物的所有方面。优选地，本发明包括用于预防金黄色葡萄球菌鼻腔定殖的药物组合物，更优选地，包括将所述组合物施用到前鼻孔，和/或用于预防金黄色葡萄球菌皮肤定殖。在对金黄色葡萄球菌的皮肤定殖敏感性增加的受试者中，例如在患有湿疹如特应性皮炎或糖尿病的受试者中，有利地预防了金黄色葡萄球菌的皮肤定殖。
在优选的实施方案中，本发明包括用于预防耐抗生素的金黄色葡萄球菌的定殖，优选用于预防耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的定殖的药物组合物。更优选地，所述药物组合物用于预防耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的鼻腔定殖。术语“耐甲氧西林”表示细菌菌株对甲氧西林的杀菌作用缺乏敏感性。MRSA菌株可能对其他抗生素(如青霉素、万古霉素、莫匹罗星、喹诺酮类等)具有耐药性。或者，本发明的药物组合物可用于预防甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的鼻腔定殖。甲氧西林敏感菌株对甲氧西林的杀菌作用敏感，但可能对其他抗生素具有耐药性。
术语“金黄色葡萄球菌的定殖”在本文中被定义为在体表存在至少一种金黄色葡萄球菌菌株，但不诱导可检测的免疫应答和/或不侵入组织或以其他方式引起组织损伤。或者，在没有感染的情况下，定殖可以被认为是金黄色葡萄球菌的存在。在某些情况下，定殖可能是暂时的、间歇性的、长期的，甚至是永久性的。特别地，金黄色葡萄球菌的定殖可发生在鼻孔、鼻窦、咽喉、胃肠道，或腋窝、鼠蹊部、腹股沟和直肠周围区域、伤口或皮肤或粘膜的其它地方。金黄色葡萄球菌定殖是后期的金黄色葡萄球菌感染的风险因素。
术语“金黄色葡萄球菌的感染”在本文中被定义为在体表存在至少一种金黄色葡萄球菌菌株，其诱导可检测的免疫应答和/或经历不受控制的细菌生长。免疫应答可以是特异性的或非特异性的(如发热)。金黄色葡萄球菌感染可引起皮肤和软组织感染(SSTI)，如脓肿、疔疮、痈、疖、脓疱、细菌性结膜炎或蜂窝织炎、麦粒肿、皮疹、葡萄球菌烫伤样皮肤综合征、坏死性筋膜炎、肺炎、伤口感染、心内膜炎、坏疽、骨髓炎、脓毒性关节炎、败血症等。
术语“金黄色葡萄球菌的鼻腔定殖”在本文中更具体地定义为在鼻孔中存在金黄色葡萄球菌细菌。
术语“鼻腔去定殖”在本文中定义为用于减少或根除来自鼻孔的金黄色葡萄球菌的方法。“完全去定殖”在本文中定义为在鼻孔中没有检测到金黄色葡萄球菌持续至少连续两周。部分去定殖在本文中定义为与先前鼻孔中的金黄色葡萄球菌水平相比，鼻孔中的金黄色葡萄球菌至少连续两周减少至少50％，优选地减少至少80％，更优选地减少至少90％，更优选地减少至少95％，甚至更优选地减少至少99％。
鼻孔中金黄色葡萄球菌的存在可以通过本领域众所周知的方法检测，其包括例如通过鼻拭子从前鼻孔获得样品，并检测金黄色葡萄球菌。可以在物种和/或菌株水平上检测金黄色葡萄球菌。检测方法包括，例如，基于培养的方法(例如，将样品在选择性培养基(如显色和/或血液琼脂)上铺板)和分子诊断方法(例如，PCR、实时PCR、核糖分型、脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性DNA测序、基于BOX-A1R的基因外重复回文序列-PCR(BOX-PCR)、多位点序列分型、全基因组测序等)。
根据另一个方面，本发明包括在有此需要的人类受试者中预防金黄色葡萄球菌定殖的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的根据本发明的药物组合物。本文所述的药物组合物的所有方面都包含在预防金黄色葡萄球菌定殖的方法中。
这里使用的术语“预防”并不意味着是一个排他地绝对术语。事实上，本文所用的术语“预防”可以是金黄色葡萄球菌定殖的延迟、定殖金黄色葡萄球菌水平的降低或金黄色葡萄球菌定殖频率的降低。
本文使用的术语“治疗有效剂量”是指足以至少部分地、优选完全地预防金黄色葡萄球菌在治疗部位定殖的药物组合物的量。在预防金黄色葡萄球菌定殖的背景下，该术语特别指的是足以延迟金黄色葡萄球菌定殖或降低金黄色葡萄球菌定殖频率的量。治疗有效剂量可以一次或多次施用。在一些情况下，药物组合物可用于预防金黄色葡萄球菌在单个受试者体内的多个部位(例如皮肤和前鼻孔两者)定殖。在这种情况下，根据适当的施用方案，对每个部位施用治疗有效剂量。
因此，本发明包括基于本文描述的形式使用药物组合物来预防金黄色葡萄球菌的定殖。
根据第一方面，预防金黄色葡萄球菌定殖的方法包括施用所述药物组合物，其中棒状杆菌属物种与巴氏葡萄球菌的比率在1：0.1至1：2的范围内，或者其中棒状杆菌属物种与巴氏葡萄球菌与表皮葡萄球菌的比率在1：0.01：0.01至1：1：1的范围内。根据第二方面，预防金黄色葡萄球菌定殖的方法包括施用所述药物组合物，所述药物组合物每剂量具有至少103CFU的棒状杆菌属物种、至少103CFU的巴氏葡萄球菌和任选的至少103CFU的表皮葡萄球菌。优选地，预防金黄色葡萄球菌定殖的方法包括施用所述药物组合物，所述药物组合物每剂量具有103至1012CFU的棒状杆菌属物种、103至1012CFU的巴氏葡萄球菌和任选的103至1012CFU的表皮葡萄球菌。根据优选的方面，预防金黄色葡萄球菌定殖的方法包括施用所述药物组合物，所述药物组合物每剂量包含总共至少103CFU，优选地至少1.2、1.4、2或3x103CFU。优选地，所述药物组合物是冻干的或冷冻干燥的。
优选地，预防金黄色葡萄球菌定殖的方法包括施用进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。根据第一方面，所述至少一种药学上可接受的赋形剂是冻干保护剂，其优选地选自：蛋白胨、甘油、乳糖、明胶、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、麦芽糖糊精、阿东糖醇和谷氨酸钠。根据第二方面，所述至少一种药学上可接受的赋形剂是胶凝剂。所述至少一种药学上可接受的赋形剂可以选自上面列出的那些，或者选自本领域公知的赋形剂
优选地，预防金黄色葡萄球菌定殖的方法包括将药物组合物施用至前鼻孔和/或皮肤。
优选地，本发明的预防金黄色葡萄球菌定殖的方法可预防金黄色葡萄球菌鼻腔定殖。优选地，本发明的预防金黄色葡萄球菌定殖的方法可预防MRSA或MSSA的鼻腔或皮肤定殖。
本发明的另一个目的是用于预防受试者中金黄色葡萄球菌在鼻内或皮肤上定殖的方法，其包括：
a)确定金黄色葡萄球菌是否存在于鼻孔中或皮肤上；和
b)如果没有检测到金黄色葡萄球菌，则向所述受试者施用本发明的药物组合物。
本发明还包括根据本发明的组合物在制备用于预防金黄色葡萄球菌定殖的药物中的用途。
本发明还包括根据本文描述的任何实施方案的组合物在预防金黄色葡萄球菌定殖优选在鼻孔中和/或皮肤上定殖中的用途。
本发明还包括一种在有此需要的受试者中预防金黄色葡萄球菌定殖(优选地，在鼻孔中和/或皮肤中定殖)的方法，所述方法包括施用本文所述的组合物。
本文提供的任何方法的受试者可以是先前在所述组合物的用途的背景下确定的任何受试者。具体地，所述受试者可以是因心脏或整形外科手术住院的受试者、携带植入装置的受试者、居住在康复或长期护理机构中的受试者、具有意外或手术创伤的受试者、患有湿疹如特应性皮炎的受试者或患有糖尿病的受试者。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，其包含本文所述的组合物(优选地，为所述药物组合物)，一种适用于鼻腔使用的凝胶和一种用于鼻腔施用的构件。
优选地，所述试剂盒包含：
a)所述药物组合物，其包含拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和任选的表皮葡萄球菌，以及至少一种药学上可接受的赋形剂，所述组合物具有冻干产物配方，
b)至少一种药学上可接受的组分，
c)用于所述组合物的鼻腔施用的构件，和
d)任选地，使用注意事项。
优选地，b)的至少一种药学上可接受的组分是用于重构所述冻干物的水溶液或胶凝剂。更优选地，b)的组分包括用于重构的水溶液和药学上可接受的胶凝剂。
在所述试剂盒中，棒状杆菌属物种可优选地选自拥挤棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黏金色棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌、非发酵棒状杆菌和/或丙酸棒状杆菌。在所述试剂盒中，拥挤棒状杆菌可以特别地与至少一种其他棒状杆菌属物种(如丙酸棒状杆菌)组合。根据优选的实施方案，在试剂盒中，拥挤棒状杆菌被丙酸棒状杆菌代替。
本文还提供了用于分配药物组合物的构件，使得所述药物组合物被应用于上皮或粘膜，优选应用于鼻孔。术语“构件”在本文中被定义为用于局部、外部应用的任何设备。优选地，当使用冻干细菌时，用于分配药物组合物的构件还将冻干细菌与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。
在药物组合物以多个剂量存在于单个构件中的情况下，可以进一步包括用于测量单个剂量的特定构件。例如，单个剂量可以相当于分配器的一个或两个凹陷(depression)。
附图说明
图1:与巴氏葡萄球菌或表皮葡萄球菌共培养的拥挤棒状杆菌的生长
根据实施例2中所述的方法，在与(A)巴氏葡萄球菌AF2653或(B)表皮葡萄球菌AF2302的共培养中测定拥挤棒状杆菌AF2345的细菌生长。在相同的放大倍数下，在72小时(A)或7天(B)后观察拥挤棒状杆菌菌落。巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌斑点用箭头指出。拥挤棒状杆菌菌落在与巴氏葡萄球菌的共培养中是肉眼可见的，但是随着与巴氏葡萄球菌菌斑点的距离的增加而变小。相反，在与表皮葡萄球菌共培养中生长的拥挤棒状杆菌菌落比那些即使在离图1A的巴氏葡萄球菌斑点有一定距离的地方观察到的菌落也小得多，并且肉眼不可见。
图2:具有拥挤棒状杆菌的混合生物膜
根据实施例8中描述的方法，评估在巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者存在的情况下，单独或作为单一或混合生物膜的一部分的拥挤棒状杆菌AF2345的细菌生长。在巴氏葡萄球菌单独存在或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者都存在的情况下观察生长。这两种条件下的生长没有显著差异(p＝0.0651)
图3:具有丙酸棒状杆菌的混合生物膜
根据实施例8和9中描述的方法，评估在巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者存在的情况下，单独或作为单一或混合生物膜的一部分的丙酸棒状杆菌AF1882的细菌生长。在所有条件下都观察生长。当存在单独的巴氏葡萄球菌或同时存在巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌时，丙酸棒状杆菌的生长没有显著差异(p＝0.0748)。
图4:当拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者共培养时细胞外基质的产生
细菌在用TSB填充的96孔板的孔中单独或以多种组合方式生长。在37℃孵育48小时后，通过在595nm测量溶解的结晶紫染色的细胞外基质的光密度来估计生物膜的形成。当拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者共培养时，细胞外基质的产生显著增加。最大的效果是用拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌的组合获得的(与单独的拥挤棒状杆菌相比增加约7.6倍、与单独的巴氏葡萄球菌相比增加约12倍、与单独的表皮葡萄球菌相比增加约3.1倍)。
图5:预防金黄色葡萄球菌在复层鳞状上皮体内模型中的定殖
(A)健康志愿者前臂皮肤上的水胶体贴剂的图片。穿孔(对应于皮肤孔)接收被聚氨酯无菌切口膜覆盖的待测试细菌悬浮液。(B)当用拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌各自以2x106CFU/孔的剂量单独或组合地接种时，对金黄色葡萄球菌29213(5x103CFU/皮肤孔)的抑制。单独接种金黄色葡萄球菌作为阳性对照。对每个测试条件绘制了[(阈值-CT)/阈值]比。
实施例
纳入以下实施例以说明本发明的优选实施方案。在以下实施例和附图中阐述或示出的所有主题应被解释为说明性的，而不是限制性的。以下实施例包括本领域技术人员可以确定的任何替代方案、等价方案和修改方案。
在这些实施例中使用的代表性细菌菌株详见下表1。选择用于实施例中的菌株(列于表1)包括参照株，其具有代表给定物种的所有菌株的特征。
表I.使用的菌株
Figure BDA0002438541300000201
缩写：MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MSSA，对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌。
实施例1：拥挤棒状杆菌对金黄色葡萄球菌生长的体外抑制
鉴于现有技术描述的拥挤棒状杆菌在体内对金黄色葡萄球菌定殖的作用互相矛盾，本文首先评价了在体外拥挤棒状杆菌对金黄色葡萄球菌生长的作用。
材料和方法
通过在哥伦比亚5％羊血琼脂上、于35+/-2℃下培养48小时，制备250μl1.0McFarland的拥挤棒状杆菌悬液，将所述悬液通过在90mm直径的血液琼脂平板上擦拭进行接种，以获得约5x104CFU/cm2。接种250μl生理盐水作为阴性对照。将一个50mm 0.2μm的轨迹蚀刻过滤器放置在拥挤棒状杆菌悬液的顶部。通过在哥伦比亚5％羊血琼脂上、于35+/-2℃下培养24小时制备的金黄色葡萄球菌悬液在10μl中含有目标数100CFU、10CFU或1CFU，将所述悬液在50mm直径的过滤器上点样。
在35℃孵育48小时后，收获过滤器上的金黄色葡萄球菌菌落，并将细菌重悬于盐水(2.5至10mL)中。然后通过测量600nm处的光密度(OD)来确定每个菌落中存在的金黄色葡萄球菌CFU的数量。为了量化金黄色葡萄球菌在拥挤棒状杆菌存在下的生长抑制，测定了有或没有拥挤棒状杆菌存在时的OD值/菌落。每组实验至少重复两次。
结果
令人惊讶的是，取决于所测试的拥挤棒状杆菌和金黄色葡萄球菌菌株，拥挤棒状杆菌导致金黄色葡萄球菌生长降低了27.78％至51.93％(参见表II)。同样，令人惊讶地，MRSA(金黄色葡萄球菌USA300)和MSSA(金黄色葡萄球菌AF3147和AF2419)菌株的生长均被显著抑制。生长抑制百分比似乎取决于所用的拥挤棒状杆菌菌株，因为在存在相同拥挤棒状杆菌菌株的情况下生长的不同金黄色葡萄球菌菌株之间未观察到生长抑制的显著差异。
表II
Figure BDA0002438541300000211
Figure BDA0002438541300000221
a学生t检验(p值<0.01被认为是显著的)，SD：标准差。
实施例2：与巴氏葡萄球菌共培养的拥挤棒状杆菌的生长促进
我们接下来研究了拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌在体外的相互作用。使用平板计数琼脂(PCA)研究了巴氏葡萄球菌对拥挤棒状杆菌生长的影响，所述平板计数琼脂(PCA)允许巴氏葡萄球菌生长，但不允许拥挤棒状杆菌生长。表皮葡萄球菌被用作对照物种。
材料和方法
将按照实施例1所述制备的、500μl 10-2倍稀释的0.5McFarland的拥挤棒状杆菌悬液(菌株AF2345)接种到PCA培养基上。在完全干燥之后，通过在哥伦比亚5％羊血琼脂上、于35+/-2℃下培养24小时制备10μl 0.5McFarland的巴氏葡萄球菌(菌株AF2653)或表皮葡萄球菌(菌株AF2302)的悬液，将所述悬液在平板中心点样。将十微升无菌盐水点样作为阴性对照。在35℃下孵育72小时后，即可测定拥挤棒状杆菌的生长。通过肉眼可见的菌落的存在来测定生长。
结果
培养72小时后，在巴氏葡萄球菌斑点的外围检测到拥挤棒状杆菌的生长(图1A)，而在表皮葡萄球菌斑点(图1B)或对照斑点(未显示)周围检测到败育的菌落。在巴氏葡萄球菌斑点周围检测到的拥挤棒状杆菌菌落可以用肉眼检测到，而表皮葡萄球菌斑点周围的败育菌落不经放大不能被检测到。即使当将平板孵育多达总共7天时，与表皮葡萄球菌共培养较长时间的拥挤棒状杆菌的孵育也没有进一步促进拥挤棒状杆菌的生长。因此，与表皮葡萄球菌相比，巴氏葡萄球菌促进了拥挤棒状杆菌的生长。
实施例3：拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌联合对金黄色葡萄球菌的生长的体外协同抑制。
由于巴氏葡萄球菌促进拥挤棒状杆菌的生长，我们研究了单独或组合的巴氏葡萄球菌和拥挤棒状杆菌的抗金黄色葡萄球菌活性。也测试了表皮葡萄球菌单独或与拥挤棒状杆菌组合的抗金黄色葡萄球菌活性。
材料和方法
对于每种单独或组合的菌株，通过在哥伦比亚5％羊血琼脂上、于35+/-2℃下培养制备1.0McFarland悬液(拥挤棒状杆菌：孵育48h；巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌：孵育24h)，将250μl所述悬液通过在90mm直径的血液琼脂平板上擦拭进行接种(约5x104CFU/cm2)。接种250μl生理盐水作为阴性对照。将一个50mm 0.2μm的轨迹蚀刻过滤器放置在斑点的顶部。将10uL中含有目标数目100CFU、10CFU和1CFU的金黄色葡萄球菌USA300悬液在50mm直径的过滤器上点样。其它材料和方法如实施例1所述。
结果
表III给出了用拥挤棒状杆菌AF2345、巴氏葡萄球菌AF2543和表皮葡萄球菌AF2302获得的结果。如图所示，拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌的组合比单独的每种物种显著地更具抑制性，并且抑制金黄色葡萄球菌生长超过95％。相比之下，拥挤棒状杆菌和表皮葡萄球菌的组合没有协同作用，甚至趋于拮抗(平均金黄色葡萄球菌生长抑制为68.92％，而单独用表皮葡萄球菌AF2302的为79.28％，p＝0.0133)。
表III
Figure BDA0002438541300000231
Figure BDA0002438541300000241
a学生t检验(p值<0.01被认为是显著的)。
我们在相同条件下测试了拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌菌株的其他组合。如表IV所示，所有测试的组合抑制金黄色葡萄球菌的抑制率超过95％。
表IV
Figure BDA0002438541300000242
a从悬浮在盐水中的十个菌落的库中测量OD。
实施例4：拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌的组合的剂量-效应关系
材料和方法
从每种菌株的1.0McFarland悬液制备系列1/5稀释液，并通过在90mm直径的血琼脂板上擦拭接种250μl每种细菌悬液，以获得每种单独的菌株或组合的菌株，其铺板密度为约5x104、约104、约2x103、约4x102和约0.8x102CFU/cm2。其它材料和方法如实施例3所述。
结果
如表V中所示，在所有测试的细菌密度下，拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌的组合都具有令人惊讶的显著协同作用，在约0.8x102CFU/cm2时获得了最强的协同作用。但是，只有高于或等于约2x103CFU/cm2的密度(例如，约5x104CFU/cm2、约104CFU/cm2和约2x103CFU/cm2)才显示出抗金黄色葡萄球菌活性，可抑制细菌生长超过95％。
表V
Figure BDA0002438541300000251
Figure BDA0002438541300000261
a学生t检验(p值<0.01被认为是显著的)。
实施例5：拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的组合的抗金黄色葡萄球菌活性
鉴于我们先前在实施例3中给出的结果，我们评估了表皮葡萄球菌的添加是否对拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌的组合对金黄色葡萄球菌的抑制活性产生负面影响。
材料和方法
对于每种组合的菌株，通过在哥伦比亚5％羊血琼脂上、于35+/-2℃下培养制备1.0McFarland悬液(拥挤棒状杆菌：孵育48h；巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌：孵育24h)，将250μl所述悬液通过在90mm直径的血液琼脂平板上擦拭进行接种(约5x104CFU/cm2)；接种250μl生理盐水作为阴性对照。将一个50mm 0.2μm的轨迹蚀刻过滤器放置在斑点的顶部。将10μL中含有目标数目100CFU、10CFU和1CFU的金黄色葡萄球菌USA300悬液点样在50mm直径的过滤器上。其它材料和方法如实施例1所述。
结果
如表VI所示，用拥挤棒状杆菌AF2345/巴氏葡萄球菌AF2653组合与拥挤棒状杆菌AF2345/巴氏葡萄球菌AF2653/表皮葡萄球菌AF2302组合获得相同水平的金黄色葡萄球菌生长抑制。
表VI
Figure BDA0002438541300000271
a学生t检验(p值<0.01被认为是显著的)。
实施例6：丙酸棒状杆菌可以替代组合拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌和拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌中的拥挤棒状杆菌
然后，我们研究了棒状杆菌的其他物种(例如丙酸棒状杆菌)单独和/或与巴氏葡萄球菌或与巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌组合使用是否也可能具有抗金黄色葡萄球菌活性。
材料和方法
材料和方法如实施例3所述，不同的是丙酸棒状杆菌AF1882代替拥挤棒状杆菌AF2345。
结果
如表VII中所示，丙酸棒状杆菌/巴氏葡萄球菌和丙酸棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌的组合均是协同的并且具有显著的抗金黄色葡萄球菌活性，抑制金黄色葡萄球菌的生长超过95％。
表VII
Figure BDA0002438541300000281
a学生t检验(p值<0.01被认为是显著的)。
bAF1882+AF2653 vs AF1882+AF2653+AF2302，p值＝0.3524。
实施例7：不同棒状杆菌属物种：葡萄球菌属物种比率的细菌组合的抗金黄色葡萄球菌活性
还评估了不同比率的棒状杆菌属物种：葡萄球菌属物种的抗金黄色葡萄球菌活性。特别是，我们评估了不同比率的拥挤棒状杆菌：巴氏葡萄球菌：表皮葡萄球菌的组合或丙酸棒状杆菌：巴氏葡萄球菌：表皮葡萄球菌的组合。
材料和方法
从每株菌株的2.0McFarland悬液中制备拥挤棒状杆菌AF2345、丙酸棒状杆菌Af1882、巴氏葡萄球菌AF2653和表皮葡萄球菌AF2302的适当稀释液，并通过在90mm直径的血琼脂平板上擦拭，共同接种25至250μl的每种细菌悬液，从而获得约105、约5x104、约104、约5x103和约103CFU/cm2的拥挤棒状杆菌Af2345或丙酸棒状杆菌AF1882，所述拥挤棒状杆菌Af2345或丙酸棒状杆菌Af1882与巴氏葡萄球菌AF2653和表皮葡萄球菌Af2302以以下比率组合(棒状杆菌属：巴氏葡萄球菌：表皮葡萄球菌)：1:1:1、1:0.2:0.2、1:0.1:0.1、1:0.02:0.02、1:0.01:0.01。其它材料和方法如实施例3所述。
结果
表VIII和IX分别显示了用基于拥挤棒状杆菌和丙酸棒状杆菌的组合获得的结果。
如表VIII所示，组合拥挤棒状杆菌：巴氏葡萄球菌：表皮葡萄球菌令人惊讶地在除了以下的所有测试的密度和比率下均具有超过95％的抗金黄色葡萄球菌活性：密度≤104CFU/cm2比率为1：0.01：0.01时、密度≤5x103CFU/cm2比率为1：0.02：0.02时以及密度为103CFU/cm2比率为1：0.1：0.1时。但是，在所有测试浓度和密度下，抗金黄色葡萄球菌的活性仍然很显著。实际上，即使在最低的测试浓度和密度下(例如，在103CFU/cm2的密度下以1：0.01：0.01的比率)，金黄色葡萄球菌的生长也仍然被抑制了至少74％。增加比率(例如增加至1：0.02：0.02)或密度(例如增加至5x103)可增加抗金黄色葡萄球菌的活性，分别抑制金黄色葡萄球菌的生长约83％和85％。
表VIII.不同比率和密度下的拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌组合
Figure BDA0002438541300000301
Figure BDA0002438541300000311
a比率以拥挤棒状杆菌：巴氏葡萄球菌：表皮葡萄球菌的数量表示。
如表IX中所示，用丙酸棒状杆菌获得的结果与用拥挤棒状杆菌获得的结果相似。实际上，对于包括丙酸棒状杆菌的细菌组合，抗金黄色葡萄球菌活性也令人惊讶地在除了以下的所有测试的密度和比率下均超过95％：密度≤5x103CFU/cm2比率为1：0.01：0.01和密度为103CFU/cm2比率为1：0.1：0.1和1：0.2：0.2。如对于具有拥挤棒状杆菌的组合所见的，具有丙酸棒状杆菌的组合的抗金黄色葡萄球菌活性在所有测试的浓度和密度下保持显著水平，实际上通常高于拥挤棒状杆菌时所见的抗金黄色葡萄球菌活性。实际上，在最低的测试浓度和密度下(例如，在103CFU/cm2的密度下以1：0.01：0.01的比率)，金黄色葡萄球菌的生长被抑制了至少81％。增加比率(例如增加至1：0.02：0.02)或密度(例如增加至5x103)可增加抗金黄色葡萄球菌的活性，分别抑制金黄色葡萄球菌的生长约89％和93％。
表IX.不同比率和密度下的丙酸棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌组合
Figure BDA0002438541300000312
Figure BDA0002438541300000321
Figure BDA0002438541300000331
a比率以拥挤棒状杆菌：巴氏葡萄球菌：表皮葡萄球菌的数量表示。
实施例8：拥挤棒状杆菌在巴氏葡萄球菌的存在下形成生物膜
拥挤棒状杆菌需要复杂的培养基，并且胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)不支持它生长。在这里，我们显示了拥挤棒状杆菌和巴氏葡萄球菌可以形成混合生物膜，其支持拥挤棒状杆菌在其通常无法生长的条件下生长。
材料和方法
如实施例3所述，从在哥伦比亚-5％羊血琼脂平板上的培养中制备McFarland 0.5浊度的细菌悬液。将50μl拥挤棒状杆菌AF2345的悬液(约2x106CFU)分配到12个孔中(A行)；将50μl的1：100稀释液(约2x104CFU)分配到12个孔中(B行)；将50μl表皮葡萄球菌AF2302的悬液(约2x106CFU)分配在第1、2、3、7、8和9列中；将50μl巴氏葡萄球菌AF2653悬液(约2x106CFU)分配到第4、5、6、7、8和9列中。第10、11和12列包含悬浮在100μl培养基中的拥挤棒状杆菌AF2345。
将板离心，除去悬浮盐水，并向每个孔中加入100μl TSB。孵育24小时后，除去50μl培养基，并用新鲜的TSB代替。检查板的生长。48小时后，观察板，除去培养基，并将孔用盐水轻轻洗涤两次。向每个孔中添加200μl盐水，并将板浸入超声浴中以分散并重悬生物膜。对于每个孔，将5μl(1/40)转移到95μl盐水(1/800)中。然后将5μl的此悬浮液转移到含有95μl盐水的新鲜平板中(1/16000)。然后将每种悬液10μl加到Mueller Hinton 2琼脂平板上，以及含有莫匹罗星(128μg/ml)的Mueller Hinton 5％血液NAD富集的去纤维蛋白琼脂平板上。
24小时后，将生长的细菌悬浮在2.2ml安瓿中，并使用McFarland读数器测量浊度。
结果
用高和低接种量的拥挤棒状杆菌(行A和行B)获得的结果在定性上相似。但是，与较低的接种量孵育24小时后获得的细菌密度过低，无法使用McFarland浊度仪进行定量。下文报道的数据来自测试的较高接种量(A行)。
如预期的，拥挤棒状杆菌不会在TSB中生长，也不会形成生物膜。相反，表皮葡萄球菌和巴氏葡萄球菌两者均在TSB中形成生物膜(数据未示出)。令人惊讶的是，拥挤棒状杆菌能够在巴氏葡萄球菌生物膜或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的混合生物膜中生长，但是它不能在单独的表皮葡萄球菌的生物膜中生长(参见图2)。如所预期的，由于已知TSB不支持拥挤棒状杆菌的生长，因此在TSB中包含拥挤棒状杆菌的对照孔中未观察到生长。拥挤棒状杆菌在巴氏葡萄球菌生物膜和表皮葡萄球菌生物膜中的生长差异是显著的(p＝0.0065)。拥挤棒状杆菌在巴氏葡萄球菌生物膜和巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌混合生物膜中的生长之间的差异未达到统计学显著性(p＝0.0651)。
实施例9：丙酸棒状杆菌在混合生物膜中的生长
通过用丙酸棒状杆菌代替拥挤棒状杆菌进行实施例8中所示的相同实验。
材料和方法
如实施例8中所述进行实验，不同之处在于，测试了丙酸棒状杆菌AF1882而不是拥挤棒状杆菌AF2345。
结果
如图3所示，丙酸棒状杆菌能够在TSB中形成稳健的生物膜。它也可以与表皮葡萄球菌和巴氏葡萄球菌组合形成混合生物膜。表皮葡萄球菌内的生长显著低于含有巴氏葡萄球菌的生物膜中的生长(p＝0.019)。但是，与拥挤棒状杆菌的情况一样，表皮葡萄球菌的存在不会对含拥挤棒状杆菌的生物膜内的生长产生不利影响(丙酸棒状杆菌与巴氏葡萄球菌vs丙酸棒状杆菌与巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌，p＝0.0748)。
实施例10：将拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌组合对生物膜形成的协同作用
除了对细菌生长进行定量(如以上实施例8和9中所示)之外，本文通过用结晶紫对细胞外基质进行染色(这可以对体外生物膜的形成进行相对定量)，评估了单独生长或与巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌或巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者组合生长的拥挤棒状杆菌的生物膜形成。
材料和方法
如实施例1中所述，在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中制备拥挤棒状杆菌AF2345、巴氏葡萄球菌AF2653和表皮葡萄球菌AF2302的1.0McFarland悬液。将50μL未稀释的拥挤棒状杆菌悬液和50μL巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌悬液的10-2稀释液单独或以如下的组合接种到96孔板的孔中：拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌、拥挤棒状杆菌/表皮葡萄球菌和拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌。用TSB将体积补至每孔200μL，并将板在37℃下孵育。孵育48小时后，将孔用蒸馏水冲洗、风干，并将生物膜用在蒸馏水中制备的200μL 0.2％结晶紫溶液染色。然后将孔用蒸馏水冲洗，风干，并将固定的结晶紫溶解在200μL在蒸馏水中制备的30％乙酸溶液中。将100μL溶解的结晶紫溶液转移到新的96孔板中，并通过在595nm处测量悬液的光密度来定量生物膜细胞外基质。
结果
如图4所示，当将拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌或与巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者组合生长时，产生的胞外基质明显多于单独的每种细菌物种。拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌组合使用时，细胞外基质产量的增强最高。
此外，由组合的细菌产生的细胞外基质的量大于鉴于每种物种单独产生的量所预期的预期加和效应。因此，当拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌共培养时，观察到协同作用。当拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者共同培养时，效果最大。
实施例11：重构的冻干细菌预防金黄色葡萄球菌定殖
由于最终制剂可能包括将细菌冷冻干燥，因此我们验证了该过程不会损害拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌组合预防金黄色葡萄球菌体外生长的能力。因此，我们比较了“新鲜”的与重构的冷冻干燥的细菌的抗金黄色葡萄球菌活性。
材料和方法
分别以1：1：1或1：0.1：0.1的比率，将拥挤棒状杆菌Af2345、巴氏葡萄球菌Af2652和表皮葡萄球菌AF2302的细菌悬液在冷冻干燥缓冲液中进行组合。将这些悬浮液的一部分(以下称为“新鲜细菌”)用于通过将300μL悬液擦拭到琼脂平板表面上而以103CFU/cm2、102CFU/cm2或101CFU/cm2的最终密度接种至90mm培养皿。接种300μl无菌水作为阴性对照。将一个50mm 0.2μm的轨迹蚀刻过滤器放在接种表面的上方，并在滤膜表面上一式三份地将含有10μl中10和100CFU的目标数的金黄色葡萄球菌USA300悬液点样。其它材料和方法如实施例3所述。将所制备的悬液的另一部分在架式冷冻干燥器中使用两阶段过程在负压下进行冷冻干燥(初次干燥：零下的温度；二次干燥：15℃)。在过程结束时，将小瓶在真空下密封，并在黑暗中于4℃储存直至使用。在测定当天，将冻干的滤饼重悬于400μL无菌水中，并按照与新鲜细菌悬液相同的条件和稀释度接种重构的悬液。
结果
如下表X所示，当使用新鲜的或重构的冻干的拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌的组合时，对金黄色葡萄球菌生长的抑制相似，而与测定中测试的细菌密度或比率无关(未观察到显著差异)。
表X:新鲜或重构的拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌组合在不同密度下的抗金黄色葡萄球菌活性。
Figure BDA0002438541300000361
Figure BDA0002438541300000371
a学生t检验(显著性P<0.05)。
因此，将细菌组合(在这种情况下为拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌)冷冻干燥不会损害细菌组合的抗金黄色葡萄球菌活性。因此仍然可以成功地预防金黄色葡萄球菌的定殖。
实施例12：将拥挤棒状杆菌与巴氏葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌组合在预防金黄色葡萄球菌在人皮肤模型中体内定殖的协同作用
我们研究了单独配制或以多种组合形式配制的拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和S表皮葡萄球菌的冷冻干燥的菌株抑制健康个体前臂皮肤上金黄色葡萄球菌生长的能力，使用穿孔的水胶体无菌贴片作为模板来勾画实验区域(如图5A所示)。事实上，如前所述，考虑到这些部位之间结构和微生物群落组成的相似性，前臂皮肤是皮肤和前鼻孔两者的极好模型。
材料和方法
如实施例11中所述制备冻干的拥挤棒状杆菌菌株AF2345、巴氏葡萄球菌菌株AF2652和表皮葡萄球菌菌株AF2302的小瓶。在水胶体无菌贴片中打出9个均匀间隔的4.5mm直径的孔，每个孔构成一个30μl的以皮肤为底部的孔。在测定当天，在知情同意的健康人类志愿者的前臂内侧皮肤上施加两个贴剂。将冻干的细菌滤饼重悬于无菌水中，并稀释至3x108CFU/mL的浓度。将金黄色葡萄球菌ATCC 29213在血琼脂上传代培养，并制备浊度为1McFarland的盐水悬液并稀释，以得到约108CFU/mL的悬液。
将拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌单独或以各种组合以每物种每孔2x106CFU的剂量添加到皮肤孔中，并且金黄色葡萄球菌的剂量为每孔5x103CFU。然后用无菌聚氨酯粘合剂手术切口膜覆盖水胶体贴片和周围的皮肤(图5A)。将贴片放置在原处30小时，然后将其剥离，并用湿拭子在与每个孔相对应的皮肤区域取样以定量金黄色葡萄球菌。用无菌外科手术钳将拭子的头部切下并收集在无菌容器中。根据制造商的方案，使用Dneasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取DNA。使用靶向Spa基因的引物，在CFX96 C1000Touch实时系统(Biorad)上通过定量实时PCR(qPCR)扩增DNA提取物。用1X Itaq UniversalProbes supermix(Biorad)、500nM的每种引物，250nM探针和DNA模板制备反应混合物，最终体积为20μl。对于qPCR，先进行初始变性步骤(95℃，5min)，然后进行95℃15s和60℃1min的40个循环。进行四十个扩增循环并确定CT。结果表示为[(阈值-CT)/阈值]比率。如果在没有扩增的情况下可检测到Spa DNA，则该比率达到1，而在40个循环扩增结束时未检测到SpaDNA时，该比率达到零。
结果
图5B示出了在拥挤棒状杆菌、巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌单独和以各种组合共同孵育之后用金黄色葡萄球菌qPCR获得的[(阈值-CT)/阈值]比率。当单独使用时，所述物种中没有一个抑制金黄色葡萄球菌生长。相比之下，对于根据本发明的细菌组合拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌(与单独的金黄色葡萄球菌生长相比，金黄色葡萄球菌生长减少2.9倍)或组合拥挤棒状杆菌/巴氏葡萄球菌/表皮葡萄球菌(减少了12.6倍)，观察到了对金黄色葡萄球菌生长的协同抑制作用。
没有观察到志愿者的皮肤刺激、红斑或改变。
结论
综上所述，这些实施例说明了当将至少一种棒状杆菌属物种(例如拥挤棒状杆菌或丙酸棒状杆菌)与巴氏葡萄球菌和任选的表皮葡萄球菌组合时出现的令人惊讶的协同抗金黄色葡萄球菌活性。此外，这些结果表明，巴氏葡萄球菌特别促进棒状杆菌属物种(如拥挤棒状杆菌)的生长，并且，如在胞外基质的定量中所示，当共培养时，还以协同方式促进拥挤棒状杆菌的生物膜形成。当将棒状杆菌属物种与巴氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌共培养时，生物膜的形成也同样以协同方式得到改善。有利地，包含所述细菌物种的组合物还可以被成功地冻干并重构而没有丧失任何效应，因为重构的组合物可以以与新鲜细菌相同的水平预防金黄色葡萄球菌定殖。此外，将所述组合物施用于代表最常见的金黄色葡萄球菌生态位(即皮肤和前鼻孔)的人前臂皮肤，大大减少了金黄色葡萄球菌在体内的定殖。
这些实施例提供了第一证据，即，包含至少拥挤棒状杆菌或丙酸棒状杆菌和巴氏葡萄球菌以及优选地还包括表皮葡萄球菌的组合物代表了一种新型的、出乎意料且非常有利的组合物，可用于预防MSSA和MRSA金黄色葡萄球菌定殖。
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Claims (17)

1.一种用作药物的药物组合物，其包含至少一种棒状杆菌属物种和巴氏葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种棒状杆菌属物种选自拥挤棒状杆菌、丙酸棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黏金色棒状杆菌、结核硬脂酸棒状杆菌和非发酵棒状杆菌，优选为拥挤棒状杆菌和/或丙酸棒状杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的用作药物的药物组合物，其还包含表皮葡萄球菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用作药物的药物组合物，其每剂量包含至少103CFU的棒状杆菌属物种、至少103CFU的巴氏葡萄球菌和任选的至少103CFU的表皮葡萄球菌。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用作药物的药物组合物，其每剂量包含总共至少103细菌CFU，优选每剂量至少1.2x103，更优选至少1.4x103，甚至更优选至少3x103细菌CFU。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的用作药物的药物组合物，其中棒状杆菌属物种与巴氏葡萄球菌与表皮葡萄球菌的比率在1：0.01：0.01至1：1：1的范围内。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用作药物的药物组合物，其还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7所述的用作药物的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含至少一种冻干保护剂，其优选地选自蛋白胨、甘油、乳糖、明胶、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、麦芽糖糊精、阿东糖醇和谷氨酸钠。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用作药物的药物组合物，其中所述组合物是冻干的或冷冻干燥的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的用作药物的药物组合物，其还包含至少一种药学上可接受的胶凝剂。
11.根据权利要求1或10中任一项所述的药物组合物，其用于预防金黄色葡萄球菌的鼻腔定殖。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述金黄色葡萄球菌是甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
13.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物、适于鼻腔使用的凝胶和用于鼻腔施用的构件。
14.组合物，其包含至少一种棒状杆菌属物种和巴氏葡萄球菌，并且任选地还包含表皮葡萄球菌。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是冻干的或冷冻干燥的。
16.根据权利要求14或15所述的组合物在预防金黄色葡萄球菌定殖中的用途。
17.在有需要的受试者中预防金黄色葡萄球菌定殖，优选在鼻孔和/或皮肤中定殖的方法，其包括施用根据权利要求14或15所述的组合物。
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