CN115715781A - 抗微生物疗法 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含hogocidin肽(SH‑羊毛硫菌素)、衍生物和变体的方法和组合物。还提供包括益生菌组合物的方法和组合物，其利用产生hogocidin、hogocidin样肽或其他皮肤病原体抑制剂的人葡萄球菌和表皮葡萄球菌的菌株。还提供治疗微生物皮肤感染和特应性皮炎的方法。

Description

抗微生物疗法

本申请是PCT申请号为PCT/US2016/031067的PCT国际申请进入中国国家阶段后申请号为201680039082.8、申请日为2016年5月5日、发明名称为“抗微生物疗法”的中国发明专利申请的分案申请。

序列表参考

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为名称为Sequence_ST25.txt(序列表_ST25.txt)的文件，该文件于2016年5月4日创建，大小为45Kb。序列表的电子格式的信息以引用方式整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用于治疗感染以及调节皮肤和粘膜微生物区系以治疗与生态失调(dysbiosis)有关或由生态失调所加剧的疾病或病症的方法和组合物。

背景技术

小的阳离子抗微生物肽(AMP)是先天免疫系统的天然存在的抗生素。AMP广泛分布在动物和植物中，并且属于最古老的宿主防御因子。它们的活性谱包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌以及真菌和某些传染原(infective agent)。随着病原微生物对常规抗生素的抗性增加，研究人员正在探索这些内源性抗生素作为针对各种传染性疾病的潜在的来源或新疗法。

特应性皮炎(AD)患者具有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SA)复发性皮肤感染以及他们的皮肤微生物群系(microbiome)的生态失调。增加的对SA的敏感性与降低的先天免疫防御(包括异常的屏障功能和降低的抗微生物肽(AMP)(例如组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)和β-防御素)的诱导)相关。

特应性皮炎(也称为湿疹或特应性湿疹)的症状包括：形成疹的干性皮肤；鳞状、肿胀和发红的皮肤；面部上或膝、肘或腕内侧的疹；渗出的水泡；反复发作后皮肤颜色的变化；增厚、龟裂、干燥、鳞状的皮肤或看似皮革样、呈斑块的皮肤；和严重的瘙痒(瘙痒症)，尤其是在夜间，以及搔抓所致的擦破(raw)、敏感、肿胀的皮肤。特应性皮炎(湿疹)体征和症状在人与人之间变化很大，并且可进一步包括：红色到棕灰色斑块，尤其是在手、足、踝、腕、颈、上胸、眼睑上，肘和膝的弯曲内侧，以及婴儿中的面部、头皮、后脑勺、耳、腿、足、臂、手和臀部；小的凸起肿块，其可能在被抓伤时泄露流体并结成硬皮。特应性皮炎最经常始于5岁之前，并且可持续到青春期和成年期。对于一些人来说，它会定期爆发，然后消失一段时间，甚至几年。特应性皮炎引起的皮肤变化可促进这些患者对金黄色葡萄球菌的定殖和感染的高敏感性。

生态失调包括皮肤或粘膜菌群(包括鼻菌群、口腔菌群、眼部菌群、泌尿生殖系统菌群、肠道菌群)的失衡，其中诸如金黄色葡萄球菌的种变得过度表现，而其他种变得表现不足。通常，在健康菌群中，非病原性细菌可分泌抑制剂或简单地占据所有可用的生态位，从而直接抑制或间接排除否则将能够建立感染状态或促进疾病或疾病样状态如特应性皮炎发展的病原体。

发明内容

本公开提供用于治疗与皮肤生态失调有关的病症的组合物和方法。这些与正常皮肤菌群的失衡以及皮肤病原体如金黄色葡萄球菌的过度生长相关的病症导致皮肤感染、特应性皮炎和牛皮癣以及其他病况。本公开提供用于通过以下方式治疗这些病症的组合物和方法：利用来源于健康皮肤菌群的常居者的抗微生物肽来恢复健康皮肤菌群，或直接施用含有菌株的益生菌组合物，所述菌株来源于健康皮肤菌群，或作为从诊断有菌群生态失调的患者的皮肤培养的稀有存活菌群，并且能够杀灭皮肤上的病原性种与疾病样微生物失衡相关的种或抑制这些种的生长。

具体地说，本公开提供稠化的局部组合物，其包含一种或多种益生细菌菌株，优选葡萄球菌属(Staphylococcus)，且更优选包含人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的所公开的菌株。这些菌株可通过本文所公开的方法从健康皮肤菌群中分离，或作为从诊断有菌群生态失调的患者的皮肤培养的存活菌群分离，并且可通过本文所公开的分泌的肽序列、脂肪酸甲酯谱(fatty acid methylester profile)和/或抗微生物肽密码子组织来鉴别。本公开的益生细菌菌株可以活的形式，以冻干形式或以可重构的形式提供。本公开进一步提供包含如本文所述的表皮葡萄球菌和人葡萄球菌的菌株的组合物，其可被配制用于局部施用到皮肤、头皮或粘膜。本公开进一步提供一种组合物，其中益生细菌菌株包括表皮葡萄球菌菌株MO34、MO38、A11、AMT1、AMT5-C5和/或AMT5-G6和/或人葡萄球菌菌株A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-G1和/或AMT4-D12中的一种或多种。

本公开的组合物还可包含条件培养基、或来源于本文所述菌株的分离的抗微生物化合物，例如本文称为Hogocidin的肽。本公开涵盖异源表达或合成的hogocidin、hogocidin衍生物或hogocidin样肽的用途。本公开还提供包含hogocidin肽、衍生物或变体以及组织蛋白酶抑制素肽、衍生物或变体的组合物。本公开进一步提供任一上述实施方案的组合物，其中所述肽包含一种或多种D-氨基酸、一种或多种非天然存在的氨基酸和/或一种或多种翻译后修饰。本公开提供任一上述实施方案的组合物，其中所述肽从其他肽被基本上纯化。本公开提供任一上述实施方案的组合物，其中所述肽从其他肽被部分纯化。本公开提供了其中肽存在于粗提取物中的组合物。本公开提供用于局部施用的制剂中的任一上述实施方案的组合物。

本公开提供任一上述实施方案的组合物，其中所述制剂包括洗剂、油膏或喷雾剂或乳膏或油悬浮液，但不限于这些形式。

本公开提供任一上述实施方案的组合物，其中所述hogocidin肽、衍生物或变体包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、包含非天然氨基酸的SEQ ID NO：2或4、包含D-氨基酸的SEQ ID NO：2或4、或包含融合构建体的SEQ ID NO：2或4的序列。

本公开还提供用于抑制微生物感染扩散和/或降低微生物感染风险的方法，其包括使所述微生物与有效量的本公开的组合物接触。在一个实施方案中，接触在体内。在另一实施方案中，体内接触是通过局部施用。本公开进一步提供通过向有需要的受试者的皮肤或粘膜施加有效量的本文所公开的组合物来治疗皮肤或粘膜感染、特应性皮炎、牛皮癣、痤疮或与皮肤生态失调有关的其他病症的方法。

本公开提供治疗特应性皮炎的方法，其包括使患有或怀疑患有特应性皮炎的受试者与有效量的包含一种或多种本文所公开的细菌菌株的益生菌组合物接触。

本公开提供治疗特应性皮炎的方法，其包括使患有或怀疑患有特应性皮炎的受试者与有效量的hogocidin肽、衍生物或变体接触。

本公开提供通过使受影响的区域与包含细菌菌株的组合物接触来治疗特应性皮炎或皮肤生态失调的方法，所述细菌菌株分泌hogocidin、firmocidin、SH-羊毛硫菌素肽、SH-抗微生物剂、SE-羊毛硫菌素(lantibiotic)肽或SE抗微生物剂，所述细菌菌株例如人葡萄球菌菌株A9、人葡萄球菌菌株C2、人葡萄球菌菌株AMT2、人葡萄球菌菌株AMT3、人葡萄球菌菌株AMT4-C2、人葡萄球菌菌株AMT4-G1、人葡萄球菌菌株AMT4-D12、表皮葡萄球菌菌株AMT1、表皮葡萄球菌菌株SE-A11、表皮葡萄球菌菌株AMT5-C5和表皮葡萄球菌菌株AMT5-G6。本公开提供如上文所述的方法和组合物，其进一步包含组织蛋白酶抑制素肽。

本公开提供一种组合物，其包含一种或多种益生细菌菌株以及任选的益生元化合物、保护剂、湿润剂、润肤剂、研磨剂、盐和/或表面活性剂的稠化的局部制剂；其中所述一种或多种益生细菌菌株包括葡萄球菌属的一种或多种细菌菌株；并且其中所述组合物被配制用于局部治疗皮肤、头皮或粘膜的生态失调病症。在一个实施方案中，一种或多种益生细菌菌株包括表皮葡萄球菌、人葡萄球菌或表皮葡萄球菌和人葡萄球菌的组合。在又一实施方案中，一种或多种益生细菌菌株包括表皮葡萄球菌菌株MO34、MO38、A11、AMT1、AMT5-C5和/或AMT5-G6。在另一实施方案中，一种或多种益生细菌菌株包括人葡萄球菌菌株A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-G1和/或AMT4-D12。在再一实施方案中，每种益生细菌菌株均表现出与图11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一个所示的那些中的一种相对应的脂肪酸甲酯谱。在另一实施方案中，一种或多种益生细菌菌株产生具有选自由SEQ ID NO：2、4、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和55以及其任一组合组成的组的序列的肽，并且其中所述肽任选地经翻译后修饰。在另一实施方案中，一种或多种益生细菌菌株以活的形式被提供。在又一实施方案中，一种或多种益生细菌菌株以冻干或冷冻干燥或喷雾干燥的形式被提供。在又一实施方案中，益生细菌可被重构为活的形式。

本公开还提供通过向皮肤或粘膜施加有效量的如本文和前述段落中所述的组合物来治疗与人或其他哺乳动物的皮肤或粘膜感染、特应性皮炎、牛皮癣、乳腺炎、痤疮或与皮肤生态失调有关的其他病症的方法。在一个实施方案中，所述组合物被局部施加。在又一实施方案中，所述组合物被配制为乳膏、油膏、软膏、喷雾剂、粉末、油、稠化制剂或泥敷剂。

本公开还提供一种组合物，其包含hogocidin肽、衍生物或变体、SH-羊毛硫菌素(lantibiotic)肽、SH-抗微生物剂、SE-羊毛硫菌素肽和/或SE抗微生物剂中的一种或多种；并且进一步包含一种或多种稠化剂、溶剂、乳化剂或药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含组织蛋白酶抑制素肽、衍生物或变体。在再又一或替代的实施方案中，hogocidin肽、衍生物或变体、SH-羊毛硫菌素肽和/或SE-羊毛硫菌素肽包含一种或多种D-氨基酸或非天然存在的氨基酸。在再又一实施方案中，hogocidin肽、SH-羊毛硫菌素肽、SH-抗微生物剂、SE-羊毛硫菌素肽或SE抗微生物剂由以下中的一种或多种原位产生：人葡萄球菌菌株A9、人葡萄球菌菌株C2、人葡萄球菌菌株AMT2、人葡萄球菌菌株AMT3、人葡萄球菌菌株AMT4-C2、人葡萄球菌菌株AMT4-G1、人葡萄球菌菌株AMT4-D12、表皮葡萄球菌菌株AMT1、表皮葡萄球菌菌株SE-A11、表皮葡萄球菌菌株AMT5-C5、表皮葡萄球菌菌株AMT5-G6和表皮葡萄球菌菌株MO34。在任一上述的再一实施方案中，所述肽被配制用于局部施用。在再又一实施方案中，所述制剂包括洗剂、油膏、乳膏、粉末、软膏、油或喷雾剂。在任一上述的另一实施方案中，hogocidin肽、衍生物或变体包含选自SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的序列或其具有抗微生物活性的活性片段(例如成熟形式)。在再一实施方案中，hogocidin肽、衍生物或变体、SH-羊毛硫菌素肽、SH-抗微生物剂、SE-羊毛硫菌素肽、SE抗微生物剂以及组织蛋白酶抑制素肽、衍生物或变体中的一种或多种被提供为以下的提取物或溶解产物：人葡萄球菌菌株A9、人葡萄球菌菌株C2、人葡萄球菌菌株AMT2、人葡萄球菌菌株AMT3、人葡萄球菌菌株AMT4-C2、人葡萄球菌菌株AMT4-G1、人葡萄球菌菌株AMT4-D12、表皮葡萄球菌菌株AMT1、表皮葡萄球菌菌株SE-A11、表皮葡萄球菌菌株AMT5-C5、表皮葡萄球菌菌株AMT5-G6和表皮葡萄球菌菌株MO34。

本公开还提供用于治疗受试者的皮肤或粘膜感染或特应性皮炎的方法，其包括使所述受试者与有效量的组合物接触，所述组合物包含hogocidin肽、衍生物或变体、SH-羊毛硫菌素肽、SH-抗微生物剂、SE-羊毛硫菌素肽以及任选的组织蛋白酶抑制素肽、衍生物或变体中的一种或多种。在一个实施方案中，所述接触是通过局部施用或任选地通过使所述受试者与产生SH-羊毛硫菌素或细菌素的人葡萄球菌菌株A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-G1、AMT4-D12和表皮葡萄球菌菌株AMT5-G6和MO34中的一种或多种接触。

本公开还提供一种重组载体，其包含编码与SEQ ID NO：2或4至少95％相同的多肽或其具有抗微生物活性的生物活性片段的多核苷酸。在一个实施方案中，所述载体包含编码SEQ ID NO：2或4的多肽的多核苷酸。在再一实施方案中，所述载体包含编码SEQ ID NO：2的约氨基酸32到约氨基酸61的多肽的多核苷酸。在又一实施方案中，所述载体包含编码SEQID NO：4的约氨基酸29到约氨基酸66的多肽的多核苷酸。在另一实施方案中，所述载体包含与SEQ ID NO：1或3至少95％相同并且分别编码SEQ ID NO：2或4的多肽的多核苷酸。在上述实施方案的再一实施方案中，载体包含SEQ ID NO：1或3的片段。在任一上述的再又一实施方案中，载体是表达载体。

本公开还提供经工程化以表达本公开的重组载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是非病原性减毒宿主细胞。

本公开还提供由本公开的宿主细胞产生的重组多肽。在另一实施方案中，从宿主细胞培养物纯化重组多肽。

本公开还提供包含本公开的宿主细胞的组合物。

附图和下面的说明书中陈述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其它特征、目标和优点将是显而易见的。

附图说明

图1A-D.与葡萄球菌属DNA相比，可培养的葡萄球菌属的比率在特应性皮炎的病变皮肤中较高。图1A：在选择性甘露醇盐琼脂板上对来自49位特应性皮炎(AD)受试者和30位无AD的受试者的可培养的总葡萄球菌属种进行计数。图1B：显示来自30位非特应性受试者和49位特应性皮炎患者的金黄色葡萄球菌生长的CFU结果。图1C：通过对来自14位非特应性受试者和37位特应性受试者的DNA进行定量PCR(qPCR)来确定总葡萄球菌属种DNA丰度。通过与表皮葡萄球菌(ATCC12228)的已知CFU的标准比较来确定相对CFU(rCFU)。图1D：在每个相应的皮肤部位计算活葡萄球菌属种CFU与通过DNA确定的葡萄球菌属的相对丰度的比率。

图2A-C.特应性皮炎皮肤被具有较低频率的抗微生物活性的凝固酶阴性葡萄球菌属定殖。图2A：通过单个培养分离物的高通量测定来确定具有针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的凝固酶阴性葡萄球菌属(CoNS)，并确定抑制金黄色葡萄球菌生长的总菌落的比例(％)。图2B：在第1天、第7天和第14天，从相同受试者确定具有抗微生物活性的CoNS的比例。图2C：如在图2B中，从相同的受试者确定活葡萄球菌属种与葡萄球菌属DNA的丰度的比率。*P＜0.05，****p＜0.0001。随机选择11位特应性受试者和11位非特应性受试者用于图层B和图层C中的分析。

图3A-B.抗微生物凝固酶阴性葡萄球菌属与不存在金黄色葡萄球菌定殖相关。图3A：将每个样品中抗微生物CoNS的比例针对从每位受试者培养的金黄色葡萄球菌的丰度绘图。基于抗微生物CoNS的频率(＞50％或＜50％)和活金黄色葡萄球菌的检测(＜1CFU/cm²或＞1CFU/cm²)来划分象限。显示每个象限中的受试者与总受试者的比例(％)。图3B：显示了金黄色葡萄球菌培养阴性受试者(白色)和金黄色葡萄球菌培养阳性受试者(实心)中的抗微生物CoNS的频率。数据是29位非特应性受试者和特应性受试者的41个非病变部位或40个病变部位的平均值±SE。

图4A-B.各种细菌种具有抗微生物活性。通过对来自具有和没有抗微生物活性的随机分离的菌落的全长16S rRNA进行DNA测序来鉴别抗微生物CoNS或非抗微生物CoNS的种。图4A：从5位非特应性受试者中鉴别出具有抗微生物活性的CoNS种的比例。图4B：从特应性皮炎受试者分离的抗微生物菌落和非抗微生物菌落中鉴别的CoNS种的比例。从每一个体中对多达48个CoNS分离物进行测序。由饼形图显示来自每个AD受试者的具有抗微生物CoNS(实心)和非抗微生物CoNS(白色)的菌落的相对比例。

图5A-B.来自皮肤微生物群系内凝固酶阴性葡萄球菌属菌株(SH-A9)的抗微生物肽的鉴别。图5A：从分离自非特应性皮肤的人葡萄球菌纯化的两种抗微生物肽的氨基酸序列以及预测的单硫键和二硫键。肽被命名为Hogocidin-α(SEQ ID NO：2 aa 32-61)和Hogocidin-β(SEQ ID NO：4 aa 29-66)(SH-羊毛硫菌素α和β)。Hogocidin-α[3152.52(M+H)]和Hogocidin-β[3548.04(M+H)]的假设成熟形式的计算分子量与观察到的分子质量[分别为m/z 3152.22和3547.71(M+H)]相同。图5B显示Hogocidin-α和Hogocidin-β针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的剂量响应曲线。与人皮肤产生的抗微生物肽(LL-37)共同孵育显示协同活性。数据代表一式三份测定的平均值±SE。箭头显示与对照相比，每一AMP的最小抑制浓度(MIC)，被定义为活细菌的3-log降低。Dha，2，3-二脱氢丙氨酸；Dhb，(Z)-2，3-二脱氢氨基丁酸(didehydrobutyrine)。

图6.金黄色葡萄球菌DNA在非特应性皮肤、特应性皮肤的非病变部位和病变部位上的丰度。分别从招募的30位正常患者和50位特应性皮炎患者获得14个和37个DNA拭子。通过用靶向金黄色葡萄球菌特异性femA基因的种特异性引物进行qPCR来确定金黄色葡萄球菌DNA的丰度。通过与金黄色葡萄球菌(ATCC35556)的已知CFU比较来确定金黄色葡萄球菌DNA的相对CFU(rCFU)。将活的细菌或细菌DNA的密度归一化为被拭抹区域。AD：特应性皮炎。

图7A-B.从非特应性皮肤分离的人葡萄球菌(SH-A9)产生的AMP的纯化和质谱分析。通过HPLC使用CapcelPac C8柱从人葡萄球菌的代表性抗微生物分离物的培养物上清液中纯化AMP(图7A)。显示了5个纯化步骤的最后一个步骤。插图表示各级分在径向扩散测定上针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。通过MALDI-TOF-MS表征具有抗微生物活性的级分(图7B)。

图8.Hogocidin-β(SH-羊毛硫菌素-β)的经基因组引导的MALDI-TOF/TOF分析中氨基酸损失的表示。由前体质量为3547.7m/z的MS/MS碎片谱中的氨基酸损失获得纯化的Hogocidin-β的氨基酸序列。Dha，2，3-二脱氢丙氨酸；Dhb，(Z)-2，3-二脱氢氨基丁酸。

图9A-B.在从非特应性皮肤分离的人葡萄球菌菌株(SH-A9)中编码Hogocidin前体的基因簇和羊毛硫菌素生物合成基因的组织。图9A显示人葡萄球菌SH-A9基因组上的羊毛硫菌素前体(A1和A2；SH-羊毛硫菌素-α和β)和生物合成基因(C、T和M)的顺序。图9B列出了假设的基因、基因座和推定的功能。该人葡萄球菌菌株含有羊毛硫菌素相关基因簇的多个拷贝。

图10显示用于本公开中的高通量方法。

图11A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的表皮葡萄球菌菌株MO-34和MO-38的FAME分析结果的色谱图。

图12A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的人葡萄球菌菌株A9和C2的FAME分析结果的色谱图。

图13A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的表皮葡萄球菌菌株A11和AMT1-A9的FAME分析结果的色谱图。

图14A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的人葡萄球菌菌株AMT2-A11和AMT3-A12的FAME分析结果的色谱图。

图15A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的人葡萄球菌菌株AMT4-C2和AMT4-G1的FAME分析结果的色谱图。

图16A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的人葡萄球菌菌株AMT4-D12和表皮葡萄球菌AMT5-C5的FAME分析结果的色谱图。

图17A-B.显示通过本公开中给出的方法鉴别的表皮葡萄球菌菌株AMT5-G6和不产生hogocidin的人葡萄球菌菌株C4的FAME分析结果的色谱图。

图18A-B.显示不产生hogocidin的人葡萄球菌菌株C5和C6的FAME分析结果的色谱图。

图19.显示表皮葡萄球菌菌株MO1的FAME分析结果的色谱图，该菌株不产生SE-羊毛硫菌素或SE-抗微生物剂。

图20A-E.抗微生物CoNS的移植降低了金黄色葡萄球菌在皮肤上的存活。图20A：人葡萄球菌对猪皮上的金黄色葡萄球菌存活的影响。利用猪皮测试将产生hogocidin的活的人葡萄球菌A9(1×10⁵CFU/cm²)与对照进行比较，所述对照包括UV杀灭并洗涤的A9菌株、不产生AMP活性的活人葡萄球菌菌株(C4、C5和C6)或单独的媒介物乳膏。数据代表5个独立测定的平均值±s.e.m.。图20B：细菌移植对小鼠皮肤上金黄色葡萄球菌的存活的影响。在小鼠的剃毛背部皮肤上以1×10⁵CFU/cm²施加金黄色葡萄球菌。在两个小时后，以相等的浓度(1×10⁵CFU/cm²)施加对照(单独的媒介物)、活的人葡萄球菌(A9)或无活性菌株(C4、C5和C6)。显示了施加CoNS或对照后20hr的金黄色葡萄球菌回收率。数据代表6只小鼠的平均值±s.e.m.。图20C：用于被金黄色葡萄球菌定殖的AD受试者上自体人微生物群系移植(AMT)的工作流程。图20D：用于AMT的CoNS克隆的表征。通过全基因组测序鉴别每个克隆的抗微生物类别。图20E：抗微生物CoNS移植对AD受试者的皮肤上金黄色葡萄球菌存活的影响。通过在移植前(基线)和处理后24hr获取的拭子的菌落计数来测量金黄色葡萄球菌存活。媒介物组和AMT组之间金黄色葡萄球菌的差异显示为Δ％金黄色葡萄球菌CFU。无活性菌株没有作用。

图21A-C：在用于自体微生物群系移植的抗金黄色葡萄球菌菌株AMT1-A9(图21A)、AMT2-A12(图21B)和AMT3-A12(图21C)中鉴别的假设抗微生物基因。通过miSeq获得活性CoNS克隆的全基因组序列，并在RAST服务器(rast.nmpdr.org)上进行分析以鉴别抗微生物类别。

图22A-B：在用于自体微生物群系移植的抗金黄色葡萄球菌菌株AMT4-C2(图22A)和AMT4-G1(图22B)中鉴别的假设抗微生物基因。通过miSeq获得活性CoNS克隆的全基因组序列，并在RAST服务器(rast.nmpdr.org)上进行分析以鉴别抗微生物类别。

图23A-C：在用于自体微生物群系移植的抗金黄色葡萄球菌菌株AMT4-D12(图23A)、AMT5-C5(图23B)和AMT5-G6(图23C)中鉴别的假设抗微生物基因。通过miSeq获得活性CoNS克隆的全基因组序列，并在RAST服务器(rast.nmpdr.org)上进行分析以鉴别抗微生物类别。

图24显示从正常皮肤分离的表皮葡萄球菌A11菌株的培养物上清液中纯化的抗微生物肽的剂量依赖性杀灭曲线。将指示的细菌种(1×10⁵CFU/mL)与不同浓度的纯化的表皮葡萄球菌A11抗微生物肽(包含SEQ ID NO：55)在50％Muller-Hinton培养液/50％PBS中在37℃孵育24hr。在100％的强化梭菌培养基中在缺氧条件下孵育痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。S.epiA11，表皮葡萄球菌A11菌株；S.epi12228，表皮葡萄球菌ATCC12228菌株；S.homA9，人葡萄球菌A9菌株；S.aurl 13，金黄色葡萄球菌113菌株；P.ac，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)ATCC6919菌株；E.coli，大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922；P.aeruginosa，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC14213。

图25A-B显示与通过HPLC从表皮葡萄球菌(A11菌株)的临床分离物菌株的培养物上清液中纯化的抗微生物肽有关的数据(A)。通过MALDO-TOF质量分析活性级分(级分33-34)以估计活性抗微生物肽的分子量(B)。观察到的分子量为3484.90(m/z)。肽的N-末端测序提供于SEQ ID NO：55中。

具体实施方式

除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“探针”的指代包括多个此类细胞，并且对“细胞”的指代包括对一个或多个细胞和本领域技术人员已知的其等同物的指代，等等。

此外，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。类似地，“包含(comprise、comprises、comprising)”、“包括(include、includes和including)”可换用并且不意在具有限制性。

应当进一步理解，当各种实施方案的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员将理解在一些特定情况下，实施方案或者可使用用语“基本上由......组成”或“由......组成”来加以描述。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义都与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等同于本文所述的那些的任何方法和试剂均可用于实施所公开的方法和组合物，但现在描述示例性方法和材料。

出于描述和公开出版物中所描述的方法的目的，本文中所提到的所有出版物均全部以引用方式并入本文中，这些出版物可以结合本文中的描述来使用。关于在一个或多个出版物中呈现的与本公开中明确定义的术语类似或相同的任何术语，在所有方面将以本公开中明确提供的术语的定义为准。

特应性皮炎是一种常见的慢性皮肤病症，其特征在于表皮屏障功能障碍和复发性皮肤炎症。该疾病的严重程度与皮肤微生物群系的生态失调以及这些患者对金黄色葡萄球菌的定殖和感染的高敏感性相关。

已出现针对特应性皮炎的病因的统一模型，认识到免疫与上皮提供的功能相互依赖。例如，抗微生物肽(AMP)的产生提供了针对入侵病原体的直接消毒剂活性。在健康皮肤中，诸如组织蛋白酶抑制素和β-防御素的AMP在损伤后增加。然而，特应性皮炎患者的皮肤产生某些AMP的能力降低，并且这与金黄色葡萄球菌(一种应当被这些AMP杀灭的病原体)的感染率增加相关。金黄色葡萄球菌进一步加剧特应性皮炎的症状并导致免疫功能障碍(例如TH2淋巴细胞倾移(skewing))、降低的AMP、加剧的过敏反应和皮肤屏障的破坏。

先前对特应性皮炎患者的研究显示，这些患者上存在的细菌菌群与非特应性受试者的皮肤上发现的细菌不同。特应性皮炎患者的微生物群系的多样性较小，并且通常具有更高的葡萄球菌种丰度。不欲受任何特定理论的束缚，已假设皮肤微生物群系的生态失调可能促成该疾病的病理生理学。具体地说，已提出通常构成微生物群系的微生物的多样群落有助于皮肤稳态。例如，在小鼠中，表皮葡萄球菌可控制损伤后的炎症，影响T细胞发育并诱导AMP的表达。此外，微生物群系可产生其自身的AMP，其自身的AMP可与宿主细胞产生的AMP协同作用。因此，除了被金黄色葡萄球菌定殖的有害作用之外，特应性皮炎中微生物群系的生态失调也可通过丧失它们的有益功能而导致疾病。

现有的抗生素疗法非特异性地杀灭细菌，这影响了常驻微生物区系的稳态。失衡的微生物区系促成皮肤炎性疾病(例如特应性皮炎、酒渣鼻和寻常痤疮等)的发病机理。本公开提供用于对表面消毒或治疗感染但不构成非特异性抗生素的安全风险的组合物和制剂。此外，本公开提供益生方法，其中可向受试者提供活的人葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌株，其可原位产生必需的抗微生物化合物，而同时恢复健康皮肤菌群的特征。

人葡萄球菌(S.hominis)是健康人皮肤的微生物区系的主要组分。最近的研究表明，表皮葡萄球菌通过借助产生在正常人皮肤上起另外的抗微生物化合物的作用的酚溶性调控蛋白(PSM)和小分子抗生素(命名为“Firmocidin”)以防止病原性感染来保护人皮肤(参见例如美国专利公开号为2013/0331384A1，其公开内容以引用方式并入本文)。此外，由表皮葡萄球菌产生的脂磷壁酸通过抑制伤口修复期间的皮肤炎症而有益于人皮肤。本公开提供活的表皮葡萄球菌和/或人葡萄球菌细胞或培养物用于恢复或增强正常皮肤菌群以支持伤口愈合并防止感染且恢复皮肤屏障功能的用途。

DNA测序的局限性在于它不能区分活生物体和死生物体，在本公开的方法中，通过培养物和DNA定量技术二者，在特应性受试者和非特应性受试者中直接评价微生物丰度。令人惊讶地，与DNA的测量相比，培养活细菌的相对能力在非特应性皮炎患者和特应性皮炎患者之间差异很大。与特应性病变皮肤相比，在非特应性皮肤中检测到相对于培养细菌的CFU超过大约10倍的细菌DNA。这些观察结果表明非特应性皮肤上相比于特应性病变皮肤上更低的细菌存活率。

对非特应性皮肤上更低的细菌存活率的一种解释是更有效的表面抗微生物活性。诸如LL-37以及hBD-2和hBD3的AMP在特应性皮炎患者的发炎皮肤中的表达水平低于正常受试者的发炎皮肤，但这些AMP表达在非发炎皮肤中较低。因此，非发炎的正常皮肤杀灭细菌的增加能力不大可能归因于这些宿主AMP的表达。在非特应性皮肤上观察到的高频率的抗微生物CoNS表明这些常驻细菌对抵抗病原体的定殖是重要的。支持这一点，仅在具有低频率的具有抗微生物活性的CoNS菌株的受试者中检测到金黄色葡萄球菌的定殖。可抑制生物膜形成的CoNS还已经在鼻粘膜中被观察到并且抑制金黄色葡萄球菌的鼻定殖。对来源于常驻在特应性皮炎患者皮肤上的细菌群落缺乏直接抗微生物活性的观察结果限定了这些个体的先天防御系统中先前未知的缺陷。

对从30名健康对照受试者以及特应性皮炎(AD)患者的50个病变和非病变部位的皮肤拭子培养的凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的超过7500个单个分离物上的抗微生物活性的高通量筛选鉴别出具有抗微生物活性的几个CoNS分离物。健康受试者具有高频率的具有抗金黄色葡萄球菌的抗微生物活性(75.26±6.59％)的CoNS分离物，而从AD非病变和病变皮肤分离的细菌具有显著更低的活性[分别为22.83±5.10％，15.76±4.10％(p＜0.0001)]。值得注意地，具有低频率的抗微生物CoNS的受试者也被SA定殖。16S rRNA测序揭示，在CoNS的各种菌株(例如表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌(S.Warneri)和头葡萄球菌(S.capitis))中检测到抗微生物活性。使用HPLC、通过MALDI-TOF-MS2进行的蛋白质测序和基因组测序鉴别出分子量为3152.2 Da和3550.7 Da的两种原核AMP。另外，如Nakatsuji，T.等(2016)，Nature Medicine递交原稿号NMED-A78395A(于2016年3月29日递交，其以引用方式整体并入本文)中所示，通过将功能性CoNS分离物施加于离体模型系统、动物模型，并且通过人受试者中的自体移植，显示施加CoNS菌株产生受感染皮肤中金黄色葡萄球菌水平的降低。例如，将这种抗微生物CoNS分离物施加于被SA定殖的小鼠皮肤在降低SA的存活方面是有效的，比在施加AD CoNS菌株时所观察到的高＞90％。这些发现表明，微生物群系是针对SA的第一道防线，并且AD中的生态失调与SA定殖具有重要的功能相关性。

鉴别出产生针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的几个CoNS种。表皮葡萄球菌和瓦氏葡萄球菌的一些实验室菌株先前被描述产生可抑制其他细菌生长的羊毛硫菌素，但在受试者群体中未检测到这些菌株。此外，基于它们的抗微生物活性而分离的几个CoNS种先前未被怀疑具有抗微生物功能。为了更好地理解这些，鉴别出两种先前未知的羊毛硫菌素，它们对金黄色葡萄球菌具有有效的活性，并且与宿主AMP LL-37高度协同。编码这些羊毛硫菌素的基因在非特应性个体中普遍存在。这一发现说明进一步分析健康人皮肤微生物群系的宿主防御功能的潜力，并且可提供预测微生物群系的活性的遗传方法。对微生物群系的宏基因组(Metagenomic)测序和与微生物群系的功能筛选的相关性可在特应性皮炎和其他皮肤病的患者的治疗中具有很大益处。

本公开提供常驻在正常人皮肤上的细菌群落提供针对金黄色葡萄球菌的重要防护的证据。同样，不欲受任何特定理论的束缚，该微生物群系介导的抗微生物防御系统中的功能障碍能使得在特应性皮炎中金黄色葡萄球菌定殖于皮肤并使该疾病进一步加剧。该观察结果表明，皮肤的细菌治疗策略可有益地用作为在不使用药学上衍生的抗生素的情况下抑制金黄色葡萄球菌的方法。鉴于该疾病的复杂性质，特应性皮炎的理想治疗方法应包括靶向既修复固有表皮屏障，又优化由微生物群系提供的免疫防御功能。

本公开还描述了来自人葡萄球菌的临床分离物的培养物上清液的新型抗微生物肽(AMP)。这些AMP在本文中被称为Hogocidin-α和Hogocidin-β。Hogocidin发挥针对金黄色葡萄球菌的抗微生物和杀细菌活性，但不抑制皮肤上共生细菌例如表皮葡萄球菌的生长。因此，本公开提供具有抗病原体的有效但选择性的活性、以及由于它们通常在人皮肤微生物群系中被发现而具有的高安全性特征的抗生素，以及提供治疗这些病况的益生方法。

本文所用的术语“抗微生物”意指所述肽破坏或抑制或阻止微生物(例如细菌、真菌和/或病毒)的生长或增殖。同样，如本文所用的术语“抗病毒”意指肽破坏或抑制或阻止病毒或病毒感染细胞的生长或增殖。如本文所用的术语“抗肿瘤”意指肽阻止、抑制肿瘤细胞的生长或破坏肿瘤细胞。类似地，术语“抗真菌”意指肽阻止、破坏或抑制真菌的生长。

如本文所用的“益生”是指提供活的或减毒的微生物培养物、或此类培养物的溶解产物、冻干物(lyophile)或提取物以补充或替代健康的皮肤或粘膜菌群的要素的过程。用于递送到皮肤的减毒载体可包括已被遗传修饰以(a)使所述载体为非病原性、(b)具有降低的病原性、(c)为复制缺陷型或(d)为非抗原性的病毒或细菌。其他减毒是本领域已知的。通常通过敲除基因或破坏基因编码序列或表达控制元件而使得(a)-(c)或(d)的关注完成来进行减毒。此类技术是本领域已知的，并且许多此类减毒细菌和病毒载体是已知的。

“hogocidin”由两个不同的结构域构成：N-末端“前序列”结构域和成熟hogocidin的C-末端结构域。成熟hogocidin-α包含SEQ ID NO：2的约氨基酸32到约氨基酸61(例如，从SEQ ID NO：2的约氨基酸30、31、32或33开始并延伸到SEQ ID NO：2的约氨基酸59、60或61)的序列。对于本领域技术人员来说将显而易见的是，hogocidin-α的前-原形式的长度为约61个氨基酸，并且被翻译后加工以提供成熟形式。基于表达系统和生物体，可取决于所存在的蛋白酶略有不同地加工成熟形式。此外，还将显而易见的是，hogocidin-α的前-原形式可用于本公开的方法、组合物和试剂盒中，其中在施用之前或之后，可在体外或体内加工所述前-原形式。

类似地，hogocidin-β的成熟形式包含SEQ ID NO：4的约氨基酸29到约氨基酸66(例如，从SEQ ID NO：4的约氨基酸27、28、29或30开始并延伸到SEQ ID NO：4的约氨基酸64、65或66)的序列。对于本领域技术人员来说将显而易见的是，hogocidin-β的前-原形式的长度为约66个氨基酸，并且被翻译后加工以提供成熟形式。基于表达系统和生物体，可取决于所存在的蛋白酶略有不同地加工成熟形式。此外，还将显而易见的是，hogocidin-β的前-原形式可用于本公开的方法、组合物和试剂盒中，其中在施用之前或之后，可在体外或体内加工所述前-原形式。

包含SEQ ID NO：2的多肽通常在SEQ ID NO：2的氨基酸编号31之后被切割，然而，本领域技术人员将认识到，取决于所用的酶、所用的表达系统和/或所述多肽的蛋白水解切割发生的条件，切割位点可在SEQ ID NO：2的氨基酸编号31的任一方向上变化1到3个氨基酸。

包含SEQ ID NO：4的多肽通常在SEQ ID NO：4的氨基酸编号28之后被切割，然而，本领域技术人员将认识到，取决于所用的酶、所用的表达系统和/或所述多肽的蛋白水解切割发生的条件，切割位点可在SEQ ID NO：4的氨基酸编号31的任一方向上变化1到3个氨基酸。

尽管遗传密码是本领域技术人员所充分理解的，并且在产生编码期望的多肽序列的多核苷酸中是常规的；但本公开还提供编码本公开的多肽的多核苷酸。例如，本公开提供编码SEQ ID NO：2和4的多肽的SEQ ID NO：1和3。

如本文所用的术语“hogocidin肽”是指包含长度为约30到约50个氨基酸并且包含如SEQ ID NO：2或4中所述的序列或其翻译后修饰形式的氨基酸链的hogocidin的成熟形式：

SEQ ID NO：2(aa 32到aa 61)-KCSWWNASCHLGNNGKICTVSHECAAGCNL

SEQ ID NO：4(aa 29到aa 66)-ATPTITTSSATCGGI IVAASAAQCPTLACSSRC GKRKK。

在一个实施方案中，所述方法提供hogocidin衍生物，其包含(a)与SEQ ID NO：2或4的hogocidin肽至少90％一致并且具有抗微生物活性的肽；(b)(a)的已经翻译后加工的成熟形式；(c)hogocidin肽的长度为约15-40个氨基酸并且具有抗微生物活性的片段；(d)包含以上(a)-(c)并且具有抗微生物活性的融合蛋白质；(e)包含(a)、(b)、(c)或(d)中任一种的肽，其中一个或多个氨基酸包括D-氨基酸，并且所述肽具有抗微生物活性；以及(f)前述任何一种并且具有抗微生物肽的逆反(retroinverso)肽。在一些另外的实施方案中，所述方法提供包含羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸残基的hogocidin衍生物、或经修饰而使得它们含有羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸残基的hogocidin衍生物。类似物、衍生物、变异或变体不必具有与获得所述类似物、衍生物、保守变异或变体的hogocidin肽的活性相同的活性，只要其具有一定抗微生物活性即可。在另一实施方案中，本公开提供与SEQ ID NO：2或4的多肽相比包含至少一个保守氨基酸差异的hogocidin多肽。

本公开还提供在N-末端包含SEQ ID NO：55的序列的多肽，且其中所述多肽具有抗微生物活性并且观察到的分子量为3484.90(m/z)。在又一实施方案中，所述多肽由表皮葡萄球菌A11产生。

本公开还提供包含药学上可接受的赋形剂并且包含基本上纯的hogocidin肽或衍生物的组合物。本公开还提供包含益生菌制剂的组合物，所述益生菌制剂包含一种或多种产生hogocidin或firmocidin的细菌菌株。

如本文所用的术语“纯化的”是指基本上不含其他蛋白质、脂质和多核苷酸(例如，会与体内产生的肽天然缔合的细胞组分)的肽。通常，所述肽是至少70重量％、80重量％或最常见90重量％纯的。如下文更充分描述的，所述组合物可进一步包含组织蛋白酶抑制素肽或其衍生物。

“变体”是所参考的抗微生物肽的改变形式的抗微生物肽(例如，本公开的hogocidin肽)。例如，术语“变体”包括通过本文所公开的方法产生的抗微生物肽，其中参考肽的至少一个氨基酸(例如，约1到10个氨基酸)被另一氨基酸取代。术语“参考”肽意指从中获得变体、衍生物、类似物或保守变异的本公开的任何抗微生物肽(例如，由SEQ ID NO：2和4组成的多肽或其成熟形式)。在术语“衍生物”内包括杂合肽，所述杂合肽包含两种抗微生物hogocidin肽中的每一种的至少一部分。可通过将一个或少量(例如，1到5个)氨基酸添加到抗微生物肽而不完全抑制所述肽的抗微生物活性来产生衍生物。另外，C-末端衍生物，例如C-末端甲酯可被产生并且被本公开涵盖。

本公开还包括作为本文所例示的那些肽的保守变异的肽。如本文所用的术语“保守变异”表示其中至少一种氨基酸被另一生物学上、化学上或结构上类似的残基替代的多肽。保守变异的示例包括一个疏水性残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸)对另一个的取代，或一个极性残基对另一个的取代，例如精氨酸对赖氨酸的取代、谷氨酸对天冬氨酸或谷氨酰胺对天冬酰胺的取代等。可彼此取代的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。结构上保守的变异包括丙氨酸对丝氨酸(反之亦然)、异亮氨酸对苏氨酸(反之亦然)、精氨酸对赖氨酸(反之亦然)的取代，以及酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸中的任一个对该组中的任一其他成员的替代。术语“保守变异”还涵盖具有取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸的肽；通常，针对取代的多肽产生的抗体也特异性结合未取代的多肽。

如本文所用的“SH-羊毛硫菌素”是指包含由人葡萄球菌产生的翻译后修饰的肽的化合物，所述肽任选地含有一个或多个羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸部分，并且显示针对一种或多种非人葡萄球菌种的抗微生物活性。

如本文所用的“SH-抗微生物剂”是指一种化合物，其包括由人葡萄球菌产生或分泌的非羊毛硫菌素化合物，其可任选地包含非羊毛硫菌素肽，并且其显示针对一种或多种人葡萄球菌种的抗微生物活性。

如本文所用的“SE-羊毛硫菌素”是指包含由表皮葡萄球菌产生的翻译后修饰的肽的化合物，所述肽任选地含有一个或多个羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸部分，并且显示针对一种或多种非表皮葡萄球菌种的抗微生物活性。在一个实施方案中，所述肽包含SEQ IDNO：55的序列。

如本文所用的“SE-抗微生物剂”是指一种化合物，其包括由表皮葡萄球菌产生或分泌的非羊毛硫菌素化合物，其可任选地包含非羊毛硫菌素肽，并且其显示针对一种或多种表皮葡萄球菌种的抗微生物活性。

可通过使用例如许多动物模型中的一种(例如展示对皮肤感染的增加敏感性的CRAMP敲除小鼠)筛选随机肽或目标多肽的大的收集物或文库来鉴别本公开的Hogocidin肽变体。Hogocidin肽变体可以是例如通过具有基于SEQ ID NO：2和4的各种取代而在氨基酸序列上与此类序列有关的肽群体。

肽文库包括例如包含肽和肽模拟分子的经标记的化学文库。肽文库还包括通过噬菌体展示技术产生的那些。噬菌体展示技术包括在噬菌体表面上表达肽分子以及蛋白质配体借以与或可以与编码它的核酸缔合的其他方法。用于产生噬菌体展示文库的方法(包括使被表达的肽群体多样化的载体和方法)是本领域已知的(参见例如Smith和Scott，Methods Enzymol.217：228 257(1993)；Scott和Smith，Science 249：386 390(1990)；和Huse，WO 91/07141和WO 91/07149)。这些或其他已知的方法可用于产生噬菌体展示文库，可从中切割所展示的肽并测定其抗细菌活性。如果期望，可测定肽群体的活性，且可对活性群体进行细分，并重复所述测定以便从所述群体中分离活性肽。用于产生可用于本公开中的肽的其他方法包括例如基于如例如SEQ ID NO：2或4中所述的hogocidin肽的氨基酸序列的合理设计和诱变。

hogocidin肽变体可以是肽模拟物，它是模拟例如SEQ ID NO：2或4的hogocidin肽(或其成熟形式)的结构、但仍保留抗微生物/抗细菌活性的非氨基酸化学结构。此类模拟物通常被表征为展示在于hogocidin肽对应物发现的相同空间布置中的类似的物理特征，例如大小、电荷或疏水性。肽模拟物的具体示例是其中一个或多个氨基酸之间的酰胺键被例如碳-碳键或本领域熟知的其他键所替代的化合物(参见例如Sawyer，Peptide Based DrugDesign，ACS，Washington(1995))。

本公开的hogocidin肽、变体或肽模拟物的氨基酸选自20种天然存在的氨基酸，除非另有说明，否则包括L-氨基酸和D-氨基酸。D-氨基酸的使用对于增加蛋白质或肽的寿命特别有用。含有D-氨基酸的多肽可抵抗蛋白水解消化。术语氨基酸也指例如化学修饰的氨基酸的化合物，所述化学修饰的氨基酸包括氨基酸类似物、通常不掺入蛋白质中的天然存在的氨基酸(例如正亮氨酸)，以及具有本领域已知的表示氨基酸特征的化学合成化合物，条件是该化合物可在肽内取代，使得其保留其生物活性。例如，谷氨酰胺可以是天冬酰胺的氨基酸类似物，条件是它可在hogocidin肽、变体等的活性片段内被取代，使得其保留其抗微生物/抗细菌活性。在Gross和Meienhofer，The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Academic Press公司，New York(1983)中列出了氨基酸和氨基酸类似物的其他示例。氨基酸还可以是氨基酸模拟物，它是展现与氨基酸基本上相同的官能团的空间布置、但未必具有表示氨基酸的“-氨基”和“-羧基”二者的结构。

本公开的多肽和肽可通过常用的方法(例如包括对α-氨基的t-BOC或FMOC保护的那些)合成。这两种方法均涉及逐步合成，其中在每个步骤中从多肽或肽的C末端开始添加单个氨基酸(参见Coligan等，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，第9单元)。本公开的多肽和肽还可通过熟知的固相肽合成方法(例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149，1962以及Stewart和Young，Solid Phase Peptides Synthesis，Freeman，San Francisco，1969，第27-62页中所述的那些方法)来合成。如果期望，可通过固相埃德曼(Edman)降解对肽进行定量。

使用合成仪可特异性地产生hogocidin肽(即SEQ ID NO：2或4的成熟形式)，而不需要翻译后加工。

本公开还包括编码本公开的多肽和肽的分离的多核苷酸(例如DNA、cDNA或RNA)。包括编码本文所述的多肽和肽的类似物、突变体、保守变异和变体的多核苷酸。如本文所用的术语“分离的”是指基本上不含与体内产生的多核苷酸天然缔合的蛋白质、脂质和其他多核苷酸。通常，多核苷酸是至少70％、80％或90％分离于其他物质的，并且用于体外合成多核苷酸的常规方法可代替体内方法使用。

如本文所用的“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其形式为单独的片段或作为较大遗传构建体的组分(例如，通过可操作地将启动子连接到编码本公开的肽的多核苷酸)。许多遗传构建体(例如，质粒和其他表达载体)是本领域已知的，并且可用于在无细胞系统或原核或真核(例如酵母、昆虫或哺乳动物)细胞中产生本公开的肽。通过考虑到遗传密码的简并性，本领域普通技术人员可容易地合成编码本公开的肽的多核苷酸。本公开的多核苷酸可容易地用于常规分子生物学方法中以产生本公开的肽。

可将编码本公开的hogocidin肽、其变体的衍生物的DNA插入“表达载体”中。术语“表达载体”是指本领域已知的可被工程化以含有编码本公开的多肽的多核苷酸的遗传构建体，例如质粒、病毒或其他运载体。此类表达载体通常是含有促进插入的遗传序列在宿主细胞中转录的启动子序列的质粒。表达载体通常含有复制起点和启动子，以及允许受转化细胞的表型选择的基因(例如，抗生素抗性基因)。包括诱导型启动子和组成型启动子在内的各种启动子可用于本公开中。通常，表达载体含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子位点和控制序列。

用本公开的多核苷酸转化或转染宿主细胞可使用本领域技术人员熟知的常规技术来进行。例如，在宿主细胞是大肠杆菌的情况下，可以使用本领域已知的CaCl₂、MgCl₂或RbCl方法制备能够进行DNA摄取的感受态细胞。或者，可使用物理手段，例如电穿孔或显微注射。电穿孔允许通过高压电脉冲将多核苷酸转移到细胞中。另外，可使用本领域熟知的方法通过原生质体融合将多核苷酸引入宿主细胞中。用于转化真核细胞的适合方法，例如电穿孔和脂质体转染(lipofection)也是已知的。

本公开所涵盖的“宿主细胞”是其中本公开的多核苷酸可用于表达本公开的hogocidin肽、衍生物或变体的任何细胞。该术语还包括宿主细胞的任何后代。可用的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞(例如酵母细胞)、植物细胞和动物细胞。例如，宿主细胞可以是高等真核细胞，例如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，例如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。将构建体引入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染或电穿孔实现(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in MolecularBiology(1986))。作为适当宿主的代表性示例，可能提到：真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如果蝇S2和斜纹夜蛾(Spodoptera)Sf9；动物细胞，例如CHO、COS或鲍斯(Bowes)黑素瘤细胞；植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择被认为在本领域技术人员的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞可包括存在于皮肤的正常细菌菌群中的细菌细胞，其被工程化以表达或过表达本公开的hogocidin肽或其他抗微生物肽。这些工程化的细菌细胞然后可被用作益生菌，以便将它们施加于皮肤。

宿主细胞可以是真核宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞是适于在细胞培养中生长的哺乳动物生产细胞。通常用于工业中的此类细胞的示例是CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos；Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤细胞系(尤其是鼠)、PC12和W138细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被广泛用于生产几种复杂的重组蛋白质，例如，细胞因子、凝血因子和抗体(Brasel等，Blood 88：2004 2012(1996)；Kaufman等，J.BiolChem 263：6352 6362(1988)；McKinnon等，J Mol Endocrinol 6：231 239(1991)；Wood等，J.Immunol 145：3011 3016(1990))。二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷突变细胞系(Urlaub等，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216 4220(1980))是通常使用的CHO宿主细胞系，因为有效的DHFR可选择且可扩增的基因表达系统允许这些细胞中的高水平重组蛋白质表达(Kaufman，Meth Enzymol 185：527 566(1990))。另外，这些细胞易于作为粘附或悬浮培养物操作并且展现出相对良好的遗传稳定性。CHO细胞和其中表达的重组蛋白质已被广泛表征，并且已被监管机构批准用于临床制造。

编码本公开的多肽和肽的多核苷酸可从细胞(例如，培养的细胞)中分离，或者它们可在体外产生。编码目标hogocidin肽的DNA序列可通过以下方式获得：1)从基因组DNA中分离双链DNA序列；2)化学制造多核苷酸，使得其编码所述目标hogocidin肽；或3)通过从供体细胞中分离的mRNA的逆转录(即产生cDNA)来体外合成双链DNA序列。用于分离目标cDNA序列的标准程序包括形成含有cDNA文库的质粒或噬菌体，所述cDNA文来库源于具有高水平基因表达的供体细胞中的mRNA的逆转录。当与聚合酶链式反应技术组合使用时，甚至可以克隆稀有的基因产物。

用于蛋白质纯化的任何各种本领域已知的方法均可用于分离本公开的肽。例如，可使用制备型色谱分离和免疫分离(例如采用单克隆抗体或多克隆抗体的那些)。载体肽可促进包含本公开的肽的融合蛋白质的分离。纯化标签可以可操作地连接到本公开的hogocidin肽。例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)允许用谷胱甘肽琼脂糖亲和柱纯化。当使用来自金黄色葡萄球菌的蛋白质A或ZZ结构域作为标签时，可使用IgG-琼脂糖凝胶(sepharose)亲和柱在单个步骤中实现纯化。作为铜绿假单胞菌外膜蛋白质F的N-末端一半的pOprF-肽可以容易地被纯化，因为它是外膜制剂中的主要蛋白质种类。如果期望，可使用与融合肽的hogocidin肽特异性反应(例如，特异性结合)的试剂纯化融合肽。例如，特异性结合hogocidin肽的单克隆抗体或多克隆抗体可用于常规纯化方法中。用于产生此类抗体的技术是本领域熟知的。

包含连接到本公开的hogocidin肽的多肽的融合构建体可在所述肽的氨基末端或羧基末端连接。通常，连接到hogocidin肽的多肽是足够阴离子的，使得hogocidin肽具有中性或负性的净电荷。阴离子多肽可在序列上对应于天然存在的蛋白质，或者可在设计上是完全人造的。在功能上，连接到hogocidin肽的多肽(“载体多肽”)可帮助稳定hogocidin肽并保护其免受蛋白酶的影响，尽管所述载体多肽不需要被显示用于此类目的。类似地，载体多肽可促进融合肽的转运。可利用的载体多肽的示例包括阴离子前-原肽和阴离子外膜肽。载体多肽的示例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、金黄色葡萄球菌的蛋白质A、蛋白质A的两个合成IgG结合结构域(ZZ)、铜绿假单胞菌的外膜蛋白质F、蛋白质转导结构域等。本公开不限于使用这些多肽；其他适合的载体多肽是本领域技术人员已知的。在另一方面，包含蛋白酶切割位点的接头部分可以可操作地连接到本公开的hogocidin肽或变体。例如，所述接头可在融合蛋白质(例如，包含hogocidin肽和载体多肽的融合蛋白质)的结构域之间可操作。因为蛋白酶切割识别序列通常长度仅为数个氨基酸，因此接头部分可包含柔性间隔物氨基酸序列内的识别序列，例如GGGS(SEQ ID NO：6)。例如，包含腺病毒内肽酶的切割识别序列的接头部分可具有序列GGGGGGSMFGGAKKRSGGGGGG(SEQ ID NO：7)。如果期望，间隔物DNA序列可编码用于从hogocidin肽切割载体多肽的蛋白质识别位点。此类间隔物DNA序列的示例包括但不限于蛋白酶切割序列，例如对于Xa因子蛋白酶，甲硫氨酸、色氨酸和谷氨酸密码子序列以及前-原防御素序列。Xa因子被用于Xa因子蛋白酶切割序列处的蛋白水解切割，而通过溴化氰处理进行化学切割在甲硫氨酸或相关残基处释放肽。另外，融合产物可通过插入色氨酸(可被邻碘苯甲酸切割)或谷氨酸(可被葡萄球菌属蛋白酶切割)的密码子而被切割。插入此类间隔物DNA序列不是产生功能性hogocidin肽的要求，此类序列可增强融合肽的稳定性。前-原防御素序列带负电荷，因此相应地，在本公开内可以设想编码带负电荷的肽的其他DNA序列也可被用作间隔物DNA序列以稳定融合肽。

本公开还提供用于通过使细菌与抑制有效量的本公开的肽接触来抑制所述细菌生长的方法。术语“接触”是指将细菌暴露于肽，使得所述肽可抑制、杀灭或溶解细菌。本公开还提供用于抑制皮肤疾病或病症和/或细菌感染的方法，其包括在受试者身上或内部放置包含分泌肽或抗微生物分子的细菌的益生菌制剂，使得病原体或不期望的微生物的生长被抑制或阻止。生物体与本公开的hogocidin肽的接触可在体外发生，例如通过将所述肽添加到细菌培养物中以测试细菌对肽的易感性或使细菌污染的表面与肽接触。或者，接触可在体内发生，例如通过向患有细菌感染或易受感染的受试者施用该肽。此外，接触可通过将细菌暴露于包含细菌菌株的益生菌制剂而发生，所述细菌菌株产生hogocidin肽、或细菌生长的其他肽或非肽抑制剂。体内接触包括胃肠外以及局部两者。“抑制”或“抑制有效量”是指足以引起例如细菌抑制或杀细菌作用的肽的量。可受本公开的肽影响的细菌包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌两者。例如，可能受影响的细菌包括金黄色葡萄球菌、酿脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组)、链球菌属种(草绿色(viridans)组)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组)、牛链球菌(S.bovis)、链球菌属(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和肠球菌属种(Enterococcus sp.)；革兰氏阴性球菌，例如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)和卡他布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)；革兰氏阳性杆菌，例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、痤疮丙酸杆菌(P.acne)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和类白喉的棒状杆菌属种(Corynebacteriumspecies)(需氧和厌氧)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌、肠杆菌属种(Enterobacter species)、奇异变形杆菌(Proteus mirablis)和其他种、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、沙雷菌属种(Serratia sp.)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。这些细菌中的一种或多种的感染可能导致疾病，例如菌血症、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、鼻窦炎、关节炎、尿路感染、破伤风、坏疽、结肠炎、急性胃肠炎、脓疱病、痤疮、acneposacue、伤口感染、出生感染、筋膜炎、支气管炎和各种脓肿、医院感染和机会性感染。真菌生物体也可能受到本公开的hogocidin肽影响，并且包括皮肤真菌(例如，犬小孢子菌(Microsporum canis)和其它小孢子菌属种；以及毛癣菌属种(Trichophyton sp.)，例如红色毛癣菌(T.rubrum)和须癣毛癣菌(T.mentagrophytes))、酵母(例如白色念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(C.tropicalis)或其它念珠菌属种)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、絮状表皮癣菌(Epidermophytonfloccosum)、糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(Pityropsporon orbiculare或P.ovale)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和其他曲霉属种、接合菌(例如，根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor))、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitides)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)和申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。用于抑制细菌生长的方法还可包括使细菌与肽与一种或多种抗生素的组合接触。

可将本公开的肽以有效抑制细菌、病毒或真菌生长的量施用于任何宿主，包括人或非人动物。因此，所述肽可用作抗微生物剂、抗病毒剂和/或抗真菌剂。产生所述肽的细菌菌株可用作益生剂(probiotic agent)。

可使用多种本领域已知方法中的任一种将肽施用于受试者。例如，本公开的肽可通过注射或通过逐渐输注随时间经肠胃外施用。所述肽可经静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、局部或经皮施用。在另一实施方案中，本公开的hogocidin肽可被配制用于局部施用(例如，作为洗剂、乳膏、喷雾剂、凝胶、油悬浮液或油膏)。市面上的制剂的示例包括局部洗剂、乳膏、肥皂、擦拭物、粉末、像覆盖伤口的纱布垫这样的装置等。可将其配制成脂质体以降低毒性或增加生物利用度或稳定性。用于递送肽的其他方法包括需要将肽封装在微球或类蛋白质中的口服方法、气溶胶递送(例如，到肺部)或透皮递送(例如，通过离子透入或透皮电穿孔)。其他施用方法将是本领域技术人员已知的。

用于本公开肽的胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体的示例包括水、盐水和缓冲介质、醇/水溶液和乳液或悬浮液。胃肠外媒介物的示例包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer′s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格氏液(lactated Ringer′s)和固定油。静脉内媒介物包括液体和营养素补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可包括防腐剂和其他添加剂，例如其他抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

本公开提供用于抑制局部细菌或真菌相关病症的方法，其通过使治疗有效量的本公开的肽或皮肤益生菌与患有此类病症或处于患此类病症的风险的受试者接触或向该受试者施用治疗有效量的本公开的肽或皮肤益生菌来实现。术语“抑制”意指预防或改善病症(例如，皮疹、疮等)的体征或症状。可改善的疾病体征的示例包括受试者的血液TNF水平升高、发热、低血压、中性粒细胞减少、白细胞减少、血小板减少、弥散性血管内凝血、成人呼吸窘迫综合征、休克和器官衰竭。可在本公开中治疗的受试者的示例包括处于患毒血症(例如由革兰氏阴性细菌感染、毒液中毒或肝衰竭引起的内毒素血症)的风险下的人或动物受试者，或罹患毒血症(例如由革兰氏阴性细菌感染、毒液中毒或肝衰竭引起的内毒素血症)的人或动物受试者。其他示例包括患有皮炎的受试者，以及具有皮肤感染(例如乳腺炎且尤其是牛乳腺炎)或经受革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌或真菌感染的损伤的受试者。候选患者的示例包括那些罹患大肠杆菌、流感嗜血杆菌B(Hemophilus influenza B)、脑膜炎奈瑟氏菌、葡萄球菌或肺炎球菌感染的患者。其他患者包括罹患枪弹伤、肾或肝衰竭、创伤、烧伤、免疫受损感染(例如，HIV/SIV/FIV感染)、造血性新瘤形成、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼氏病(Castleman′s disease)或心脏粘液瘤的患者。医学领域技术人员可容易地采用常规准则来鉴别用于根据本公开进行治疗的适当受试者。

如本文所用的用于治疗患有疾病或病症的受试者的术语“治疗有效量”意指足以改善疾病或病症的体征或症状的hogocidin肽的量。例如，治疗有效量可通过测量皮肤疮的严重性的频率被测量为足以减少受试者皮炎或皮疹的症状的量。通常，用足以将疾病或病症的症状减少至少50％、90％或100％的量的hogocidin肽治疗受试者。通常，所述肽的最佳剂量将取决于病症和诸如以下的因素：患者的体重、细菌或真菌感染的类型、体重、性别和症状程度。但是，本领域技术人员可容易地确定适合的剂量。通常，适合的剂量为0.5到40mg肽/kg体重，例如1到8mg肽/kg体重。

如果期望，适合的疗法方案可将本公开的肽或益生菌组合物与一种或多种另外的治疗剂(例如，TNF抑制剂、抗生素等)组合施用。肽、其他治疗剂和/或抗生素可被同时施用，但还可被依序施用。适合的抗生素包括氨基糖苷(例如，庆大霉素(gentamicin))、β-内酰胺(例如，青霉素和头孢菌素)、喹诺酮(例如，环丙沙星(ciprofloxacin))和新生霉素(novobiocin)。通常，以杀细菌量施用所述抗生素。然而，所述肽提供了增加抗生素活性的方法。通常，hogocidin肽和抗生素在彼此的48小时内(例如2到8小时)施用，或者可同时施用。“杀细菌量”是足以在接受治疗的受试者中实现杀灭细菌的血液浓度的量。根据其常规定义，如本文所用的“抗生素”是在稀释溶液中抑制微生物生长或杀灭微生物的化学物质。该术语还涵盖本领域已知的合成抗生素(例如，类似物)。

本公开的肽可例如用作易受微生物或病毒污染的材料的防腐剂或杀灭剂(sterilant)。例如，所述肽可用作加工食品中的防腐剂(例如，以抑制诸如沙/门氏菌属、耶尔森氏菌属(Yersinia)、李斯特菌属(Listeria)和志贺氏菌属的生物体)。如果期望，所述肽可与诸如溶菌酶的抗细菌食品添加剂组合使用。本公开的肽和/或益生菌还可用作局部试剂，例如，以抑制假单胞菌属或链球菌属或杀灭产生臭味的微生物(例如，微球菌)。本领域技术人员可容易地确定本公开的hogocidin肽用于任何给定应用的最佳量。

本公开的hogocidin和/或益生菌还可用于促进伤口修复和组织再生。基质金属蛋白酶(MMP)是各种组织中降解蛋白质的炎性酶。最近的科学研究已显示慢性伤口渗出物(这是浸湿伤口床的流体)中升高水平的蛋白酶(例如，MMP)。这些过量的蛋白酶导致重要的细胞外基质蛋白质的降解以及在伤口愈合过程中至关重要的重要生长因子的失活。这可能促成导致伤口愈合延迟的次优愈合环境。

本文所提供的组合物可与其他抗细菌剂同时使用，所述其他抗细菌剂包括磺胺药物，例如磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺异

唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、柳氮磺吡啶、磺胺嘧啶银等；喹啉抗细菌剂，例如萘啶酸、吡哌酸三水合物、依诺沙星(enoxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、托西酸托舒沙星(tosufloxacin tosilate)、盐酸环丙沙星(ciprofloxacin hydrochloride)、盐酸洛美沙星(lomefloxacin hydrochloride)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)等；抗结核剂，例如异烟肼、乙胺丁醇(盐酸乙胺丁醇)、对氨基水杨酸(对氨基水杨酸钙)、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、利福平(rifampicin)、硫酸链霉素(streptomycinsulfate)、硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、环丝氨酸等；抗抗酸细菌药物(antiacidfast bacterium drug)，例如二氨基二苯砜(diaphenylsulfone)、利福平等；抗病毒药物，例如碘苷、阿昔洛韦(acyclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)、更昔洛韦(ganciclovir)等；抗-HIV剂，例如齐多夫定(zidovudine)、去羟肌苷、扎西他滨(zalcitabine)、硫酸茚地那韦乙醇化物(indinavir sulfate ethanolate)、利托那韦(ritonavir)等；抗螺旋体剂(antispirochetele)；抗生素，例如盐酸四环素(tetracyclinehydrochloride)、氨苄西林(ampicillin)、哌拉西林(piperacillin)、庆大霉素(gentamicin)、地贝卡星(dibekacin)、卡那霉素B(kanendomycin)、利维霉素(lividomycin)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、弗氏霉素(fradiomycin)、西梭霉素(sisomycin)、四环素(tetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、罗利环素(rolitetracycline)、多西环素(doxycycline)、氨苄西林、哌拉西林、替卡西林(ticarcillin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢克洛(cefaclor)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢沙定(cefroxadine)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢孟多(cefamandole)、cefotoam、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢替安(cefotiam)、头孢替安酯(cefotiam hexetil)、头孢呋辛酯(cefuroxime axetil)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑匹酯(cefditoren pivoxil)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢磺啶(cefsulodin)、头孢甲肟(cefinenoxime)、头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢唑兰(cefozopran)、头孢吡肟(cefepime)、头孢磺啶(cefsulodin)、头孢甲肟、头孢美唑(cefinetazole)、头孢米诺(cefminox)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢拉宗(cefbuperazone)、拉氧头孢(latamoxef)、氟氧头孢(flomoxef)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢唑肟(ceftizoxime)、拉氧头孢(moxalactam)、沙纳霉素(thienamycin)、磺胺泽辛(sulfazecin)、氨曲南(aztreonam)或其盐、灰黄霉素(griseofulvin)、兰卡杀菌素类(lankacidin-group)等。

在人中，有几类已知的抗微生物肽(AMP)，包括α-防御素、β-防御素和组织蛋白酶抑制素。在几个哺乳动物物种中发现组织蛋白酶抑制素。组织蛋白酶抑制素的产生是响应上皮损伤或感染攻击而诱导的，或被某些细菌病原体(例如，痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae))的毒力机制所抑制。组织蛋白酶抑制素表达在某些慢性炎性病症中也被有差别地实现。在牛皮癣中，组织蛋白酶抑制素水平升高且继发性感染罕见，而在特应性皮炎中，组织蛋白酶抑制素表达缺乏且细菌或病毒的重复感染是常见的。已通过实验证实组织蛋白酶抑制素的治疗益处，包括局部施用后皮肤伤口的细菌定殖减少，以及通过病毒基因转移利用组织蛋白酶抑制素过表达对肺部细菌清除的改善。本公开的hogocidin肽显示与组织蛋白酶抑制素的协同效应。因此，在一些实施方案中，制剂、组合物和方法包含hogocidin和组织蛋白酶抑制素二者。在一些实施方案中，局部制剂(例如，洗剂、油膏或气溶胶喷雾剂)可包含组织蛋白酶抑制素和hogocidin肽(或其衍生物)二者。

组织蛋白酶抑制素蛋白质由两个不同的结构域构成：N-末端“cathelin样”或“原序列”结构域和成熟AMP的C-末端结构域。组织蛋白酶抑制素的C-末端结构域是最早显示有效、快速且广谱的杀灭活性的哺乳动物AMP之一。术语“cathelin样”来源于N-末端序列与cathelin的相似性，cathelin是从与猪嗜中性粒细胞分离的12kDa蛋白质，其与半胱氨酸蛋白酶抑制剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族共有相似性。

组织蛋白酶抑制素在中性粒细胞和髓样骨髓细胞以及大多数上皮来源中表达，并且由于它们存在于伤口流体中而是在哺乳动物皮肤中发现的第一种AMP。在中性粒细胞中，组织蛋白酶抑制素被合成为全长前体，并靶向储存它们的次级颗粒。在刺激后，全长组织蛋白酶抑制素蛋白质被蛋白水解加工，以释放来自cathelin样结构域的C-末端肽的杀微生物活性。

人组织蛋白酶抑制素的C-末端37个氨基酸(LL-37)已被表征。LL-37最初被称为FALL39，其出于该结构域的前4个N-末端氨基酸和残基的总数(即，39个)而被命名。LL-37是预测含有两亲性α螺旋且缺少半胱氨酸的肽，这使其与防御素家族的所有其他先前分离的人肽抗生素不同，这些抗生素均含有3个二硫桥键。全长人组织蛋白酶抑制素(有时称为全长LL-37)包含cathelin样前体蛋白质和C-末端LL-37肽，因此包含170个氨基酸(SEQ IDNO：5)。

包含SEQ ID NO：5的多肽具有多个不同的结构域。例如，存在包含如SEQ ID NO：5约1到约29-31所述的序列的信号结构域。信号结构域通常在SEQ ID NO：5的氨基酸编号30之后被切割，然而，本领域技术人员将认识到，取决于所用的酶、所用的表达系统和/或所述多肽的蛋白水解切割发生的条件，切割位点可在SEQ ID NO：5的氨基酸编号30的任一方向上变化1到3个氨基酸。另一结构域包括称为cathelin样结构域的N-末端结构域。cathelin样结构域包含SEQ ID NO：5的约氨基酸29(例如，29-31)到约氨基酸128(例如，128-131)。SEQ ID NO：5的再另一结构域包括称为LL-37的C-末端结构域。LL-37结构域包含SEQ IDNO：5的约氨基酸128(例如，128-134)到氨基酸170。LL-37包含SEQ ID NO：5中所述的氨基酸序列。

阳离子型人抗微生物肽杀灭细菌和真菌的机制通常通过肽与微生物细胞膜的结合，此后所述膜的质子梯度和完整性丧失。

可全身施用维生素D3(或其类似物)与hogocidin(以及在一些实施方案中与组织蛋白酶抑制素组合)以治疗全身性感染，特别是肺炎、败血症和TB。它还可被局部施加以治疗感染性皮肤病症。它可与抗生素用于组合疗法中或用于治疗免疫受损患者，例如HIV阳性个体。与免疫刺激方法组合，它可以治疗性地解决癌症。

本公开的组合物和方法还可包括通过施用抗微生物化合物或分泌抗微生物化合物的生物体、或施用包含支持皮肤健康的生物体的益生菌组合物来治疗皮肤生态失调病症。在一些实施方案中，所述组合物包含第二活性剂(例如，抗生素、维生素D3、组织蛋白酶抑制素等)。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含益生菌生物体。在另外的实施方案中，益生生物体是细菌。在另外的实施方案中，所述细菌包含正常皮肤菌群的组分。在另外的实施方案中，所述细菌包括人葡萄球菌菌株。在其他实施方案中，所述细菌包括表皮葡萄球菌菌株。在其他实施方案中，益生菌生物体包括菌株的混合物。在一些实施方案中，菌株混合物包含人葡萄球菌的多个菌株。在其它实施方案中，菌株混合物包含表皮葡萄球菌的多个菌株。在其他实施方案中，菌株混合物包含一种或多种人葡萄球菌菌株和一种或多种表皮葡萄球菌菌株。在一些实施方案中，所述组合物还包含除了人葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌之外的一种或多种菌株。在一些另外的实施方案中，额外的一种或多种菌株包括来自葡萄球菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)的一种或多种菌株。例如，特定的制剂可包含人葡萄球菌或表皮葡萄球菌，特别是人葡萄球菌菌株A9、人葡萄球菌菌株C2、人葡萄球菌菌株AMT2、人葡萄球菌菌株AMT3、人葡萄球菌菌株AMT4-C2、人葡萄球菌菌株AMT4-G1、人葡萄球菌菌株AMT4-D12、表皮葡萄球菌菌株AMT1、表皮葡萄球菌菌株SE-A11、表皮葡萄球菌菌株AMT5-C5和/或表皮葡萄球菌菌株AMT5-G6。此类制剂通常包含足量的细菌细胞，以便当施加于受试者的皮肤时提供10³-10⁶CFU/cm²的最终密度。此类制剂可包含约10⁴到约10⁷CFU/g、或者10到约10⁵CFU/g、或者约10⁵到约10⁹CFU/g的浓度。此类制剂可包含人葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的多种菌株，并且可进一步包含乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和/或本领域已知形成正常健康皮肤或粘膜菌群的一部分的其他此类种或菌株。在一些实施方案中，如上文所述的人葡萄球菌菌株包含制剂中100％的细菌细胞。在一些另外的实施方案中，人葡萄球菌占给定制剂中细菌细胞的90-100％、85-95％、70-80％、75-85％、60-70％、65-75％、50-60％、55-65％、40-50％、45-55％、30-40％、35-45％、20-30％、25-35％、10-20％、15-20％、1-10％、5-15％或小于1％，其中菌落形成单位的剩余部分由表皮葡萄球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或本领域已知形成正常健康皮肤或粘膜菌群的一部分的其他此类菌株提供。在一些实施方案中，如上文所述的表皮葡萄球菌菌株包含制剂中100％的细菌细胞。在一些另外的实施方案中，表皮葡萄球菌占给定制剂中细菌细胞的90-100％、85-95％、70-80％、75-85％、60-70％、65-75％、50-60％、55-65％、40-50％、45-55％、30-40％、35-45％、20-30％、25-35％、10-20％、15-20％、1-10％、5-15％或小于1％，其中菌落形成单位的剩余部分由人葡萄球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或本领域已知形成正常健康皮肤或粘膜菌群的一部分的其他此类菌株提供。在一些实施方案中，除人葡萄球菌或表皮葡萄球菌之外的细菌占制剂中细菌细胞的约50％或更小。在一些实施方案中，所述细菌占给定制剂内细菌细胞的小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。在一些实施方案中，除人葡萄球菌或表皮葡萄球菌外的细菌可包括乳酸乳球菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或本领域已知形成正常健康皮肤或粘膜菌群的一部分的其他此类种或菌株。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约60％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约40％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约50％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约50％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约40％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约60％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约70％人葡萄球菌和约30％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约30％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约70％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约80％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约20％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约20％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约80％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中的约90％人葡萄球菌和上文所列菌株中的约10％表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中大于约90％的人葡萄球菌和上文所列菌株中小于约10％的表皮葡萄球菌。在一些实施方案中，所述制剂包含上文所列菌株中小于约10％的人葡萄球菌和上文所列菌株中大于约90％的表皮葡萄球菌。

如本文所用的自体移植是指将细菌菌株从一个部位移植到同一受试者上的另一部位、或同一部位，而不管所述菌株在被施用之前是否被培养。在一些实施方案中，将从受试者获得的细菌菌株在培养中扩增，然后移植回受试者。

如本文所用的同种异体移植是指将细菌菌株从一位受试者移植到另一受试者，或者是指向受试者施用包含不是从其自身机体上或机体内收集的细菌菌株的组合物。

此类收集可通过以下方式来进行：拭抹、刮擦、擦拭或切割和移除上面驻有如本文所述的细菌菌株之一的组织；任选地从琼脂板上或以其他方式使用本领域已知的方法生长并分离单个菌落；任选地，根据本领域已知的方法，在液体或固体培养中生长分离的细菌或粗制拭子、擦拭物、刮擦物、组织或其他分离物的扩大培养物；任选地通过离心、过滤、重力沉降、刮擦或借助本领域已知的其他手段从所述扩大培养物收获细菌；用稠化剂、载体或赋形剂配制所述细菌或粗制分离物；以及使受试者在被确定为需要移植的区域与所述制剂接触。

如本文所用的益生元化合物包含多糖、水解产物、盐、草本提取物或足以在与相关益生菌株组合使用时促进该菌株的生长的任何其他化合物，例如浓度小于约40％(w/w)的酵母水解产物、浓度小于约10％(w/w)的微晶纤维素和/或浓度小于约10％(w/w)的蔗糖。可适于与皮肤细菌使用的益生元的其他示例包括菊糖、低聚葡萄糖、低聚异麦芽糖、低聚乳果糖(lactosucrose)、聚右旋糖、大豆低聚糖和低聚木糖，以及Gibson，G.R.和Roberfroid，M，(编辑)Handbook of Prebiotics，CRC press(2008)；Roberfroid，M.，J.Nutr.137(3)：830S-837(2007)和Slavin，J.Nutrients 5(4)：1417-1435(2013)中所公开的那些，这些参考文献中的每一个均以引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，所述方法包括使受试者与如本文所述的益生菌组合物和/或益生元组合物接触。在一些实施方案中，此类接触包括自体移植。在一些实施方案中，此类接触包括同种异体移植，其中皮肤或粘膜菌群的成分从第二受试者(供体)被移植到有需要的第一受试者。例如，在一些实施方案中，从第二受试者中鉴别并分离如上文所公开的细菌菌株，将其在适当的培养基中在本领域已知的有助于细菌生长的条件下扩增，之后收获细菌细胞，将收获的细胞以根据本公开的预定浓度与预定制剂混合，并将所述混合物施加于第一受试者的受影响区域。在一些实施方案中，此类组合物包含标准化制剂，例如其中成分浓度固定且不随受试者而变化的制剂。在一些实施方案中，基于包括但不限于以下的准则对每位受试者单个地开发制剂：受试者自身的皮肤或粘膜菌群的组成；受试者的疾病状态和治疗史；受试者病况的性质和严重性；并发的皮肤或粘膜感染的性质和严重性；在受试者体内存在其他抗微生物化合物，包括全身性抗生素；以及诸如本领域技术人员已知的或将容易显而易见的其他准则。

在一些实施方案中，所述组合物包含乳膏、油膏、油悬浮液或软膏，其中如上所述的益生细菌被掺入保湿剂或乳液内，例如下文和Nakatsuji，T.等(2016)，Nature Medicine递交原稿号NMED-A78395A(于2016年3月29日递交)中所述的那些。在一些实施方案中，所述组合物包含贴剂或泥敷剂，其中所述细菌与适合的赋形剂组合并掺入织物、凝胶基质或聚合物片材内。用于局部施用的适合的赋形剂和载体是本领域已知的，且包括稠化剂、乳化剂、脂肪酸、多糖、多元醇以及聚合物和共聚物，包括但不限于藻酸盐、微晶纤维素、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、矿脂和本领域已知的许多其他赋形剂和载体。

在一些实施方案中，所述组合物包含细菌培养基、条件细菌培养基和/或细菌培养物。在一些实施方案中，所述组合物包含细菌培养基的滤液或上清液。在一些实施方案中，所述组合物包含冻干的培养基。在一些实施方案中，所述组合物包含由细菌培养基的滤液或上清液产生的冻干的条件培养基。

在一些实施方案中，如本文所述的方法包括支持受试者皮肤的健康。在另外的实施方案中，所述方法包括提供对于皮肤生态失调和由其衍生的病症的治疗。在一些实施方案中，所述方法包括提供对于皮肤的细菌感染的治疗。在一些实施方案中，所述治疗包括以下步骤：鉴别患有皮肤生态失调、细菌感染、乳腺炎、烧伤或其他伤口、特应性皮炎、牛皮癣或其他慢性皮肤状况的受试者；以及向需要治疗的病况部位施用如本文所公开的益生菌组合物。给定制剂(油膏、凝胶、贴剂等)的适当施用方式的确定可由治疗皮肤感染领域的普通技术人员完成。在一些另外的实施方案中，以有规律的定时间隔重新施加益生菌组合物。在一些实施方案中，每三天重新施加益生菌组合物。在一些实施方案中，每两天重新施加益生菌组合物。在一些实施方案中，每两天重新施加益生菌组合物。在一些实施方案中，每天重新施加益生菌组合物。在一些实施方案中，益生菌组合物每天重新施加超过一次。在一些实施方案中，每周重新施加益生菌组合物。在一些实施方案中，益生菌组合物仅被施加一次。

在一些实施方案中，所述方法包括提供对于金黄色葡萄球菌(包括抗甲氧西林(methicillin)或苯唑西林(oxacillin)的金黄色葡萄球菌)感染的治疗。在一些另外的实施方案中，所述方法包括以下步骤：诊断金黄色葡萄球菌感染；以及向感染部位施加如本文所公开的益生菌和/或益生元组合物，其中此类组合物能够通过产生抗微生物化合物、通过竞争皮肤或粘膜生物区系内的资源或通过其他手段来杀灭金黄色葡萄球菌或抑制其生长。给定制剂(油膏、凝胶、贴剂等)的适当施用方式的确定可由治疗皮肤感染领域的普通技术人员完成。在一些另外的实施方案中，以有规律的定时间隔(例如，每天、每两天、每三天、每周等)重新施加益生菌组合物。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，在其他实施方案中，可应用类似或相同的步骤来提供对于铜绿假单胞菌感染或来源于假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)或弧菌属(Vibrio)的细菌或未表征病原体的感染的治疗。在一些实施方案中，所述方法包括提供对于未知或未表征的病原体的感染的治疗。在一些实施方案中，所述方法包括提供对于多种微生物感染的治疗。在一些实施方案中，所述方法包括对烧伤或伤口施用此类治疗。在一些实施方案中，所述方法包括提供对于慢性皮肤病况的治疗。在一些实施方案中，所述病况是特应性皮炎、牛皮癣或其他慢性皮肤病况。

以下实施例意在举例说明，而不限制本发明。尽管它们是可能使用的那些中的典型的，但可替代地使用本领域技术人员已知的其他程序。

实施例

实施例1

CoNS菌株和抗微生物肽的分离。招募特应性皮炎成年患者和年龄匹配的非特应性皮炎受试者。人口统计学数据示于表1中。所有涉及人受试者的实验均根据所述机构批准的IRB方案进行。

表1：特应性皮炎和非特应性受试者的临床特征。

*在招募的50位患者中，1位患有特应性皮炎的受试者中未检测到活的葡萄球菌和葡萄球菌DNA。因此，报告49位特应性受试者的数据。BMI，体重指数；EASI，湿疹面积和严重度指数；NJH，国立犹太健康中心(National Jewish Health)；SD，标准偏差

细菌丰度的测量。由肘前窝上的病变皮肤的预测量区域(约3×10cm)和上臂的距病变部位至少2cm的非病变皮肤进行活的表面细菌和细菌DNA的收集。从非特应性受试者的相同皮肤部位获得类似收集物。利用经用于收集活细菌的胰蛋白酶大豆培养液(TSB)或经用于收集细菌DNA的Tris-EDTA缓冲液预先润湿的拭子摩擦皮肤。将活细菌样品接种在具有蛋黄的甘露醇盐琼脂上以区分凝固酶阴性葡萄球菌属(CoNS)。利用QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen)提取总基因组DNA，并通过利用种或属特异性引物进行定量实时PCR(qPCR)来确定DNA丰度。在招募的50位患者中，1位患有特应性皮炎的受试者中未检测到活的葡萄球菌和葡萄球菌DNA。因此，报告49位AD受试者的数据。

细菌DNA的定量。为了收集细菌DNA，用经含有0.1％TritonX-100和0.05％Tween-20(w/v)的Tris-EDTA缓冲液预先润湿的拭子擦拭类似于用于细菌培养的预先测量的区域。通过蛋白酶K、之后纯化的无色肽酶(Wako Chemical)和

(epicenter公司)溶解细菌细胞。用QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen)纯化总基因组DNA，并用50μL洗脱缓冲液洗脱。通过用种或属特异性引物(表2)进行定量实时PCR(qPCR)来确定细菌DNA的丰度。为了确定葡萄球菌属种DNA的相对CFU(rCFU)，利用从来源于已知CFU的表皮葡萄球菌(ATCC12228)的标准品提取的基因组DNA产生标准曲线。通过解链曲线分析和与标准曲线的比较确认所有引物对的特异性。

表2：PCR引物序列

筛选抗微生物活性。随机挑取来自每个皮肤部位的CoNS分离物的多达84个单个菌落，并将其转移到含有TSB的96孔排管中。每个板还接受作为阴性对照的表皮葡萄球菌的非抗微生物菌株(ATCC1457)、作为阳性对照的人葡萄球菌的已知抗微生物菌株(见下文)和无细菌的空白孔。将CoNS在37℃振荡培养过夜。通过OD₆₀₀评价生长。通过离心去除细菌，之后用0.22μm膜进行无菌过滤。通过与1×10⁴个菌落形成单位(CFU)的金黄色葡萄球菌(ATCC35556)混合来评价从每个菌落释放的抗微生物活性。抗微生物菌株被定义为在22hr后将金黄色葡萄球菌生长抑制到小于在阴性对照中见到的生长的50％(I₅₀)的菌株。从招募的一些受试者中生长不足的CoNS菌落。因此，报告了29位非特应性受试者以及特应性受试者的41个非病变部位和40个病变部位的数据。将所有CoNS分离物冷冻储存用于种鉴别。利用通用16S引物(27-F和1525-R)从48个代表性菌落扩增全长16S rRNA基因。通过桑格(Sanger)方法从两端对扩增子进行测序。

由人葡萄球菌产生的AMP的纯化。来自从健康受试者分离的代表性抗微生物人葡萄球菌菌株的无菌条件培养基被用于进一步鉴别正常皮肤上具有抗微生物活性的分子，这些分子在特应性皮肤(atopics)上丰度低。硫酸铵(70％饱和)使活性沉淀，将其溶解在H₂O中并施加在Sep-Pak柱(Waters公司)上。将活性级分用H₂O中的30％乙腈洗脱并进行

(GE Healthcare Life Sciences)分离，并且以125mM NaCl洗脱活性。利用CapCel Pak C8(5μm，

4.6×250mm)(Shiseido公司)以0.1％(v/v)TFA中的5％到50％乙腈的线性梯度，以0.8mL/分钟进行第三步HPLC纯化。

由人葡萄球菌产生的AMP的鉴别。从分离自非特应性受试者的代表性抗微生物人葡萄球菌菌株的无菌条件培养基中纯化抗微生物活性。通过MALDI-TOF/TOF、埃德曼末端测序和基因组测序来确定纯化的活性分子的二级结构。

质谱。使用由flexcontrol软件(Bruker Daltonics)控制的MALDI-TOF/TOFBruker Autoflex^TM Speed仪器(Bruker Daltonics)记录来自人葡萄球菌的经HPLC纯化的AMP的质谱。使用溶解在50％乙腈(ACN)和0.1％三氟乙酸(TFA)中的作为基质的氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)10mg/mL(Sigma-Aldrich)，以正离子反射器模式进行质谱分析。对于质量范围1000-4000m/z以正离子反射器模式获得全扫描质谱。每个质谱都是750次平均激光发射的结果，激光强度设定为全激光强度的约65％，且检测器增益以8x 4GS/s(如BrukerFlex Control软件内选择)增强。使用TOF/TOF碰撞诱导解离获得手动选择的离子m/z 3547的具有5Da窗口范围的MALDI-MS/MS谱。每个MS/MS谱是1000次平均激光发射的结果，激光强度被设定为约60％(在软件内选择)，并且检测器增益以10x 4GS/s被增强。使用flex分析软件(Bruker Daltonics)分析所得质谱。将光谱校准为PepMix内标溶液。

N-末端蛋白质测序。通过在

494HT蛋白质序列系统(AppliedBiosystems)上进行15个循环的埃德曼降解来分析纯化的Hogocidin-α(级分30，图7A)的N-末端氨基酸序列。Hogocidin-α的预测成熟形式示于图5A中。

通过MALDI-TOF/TOF分析进行蛋白质测序。由于来自人葡萄球菌的Hogocidin-β的N-末端区域(级分32，图8)含有经修饰的氨基酸，因此不能通过埃德曼降解获得序列。因此，基于基因组引导的MALDI-TOF/TOF分析获得该AMP的完整蛋白质序列。在抗生素和次级代谢物分析壳-AntiSMASH平台上进行人葡萄球菌的核苷酸序列分析，以鉴别次生代谢物生物合成基因簇。AntiSMASH结果提供了对于羊毛硫肽(lantipeptide)的一个基因簇(图9A)，在基因座2050-2250处具有潜在候选物。对参与合成和修饰的基因的NCBI BlastP分析显示与2类羊毛硫肽的高同源性。从对于2型羊毛硫菌素常见的具有GG切割位点的前导肽切割具有序列ATPTITTSSATCGGIIVAASAAQCPTLACSSRCGKRKK(SEQ ID NO：4 aa29到66)的核心肽。组合基因组挖掘和MS/MS断裂预测Hogocidin-β的成熟形式(图5A)。

基因组测序。由于来自人葡萄球菌的AMP的蛋白质序列与在现有基因组数据库中发现的任何分子均不匹配，因此进行人葡萄球菌的抗微生物菌株的全基因组序列。使用

微生物DNA分离试剂盒(MO Bio)纯化基因组DNA。使用Nextera-XT DNA样品制备试剂盒(Prep Kit)(Illumina)按照供应商的方案构建全基因组DNA测序文库。通过Illumina MiSeq^TM上的配对末端测序(300×300)对最终文库进行测序。使用SPAdes 2.5.1，利用长度为21、33、55、77和127的k-mer对测序的读段(read)进行从头组装，并开启“小心”标记(flag)。在所有生产的支架上，使用翻译全基因组多染色体.pl(translate WholeGenome Multi Chromosome.pl)([http：//]proteomics.ucsd.edu/Downloads/)进行六框翻译。然后查询该输出与通过质谱鉴别的肽片段的匹配。

抗微生物测定。使用金黄色葡萄球菌(ATCC35556)菌株进行径向扩散测定以测试纯化级分的抗微生物活性。简单地说，将融化的TSB琼脂(10mL)与金黄色葡萄球菌(1×10⁶CFU)混合并倒入10cm皮氏培养皿中。将2到4μL测试样品施加于在琼脂板上打孔的小孔中。将板在37℃孵育过夜，以允许细菌的可见生长。抗细菌活性由孔周围的透明区域(无细菌生长)指示。通过将金黄色葡萄球菌(1×10⁵CFU/mL)与纯化Hogocidin的2倍连续稀释物，在PBS中的半浓度Muller-Hinton肉汤(MHB)中在37℃孵育24hr来评价Hogocidin的抗微生物活性。孵育后，通过对在TSB琼脂板上涂铺细菌的10倍连续稀释物后的CFU计数来测量活细菌的数目。MBC被确定为24小时孵育后活细菌的3-log降低(99.9％)。

统计学分析。配对t检验被用于比较特应性受试者内的病变样品与非病变样品，并且独立t检验被用于比较非特应性样品与特应性样品。还拟合了抗微生物CoNS的频率和活葡萄球菌属与葡萄球菌属DNA的比率随时间的纵向混合模型。每个模型均包括病变类型、访视和它们的相互作用项作为固定效应，而使用复合对称结构来说明在多个时间点从同一受试者获得的样本之间的相关性。抗微生物CoNS的频率使用分类百分比(＜＝20，21-79，＞＝80)的累积logit连接和多项分布来解释双峰分布。使用SAS(9.3版)软件进行统计分析。

在特应性皮炎中葡萄球菌的存活增加。为了评估可培养/活的葡萄球菌属种的量和不可培养/死的葡萄球菌种的量之间的关系，通过手工菌落计数和对于属特异性16S核糖体DNA的qPCR两者来测量细菌密度。与先前报告一致，与从特应性皮炎患者的非病变皮肤或非特应性受试者相比，可从特应性皮炎患者前臂上的病变皮肤培养更多的总的葡萄球菌种和金黄色葡萄球菌(图1A和1B)。DNA丰度的测量揭示出类似的趋势(图1C和图6)。然而，这两种独立技术的结果在特应性病变皮肤和非特应性皮肤之间显著不同。在患有特应性皮炎的受试者的病变皮肤中，基于培养物和DNA的结果是类似的(图1D)。相比之下，在非特应性皮肤中，培养CFU与基于DNA丰度的相对CFU的比率为大约0.1，表明非特应性受试者的皮肤上细菌的较低存活率。

皮肤微生物群系的抗微生物活性。分离来自30位非特应性受试者(2029个菌落)和50位特应性受试者(5695个菌落)的活CoNS，以表征它们对金黄色葡萄球菌存活的影响。观察到从非特应性受试者分离的大多数CoNS克隆(75.26±35.49％)抑制金黄色葡萄球菌生长(图2A)。相比之下，在特应性皮肤上发现的少数CoNS具有这种活性[22.83±32.64％(非病变)和15.76±25.92％(病变)]。从每个群体分离的CoNS的抗微生物功能的这种差异是随时间稳定且可再现的，如在2周时期内在重复的拭抹后所见的(图2B)。可培养的葡萄球菌属与总葡萄球菌属DNA的增加的比率在这个队列中在两周内也是稳定的(图2C)。这些数据表明，尽管特应性皮炎患者的皮肤支持CoNS细菌的生长，但它能够使抗微生物功能不同于在非特应性皮肤上所发现的那些的菌株存活。

如图1中所示，仅3％的非特应性受试者是金黄色葡萄球菌培养阳性(＞1CFU/cm²)，而57％的特应性受试者是金黄色葡萄球菌培养阳性。为了确定从CoNS检测到的抗微生物活性是否与金黄色葡萄球菌存活有关，比较抗微生物CoNS的频率与活的金黄色葡萄球菌的测量值(图3A)。引人注目的是，所有具有活金黄色葡萄球菌的患者都具有低频率的抗微生物CoNS。另外，金黄色葡萄球菌培养阳性组(＞1CFU/cm²)的频率低于金黄色葡萄球菌阴性组(图3B)。这些数据表明抗微生物CoNS可预防金黄色葡萄球菌的定殖。

皮肤上抗微生物细菌种类的鉴别。为了进一步鉴别具有抗微生物活性的CoNS种，选择细菌菌落的随机亚组用于全长16S rRNA基因测序。在非特应性皮肤中，抗微生物CoNS的主要种是表皮葡萄球菌或人葡萄球菌(图4A)。在特应性受试者中，抗微生物CoNS成员包括巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、瓦氏葡萄球菌、头葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌。然而，在大多数受试者中，在发现具有抗微生物功能和非抗微生物功能的组内鉴别出类似种(图4B)。这些观察结果显示，抗微生物活性在种的水平下不可预测。在特应性皮炎患者中似乎发生功能上无活性的CoNS菌株的过度生长。

由微生物群系产生的具有抗微生物活性的肽。为了确定CoNS菌株中检测到的抗微生物活性的原因，使用遗传和生物化学方法。细菌素是由一些CoNS种产生的一类AMP。然而，通过PCR(表2，引物序列)在非特应性皮肤(n＝14)中未检测到编码已知细菌素(epiA、pepA、eciA和elkA)的DNA。因此，进行实验以纯化和鉴别从非特应性受试者分离的抗微生物人葡萄球菌的代表性菌落的活性来源。反相色谱揭示与抗微生物活性相关的两个独立峰(3152.2Da和3547.7Da)(图7)。3152.2Da肽的N-末端氨基酸测序为KCSWWNAA。通过基因组引导的MALDI-TOF/TOF分析获得3547.7Da肽的完整序列(图8)。该人葡萄球菌菌株的质量和氨基酸序列与基因组序列的比对揭示，这些新型的AMP在lanM、lanC和lanT同源物的基因簇内被编码(图9)，并且与作为羊毛硫菌素的特性一致。由于这些AMP先前是未知的，因此它们从意为“保护”的日语“Hogo”被命名为Hogocidin-α(3152.2Da)和Hogocidin-β(3547.7Da)。这些新描述的AMP在50％的14位非特应性个体中通过PCR可容易地检测到。成熟Hogocidin-α和Hogocidin-β的预测二级结构示于图5A中。纯化的Hogocidin-α和Hogocidin-β针对金黄色葡萄球菌的最低杀细菌浓度(＞99.9％杀灭)分别为0.625μM和1.25μM(图5B)，其活性比在人皮肤上产生的常规AMP更有效。重要的是，每种Hogocidin肽与人皮肤组织蛋白酶抑制素AMP LL-37的共孵育显示出针对金黄色葡萄球菌的强的协同抗微生物活性(图5B)，表明来源于微生物群系的AMP增强宿主先天免疫防御抵抗金黄色葡萄球菌的能力。

实施例2

细菌菌株的FAME分析。由于可由细菌细胞提取物的皂化和甲基化样品中存在的脂肪酸甲酯的相对丰度表示的整个细菌细胞(主要是细胞膜)的脂质组成几乎是每种菌株独有的，因此对所鉴别的菌株进行脂肪酸甲酯(FAME)分析。根据标准技术培养和收获细菌菌株。对细胞进行皂化和甲基化，然后提取到用于气相色谱的流动相溶剂中。根据仪器制造商的说明加载并运行样品。所得色谱图示于图11到图19中。

实施例3

共生细菌保护皮肤免受金黄色葡萄球菌的定殖。已建立了产生AMP的共生CoNS与金黄色葡萄球菌的定殖之间的关联，并且已鉴别了由这些菌株产生的活性肽，进行实验以测试这些细菌的存在是否将减少金黄色葡萄球菌的定殖。将临床CoNS分离物施加于首先施加了限定量的金黄色葡萄球菌的消毒猪皮表面。在以与正常人皮肤上的细菌密度的估计值一致的密度(1×10⁵CFU/cm²)单次施加人葡萄球菌A9后，观察到金黄色葡萄球菌存活的显著降低(图20A)。施加在施加前被杀灭并冲洗的人葡萄球菌A9，或使用在培养中不显示抗微生物活性的其他人葡萄球菌菌株不影响金黄色葡萄球菌的存活。类似地，将活性人葡萄球菌单次施加于已施加限定量的金黄色葡萄球菌的小鼠背部降低了金黄色葡萄球菌在皮肤上的存活(图20B)。相比之下，以相似密度施加无活性菌株并不抑制金黄色葡萄球菌。

最后，为了直接测试功能筛选和分离的共生细菌在人体中抑制金黄色葡萄球菌的能力，进行实验以测试将这些细菌施加于AD患者皮肤的作用。如前所示，具有抗微生物活性的菌株在这些受试者的总CoNS群落内极少，但如果筛选出足够的菌落，则可被鉴别出。5位金黄色葡萄球菌培养阳性的AD患者被招募参与本研究。鉴别出具有抗微生物活性的CoNS克隆并将其扩增，用于有计划的重新施加于受试者(自体移植)。对每个所选克隆测序并在5个表皮葡萄球菌或人葡萄球菌菌株中鉴别出羊毛硫菌素相关基因簇，并且在2个表皮葡萄球菌菌株和1个人葡萄球菌菌株中观察到大肠杆菌素V基因(图21-23)。以双盲方式，将单独的媒介物乳膏或在乳膏中配制的细菌施加于每只手臂的皮肤一次，然后在24hr后测量金黄色葡萄球菌。将所选菌株施加到1×10⁵CFU/cm²的总最终浓度，该密度类似于先前对正常人皮肤上细菌的丰度的评估。与基线相比，单次施加这些功能限定且自体衍生的CoNS菌株在24hr内显著降低金黄色葡萄球菌CFU(图20E)。

实施例4

抗微生物CoNS于离体猪皮和小鼠上的移植。从Loretta Tomlin AnimalTechnologies(Livermore，CA)获得冷冻猪皮片，并通过用3％氯二甲酚进行手术刷洗加以消毒。将皮肤片切成2.5cm×2.5cm并用无菌PBS冲洗超过20次，以去除氯二甲酚残余物。将随机选择的C57BL6雌性6周龄小鼠的背部皮肤剃毛，用脱毛膏处理并在施加细菌之前用水冲洗至少24hr。用酒精拭子将剃毛的皮肤清洁两次以去除最初定殖的细菌。涉及活动物工作的所有实验均得到机构动物护理和使用指南(Institutional Animal Care and UseGuideline)批准。

将金黄色葡萄球菌(ATCC35556)(1×10⁵CFU/cm²)在猪皮(2.5×2.5cm)或小鼠背部皮肤(2×2cm)上进行外表皮(epicutaneously)攻击。在确认不影响细菌存活力的皮肤保湿剂中以1×10⁷CFU/g配制从非AD受试者分离的产生Sh-羊毛硫菌素(hogocidin)的人葡萄球菌A9菌株、或从AD受试者的病变皮肤分离的不在培养中产生抗微生物活性的人葡萄球菌菌株。随后将具有抗金黄色葡萄球菌活性的人葡萄球菌A9菌株、紫外线杀灭的人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、C5和C6的无活性菌株(1×10⁵CFU/10μL)或媒介物施加于猪皮或小鼠背部皮肤的表面上并保持20hr(图20A和图20B)。将纯化的羊毛硫菌素(0.5nmol)、人葡萄球菌A9的条件培养基(50μL)施加于消毒猪皮的表面。在6孔板中在30℃孵育猪皮。如上文所述，利用经TSB预润湿的Catch-All拭子从皮肤表面收获活细菌。通过剧烈涡旋拭子头将细菌悬浮于1mL TSB中。将细菌悬浮液的10倍连续稀释物涂铺在具有卵黄亚碲酸盐的Baird-Parker琼脂上用于金黄色葡萄球菌的选择性计数。在选择性琼脂板上将金黄色葡萄球菌(带有晕圈的大的黑色菌落)与人葡萄球菌(没有晕圈的小的灰色菌落)区分开来。

实施例5

自体微生物群系移植。用于AD患者的自体微生物群系移植(AMT)的方法已被美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)(FDA)官方批准，并且该方案已被提交为研究性新药申请(investigational new drug application)(IND)(UCSD批准号15786)。在筛选访视时，筛选为两个肘前窝的病变部位上的金黄色葡萄球菌携带者的AD患者。同时，通过从AD患者的上臂的非病变皮肤拭抹获得皮肤细菌，以筛选产生针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的CoNS菌株。通过对全长16S rRNA基因的桑格测序来鉴别抗微生物CoNS分离物的种。将CoNS分离物的甘油贮液储存在-80℃，直到第二次访视，此时患者接受移植疗法。将每个CoNS菌株在TSB中单个地扩增过夜。在确认不影响细菌存活力的皮肤保湿剂中以1×10⁷CFU/g配制每种CoNS菌株。从3名患者中仅分离出具有抗微生物活性的单个表皮葡萄球菌或人葡萄球菌菌株。在这些情况下，配制单一的CoNS菌株。从2名AD患者中分离出3个和2个抗微生物人葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌株(图20D)。在这些情况下，以10⁷CFU/g的总浓度配制等CFU的每一CoNS。在第二次访视时，测量受累面积，并如上文所述对两只前臂的病变部位上活金黄色葡萄球菌的基线CFU进行定量。用10mg/cm²的AMT制剂处理一臂，以得到1×10⁵CFU/cm²的CoNS。另一臂只接受等量的保湿剂。所有治疗均以双盲方式进行，并在分析所有结果后去盲。受试者避免浸浴、淋浴、锻炼或将任何局部产品施加到他们的手臂，并且穿着干净的长袖衬衫，以避免被施加的CoNS对另一臂的交叉污染，直到下一次访视。在第三次访视时，测量受累区域中的金黄色葡萄球菌CFU。媒介物臂和AMT臂之间的金黄色葡萄球菌存活之差被计算为[AMT(χhr)-媒介物(χhr)]/AMT(基线)，得到Δ％金黄色葡萄球菌CFU(χ＝0hr或24hr)(图20E)。

统计学分析。对于所有实验，使用至少3个或更多个生物重复，并且这些示于图例中。对于所有小鼠实验，每个处理组使用至少6只小鼠。因此，对于所报告的差异，所用的样品大小给出了足够的可靠性。配对t检验(双尾)被用于比较AD受试者内的病变样品与非病变样品，并且独立t检验(双尾)被用于比较非AD样品与AD样品。对于非正态分布变量，例如具有Sh-抗生素-α的CoNS(％)，在AD受试者内使用非参数方法，例如威-曼-怀三氏检验(Wilcoxon-Mann-Whitney test)用于非AD对AD样品的，和使用威氏符号秩检验(Wilcoxonsigned rank test)用于病变对非病变样品。还拟合了抗微生物CoNS的频率和活葡萄球菌属与葡萄球菌属DNA的比率随时间的纵向混合模型。每个模型均包括病变类型、访视和它们的相互作用项作为固定效应，而使用复合对称结构来说明在多个时间点从同一受试者获得的样本之间的相关性。抗微生物CoNS的频率使用分类百分比(＜＝20，21-79，＞＝80)的累积logit连接(cumulative logit link)和多项分布来解释双峰分布。使用SAS(9.3版)软件和R软件(3.1.1版)进行统计分析。

实施例6

同种异体移植。在确认不影响细菌存活力的皮肤保湿剂中配制10⁵CFU/g菌株SH-A9、SH-C2、SE-A11、AMT1、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-G1、AMT4-D12、AMT5-C5、AMT5-G6和/或SE-MO34。基于特应性皮炎和/或活性金黄色葡萄球菌感染的存在鉴别用于治疗的受试者。指示受试者避免在三天内浸浴、淋浴、运动或将任何局部产品施加于受影响区域。顺应性患者显示在7天后经治疗区域中金黄色葡萄球菌水平显著降低(可回收金黄色葡萄球菌菌落计数降低＞/＝3log)。顺应性患者显示在初始治疗后金黄色葡萄球菌感染和/或特应性皮炎的症状持续至少14天的临床可观察降低。

实施例6

由表皮葡萄球菌产生的AMP的纯化。来自代表性抗微生物表皮葡萄球菌A11菌株的无菌条件培养基被用于进一步鉴别正常皮肤上具有抗微生物活性的分子，这些分子在特应性皮肤(atopics)上丰度低。硫酸铵(70％饱和)使活性沉淀，将其溶解在H₂O中并施加在Sep-Pak柱(Waters公司)上。将活性级分用H₂O中的40％乙腈洗脱并进行

SP(GEHealthcare Life Sciences)分离，并且以500mM NaCl洗脱活性。利用CapCel Pak C8(5μm，

4.6×250mm)(Shiseido公司)以0.1％(v/v)TFA中的5％到50％乙腈的线性梯度，以0.8mL/分钟进行第三步HPLC纯化。

由表皮葡萄球菌产生的AMP的鉴别。从分离自非特应性受试者的代表性抗微生物表皮葡萄球菌A11菌株的无菌条件培养基中纯化抗微生物活性。通过MALDI-TOF/TOF和埃德曼末端测序来确定纯化的活性分子的特征。

质谱。使用由flexcontrol软件(Bruker Daltonics)控制的MALDI-TOF/TOFBruker Autoflex^TM Speed仪器(Bruker Daltonics)记录来自表皮葡萄球菌A11的经HPLC纯化的AMP的质谱。使用溶解在50％乙腈(ACN)和0.1％三氟乙酸(TFA)中的作为基质的氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)10mg/mL(Sigma-Aldrich)，以正离子反射器模式进行质谱分析。对于质量范围1000-6000m/z以正离子反射器模式获得全扫描质谱。每个质谱是750次平均激光发射的结果，激光强度设定为全激光强度的约65％，且检测器增益以8x 4GS/s(如BrukerFlex Control软件内选择)增强。使用flex分析软件(Bruker Daltonics)分析所得质谱。将光谱校准为PepMix内标溶液。

N-末端蛋白质测序。通过在

494HT蛋白质序列系统(AppliedBiosystems)上进行15个循环的埃德曼降解来分析纯化的(级分33-34，图25A)的N-末端氨基酸序列。在SEQ ID NO：55中提供N-末端序列。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，可在不脱离本发明的精神和范围的前提下作出各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种组合物，其包含一种或多种益生细菌菌株以及任选的益生元化合物、保护剂、湿润剂、润肤剂、研磨剂、盐和/或表面活性剂的稠化局部制剂；

其中所述一种或多种益生细菌菌株包括葡萄球菌(Staphylococcus)属的一种或多种细菌菌株；并且

其中所述组合物被配制用于局部治疗皮肤、头皮或粘膜的生态失调的病症。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种益生细菌菌株包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)或表皮葡萄球菌和人葡萄球菌的组合。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述一种或多种益生细菌菌株包括表皮葡萄球菌菌株MO34、MO38、A11、AMT1、AMT5-C5和/或AMT5-G6。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中一种或多种益生细菌菌株包括人葡萄球菌菌株A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-G1和/或AMT4-D12。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中每种益生细菌菌株均表现出与图11、12、13、14、15、16、17、18或19任一个中所示的那些中的一种对应的脂肪酸甲酯谱。

6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述一种或多种益生细菌菌株产生具有选自由SEQ ID NO：2、4、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和55以及其任一组合组成的组的序列的肽，并且其中所述肽任选地经翻译后修饰。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种益生细菌菌株以活的形式被提供。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种益生细菌菌株以冻干或冷冻干燥或喷雾干燥的形式被提供。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述益生细菌可被重构为活的形式。

10.一种通过向有需要的受试者的皮肤或粘膜施用有效量的根据权利要求1-9中任一项所述的组合物来治疗人或其他哺乳动物中的皮肤或粘膜感染、特应性皮炎、牛皮癣、乳腺炎、痤疮或与皮肤生态失调有关的其他病症的方法。

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