TW202328169A - 治療細菌性陰道炎的方法和組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種使用尼羅吳郭魚抗菌胜肽4（TP4）治療由陰道加德納菌引起的細菌性陰道炎（BV）的新療法，該TP4對BV相關細菌具有廣效抗微生物及抗生物膜活性，但對有益的乳酸桿菌無作用。
Description
本發明涉及一種治療細菌性陰道炎的方法和組合物。
細菌性陰道炎（BV）為育齡婦女的常見病況，全球盛行率超過30%。BV的原因為陰道中的微生物叢失衡，其中產乳酸菌通常在保持抑制病原菌拓殖的酸性環境（pH ＜4.5）中扮演必要角色
1 、 2。一種這樣的病原體為陰道加德納菌（
Gardnerella vaginalis），其在BV中經常隨著產乳酸菌的比率減少而增加
3。患者通常會出現陰道異味及稀薄的乳狀分泌物。若忽視治療，則BV可能引起骨盆腔發炎、早產感受性增加、或甚至不孕
4。
目前一線抗生素給藥方案包括有口服甲硝唑、局部陰道內克林達黴素（clindamycin）乳膏、及甲硝唑凝膠
5。這些治療與BV的高復發率（在六個月到一年內超過50%）相關，這可能是由於抗生素無法有效根除細菌生物膜所致
6 、 7 、 8。目前一線抗生素甲硝唑及克林達黴素無法抑制許多BV相關細菌
9。過去認為BV以陰道加德納菌為主，並伴有其他厭氧菌，諸如陰道奇異菌（
Atopobium vaginae）、無枝菌酸棒狀桿菌（
Corynebacterium amycolatum）、二路普雷沃菌（
Prevotella bivia）、及具核梭桿菌（
Fusobacterium nucleatum）
3 、 47。然而，最近的研究表明，好氧菌，諸如咽峽炎鏈球菌（
Streptococcus anginosus），也與陰道炎相關
11。這意味著目前僅對厭氧菌有效的一線抗生素給藥方案不足以治療某些患者。然而，新的BV藥物開發極其緩慢。儘管FDA在2017年批准塞尼噠唑（Solosec，硝基咪唑衍生物），但預期這種新藥具有與目前一線抗生素相同的缺點
48。陰道加德納菌及BV相關細菌經常在BV生物膜中形成複雜的多微生物生物結構
10，其並非僅由厭氧菌所構成。已發現到一些好氧菌，諸如鏈球菌種及大腸桿菌，也與BV致病性相關
11。在患者接受抗生素治療後，對抗生素不敏感的共存微生物可能變成人類陰道微生物相內的優勢種。例如，抗生素治療的副作用為陰道念珠菌症
12、 13。當患者反復患有陰道炎時，他們更容易感染性傳播感染（STI），諸如滴蟲病或人類免疫不全病毒（HIV）
14 、 15，使得難以恢復健康環境。因此，BV治療需要新的治療策略。
最近的各種研究已提出減少BV復發的替代治療方法，包括有延長抗微生物給藥方案
13、口服或陰道施用益生菌
16 、 17 、 18、或雙性表面活性劑子宮托（WO3191）與一線給藥方案的組合
19、以及輔助陰道內乳酸
20或硼酸治療
21。儘管其中一些方法似乎有前途，但在停止治療後就提供長期治癒方面進展有限。
希望開發一種用於BV治療的新活性醫藥成分（API），其對相關陰道病原體具有廣效抗微生物活性，且不會損害正常的有益陰道菌群
22。
在本發明中出乎意料地發現，尼羅吳郭魚抗菌胜肽4（tilapia piscidin 4，TP4）展現出對BV相關細菌具有廣效抗微生物及抗生物膜活性，但對有益的乳酸桿菌無作用。也發現到BV相關陰道加德納菌即使在連續暴露於肽後仍易受TP4影響。
另外，TP4肽及EDTA二鈉與生物膜破壞劑（幾丁聚醣）的組合可根除由單一或混合的陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌所形成的生物膜。另外，TP4肽在幾丁聚醣中的長期儲存不會降低其對陰道加德納菌的殺菌活性。另一個考量為廣效抗微生物活性API應與生物膜破壞劑組合使用以促進其殺菌作用。
因此，本發明提供一種治療細菌性陰道炎（BV）的新策略。
在一方面，本發明提供一種吳郭魚抗菌胜肽4（TP4）的用途，其係用於造治療細菌性陰道炎（BV）的藥劑。
在本發明的一個具體實施例中，TP4具有SEQ ID NO: 1中所示的胺基酸序列；其為TP4的功能性片段或變體。
在另一方面，本發明提供一種吳郭魚抗菌胜肽4（TP4）的用途，其係用於製造抑制陰道加德納菌的藥劑。
在本發明的一個具體實施例中，該陰道加德納菌伴隨有選自由以下組成的群的厭氧菌：陰道奇異菌、無枝菌酸棒狀桿菌、二路普雷沃菌、具核梭桿菌、及其任意組合。
在一個具體實施例中，該TP4與生物膜破壞劑組合。例如，該TP4及EDTA二鈉與生物膜破壞劑組合，其可根除由單一或混合的陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌所形成的生物膜。
在本發明的一個實例中，該生物膜破壞劑為幾丁聚醣。
另一方面，本發明提供一種用於治療細菌性陰道炎（BV）的醫藥組合物，其包含TP4及醫藥上可接受的載體。
本發明也提供一種抑制陰道加德納菌的醫藥組合物，其包含TP4及醫藥上可接受的載體。
在再一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含TP4與一或多個抗BV劑的組合，該組合的比率在治療BV時提供增效作用。
在又一方面，本發明提供一種TP4的用途，其係用於製造治療BV或抑制陰道加德納菌的藥劑。
下面描述闡述本發明的一或多個具體實施例的細節。本發明的其他特徵或優點將從以下若干具體實施例的詳細描述以及從所附申請專利範圍變得顯而易見。
下面的描述僅僅是為了說明本發明的各種具體實施例。因此，本文所討論的具體實施例或修飾不應解釋作對本發明的範圍的限制。對本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，在不背離本發明的範圍的情況下可進行各種改變或等同替換。
為了提供對本發明的清楚與容易的理解，首先定義某些用語。在整個詳細描述中闡述其他定義。除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學用語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般理解的相同含義。
如本文中使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指稱物件。因此，例如提及「一種組分」，其包括複數個該組分及本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的等同物。
「包含（comprise）」或「包含（comprising）」等詞大體上以包括/包括（include/including）的意義使用，其是指允許存在一或多種特徵、成分或組分。「包含（comprise）」或「包含（comprising）」等詞涵蓋「由…組成（consists）」或「由…組成（consisting of）」等詞。
本文所用的「大約」或「約」等詞涉及本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解的可接受偏差的程度，其可根據其所使用的上下文而在一定程度上變化。特定而言，「大約」或「約」可指具有在引用的值附近的±10%或±5%或±3%的範圍內的數值。
本文所用的「抗微生物肽」或「AMP」等詞涉及具有抗微生物功效的肽，其為許多植物及動物的先天免疫系統的重要組成部分，有助於有效殺滅入侵的病原菌及調節宿主免疫，而不會傷害宿主細胞
23 、 24。大多數已知的AMP具有α-螺旋構型，總體上帶正電荷及雙性特徵。由於帶正電荷，因此可能選擇性攻擊帶負電荷的病原菌。疏水肽結構域與脂質雙層相互作用引起膜擾動
25 、 26。另外，許多AMP能有效抑制生物膜的形成
27。AMP由於其體內穩定性差、快速降解及生理環境去活化，因此很少轉化為臨床應用。然而，一些候選AMP已進入用於治療局部感染的臨床試驗，諸如LTX-109（Lytixar）（臨床試驗辨識碼：NCT01223222、NCT01803035及NCT01158235），以及Pexiganan（Locilex）（NCT01590758及NCT01594762）、SGX942（NCT02013050）
63。
本文所用的「尼羅吳郭魚抗菌胜肽4」、「吳郭魚抗菌胜肽4」、「TP4肽」或「TP4」等詞涉及從尼羅吳郭魚（
Oreochromis niloticus）鑑定的AMP、或其功能性片段或變體，其對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌表現出廣效活性。TP4具有FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR（SEQ ID NO: 1）的胺基酸序列，如Peng等人所揭示（Peng等人，Five different piscidins from Nile tilapia，Oreochromis niloticus: analysis of their expressions and biological functions；PLoS One 7(11):e50263，2012）。已證實其對抗藥性細菌有效
28 、 29。TP4肽除了作為殺微生物劑的直接作用外，其也具有其他性質，包括有調節宿主細胞免疫、根除生物膜、及促進傷口癒合
28 、 30 、 31。
在本研究中評估及發現到TP4肽可作為局部殺微生物劑用於臨床用途。應當考慮局部環境是否影響殺菌活性。因此，在本研究中進行產品的預配方評估
64。一般而言，AMP在溶於水時呈隨機螺旋形態，且當其與細菌表面接觸時形成活性兩親性α-螺旋，接著促進膜滲漏
65。二級結構極易受環境影響，這會改變AMP引起膜滲漏的能力
66。VFS用於模擬陰道分泌物環境，並發現在這種溶劑中，TP4保持對陰道加德納菌的選擇性殺菌活性，且不影響健康人類陰道乳酸桿菌（圖1A到1C及表1）。發明人也考慮在製造期間或當其進入生物系統時肽的降解
67。HPLC及CD用於評估TP4肽穩定性及二級結構，揭示TP4肽在很寬範圍的溫度以及鹽、EDTA二鈉、過氧化氫及乳酸的濃度下是穩定的；其在這些條件下不會失去其二級結構（圖6A到6H）。綜上所述，發明人的數據顯示TP4肽作為殺微生物劑候選物具有很大的發展潛力。
表 1 ：模擬陰道分泌物的組合物
| 模擬陰道分泌物的組合物 | ||
| 化學名稱 | 化學式 | g/L |
| 葡萄糖 | C 6H 12O 6•H 2O | 5 |
| 甘油 | C 3H 8O 3 | 0.16 |
| 氯化鈉 | NaCl | 3.51 |
| 氯化鉀 | KCl | 1.5 |
| 尿素 | NH 2CONH 2 | 0.4 |
| 白蛋白 | 0.018 | |
| 黏蛋白 | 0.25 | |
| 乳酸 | C 3H 6O 3 | - |
| 乙酸 | CH 3CO 2H | - |
由於安全考量，所以各種陰道殺微生物劑製劑不能進入臨床試驗，因此在開發過程的早期需要對先導殺微生物劑製劑進行評估
68。世界衛生組織（WHO）建議殺微生物劑製劑候選物的滲透壓不應超過380 mOsm/kg以降低陰道上皮損傷的風險，且pH值應為約3.5到4.5（在正常陰道值附近）以防止增加BV風險及HIV存活
69。在本研究中，作為TP4肽賦形劑的幾丁聚醣製劑符合這些WHO的建議（TP4殺微生物劑製劑滲透壓＜380 mOsm/Kg，pH 4.5）。在C57BL/6小鼠中評估TP4殺微生物劑製劑的臨床前安全性，包括有評估陰道發炎、腫脹、黏膜損傷及局部毒性、以及對陰道正常菌群的危害
68。在接受陰道內施用TP4殺微生物劑製劑的小鼠中並無明顯毒性。經雌二醇治療的小鼠經常用作動物模型以建立與人類生殖道感染相關的病原體的拓殖，諸如陰道加德納菌
46、 59、 70、無乳鏈球菌（
Streptococcus agalactiae）
71、淋病雙球菌（
Neisseria gonorrhoeae）
45 、 72。經雌二醇治療的小鼠陰道的pH（pH範圍5.8到7.2
45）有益於BV相關細菌的拓殖，其可經接種以評估TP4殺微生物劑製劑的體內殺微生物活性。在本研究中，發明人建立由陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌或乳酸桿菌的單一或雙物種陰道拓殖的鼠模型。發明人證明TP4殺微生物劑製劑降低BV相關細菌而非乳酸桿菌的拓殖密度。不令人感到意外的是，甲硝唑並無降低經雙物種感染的小鼠中的咽峽炎鏈球菌存活。然而，TP4殺微生物劑製劑的免疫調節作用無法在此模型中評估，這是因為在經接種的小鼠陰道組織及液體中有非明顯發炎反應的緣故（未顯示數據）（在陰道加德納菌、咽峽炎鏈球菌或雙物種後觀察）。這些結果與先前報導一致
46。總體而言，本研究表明TP4殺微生物劑製劑具有廣效BV相關殺菌活性。TP4肽、螯合劑EDTA二鈉及生物膜破壞劑幾丁聚醣可能為治療多微生物BV生物膜的有效抗生物膜製劑。
本文所用的「治療」乙詞涉及向患有病症、病症的病徵或病況、或病症的惡化的個體施用一或多種活性劑，目的為治癒、癒合、減輕、緩和、改變、補救、改善、改進或影響病症、病症的病徵或病況、由病症引起的殘疾、或病症的惡化或患病傾向。
本文所用的「醫藥上可接受的」是指載體與組合物中的活性成分相容，且較佳可穩定該活性成分且對接受個體是安全的。該載體可為活性成分的稀釋劑、媒介物、賦形劑或基質。通常，包含如本文所述的抗TP4作為活性成分的組合物可呈溶液形式，諸如水溶液，例如鹽水溶液，或其可呈粉末形式提供。合適的賦形劑也包括有乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶型纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、滅菌水、糖漿、以及甲基纖維素。該組合物可進一步含有接近生理條件所需的醫藥上可接受的輔助物質，例如pH調節及緩沖劑，諸如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。該組合物的形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、小包、糖劑、酏劑、懸浮劑、洗劑、溶液、糖漿、軟明膠膠囊及硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液、以及包裝粉末。本發明的組合物可經由任何生理學上可接受的途徑給藥，諸如口服、腸胃外（諸如肌肉內、靜脈內、皮下及腹膜內）、經皮、栓劑、以及鼻內方法。在某些具體實施例中，本發明的組合物作為液體可注射製劑施用，其可以即用型劑型或可複溶的穩定粉末提供。
本文所用的「有效量」乙詞涉及在經治療的個體或細胞中賦予所欲生物作用的活性成分的量。有效量可根據各種原因而改變，諸如給藥途徑及頻率、接受該藥品的個體的體重及種類、以及施用目的。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可基於本文的發明、已建立的方法、及其自身經驗來判定每種情況下的劑量。
本文所用的藉由本文所述的治療方法治療的「個體」乙詞涉及人類或動物。需要治療的人類個體可為患有、處於風險中或懷疑患有細菌性陰道炎（BV）的人類患者。懷疑患有任何這種目標疾病/病症的個體可能顯示出一或多個疾病/病症的症狀。處於疾病/病症風險中的個體可為具有一或多個該疾病/病症的風險因素的個體。
在一些具體實施例中，如本文所述的TP4治療可與本領域已知的一或多個抗BV劑（諸如抗生素）組合使用。
為了研究TP4肽在BV中的治療潛力，也在BV相關細菌的生物膜形成中製備TP4肽。TP4肽與BV相關細菌的成熟生物膜上的生物膜破壞劑組合。評估TP4殺微生物劑製劑在體內的安全性及功效，並發現TP4殺微生物劑製劑應為BV治療的潛在策略。
藉由以下實例進一步說明本發明，提供這些實例是為了說明而非限制。根據本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應當理解，可在所揭示的特定具體實施例中進行許多改變，且在不脫離本發明精神及範圍下仍可獲得相同或相似結果。
實施例
1.
材料及方法
1.1
多肽合成及二級結構分析
由GL Biochem Ltd.（Shanghai，China）合成TP4肽（H-FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR-OH）。TP4的溶液結構已在先前研究中報導（蛋白質數據庫，登錄號：5H2S）；使用PyMOL看到肽結構
73。
1.2
菌株、原生動物及培養條件
BV相關細菌陰道加德納菌（ATCC 14018、ATCC 49145）、念珠菌病原體白色念珠菌（
Candida albicans）（ATCC 14053）、滴蟲病病原體陰道滴蟲（
Trichomonas vaginalis）（ATCC 30001）及人類陰道衍生的乳酸桿菌、捲曲乳酸桿菌（
Lactobacillus crispatus）（ATCC 33820）、加氏乳酸桿菌（
Lactobacillus gasseri）（ATCC 33323）、植物乳酸桿菌（
Lactobacillus plantarum）（ATCC 14917）、詹氏乳酸桿菌（
Lactobacillus jensenii）（ATCC 25258）購自美國典型培養物保存中心（ATCC）。陰道加德納菌M
R為ATCC 14018的自發甲硝唑抗性突變株。BV相關細菌及健康人類陰道乳酸桿菌的臨床分離株由台灣國立陽明交通大學莊博士提供（所有細菌分離株列於表2）。所有BV相關細菌都在NYCIII肉湯（ATCC培養基1685）中培養，並在37℃、厭氧條件下使用AnaeroPack®-Anaero（MGC，Japan）成長。除了加氏乳酸桿菌在好氧條件下生長以外，所有乳酸桿菌種在MRS肉湯（Difco BD）中培養，並在37℃兼厭氧條件下使用AnaeroPack®-MicroAero（MGC，Japan）生長。白色念珠菌在YM肉湯（Difco BD）中培養，並在37℃、好氧條件下生長。
表 2 ： TP4 及抗生素在 BV 相關細菌及陰道乳酸桿菌的臨床分離株上的 MIC 及 MBC 測試。
X：無生物膜形成能力；O：能形成生物膜
| 編號 | 臨床株 | 甲硝唑 | 克林達黴素 | TP4 | 生物膜形成能力 | |||
| MIC | MBC | MIC | MBC | MIC | MBC | |||
| μg/mL | ||||||||
| 11-1-1 | 中間鏈球菌 | 62.5 | 250-500 | 15.63 | 31.25-62.5 | 15.63 | 31.25 | X |
| 11-4-1 | 咽峽炎鏈球菌 | 125 | ＞500 | 15.63 | 62.5-125 | 7.81 | 15.63 | O |
| 3-1-1 | 咽峽炎鏈球菌 | 125 | 250-500 | 31.25 | 125-250 | 7.81 | 15.63-31.25 | O |
| 3-3-1 | 咽峽炎鏈球菌 | 125 | 250-500 | 15.63 | 62.5 | 7.81 | 15.63-31.25 | O |
| 3-5-8 | 咽峽炎鏈球菌 | ＞500 | ＞500 | 31.25 | 62.5 | 7.81-15.63 | 15.63 | O |
| 4-3-1 | 咽峽炎鏈球菌 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | 7.81 | 7.81-15.63 | O |
| 3-2-9 | 無乳鏈球菌 | ＞500 | ＞500 | 500 | ＞500 | 15.63 | 15.63-31.25 | X |
| 11-5-11 | 無乳鏈球菌 | ＞500 | ＞500 | 125 | ＞500 | 7.81-15.63 | 7.81-15.63 | X |
| 4-4-1 | 無乳鏈球菌 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | 7.81 | 7.81 | O |
| 12-1-1 | 巴氏鏈球菌( Streptococcus pasteurianus) | 500 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | 3.91-7.81 | 15.63-31.25 | X |
| 8-1-1 | 大腸桿菌 | 500 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | 3.91-7.81 | 15.63 | X |
| 8-4-1 | 鳥腸球菌( Enterococcus avium) | ＞500 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | 1.95-3.91 | 3.91 | X |
| 1-3-16 | 放線棒菌(( Actinobaculum schaalii) | 15.63 | 500 | ＞500 | ＞500 | 1.95-3.91 | 3.91 | X |
| 6-2-4 | 陰道加德納菌 | 7.81 | 15.63-31.25 | 15.63 | 31.25-62.5 | 3.91-7.81 | 7.81-15.63 | O |
| 11-5-4 | 陰道加德納菌 | 62.5 | 125 | 500 | ＞500 | 7.81 | 7.81-15.63 | O |
| 3-2-23 | 陰道加德納菌 | 3.91 | 15.63 | 3.91 | 3.91-7.81 | 3.91 | 7.81 | O |
| 4-3-11 | 陰道加德納菌 | ＞500 | ＞500 | 7.81 | 15.63 | 3.91 | 7.81 | O |
| 7-2-4 | 捲曲乳酸桿菌 | ＞500 | ＞500 | 125 | 250 | 125 | 250 | X |
| 8-5-12 | 捲曲乳酸桿菌 | ＞500 | ＞500 | 125 | 250 | 125 | 250 | X |
| 4-5-8 | 捲曲乳酸桿菌 | ＞500 | ＞500 | 500 | ＞500 | 62.5 | 250 | X |
1.3
微量肉湯稀釋檢定
藉由MIC及MBC實驗評估TP4及抗生素的抗菌活性。體外抗微生物活性的評估方法遵照臨床與實驗室標準協會（CLSI）的指導方針，僅稍作修改。補充有1%葡萄糖（BHIG）、YM及MRS肉湯的腦心浸出液（BHI）培養基（Difco BD）分別用於BV相關細菌，即白色念珠菌及乳酸桿菌種的微量肉湯稀釋檢定。以圓底96孔微量盤（Corning）中的試驗培養基製備抗微生物劑的連續稀釋液，並使細菌的新鮮隔夜培養物加入到最終接種物為5 × 10
5CFU/mL（在抗真菌藥物敏感試驗中為1 × 10
3CFU/mL，CLSI M27-A3）。在培養24小時後，使無可見生長的最低抗微生物劑濃度定義為MIC。在MIC測試中，在瓊脂培養盤上從肉湯稀釋液中對細菌進行繼代培養，以測定抗微生物劑具有抗菌作用的最低濃度（定義為MBC）。
1.4
生物膜形成能力的評估
BV相關細菌的生物膜形成能力如前所述進行測定，僅稍作修改
74 、 75。所有BV相關細菌都在含有0.3%澱粉（Sigma）及1%葡萄糖（sBHI）的BHI中生長以形成生物膜。使生長培養基（NYCIII）中陰道加德納菌的隔夜培養物在生物膜培養基（sBHI）中進行傳代培養。進行若干次繼代培養以使細菌適應生物膜培養基；細菌在浮游及生物膜階段具有不同的基因表現及代謝特徵。在96孔平底微孔盤（Corning）中，將200 μL sBHI中新鮮的細菌隔夜培養物添加到1 × 10
6CFU/mL的最終接種物中。在37℃、厭氧條件下培養24小時後，除去培養基及浮游細胞，並以鹽水清洗每個孔兩次。在清洗後，使培養盤在烘箱中乾燥1小時。生物膜以200 μL 0.5%結晶紫溶液染色，接著以200 μL鹽水清洗兩次以除去未結合的染料。藉由在結晶紫染色後看見生物膜來測定生物膜形成能力。
1.5
殺滴蟲檢定
在37℃、5% CO
2下，使陰道滴蟲（ATCC 30001）保持在補充有10%（v/v）熱去活化牛血清（Sigma）的胰蛋白糖-酵母-麥芽糖（TYM，ATCC培養基358）培養基中。對於殺滴蟲檢定，使5 × 10
5個細胞接種到12孔盤的孔中。接著，使細胞與指定濃度的TP4或甲硝唑一同培養24小時。如前所述，使用台盼藍排除測試評估陰道滴蟲存活力
76。血細胞計數器用來計算活細胞的數量。
1.6 VFS
中的
TP4
殺菌活性
VFS組合物示於表1，並如前所述製備，僅稍作修改
77。此VFS配方不包括有乳酸及乙酸，以保持陰道加德納菌的高存活率。由新鮮的隔夜培養物製備陰道加德納菌（ATCC 14018）、捲曲乳酸桿菌（ATCC 33820）及加氏乳酸桿菌（ATCC 33323）接種物，在VFS中調節到最終濃度為1 × 10
6CFU/mL。加入TP4到最終濃度為0、20、50、100 μg/mL（0 μg/mL作為對照組）。在培養2小時後，使混合物鋪板用於CFU定量。
1.7
時間
-
殺滅分析
以BHIG中的新鮮隔夜培養物製備的陰道加德納菌（ATCC 14018）接種物，調節到最終濃度為1 × 10
6CFU/mL。加入TP4及抗生素到1× MBC（甲硝唑：3.91 μg/mL，克林達黴素：7.81 μg/mL及TP4：3.91 μg/mL）或2× MBC（甲硝唑：7.81 μg/mL，克林達黴素：15.63 μg/mL及TP4：7.81 μg/mL）的濃度。不加入抗微生物劑BHIG以控制生長。從塗布在NYC III瓊脂培養盤上的培養物計算CFU的數量，並在37℃、厭氧條件下培養0、1、2、4、6、8、12及24小時。
1.8
抗性發展檢定
藉由微量肉湯稀釋檢定評估TP4肽治療誘導抗性的傾向。陰道加德納菌（ATCC14018）在抗性誘導研究中連續傳代。如前所述進行實驗，僅稍作修改
78 、 79。甲硝唑及克林達黴素作為抗生素對照組。首先進行MIC測試，且以新鮮的NYC-III培養基在一半MIC（1/2 MIC孔）中使細菌傳代培養。在細菌生長到穩定期後，測量下一代MIC；根據微量肉湯稀釋檢定中描述的實驗程序，使細胞在37℃下培養24小時。對於22代中的每一代，三重複測定MIC。
1.9
最低生物膜抑制濃度（
MBIC
）
如前所述進行生物膜形成抑制活性的評估，僅稍作修改
80。以sBHI在平底盤96孔微孔盤製備抗微生物劑的連續稀釋液，並使細菌的新鮮隔夜培養物加入到最終接種物為1 × 10
6CFU/mL。在37℃、厭氧條件下培養24小時後，從各孔中除去培養基及浮游細胞，並以鹽水清洗各孔兩次。在清洗後，使培養盤在烘箱中乾燥1小時。生物膜以200 μL 0.5%結晶紫溶液染色，接著以鹽水清洗兩次以除去未結合的染料。MBIC測定為抑制生物膜的發展所需的最低抗微生物劑濃度。
1.10 RNA
分離及定量即時
PCR
（
qRT-PCR
）
在NYC III（生長培養基）及sBHI（生物膜培養基）中陰道加德納菌的新鮮隔夜培養物用來評估浮游及生物膜階段的細菌細胞。根據製造商的操作說明，使用TRIzol Max細菌RNA分離試劑盒（Thermo Scientific）萃取總RNA。逆轉錄試劑（Toyobo）用於逆轉錄總RNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo）及ABI StepOnePlus即時PCR系統（Applied Biosystems，Foster，CA，USA），藉由qRT-PCR分析唾液酸酶、陰道溶素（vaginolysin）、桿菌素運輸ATP結合蛋白、及多藥物抗性ABC運輸蛋白基因的表現程度。循環步驟為：95℃下5分鐘，接著95℃下15秒、56℃下60秒的循環40個。用於qRT-PCR的引子列於表3中。
表 3 ：本研究中使用的引子列表。
| 基因 | 序列 (5’-3’) | 擴增子尺寸 (bp) | 參考號或 GenBank 登錄號 | 實驗 |
| 陰道加德納菌16S | F: TGAGTAATGCGTGACCAACC (SEQ ID NO: 2) | 167 | 10、58 | 用於定量陰道加德納菌中致病力基因的轉錄 |
| R: AGCCTAGGTGGGCCATTACC (SEQ ID NO: 3) | ||||
| 唾液酸酶 | F: CCGAATTTGCGATTTCTTCT (SEQ ID NO: 4) | 189 | ||
| R: CGTACGGAAGTTTTGGAAGC (SEQ ID NO: 5) | ||||
| 多藥物抗性ABC運輸蛋白 | F: CAGCACCTGTAGCTCCAACA (SEQ ID NO: 6) | 195 | ||
| R: TGGCTCAAGAGATTGTGTGC (SEQ ID NO: 7) | ||||
| 桿菌素運輸ATP結合蛋白 | F: CCGACCGCATACCTATTTTG (SEQ ID NO: 8) | 178 | ||
| R: GCAAGACGGTCTCCAAACTC (SEQ ID NO: 9) | ||||
| 陰道溶素 | F: GAACAGCTGGGCTAGAGGTG (SEQ ID NO: 10) | 153 | ||
| R: AATTCCATCGCATTCTCCAG (SEQ ID NO: 11) | ||||
| 共同16S | F: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID NO: 12) | 309 | 87 | 用於鑑定經接種的小鼠陰道細菌 |
| R: ACTGCTGCSYCCCGTAGGAGTCT (SEQ ID NO: 13) | ||||
| 加氏乳酸桿菌16S | F: AAGGGCGCATGGTGAATGCCT (SEQ ID NO: 14) | 312 | AF182721.1 | |
| R: TGCTATCGCTTCAAGTGCTT (SEQ ID NO: 15) | ||||
| 捲曲乳酸桿菌16S | F: GCGAGCGGAACTAACAGATTT (SEQ ID NO: 16) | 150 | MT613437.1 | |
| R: TGATCATGCGATCTGCTTTCT (SEQ ID NO: 17) | ||||
| 咽峽炎鏈球菌16S | F: GTTTTGCAGAAGCGATTGTC (SEQ ID NO: 18) | 159 | AH008392.2 | |
| R: TGAGAGCACGGTTTGAGTCG (SEQ ID NO: 19) | ||||
| 陰道加德納菌16S | F: GGTCGCGTCCTATCAGCTTGTAG (SEQ ID NO: 20) | 558 | MT644518.1 | |
| R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCT (SEQ ID NO: 21) | ||||
| F：前置，R：反置 |
1.11
生物膜破壞檢定
在本研究中使用的不同分子量的幾丁聚醣（Sigma）總結在圖5A中。使1.2%的幾丁聚醣儲備液溶解在0.1M乙酸的無菌鹽水中。製備新鮮的陰道加德納菌（ATCC 14018）生物膜隔夜培養物，從各孔中取出浮游細胞並以鹽水清洗兩次。接著，使連續稀釋的幾丁聚醣加入到成熟生物膜。在隔夜培養後，以鹽水清洗生物膜兩次、以結晶紫染色、並藉由OD在585 nm進行定量。如前所述，藉由結晶紫染色法進行生物膜質量定量，僅稍作修改
75。
1.12
生物膜細胞存活力檢定
在96孔平底微孔盤中，將sBHI中陰道加德納菌3-2-23、咽峽炎鏈球菌11-4-1、或陰道加德納菌3-2-23與咽峽炎鏈球菌11-4-1組合（1:1，混合培養生物膜）的新鮮隔夜培養物加入到50 μL 的1 × 10
6CFU/mL的最終接種物中。在37℃、厭氧條件下培養24小時後，除去培養基及浮游細胞，且各孔以鹽水清洗兩次。將TP4與EDTA二鈉（Sigma）溶液組合的連續稀釋液加到成熟生物膜中。使細胞在37℃、厭氧條件下培養6小時，接著根據製造商的操作說明，使用阿爾瑪藍（Thermo Scientific）分析細菌存活力。在測試TP4與EDTA二鈉在幾丁聚醣凝膠的組合抗成熟生物膜的實驗中，在24孔平底微孔盤中，將sBHI中陰道加德納菌3-2-23、咽峽炎鏈球菌11-4-1、或陰道加德納菌3-2-23與咽峽炎鏈球菌11-4-1組合（1:1，混合培養生物膜）的新鮮隔夜培養物加入到400 μL 的1 × 10
6CFU/mL的最終接種物中。如上所述進行實驗程序。將TP4、EDTA二鈉及幾丁聚醣的不同組合加入到成熟生物膜。在37℃、厭氧條件下培養6小時後，使用CFU平板計數法分析細菌存活力。
1.13 TP4
肽的預配方研究
HPLC及CD用於研究TP4肽在不同環境條件下的穩定性及二級結構。為研究TP4的長期穩定性，將500 μg/mL的肽溶解在各種緩沖水溶液中。藉由將肽在-20、4、25、37及65℃下儲存1個月來評估溫度對TP4肽的影響。藉由將肽儲存在0、50、150、250、500 mM氯化鈉中1個月來評估鹽濃度對TP4肽的作用。在生理環境中，人體陰道菌群中以乳酸桿菌為主，其分泌乳酸及過氧化氫（H
2O
2）到陰道分泌物中。評估氧化及酸性環境對TP4肽的影響。實驗濃度高於生理濃度範圍
38。在0、56.5、113、565、1130 mM乳酸（乳酸的生理濃度：55到111 mM）下評估酸性環境對TP4肽穩定性的作用
38。藉由使TP4暴露於8 mM H
2O
2溶液（H
2O
2的生理濃度＜ 100 μM）來評估TP4肽的氧化
38。評估TP4肽在不同環境條件下一個月的穩定性；在第0、1、2、3、7、14、21及28天收集樣品，按照先前報導的方法藉由HPLC（Waters Corporation，Milford，MA）進行分析
81。為了研究TP4肽的二級結構變化並測定其在不同溶液中的穩定性，使TP4肽（145 μg/mL）溶解在連續稀釋的膜模擬SDS溶液（0、1、5、10、50、100 mM）或含有不同濃度氯化鈉（0、100、200及400 mM）或不同濃度EDTA二鈉（0、0.1、0.4、1.6及6.4 mM）的100 mM SDS溶液中。測量溫度對TP4結構的作用，使145 μg/mL的肽在不同溫度（20、37、50及90℃）下在100 mM SDS溶液中預培養1小時。使用J-815 CD光譜儀（Jasco，Japan），在25℃下、260到190 nm或260到200 nm的波長範圍內測量樣品的遠紫外光CD光譜。對於每個光譜，使用1 mm路徑長度的石英比色槽（Hellma Analytics，Germany）收集五次掃描的平均值。
1.14
實驗動物
小鼠實驗得到中央研究院實驗動物照護及使用委員會批准（申請表編號：IACUC 20-12-1568）。六周齡雌性C57BL/6小鼠購自BioLASCO，Taiwan Co.，Ltd.。所有小鼠都保持在恆溫下及12:12小時的亮暗循環中。使小鼠在實驗前適應環境2周。
1.15
小鼠發情周期
小鼠發情周期分為四個主要階段，包括有發情前期、發情期、發情後期及發情間期，該周期持續4到5天
82。發情周期將影響小鼠生殖道組織的生理特徵及局部免疫反應
83 、 84。在發情前期到發情期，在陰道腔中上皮完全角質化，且表皮逐漸脫落
83 、 84。難以區分由生理或藥物毒性引起的上皮細胞脫落。因此，這個階段不適合評估藥物毒性。在目前評估局部藥劑對生殖道毒性的研究中，施用Depo-Provera使小鼠保持在類發情間期狀態，從而降低組織病理學評估的變異性
43 、 44。在發情後期到發情間期，陰道上皮細胞變薄，且陰道上皮細胞中存在白血球浸潤
83 、 84。在此階段，陰道菌群中的細菌數量減少，且宿主免疫反應防止細菌感染及拓殖
45 、 71。β-雌二醇經常用於小鼠陰道感染模型中的發情同步
45 、 46 、 59 、 85。這種治療抑制發炎反應（多形核白血球的自然流入）並增加小鼠陰道中細菌拓殖的感受性。因此，本研究中的小鼠陰道感染模型包括有施用β-雌二醇的步驟，其根據陰道細胞學使小鼠處於類發情狀態。這種狀態降低細菌拓殖能力的變異性。在實驗之前，根據陰道細胞學，確認所有小鼠都處於發情期[圖13A到13B]。
1.16 TP4
殺微生物劑製劑在小鼠中的毒性評估
對小鼠陰道毒性的評估遵照先前的研究，僅稍作修改
43 、 44。八周齡雌性C57BL/6小鼠，在陰道施用TP4殺微生物劑製劑後，用於評估組織毒性。為了在發情間期同步，在藥物毒性測試前4天，小鼠皮下注射200 μL乳酸林格氏液中的2 mg Depo-Provera（Sigma）。在同步後，小鼠陰道抹片具有優勢的白血球群，表明處於類發情狀態。小鼠接受單次陰道施用20 μL鹽水（陰性對照組）、5% N-9（陽性對照組）（Sigma）、2% BZK（陽性對照組）（Sigma）、5或10 mg/mL TP4鹽水、或5或10 mg/mL TP4凝膠（載體凝膠含有0.1%幾丁聚醣及0.4 mM EDTA二鈉鹽水）。「空白組」是指不施用藥物且對陰道組織無刺激。小鼠在藥物施用後24小時犧牲，以進行組織病理學檢查。所有動物都在純二氧化碳麻醉下藉由放血而犧牲。收集雌性生殖系統（陰道、子宮頸、子宮及卵巢）並保存在10%中性緩衝福馬林（Sigma）中。組織修整、藉由梯度乙醇脫水、在二甲苯中澄清、包埋在石蠟中、切片至大約4到5 μm厚度、並以蘇木精-伊紅（H&E）染色。根據Shackelford等人描述的方法對病變的嚴重程度進行分級
86。根據嚴重程度，使病變的程度在組織病理學上從0到5進行分級：0=正常；1=最小（＜ 1%）；2=輕微（1到25%）；3=中度（26到50%）；4=中重度（51到75%）；5=嚴重/高（76到100%）。
1.17
小鼠陰道感染模型
為了測試TP4殺微生物劑製劑對BV相關細菌及正常人類陰道菌群的體內作用，使用BV相關細菌（陰道加德納菌3-2-23及咽峽炎鏈球菌11-4-1）及乳酸桿菌種（捲曲乳酸桿菌ATCC 33820及加氏乳酸桿菌ATCC 33323）的臨床分離株來拓殖小鼠陰道組織。這些程序遵照先前的研究，僅稍作修改
46。所有待接種的細菌都是鏈黴素抗性突變株（S
R），以便使經接種的細菌與內源性細菌區分開來。8周齡雌性C57BL/6小鼠在藥物施用前1天及3天在小腹皮下注射含0.5 mg β-雌二醇的芝麻油100 μL，以便使發情週期同步。在測試藥物施用前兩天，每天灌洗小鼠並以20 μL細菌懸浮液進行陰道接種一次，連續兩天。在陰道接種連續兩天後，每天施用測試藥物兩次，且在施用後當天藉由陰道灌洗測定細菌載量。細菌接種劑量及實驗程序示於圖14及表4中。為了定量在測試藥物施用後小鼠陰道中的細菌載量，使用含有30 μL無菌鹽水的p200微量吸管輕輕插入小鼠陰道（約5 mm深）反復吸量進行陰道灌洗。重複灌洗5次以獲得總共150 μL陰道灌洗液。使液體連續稀釋並塗布到含有1 mg/mL鏈黴素（消除內源性細菌汙染）的NYC III（用於計數陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌CFU）或MRS（用於計算捲曲乳酸桿菌及加氏乳酸桿菌CFU）平板上。使平板在37℃下厭氧培養，並在72小時後對菌落進行計數。藉由菌落PCR確認所有菌落。在Veriti™ 96孔熱循環儀（AppliedBiosystems，Foster，CA，USA）中進行菌落PCR，循環參數如下：95℃下5分鐘，接著95℃下20秒、56℃下30秒及72℃下20秒的循環40個。用於菌落PCR的引子列於表3中。
表 4 ：小鼠陰道感染實驗中所用細菌菌株、接種量及測試藥物組的列表
| 編號 | 接種的菌株 | 接種的劑量 | 第0 天( 治療/ 每天兩次) | |
| 第二天 | 第一天 | |||
| 1 | 陰道加德納菌S R3-2-23 | 2×10 7 | 1.8×10 7 | 1. 無治療對照組 2. 載體凝膠 3. TP4凝膠(5 mg/mL) 4. TP4凝膠(10 mg/mL) |
| 2 | 咽峽炎鏈球菌S R11-4- | 4×10 6 | 1×10 6 | |
| 3 | 陰道加德納菌S R3-2-23及咽峽炎鏈球菌S R11-4-1(共同感染) | 陰道加德納菌：4×10 7 | 陰道加德納菌：4.5×10 7+ 咽峽炎鏈球菌：4.8×10 4 | 1. 無治療對照組 2. 載體凝膠 3. TP4凝膠(7.5 mg/mL) 4. 甲硝唑凝膠(7.5 mg/mL) |
| 4 | 捲曲乳酸桿菌S RATCC®33820 | 1.2×10 8 | 1×10 8 | 1. 無治療對照組 2. TP4凝膠(5 mg/mL) 3. TP4凝膠(10 mg/mL) |
| 5 | 咽峽炎鏈球菌S RATCC®33323 | 2×10 8 | 2.5×10 8 |
1.18
統計分析
使用GraphPad Prism 8.0軟體進行統計分析。從至少三個獨立實驗中收集數據。藉由單因子獨立變異數分析(ANOVA)及Tukey多重比較測試來測定統計顯著性。p ＜ 0.05的值被認為是顯著的。
2.
結果
2.1 TP4
對病原體及正常陰道菌群的抗微生物活性
目前用於BV的一線抗生素與高復發率及念珠菌病相關。另外，在抗生素治療後的復發與增加性傳播感染的風險，諸如滴蟲病
13 、 14 、 15。TP4肽具有陽離子兩親性α-螺旋結構（圖9A到9B），且據報導表現出廣效抗微生物性質
28。為了研究TP4對陰道病原體，諸如陰道加德納菌、白色念珠菌及陰道滴蟲、以及健康人類陰道乳酸桿菌的影響，對一組陰道病原體及乳酸桿菌進行最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）、及殺滴蟲的檢定。表5及圖10A到10B顯示對照組抗生素對陰道病原體表現出高效的殺微生物活性。健康人類陰道乳酸桿菌顯示對抗生素的低感受性（抗生素MBC範圍為陰道加德納菌1.95到7.81 µg/mL，白色念珠菌＜0.48 µg/mL，所有乳酸桿菌＞ 62.5 µg/mL；甲硝唑＜0.98 µg/mL抑制滴蟲的生長）。對照之下，TP4肽對所有陰道病原體，包括陰道加德納菌、白色念珠菌及陰道滴蟲都表現出廣效殺微生物活性，且其也對抗甲硝唑的陰道加德納菌菌株有效（TP4肽對陰道加德納菌、陰道加德納菌M
R及白色念珠菌的MBC在3.91到7.81 µg/mL的範圍內；TP4肽31.25 μg/mL抑制滴蟲的生長）。值得注意的是，所有健康人類陰道乳酸桿菌都對TP4肽具有抗性（在所有乳酸桿菌中MBC＞250 µg/Ml）。接著，發明人評估TP4肽對BV相關細菌及用於模擬陰道環境的陰道分泌物模擬物（VFS）中正常陰道菌群的抗微生物活性。圖1A到1C及表1顯示在2小時TP4治療（TP4 20、50及100 μg/mL）後，陰道加德納菌的存活率降低超過90%（圖1A）。對照之下，與未治療的對照組相比，以TP4（TP4 20、50及100 μg/mL）治療的捲曲乳酸桿菌（圖1B）或加氏乳酸桿菌（圖1C）並無顯著差異。這些發現證明TP4肽對陰道病原體具有廣效殺微生物活性，但其不會對有益的陰道乳酸桿菌產生負面影響。重要的是，也在VFS中觀察到這種選擇性抗菌活性。
表 5 ：陰道加德納菌、白色念珠菌及陰道乳酸桿菌對 TP4 及抗生素的比較感受性。
| 菌株 | 甲硝唑 | 克林達黴素 | 雙性殺黴素B | TP4 | 生物膜形成能力 | ||||
| MIC | MBC | MIC | MBC | MIC | MBC | MIC | MBC | ||
| μg/mL | |||||||||
| 陰道加德納菌 (ATCC®14018™) | 1.95-3.91 | 3.91 | 3.91 | 7.81 | 3.91 | 3.91-7.81 | O | ||
| 陰道加德納菌M R | ＞500 | ＞500 | 7.81 | 7.81 | O | ||||
| 陰道加德納菌 (ATCC®49145™) | 1.95-3.91 | 7.81 | 1.95 | 1.95-3.91 | 3.91 | 3.91-7.81 | O | ||
| 白色念珠菌 (ATCC® 14053™) | ＜0.48 | ＜0.48 | 7.81 | 15.63 | |||||
| 捲曲乳酸桿菌 (ATCC®33820™) | ＞500 | ＞500 | 62.5 | 500 | ＞62.5 | ＞62.5 | 125 | 250 | |
| 加氏乳酸桿菌 (ATCC®33323™) | ＞500 | ＞500 | ＞500 | ＞500 | ＞62.5 | ＞62.5 | 500 | 500 | |
| 植物乳酸桿菌 (ATCC® 14917™) | ＞500 | ＞500 | 62.5 | 250 | 125 | 250 | |||
| 詹氏乳酸桿菌 (ATCC® 25258™) | ＞500 | ＞500 | 500 | ＞500 | 250 | 250 | |||
| MR：自發甲硝唑抗性突變株 O：能形成生物膜 |
2.2 TP4
以低自發抗性頻率快速殺滅陰道加德納菌
抗微生物藥物的殺菌機轉極大地影響其殺滅動力學及抗性發展。因此，發明人尋求評估TP4肽與抗生素相比的細菌殺滅動力學。對以1X或2X TP4肽或抗生素的MBC治療的陰道加德納菌研究時間-殺滅動力學。如圖2A所示，TP4肽在120分鐘內殺滅陰道加德納菌。對照之下，甲硝唑及克林達黴素表現出較長的殺菌作用時間，需要24小時來殺滅陰道加德納菌。發明人接著研究TP4肽或抗生素治療誘導抗性突變株的傾向。在殺微生物劑存在下，進行肉湯稀釋以測定細菌傳代後MIC的倍數變化。陰道加德納菌在長期暴露於TP4肽及抗生素期間傳代超過20代。如圖2B所示，甲硝唑的MIC在傳代四次後增加超過100×（MIC ＞500 μg/mL），而克林達黴素的MIC在傳代21次後增加32×（MIC為125 μg/mL）。對照之下，TP4肽的MIC在22代後僅增加4×（MIC為15.63 μg/mL）。基於這些數據，發明人得出TP4肽較一線抗生素更快地殺滅細菌且其不容易誘導抗性的結論。
2.3 TP4
防止
BV
相關細菌生物膜形成
在發明人的實驗中，發明人注意到陰道加德納菌具有形成生物膜的能力（表5）。根據先前的報導
10，陰道加德納菌比其他BV相關物種更傾向於形成生物膜，生物膜的功能類似於其他BV相關物種的支架，以便結合及拓殖陰道上皮。在其形成之後，其他BV相關細菌可使生物量加入到生物膜，最終形成賦予對藥物具有抗性的固體生物膜結構。最近的研究發現，一些好氧菌，諸如鏈球菌種及大腸桿菌，參與BV致病性機轉
11。因此，發明人接著評估TP4及抗生素對BV相關細菌及人類陰道乳酸桿菌的臨床分離株的抗菌活性。如表2所示，所有捲曲乳酸桿菌都對一線抗生素及TP4肽具有抗性（抗生素及TP4肽對所有捲曲乳酸桿菌的MBC ＞250 µg/mL）。然而，並非所有厭氧菌，諸如陰道加德納菌，都對甲硝唑敏感（對陰道加德納菌的MIC範圍從3.91到＞500 μg/mL）。不令人感到意外的是，好氧菌，即鏈球菌種、大腸桿菌及鳥腸球菌，對甲硝唑具有抗性（MIC範圍從62.5到＞500 μg/mL）。另外，克林達黴素僅對某些厭氧菌（諸如陰道加德納菌）及好氧菌具有低的MIC。大多數好氧菌及兼性厭氧放線棒菌對克林達黴素具有抗性（對陰道加德納菌的MIC範圍從3.91到500 μg/mL，且對所有好氧菌或兼性厭氧放線棒菌的MIC範圍從15.63到＞500 μg/mL）。對照之下，所有BV相關細菌都對TP4敏感（對所有BV相關細菌的MIC範圍從3.91到15.63 μg/mL）。發明人觀察到，在BV相關細菌中，咽峽炎鏈球菌、無乳鏈球菌及陰道加德納菌具有生物膜形成能力（表2）。因此，發明人接著使用結晶紫染色來評估TP4肽及抗生素是否可防止BV相關細菌生物膜形成。如圖3A到3B所示，甲硝唑及克林達黴素僅部分防止BV相關細菌生物膜形成。對照之下，TP4肽防止所有BV相關細菌形成生物膜。甲硝唑的最低生物膜抑制濃度（MBIC）範圍從3.91到＞500 μg/mL，克林達黴素的MBIC範圍從3.91到＞500 μg/mL，且TP4肽的MBIC範圍從3.91到15.63 μg/mL。這些結果顯示一線抗生素不能防止所有BV相關細菌形成生物膜。然而，TP4可防止所有BV相關細菌形成所有生物膜。最重要的是，數據也揭示捲曲乳酸桿菌臨床分離株對TP4肽具有耐受性。
2.4
生物膜增加陰道加德納菌分離株中抗生素抗性發展及相關基因表現
一般來說，生物膜比浮游細胞對抗微生物劑的耐受性高得多，這可能為抗生素治療失敗及疾病復發的原因
32。生物膜形成能力被認為是BV發病機轉的致病力因素，因此發明人比較不同陰道加德納菌分離株的生物膜形成能力。在相同培養條件下培養的不同陰道加德納菌分離株（sBHI，厭氧培養24小時）之間生物膜形成並無顯著差異（圖11A）。接著發明人想收集有關陰道加德納菌生物膜中致病力基因表現調節的資訊。發明人觀察到，在大多數陰道加德納菌分離株中，唾液酸酶基因及抗生素抗性相關基因（諸如多藥物抗性ABC運輸蛋白及桿菌素運輸ATP結合蛋白）的表現在生物膜中都較浮游培養物顯著增加。同時，與浮游細胞相比，生物膜中的細胞毒性相關基因，即陰道溶素，顯著降低（圖11B）。這些結果表明生物膜形成可能增加對抗生素的細胞內作用的抗性。
2.5
幾丁聚醣
破壞生物膜，且可作為
TP4
的賦形劑
幾丁聚醣是一種帶正電荷的線性多醣，由於其無毒、穩定、可生物降解的特性，因此廣泛用於生物醫學及生物技術領域
33。最近的研究表明，幾丁聚醣破壞葡萄球菌生物膜
34並表現出抗真菌活性
35。為了研究幾丁聚醣是否也能破壞陰道加德納菌生物膜活性，發明人培養具有不同幾丁聚醣分子量的生物膜（表6）。圖4A顯示不同分子量的幾丁聚醣以劑量依賴性方式破壞陰道加德納菌生物膜形成。值得注意的是，低分子量（LMW）及中等分子量（MMW）幾丁聚醣較高分子量（HMW）幾丁聚醣更顯著地降低陰道加德納菌生物質（HMW和MMW/LMW幾丁聚醣之間的顯著差異為0.8%；LMW和MMW之間並無顯著差異）。接著，發明人研究LMW及MMW幾丁聚醣是否會影響TP4肽抗微生物活性。TP4肽在幾丁聚醣凝膠中製備並用於測定陰道加德納菌的MBC值。圖4B顯示LMW及MMW幾丁聚醣不影響TP4肽抗微生物活性（不同幾丁聚醣濃度的MBC為7.81 μg/mL，與溶於水的TP4肽相同）。接著發明人測試TP4肽在MMW幾丁聚醣凝膠中長期儲存是否穩定並保留抗微生物活性。TP4肽在MMW幾丁聚醣凝膠中儲存半年，在此期間在不同的時間點測定MIC及MBC。如圖4C所示，在MMW幾丁聚醣凝膠中或溶於水中的TP4肽之間的MIC及MBC並無顯著差異。隨著儲存時間延長，MIC或MBC並無明顯變化。（MIC保持在1.95到7.81 μg/mL的範圍內，且MBC保持在3.91到15.63 μg/mL的範圍內）。綜上所述，這些結果顯示TP4肽可在MMW幾丁聚醣凝膠中儲存若干個月而不影響其抗微生物活性。另外，幾丁聚醣的生物膜破壞性質可使其用作TP4肽的賦形劑。
表 6 ：用於破壞陰道加德納菌生物膜且不影響 TP4 殺菌活性的不同幾丁聚醣分子量的列表
| Sigma-Aldrich | 幾丁聚醣 | 黏度(10 mg/L ，在1% 乙酸中) | 分子量 |
| 448869 | 低分子量 | 20–300 cP | 50,000–190,000 Da |
| 448877 | 中等分子量 | 200–800 cP | 190,000–310,000 Da |
| 419419 | 高分子量 | 800–2000 cP | 310,000–375,000 Da |
2.6 TP4
肽與螯合劑
EDTA
二鈉及幾丁聚醣組合促進根除由
BV
相關細菌所形成的生物膜
無法根除多微生物BV生物膜可能是與目前一線抗生素給藥方案相關的高疾病復發率的主要原因
6。發明人發現BV相關細菌，即陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌，表現出強的生物膜形成能力（表2）。研究TP4肽對BV相關生物膜的影響。對陰道加德納菌、咽峽炎鏈球菌及混合培養生物膜（陰道加德納菌與咽峽炎鏈球菌組合）進行測試。EDTA為食品藥物管理署（FDA）批准的藥品防腐劑，因為其可與二價離子螯合。EDTA可使生物膜基質不穩定並增強對抗微生物劑的感受性
36 、 37。棋盤式檢定顯示（圖12A到12C），低濃度EDTA二鈉（低於0.8 mM）增強在陰道加德納菌、咽峽炎鏈球菌及混合培養生物膜中的TP4殺菌活性（EDTA二鈉＞6 mM對TP4殺微生物活性具有拮抗作用；未顯示數據）。接著，發明人評估TP4肽與EDTA二鈉及幾丁聚醣在成熟生物膜中的殺菌活性。圖5A到5D顯示TP4肽與EDTA二鈉及幾丁聚醣組合以劑量依賴性方式（TP40、250、500、1000 μg/mL）顯著降低來自陰道加德納菌（圖5A）、咽峽炎鏈球菌（圖5B、5C）或混合培養生物膜（圖5D）的菌落形成單位（CFU）的數目。對照之下，當甲硝唑用於咽峽炎鏈球菌（圖5C）或混合培養生物膜（圖5D）時，其被去活化（甲硝唑和載體之間並無顯著差異）。這些結果表明，由TP4肽、EDTA二鈉及幾丁聚醣組成的TP4殺微生物劑製劑可促進根除BV相關細菌生物膜。
2.7 TP4
肽的預配方研究
TP4肽對BV相關細菌具有廣效活性，且為治療BV的有前途藥劑。然而，肽藥物易受環境影響，諸如賦形劑或陰道分泌物，其可能引起構形改變、氧化或水解，從而影響抗微生物活性。使用高效能液相層析法（HPLC）對暴露於不同溫度或不同濃度的鹽、乳酸及氧化條件的TP4肽進行長期穩定性研究。在-20、4、25、37及65℃下儲存28天的TP4肽並無觀察到可察覺的差異（圖6A）。另外，健康的陰道以乳酸桿菌為主，其製造H
2O
2（生理濃度＜100 μM）及乳酸（生理濃度55到111 mM）以消除其他病原體
38。長期穩定性研究顯示，暴露於一定H
2O
2（0、8 mM）、乳酸（0、56.5、113、565、1130 mM）及NaCl（0、50、150、250、500 mM）濃度範圍的TP4肽樣品在28天後不受影響（圖6B到6D）。此結果表明TP4肽在乳酸及H
2O
2的存在下以及在寬範圍的溫度及離子強度下是穩定的。這是一個重要的發現，因為該藥物將應用在陰道環境（典型的pH為3.5到4.5，H
2O
2＜100 μM）中。為了研究TP4肽中潛在的二級結構及構形改變，在若干條件下進行圓偏光二色性（CD）實驗。如圖6E所示，溶解在H
2O中的TP4肽在CD光譜（SDS 0 mM）中在約198 nm處顯示負峰值，表明存在隨機螺旋結構。隨著十二烷基硫酸鈉（SDS，膜模擬條件）濃度的增加，CD光譜中在191 nm處出現一個強的正峰值，伴隨在208 nm及222 nm處兩個負峰值的增強，表明TP4肽的二級結構含有α-螺旋。基於圖6E的結果，在不同溫度（圖6G）、NaCl濃度（圖6F）或EDTA二鈉濃度（圖6H）下溶解在SDS溶液（SDS 100 mM）中的TP4肽都保持一致的二級結構。結果表明，TP4肽是穩定的，且其二級結構在許多實驗條件下都能保持。
2.8 TP4
殺微生物劑製劑在
C57BL/6
雌性小鼠中的安全性
在評估TP4肽與EDTA二鈉及幾丁聚醣的組合對BV相關細菌生物膜的影響後，使用C57BL/6小鼠測試相同TP4殺微生物劑製劑（TP4肽在0.1%幾丁聚醣中，0.4 mM EDTA二鈉在鹽水中）的體內安全性。在藥物暴露之前，藉由陰道細胞學評估經Depo-Provera治療的小鼠的發期間期狀態。如圖13A所示，在施用Depo-Provera四天後，白血球主要存在於小鼠的陰道分泌物中，表明處於類發情間期狀態。在同步後，小鼠接受單次陰道施用測試藥物。在藥物施用後24小時，犧牲小鼠以進行組織病理學檢查。Nonoxynol-9（N-9）為非離子型清洗劑殺微生物劑，在第3期試驗中失敗，因為其引起陰道上皮細胞損傷並增加促發炎介質，隨後增加HIV及淋病感染的風險
39 、 40。苯扎氯銨（BZK）也已知會使上皮組織損傷
41。N-9及BZK對生殖道的作用已得到充分證實
42 、 43 、 44，因此發明人在發明人的小鼠陰道刺激實驗中使用這兩種藥物作為陽性對照組。生殖器官的組織學分析總結在圖7及表7中。
表 7 ：在陰道施用 TP4 殺微生物劑製劑後生殖器官的組織病理學發生率表。
在鹽水或經TP4治療的小鼠（包括有TP4肽及TP4殺微生物劑製劑）的任何生殖器官中都未觀察到明顯的病變。對照之下，在5% N-9及2% BZK組中觀察到陰道刺激（上皮變薄及糜爛/壞死）（5% N-9的發生率：3/5；2% BZK的發生率：5/5）。另外，在2% BZK組中觀察到子宮頸刺激（上皮變薄及糜爛/壞死）（發生率：3/5）。發明人也發現，在對照組小鼠及經治療的小鼠中都存在白血球滲出物及細胞碎片、上皮下基質的白血球浸潤、及黏液化；這些徵象被認為與發情周期有關。結果表明，與已知的陰道刺激物（5% N-9及2% BZK）相比，在小鼠陰道內24小時一次施用TP4肽（5 mg/mL及10 mg/mL）或TP4殺微生物劑製劑（TP4 5 mg/mL及10 mg/mL凝膠），在雌性生殖組織（陰道、子宮頸、子宮及卵巢）中不會引起毒性或上皮刺激。
2.9 TP4
殺微生物劑製劑的體內作用
最後，發明人研究TP4殺微生物劑製劑是否可用於治療小鼠中陰道BV相關細菌攻擊。以β-雌二醇治療改善小鼠對感染的陰道感受性，並可用於小鼠模型中以評估局部殺微生物劑的有效性
45 、 46。在施用治療之前，藉由陰道細胞學評估經β-雌二醇治療的小鼠中發情狀態的同步。如圖13B所示，在施用β-雌二醇後兩天，小鼠陰道分泌物中以有核上皮細胞為主，表明處於類發情狀態。小鼠陰道感染程序及細菌菌株接種劑量如圖14及表4所示。以陰道加德納菌或咽峽炎鏈球菌攻擊經β-雌二醇治療的小鼠。值得注意的是，與陰道加德納菌相比，咽峽炎鏈球菌似乎在小鼠陰道中存活得更好。對於每隻小鼠，每天接種陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌的劑量分別為約10
7及10
6個細胞（表4）。然而，在連續兩天陰道接種之後，每隻小鼠的小鼠陰道中的陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌估計分別為約4.1 × 10
4及4.6 × 10
6個細胞（圖8A到8B）。TP4殺微生物劑製劑的施用以劑量依賴性方式（ 0、5及10 mg TP4載體凝膠）顯著降低從小鼠陰道灌洗液中回收的陰道加德納菌（圖8A）及咽峽炎鏈球菌（圖8B）的量。
在大多數BV病例中，至少兩種不同的病原體存在於陰道上皮細胞中
10。因此，發明人接著研究TP4殺微生物劑製劑在經混合陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌治療的陰道中的作用。使TP4與在相同載體凝膠中製備的甲硝唑進行比較。如圖8C所示，TP4殺微生物劑製劑顯著降低從小鼠陰道灌洗液中回收的細菌CFU的總數。對照之下，經甲硝唑治療的小鼠與載體組並無表現出顯著差異（圖8C），這可能是因為其在咽峽炎鏈球菌上被去活化（圖8D）。接著，發明人評估TP4殺微生物劑製劑是否對有益的人類陰道乳酸桿菌表現出毒性。如圖8E、8F所示，在接種捲曲乳酸桿菌（圖8E）或加氏乳酸桿菌（圖8F）的TP4殺微生物劑製劑和經載體凝膠治療的小鼠之間並無發現顯著差異。綜上所述，這些結果顯示TP4殺微生物劑製劑在體內有效降低BV相關細菌數量，且對有益的人類陰道乳酸桿菌無毒。
在本研究中，研究廣效殺菌肽用於治療BV相關細菌的治療潛力，尤其以生物膜的形式。本研究的結果表明，生物膜破壞TP4殺微生物劑製劑可能為未來BV治療提供新策略。
另外，本研究證實TP4肽對相關陰道病原體具有廣效抗微生物及抗生物膜活性，使其不同於甲硝唑及克林達黴素。具體而言，如表1、2、5及圖1A到1C所示，在健康人類陰道中發現的乳酸桿菌對TP4肽具有抗性。根據推測，TP4的選擇性殺菌活性與細胞膜成分的差異有關，諸如糖醛酸磷壁酸（teichuronic acid）、脂多醣、蛋白質及磷脂，這些成分有助於整體表面電荷並影響肽和膜之間的靜電相互作用
49 、 50。陰道加德納菌為BV中一種最重要的病原體
51，但其作用一直存在爭議，因為其也存在於健康女性中
52。許多報導顯示，與其他BV相關細菌相比，陰道加德納菌具有更高的致病力潛力，包括有細胞毒性作用及形成生物膜的強烈傾向
53 、 54 、 55。在本研究的結果中證明，陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌在BV相關細菌中表現出一些最強的生物膜形成能力（表2），其可促進生物膜結構，該結構可促進其他BV相關細菌的生長細菌
10。
在BV中，細菌生物膜由BV相關細菌簇形成，這些細菌附著在陰道上皮細胞的表面
10，並包埋到包括蛋白質、多醣及細胞外DNA的自生成基質中
56。研究顯示，即使在使用甲硝唑的推定成功治療之後，生物膜仍持續存在於陰道上皮細胞上
57。生物膜可為細菌提供避開宿主免疫細胞及減少抗微生物滲透的手段。在本研究中，發明人發現，對於大多數臨床分離株，生物膜中的抗藥物相關基因、ABC運輸蛋白及桿菌素運輸ATP結合蛋白的表現顯著高於浮游培養物中的表現（圖11A到11B）。這個結果表明生物膜中的細菌可能表現出抗生素抗性，其可解釋標準療法的高復發率。因此，新研究必須集中在分解生物膜結構以實現BV抗微生物療法的最佳功效。幾丁聚醣為優異的賦形劑，因為其便宜、無毒且可生物降解。由於其抗真菌及生物膜破壞性質
34 、 61 、 62，使其適合作為BV治療的陰道藥物載體，因此其已廣泛用於生物醫學及生物技術領域
60。在本研究中，發明人證明幾丁聚醣破壞陰道加德納菌生物膜，且儲存在幾丁聚醣中長達半年的TP4肽仍保持其抗微生物活性，而不影響TP4肽對陰道加德納菌的殺菌活性（圖4A到4D）。因此，幾丁聚醣非常有用於用作TP4肽的載體或賦形劑來治療BV。
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無
當結合附圖閱讀時，將更好理解前面發明內容及以下本發明的詳細描述。為了說明本發明，附圖中示出目前較佳的具體實施例。然而，應理解到本發明並不受限於所示出的精確配置及手段。
在圖式中：
圖1A到1C提供TP4在陰道分泌物模擬物中的選擇性殺菌活性。以不同TP4濃度（0、20、50、1100 μg/mL）治療後，藉由CFU測定陰道加德納菌（圖1A）、捲曲乳酸桿菌（圖1B）、及加氏乳酸桿菌（圖1C）在VFS中的存活力。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差。藉由單因子獨立變異數分析(ANOVA)測定，與在VFS中不含TP4的對照組的細菌的CFU/mL相比，*
p＜ 0.05。
圖2A到2B顯示TP4快速殺滅在致病性陰道加德納菌中不容易誘導抗性。圖2A提供暴露於TP4、甲硝唑或克林達黴素的陰道加德納菌在1× MBC及2× MBC時的代表性時間-殺滅曲線。在時間0且隨後在若干時間點直到24小時為止，測定所有分組的log CFU/mL。圖2B顯示在厭氧環境中暴露於TP4、甲硝唑或克林達黴素的陰道加德納菌細胞中抗性的發展。Y軸顯示與第一傳代相比MIC的倍數變化。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差。
圖3A到3B顯示TP4及抗生素對BV相關細菌生物膜形成的抑制作用。以各種濃度的TP4及抗生素測試由BV相關細菌所形成的生物膜。圖3A顯示以結晶紫染色生物膜細胞；三個重複的代表性結果，其中紅色框代表MBIC。圖3B顯示在三個單獨的實驗中進行MBIC的定量。y軸500表示MBIC ≥500 μg/mL。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差。
圖4A到4C顯示幾丁聚醣可破壞陰道加德納菌生物膜且不影響TP4殺菌活性。圖4A顯示不同分子量的幾丁聚醣對生物膜破壞活性的測試結果。使不同分子量的幾丁聚醣以不同濃度加入到陰道加德納菌生物膜。鹽水用作載體對照組；sBHI用作陰性對照組；胰蛋白酶用作陽性對照組。藉由結晶紫染色測定生物膜質量。數據顯示三個單獨實驗的定量生物膜質量及平均生物量減少（%）。圖4B顯示在具有不同濃度的LMW及MMW幾丁聚醣的BHIG中的TP4殺菌活性。圖4C顯示分析儲存在幾丁聚醣凝膠中的TP4隨時間的長期穩定性。使TP4溶解在幾丁聚醣凝膠或ddH
2O中。在不同的時間點測定MIC及MBC。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差（*
p＜ 0.05，單因子獨立變異數分析(ANOVA)）。NS：無顯著差異。
圖5A到5D顯示配製在幾丁聚醣中的TP4及EDTA二鈉降低BV相關細菌生物膜中的細菌存活力。以不同組合的TP4、EDTA二鈉及幾丁聚醣治療由BV相關細菌陰道加德納菌（圖5A）或咽峽炎鏈球菌（圖5B）所形成的成熟生物膜。以載體凝膠（0.1%幾丁聚醣+0.4 mM EDTA二鈉）中不同濃度的TP4或甲硝唑治療由（圖5C）咽峽炎鏈球菌或（圖5D）咽峽炎鏈球菌與陰道加德納菌（混合培養物）組合所形成的成熟生物膜。根據CFU計數測量生物膜細胞存活力。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差（*
p＜ 0.05，單因子獨立變異數分析）。
圖6A到6H提供對TP4肽的預配方研究。500 μg/mL的TP4肽溶解在各種緩衝水溶液或條件中並保持各種時間的HPLC。圖6A顯示TP4在-20、4、25、37及65℃下儲存以評估溫度的作用。圖6B顯示TP4在不同NaCl濃度（0、50、150、250及500 mM）中培養以評估離子強度的作用。圖6C顯示TP4在不同乳酸濃度（0、56.5、113、565及1130 mM）下儲存以評估酸性生理條件的作用。圖6D顯示在8 mM H
2O
2溶液中評估TP4氧化。虛線表示90%穩定性。數據代表三個獨立實驗且數值以平均值±標準差表示。145 μg/mL TP4肽溶解在指定濃度的SDS中（圖6E）、在100 mM SDS加指定濃度的NaCl中（圖6F）、在100 mM SDS中在攝氏20、37、50及90度下1小時（圖6G）、或在100 mM SDS加指定濃度的EDTA二鈉中（圖6H）的CD光譜。
圖7顯示在小鼠中陰道施用TP4殺微生物劑製劑後的組織毒性。使用八周齡雌性C57BL/6小鼠來評估陰道施用TP4後的組織毒性。在陰道內施用鹽水（陰性對照組）、5% N-9（陽性對照組）、2% BZK（陽性對照組）、及5或10 mg/mL TP4鹽水或凝膠（TP4殺微生物劑製劑）後24小時切除的小鼠生殖器官的H&E染色。載體凝膠含有0.1%幾丁聚醣及0.4 mM EDTA二鈉鹽水。上皮變薄及糜爛分別由細箭頭及箭頭表示。影像代表
n= 5隻小鼠。比例尺適用於所有影像。
圖8A到8F顯示TP4殺微生物劑製劑的體內作用。八周齡雌性C57BL/6小鼠在假發情條件下，在接種陰道加德納菌（圖8A）、咽峽炎鏈球菌（圖8B）、捲曲乳酸桿菌（圖8E）、加氏乳酸桿菌（圖8F）、或陰道加德納菌和咽峽炎鏈球菌的組合（圖8C及8D）後，每天以20 μL載體凝膠或5或10 mg/mL TP4凝膠（圖8A及8B）、載體凝膠或TP4或甲硝唑凝膠（7.5 mg/mL）（圖8C及圖8D）、及5或10 mg/mL TP4凝膠（圖8E及8F）進行陰道治療兩次。結果顯示陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌的CFU。載體凝膠含有0.1%幾丁聚醣及0.4 mM EDTA二鈉鹽水。藉由陰道灌洗（每隻小鼠150 μL陰道灌洗液，每組n=5隻小鼠）的CFU平板計數來評估細菌存活力。所有值代表平均值±標準差。藉由單因子獨立變異數分析(ANOVA)測定，與載體凝膠（圖8A到8D）或對照組（圖8E及8F）相比，*
p＜ 0.05。
圖9A到9B顯示陽離子雙性TP4肽的二級結構。兩親性TP4 α-螺旋（蛋白質數據庫登錄號：5H2S）的親水面（圖9A）及疏水面（圖9B）的圖示（上）及靜電勢（下）。疏水面含有分布在螺旋一側的疏水殘基（F、I、L、V、A、M；綠色）。親水面含有分布在螺旋另一側的親水殘基（H、K、R、S；藍色）。藉由PyMOL計算表面靜電勢
73。分別由藍色、紅色及白色表示正、負及中性靜電勢。
圖10A到10B顯示TP4肽及甲硝唑的殺滴蟲活性。在TP4（圖10A）及甲硝唑（圖10B）存在下滴蟲的生長。初始接種細胞數為5 × 10
5個細胞/mL（虛線）。在以不同濃度的TP4（0到250 μg/mL）及甲硝唑（0到31.25 μg/mL）培養24小時後，滴蟲的活細胞計數。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差。與生長對照組（0 μg/mL）相比，*
p＜ 0.05。
圖11A到11B顯示生物膜及浮游階段的陰道加德納菌中致病力基因的比較轉錄。圖11A顯示生物膜形成能力顯示為OD585，其在結晶紫染色後獲得。NS：陰道加德納菌分離株之間無顯著差異。圖11B顯示在生物膜及浮游條件下培養的陰道加德納菌中致病力基因轉錄的定量。數據表示與浮游細胞（虛線）相比，陰道加德納菌生物膜細胞中的相對基因表現。所有值代表三個單獨實驗的平均值±標準差。藉由單因子獨立變異數分析(ANOVA)測定，在生物膜及浮游條件下培養的陰道加德納菌之間，*
p＜ 0.05存在顯著差異。
圖12A到12C顯示EDTA二鈉對成熟BV相關細菌生物膜中TP4殺菌活性的影響。棋盤式分析顯示生物膜細胞存活力以及EDTA及TP4二鈉對由陰道加德納菌（圖12A）、咽峽炎鏈球菌（圖12B）、及兩種病原體的混合培養物（圖12C）形成的BV相關細菌生物膜的綜合作用。使用阿爾瑪藍（Alamar Blue）檢定來定量生物膜細胞存活力。熱圖顯示三個重複的平均值。
圖13A到13B顯示陰道細胞學以鑑定發情期。陰道抹片取自施用Depo-Provera四天後的8周齡C57BL/6雌性小鼠（圖13A）及施用β-雌二醇兩天後的小鼠（圖13B）。圖13A顯示，小鼠陰道抹片中含有顯著的白血球群，表明處於類發情間期（diestrus-like）狀態。圖13B顯示，小鼠陰道抹片中顯示出主要的有核上皮細胞，表明處於類發情（estrus-like）狀態。圖13A中的黑色箭頭標記代表性白血球。圖13B中的白色箭頭標記代表性有核上皮細胞。顯微照片（所有影像放大100×；比例尺=50 μm）。
圖14顯示TP4殺微生物劑製劑功效的體內評估，且圖14顯示小鼠陰道感染模型的實驗流程示意圖。載體凝膠含有0.1%幾丁聚醣及0.4 mM EDTA二鈉鹽水。S
R：自發鏈黴素抗性突變株。
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Claims (19)
- 一種吳郭魚抗菌胜肽4（tilapia piscidin 4，TP4）之用途，其係用於製造治療細菌性陰道炎（BV）的藥劑。
- 如請求項1之用途，其中該TP4具有SEQ ID NO: 1中所示的胺基酸序列。
- 如請求項1之用途，其中該TP4為TP4的功能性片段或變體。
- 一種吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)之用途，其係用於製造抑制陰道加德納菌（ Gardnerella vaginalis）的藥劑。
- 如請求項4之用途，其中該陰道加德納菌伴隨有選自由以下組成的群組的厭氧菌：陰道奇異菌（ Atopobium vaginae）、無枝菌酸棒狀桿菌（ Corynebacterium amycolatum）、二路普雷沃菌（ Prevotella bivia）、具核梭桿菌（ Fusobacterium nucleatum）、及其任意組合。
- 如請求項1或4之用途，其中該TP4與生物膜破壞劑組合。
- 如請求項6之用途，其中該生物膜破壞劑為幾丁聚醣。
- 如請求項6之用途，其中該TP4及EDTA二鈉與生物膜破壞劑組合。
- 如請求項8之用途，其中該生物膜破壞劑為幾丁聚醣。
- 如請求項6之用途，其中該組合根除由單一或混合的陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌（ Streptococcus anginosus）所形成的生物膜。
- 一種用於治療細菌性陰道炎（BV）之醫藥組合物，其包含TP4與一或多個抗BV劑的組合，該組合的比率在治療BV時提供增效作用。
- 一種用於抑制陰道加德納菌之醫藥組合物，其包含TP4與一或多個抗BV劑的組合，該組合的比率在治療BV時提供增效作用。
- 如請求項11或12之醫藥組合物，其中該TP4可為TP4的功能性片段或變體。
- 如請求項12之醫藥組合物，其中該陰道加德納菌伴隨有選自由以下組成的群組的厭氧菌：陰道奇異菌、無枝菌酸棒狀桿菌、二路普雷沃菌、具核梭桿菌、及其任意組合。
- 如請求項11或12之醫藥組合物，其中該TP4與生物膜破壞劑組合。
- 如請求項15之醫藥組合物，其中該生物膜破壞劑為幾丁聚醣。
- 如請求項15之醫藥組合物，其中該TP4及EDTA二鈉與生物膜破壞劑組合。
- 如請求項17之醫藥組合物，其中該生物膜破壞劑為幾丁聚醣。
- 如請求項15之醫藥組合物，其中該組合根除由單一或混合的陰道加德納菌及咽峽炎鏈球菌所形成的生物膜。
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2022
- 2022-11-18 TW TW111144292A patent/TW202328169A/zh unknown
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