CZ201975A3 - Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace - Google Patents

Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace Download PDF

Info

Publication number
CZ201975A3
CZ201975A3 CZ2019-75A CZ201975A CZ201975A3 CZ 201975 A3 CZ201975 A3 CZ 201975A3 CZ 201975 A CZ201975 A CZ 201975A CZ 201975 A3 CZ201975 A3 CZ 201975A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
stage
skin
preparation
application
substances
Prior art date
Application number
CZ2019-75A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308231B6 (cs
Inventor
Karel Bezouška
Jan Engl
LubomĂ­r Janda
Adam Norek
Original Assignee
BiomCare s.r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BiomCare s.r.o. filed Critical BiomCare s.r.o.
Priority to CZ2019-75A priority Critical patent/CZ201975A3/cs
Priority to EP20152571.4A priority patent/EP3692980A1/en
Priority to US16/788,257 priority patent/US20200254030A1/en
Publication of CZ308231B6 publication Critical patent/CZ308231B6/cs
Publication of CZ201975A3 publication Critical patent/CZ201975A3/cs
Priority to US17/809,702 priority patent/US20230049239A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/30—Copper compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/315—Zinc compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/68—Protozoa, e.g. flagella, amoebas, sporozoans, plasmodium or toxoplasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/54—Mixtures of enzymes or proenzymes covered by more than a single one of groups A61K38/44 - A61K38/46 or A61K38/51 - A61K38/53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/12—Aerosols; Foams
    • A61K9/122—Foams; Dry foams
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek pro posílení přirozené biologické bariéry a obrany na kůži a sliznicích oslabené například v případě dysbiotických stavů, symptomů a onemocnění na kůži, jako jsou atopická dermatitida, akné, růžovka, lupenka a vitiligo, popřípadě oslabené v důsledku termického nebo mechanického poškození, jako je popálení, pořezání a zhmoždění, založený na sekvenčním použití učinných látek schopných (1) v prvém stupni rozrušit biofilmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačit viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů (2) ve druhém stupni uklidnit zánět způsobený rozbouřeným imunitním systémem a obnovit účinnou biologickou bariéru (3) ve třetím stupni dosáhnout obnovy normální fyziologické mikroflóry porušené dysbiosou a (4) ve čtvrtém stupni poskytnout látky podílející se na dlouhodobé nespecifické ochraně a přispívající ke správné konzistenci a výživě na kůži, vyznačující se tím, že účinné látky mohou být aplikovány na kůži a sliznice ve formě olejových emulzí, krémů, mastí, gelů i jiných kosmetických nebo lékařských kompozic s olejovou komponentou. Metoda aplikace kombinovaného několikastupňového mikrobiálního kosmetického přípravku založená na postupné aplikaci ve čtyřech obdobích tak, že každé z prvého, druhého a třetího období trvá jeden až dva týdny, a čtvrté období trvá jeden až šest týdnů, s tím, že aplikace je prováděna alespoň jednou denně, výhodně ráno a večer, pomocí rozstřiku nebo rozetřením příslušného stupně přípravku na postižená místa a případně i jejich okolí, nebo v případě výskytu velmi citlivých ložisek se aplikuje pouze do okolí těchto ložisek.

Description

Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace
Oblast techniky
Vynález se týká mikrobiálních bezbuněčných přípravků, které jsou účinné zejména pro posílení biologické komponenty kožní bariéry a udržení dobré kondice mikrobiálních komunit v kůži. Mohou být využity jako přípravky kosmetické i léčivé.
Dosavadní stav techniky
Koncepce rovnováhy mikrobiálních komunit v různých částech těla a blahodárného vlivu majoritních komensálních mikroorganismů na zdraví kůže a formování normální imunity v této části těla pochází již ze 60. a 70. let minulého století, kdy byly základy tohoto oboru položeny vědci bádajícími na pomezí mikrobiologie a imunologie. V tomto raném období byly objeveny základní principy mikrobiálních rovnováh, avšak jejich přesná povaha zůstala skryta vzhledem k metodickým omezením (detekce jednotlivých mikroorganismů pouze na základě kultivačních a biochemických metod). K dramatické změně této situace došlo během prvých dvou desetiletí nového milénia, kdy získal vědecký výzkum nové možnosti využívající kultivačně nezávislé analýzy jednotlivých přítomných mikroorganismů pomocí PCR amplifíkace identifikačních sekvencí (nejčastěji ITS sekvencí nacházejících se v genech pro ribosomální RNA) v kombinaci s významným urychlením DNA sekvence pomocí zařízení využívajícího principu DNA sekvenování nové generace (NGS, z angl. Next Generation Sequencing). Kromě metodického pokroku pak k vědeckému poznání a upřesnění mikrobiálních komunit v různých částech lidského těla přispěl mezinárodní projekt Human Microbiome Project garantující zejména nasazení dostatečné vědecké a finanční kapacity pro řešení jednotlivých úkolů. Počátkem současné dekády tak mohly být publikovány prvé výsledky popisující lidský mikrobiom u normálních jedinců a u jedinců trpících různými onemocněními souvisejícími s mikrobiální nerovnováhou (dysbiosou) (Grice a Segre 2011, Human Microbiome Project Consortium 2012, Sanford a Gallo 2013). Pokud jde o onemocnění na kůži a sliznicích, bylo ukázáno, že oslabení dominantního komensálního mikroorganismu kůže, bakterie Staphylococcus, epidermidis (dále .S'. epidermidis), může vést k oslabení biologické komponenty kožní bariéry a kůže se pak stává náchylnou k infekcím obávaným patogenem kůže, bakterií Staphylococcus aureus (dále .S'. aureus).
Vzhledem k nákladům a úsilí vloženým do projektu Human Microbiome Project očekávala veřejnost řadu praktických výstupů, zejména však uvedení na trh mnoha různých prostředků na řešení dysbiotických stavů a chorob s těmito stavy spojených. Doposud se však praktických řešení spojených s uplatněním nových poznatků objevilo velmi málo. Smoragiewicz a spol. (US2011/195057) popisují inhibiční vliv vybraných kmenů laktobacilů na methicillin-rezistentní .S', aureus. Gallo a Nakatsuji (US2015/290209) popisují nové antimikrobiální činidlo pocházející z mikroorganismu .S', epidermidis označené jako firmocidin. Kleinberg aZhang (US2016/263154) vyvinuli jednoduchou chemickou kompozici působící jako prebiotikum modifikující lidský kožní mikrobiom mechanismem snížení proliferace dominantního patogena kůže bakterie .S', aureus na úkor kožní komensální bakterie .S', epidermidis. Park a spol. (KR2017/3478) popisují vynález založený na kmenech .S', epidermidis rozrušujících biofilmy tvořené na kůži patogenními mikroorganismy. Takayama a Yuko (CN2018/107922956) popisují modifikovaný kmen .S'. epidermidis produkující zvýšená množství antimikrobiálních peptidů a jeho použití pro ochranu kůže. Podobný je i vynález Nakatsuji a Galo (US2018/289751) navrhující antimikrobiální terapii založenou na kmenech bakterie .S', epidermidis produkujících hogicidinové peptidy nazývané SHlantibiotika a též patent Kazue a spol. (CN2018/107922956).
Využití nových poznatků o mikrobiotách lidské kůže je dále předmětem několika publikací uveřejněných během posledních let. Naik a spol. (2012) ukázali, že kožní mikrobiota mají
- 1 CZ 2019 - 75 A3 autonomní úlohu při tvorbě lokálního imunitního systému a obranu proti mikrobiálním patogenům. Skutečnost, že dysbiosa je společně s infekcí patogenní bakterií .S', aureus hlavním hnacím motorem zánětu u atopické dermatitidy byla prokázána Kobayashim a spol (2015) na modelu ADAM17-deficientních myší. Vztah dysbiosy a různých problémů citlivé kůže je ve studiích opakovaně prokazován - například Kong a spol. (2012) a Ganju a spol. (2016).
Různé publikované studie konečně předkládají velké množství důkazů z hlediska identifikace konkrétních skupin a typů látek, jejichž nepřítomnost se může podílet na vzniku problematické pokožky. Většinou se jedná o látky produkované dominantním kožním komensálním mikroorganismem .S', epidermidis chybějící v případě deficience tohoto mikroorganismu na kožních lezích postižených dysbiosami. Specifická proteináza tohoto mikroorganismu štěpící cílové proteiny za zbytkem kyseliny glutamové podobná V8 proteináze je označena Esp a byla prokázána její úloha při eliminaci (inhibici) patogenních biofílmů na kůži a též při degradaci specifických povrchových proteinů patogena .S', aureus (Iwase a spol. 2010, Sugimoto a spol. 2013). Jako typický protizánětlivý faktor se ukázala být kyselina lipoteichoová sekretovaná bakterií .S', epidermidis (Lai a spol. 2009). Novější studie ovšem prokázaly, že řada přirozených komensálních kmenů tohoto mikroorganismu isolovaných z kožních stěrů není dobrým producentem této látky, na rozdíl od netoxického a biofilmy netvořícího sbírkového kmene .S'. epidermidis ATCC_12228 (Garcia-Gomez a spol. 2017). V posledku byla identifikována kritická úloha antimikrobiálních peptidů produkovaných některými kmeny .S', epidermidis, z nich potom zejména y-modulinu a peptidů náležících do SH-lantibiotik (Cohen a spol. 2010a, Cohen a spol. 2010b, Nakatsuji a spol, 2017).
Všechna výše navržená řešení mají řadu významných omezení. Mnohá z těchto řešení byla odzkoušena pouze na laboratorní úrovni a jejich spolehlivé fungování tedy není opřeno o náležité praktické testy. Mnohé přípravky obsahují živé mikrobiální kmeny, což umožňuje jejich zařazení pouze mezi léčiva. Vzhledem ke složitému registračnímu procesu ovšem není doposud na trhu jediný přípravek tohoto druhu, tyto přípravky jsou pouze ve stádiu klinických zkoušek (a tedy nedostupné pro většinu postižené populace). Použití autologních kmenů přenesených na postižená místa autologní transplantací může být též problematické, protože kmeny v přirozených izolátech nemusí mít očekávané látky a účinky (Garcia-Gomez a spol. 2017).
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky částečně nebo úplně odstraňuje přípravek podle předloženého vynálezu, kdy jsou oproti předcházejícím řešením zejména nově uplatněny poznatky a principy získané přihlašovateli během výzkumu a praktického ověřování vynálezu.
Jako nej důležitější nový princip vystupuje v předkládaném vynálezu několikastupňový návrh řešení problémů vyskytujících se na kůži náchylných jedinců, kdy je potřeba nejdříve kůži důkladně očistit a zbavit ji patogenů ukrytých v obtížně dostupných biofilmech před tím, než je provedena modulace zánětu způsobeného rozbouřeným imunitním systémem a jeho postupné uklidnění spojené s účinnou eliminací patogenů uvolněných z biofilmových deposit. Teprve po vyčištění kůže, eliminaci patogenů, zklidnění imunitního systému a zejména též normalizaci mikrobiální nerovnováhy a nastolení normálního složení kožní mikroflóry jsou aplikovány látky způsobující dlouhodobé posílení biologické komponenty kožní bariéry. Látky ve formě mikrobiálních extraktů, lyzátů nebo částečně purifikovaných směsí jsou získány zejména z komensálních kožních a z půdních mikroorganismů, včetně takových vyskytujících se na kůži moderního člověka pouze sporadicky. Toto mnohastupňové řešení je možno si představit jako sérii po sobě následujících vln, kdy následná aplikace plynule navazuje na předcházející aplikaci a tímto způsobem umožňuje potřebné snížení koncentrace jedné vlny účinných látek a postupné zvýšení koncentrace jiných látek vlny následující. Počet a časování jednotlivých vln byl přihlašovatelem neustále zdokonalován až do podoby systému čtyř vln s následnou aplikací dalších prostředků dlouhodobé stabilizace mikrobiomu kůže s použitím vhodných výživných a
-2CZ 2019 - 75 A3 podpůrných látek a prebiotik.
Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle předloženého vynálezu tedy obsahuje čtyři stupně přípravku, které se užijí postupně, přičemž první stupeň přípravku obsahuje účinné látky schopné rozrušit biofilmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačit viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů, druhý stupeň přípravku obsahuje účinné látky schopné uklidnit zánět způsobený rozbouřeným imunitním systémem a obnovit účinnou biologickou bariéru, třetí stupeň přípravku obsahuje účinné látky schopné dosáhnout obnovy normální fýziologické mikroflóry porušené dysbiosou, a čtvrtý stupeň přípravku obsahuje alespoň jednu účinnou látku podílející se na dlouhodobé nespecifické ochraně a přispívající k posílení náležité fýzikálně-chemické bariéry kůže a její výživě.
Řešení uváděná ve stavu techniky jsou založená převážně na aplikaci živých (viabilních) mikroorganismů včetně jejich kolonizace a následného sledování na jednotlivých místech aplikace. Takový postup je ovšem náročný zejména z pohledu registračních a regulačních řízení: živé mikroorganismy samozřejmě ovlivňují fýziologické a imunologické procesy na kůži a regulačně se tedy jedná o léčivé přípravky s živými mikroorganismy. Regulačně je tato kategorie jedna z nej náročnějších a ke dni podání přihlášky tohoto vynálezu neexistuje na trhu jediný přípravek tohoto druhu. Do pozdních fází klinických zkoušek se zatím dostalo jen několik takových přípravků. Z praktického pohledu znamená tento problém významné zpoždění na cestě k jednotlivým uživatelům. Naopak řešení navrhované v předkládaném vynálezu je založené na použití mikrobiálních extraktů bez obsahu živých mikroorganismů, které je možno použít jako komponenty kosmetických přípravků pro posílení kožní bariéry bez významných regulačních omezení (příslušné extrakty jsou v kosmetické regulativě označené názvem příslušného původového mikroorganismu a přídavkem “ferment”).
Účinné látky pro první stupeň několikastupňového přípravku obsahují jako aktivní komponenty zejména směsi hydrolytických enzymů s proteolytickými a glykohydrolytickými aktivitami, kdy toto složení je dáno známým složením patogenních biofilmů skládajících se ze směsi mikroorganismů spojených vzájemně adhezivními proteiny a kryjící se polysacharidovým filmem podobným svoji strukturou celofánu (tento film je tvořen zejména B-l,3-glukanem odpovídajícím svoji strukturou póly sacharidu laminarinu, dale celulózou a chitinem). Kožní komensální mikroorganismy jsou podle publikovaných literárních dat schopné do určité míry rozrušit patogenní biofilmy tvořené kožními patogeny, přičemž tuto schopnost mají zejména proteinázy a v menší míře laminarinázy sekretované těmito mikroorganismy. Aktivní látky pro první stupeň přípravku lze získat z kožních komensálních mikroorganismů, konkrétně z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynehacterium, Propionihacterium a Proteohacterium. Pro předkládaný vynález byly cílové enzymové aktivity získány zejména z mikroorganismu .S'. epidermidis.
Pro zvýšení účinnosti bylo spektrum potřebných enzymových aktivit doplněno o hydrolázy nedostatečně zastoupené u komensálních mikroorganismů (celulázy, chitinázy). Vhodným zdrojem potřebných enzymů mohou být půdní bakterie rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium, jejichž extrakty jsou komerčně dostupné. Pro předkládaný vynález byly cílové enzymové aktivity získány zejména z mikroorganismu Pythium num (dále P. nunn), který je v literatuře popsaný společně s Trichodermou jako hojný zdroj těchto enzymů (3). Pro praktickou aplikaci v kosmetických přípravcích se jako kritické jevilo získání homogenních šarží enzymových preparátů a tento úkol byl přihlašovateli úspěšně vyřešen, jak je detailně uvedeno v příkladu 1. Dávkování enzymových aktivit ve finálním přípravku pro první stupeň vycházelo jednak z publikovaných poznatků v enzymových terapiích, jednak z našich vlastních laboratorních dat rozrušení biofilmů uvedených v příkladu 4. Účinné látky pro první stupeň přípravku tedy jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynehacterium, Propionihacterium a Proteohacterium a půdních mikroorganismů vybraných z mikroorganismů rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium, výhodně z rodu Staphylococcus a
-3 CZ 2019 - 75 A3
Pythium, nejvýhodněji z mikroorganismů Staphylococcus epidermidis a Pythium nunn. Účinné látky pro první stupeň zahrnují proteinázy, laminarinázy, celulázy a chitinázy.
Pokud jde o účinné látky pro druhý stupeň až čtvrtý stupeň, tyto látky byly v posledních letech identifikovány buď naším empirickým zkoušením, nebo jsou publikovány ve vědeckých studiích uvedených ve stavu techniky. Dobrá antimikrobiální aktivita a schopnost rozrušovat biofilmy byla prokázána laboratorními testy popsanými v příkladu 4. Testy byly důležité pro určení ředicích poměrů účinných látek pro jejich přidání do finálních přípravků a přinesly též některé překvapivé poznatky, zejména z hlediska schopnosti snižovat viabilitu mikroorganismů uvolněných z biofilmů (kombinovaný efekt rozrušení biofilmů a zabití patogenů). Účinné látky pro druhý stupeň přípravku jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionihacterium a Proteohacterium, výhodně rodu Staphylococcus, nejvýhodněji Staphylococcus epidermidis. Účinné látky pro druhý stupeň zahrnují kyselinu lipoteichoovou, antimikrobiální peptidy SH-lantibiotikového typu, antimikrobiální peptid γmodulin a Esp proteinázu.
Účinné látky pro třetí stupeň přípravku jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z půdních bakterií vybraných z mikroorganismů rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium, výhodně rodu Nitrosomonas a nejvýhodněji Nitrosomonas europea. Účinné látky pro třetí stupeň zahrnují jak nízkomolekulámí látky, tak i proteiny, zejména proteiny obsahující membránový komplex oxidující močovinu a produkující oxid dusnatý.
Účinné látky pro čtvrtý stupeň jsou látky, které přispívají k hydrataci a regeneraci kůže a stabilizaci kožní mikroflóry a mohou být vybrány z následujících látek: xylitol, famesol, Larginin, světlicový olej, pupalkový olej, konopný olej, řepkový olej, olej z pšeničných klíčků, laktát, glycin, fruktosa, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý. Alespoň jedna z těchto látek může být také přítomna ve formulacích pro kterýkoliv z prvního až třetího stupně vícestupňového přípravku.
Výše uvedené účinné látky je možné formulovat do přípravků, výhodně ve formě pleťového mléka, krému, gelu nebo pěny, a v případě léčivých přípravků ve formě kožní emulze, krému, kožní pěny nebo gelu. Výhodné formy jsou pleťové mléko a kožní emulze, které mohou být případně i ve formě spreje.
Výsledný přípravek, resp. každý stupeň vícestupňového přípravku, obsahuje účinné množství příslušných výše uvedených účinných látek. Účinné množství odborník stanoví na základě testů popsaných v předkládané přihlášce nebo testů, které jsou odborníkům všeobecně známé. Výhodná účinná množství jsou uvedena v příkladech provedení vynálezu.
Za standardní aplikační dávku kožní emulze nebo pleťového mléka lze považovat dávku o objemu 1 až 5 ml, výhodně 3 ml. Aplikační dávka může být výhodně definována dávkovači pumpičkou, která může být součástí obchodního balení.
Obchodní balení vícestupňového přípravku může obsahovat pro každý stupeň samostatné balení o objemu např. 30 ml, 75 ml, 150 ml, 300 ml, 400 ml nebo 500 ml. Maloobjemová balení (30 ml, 75 ml, 150 ml) mohou být výhodně ve formě tuby, velkoobjemová (300 až 500 ml) ve formě lahvičky s dávkovači pumpičkou. Jiným výhodným balením je rozprašovač (sprej).
Uvedení připravených účinných látek do prostředí přípravku (kosmetického a/nebo léčivého) ve formě olejové emulze (kožní emulze, pleťového mléka) se ukázalo jako poměrně obtížné. Poměrně dlouhý proces zkoušení vedl nakonec k získání směsí s dostatečnou kompatibilitou a dlouhodobou stabilitou vhodné pro kosmetické aplikace. Finální optimalizovaná kompozice obsahovala vodu jako solvent, triethylamonium acetát jako pufrující komponentu poskytující optimální pH kůže kolem 4,7 až 4,8, glyceryl stearát jako emulgátor a polyakrylát crosspolymer 6
-4CZ 2019 - 75 A3 a xanthanovou gumu jako regulátory viskozity. Stanovená stabilita této kompozice v přítomnosti aktivních komponent činila více než 12 měsíců, z čehož byla odvozena i stabilita příslušného kosmetického přípravku. Během uvádění účinných látek do prostředí kosmetického přípravku byla překvapivým způsobem zjištěna významná stabilizace použitých enzymových aktivit v prostředí olejové emulze, kdy byly jak hodnoty změřených enzymových aktivit, tak i dlouhodobé stability až dvojnásobné.
V počátečních experimentech praktického testování byla ověřena účinnost formulovaných kosmetických přípravků na cílových skupinách uživatelů. Vzhledem k tomu, že se jednalo o kompozice plánované pro uvedení na trh zejména jako kosmetické přípravky, nebylo úplné odstranění zdravotního problému požadováno (a také k němu vždy nedošlo). Nicméně, ve všech aplikacích byly přípravky hodnoceny uživateli pozitivně i oproti mnoha alternativním přípravkům na trhu, kdy bylo oceňováno zejména úplné nebo částečné zlepšení vizuálního vzhledu poškozené kůže, zklidnění situace na místech aplikace z hlediska svědění a jiných nežádoucích jevů a pozitivní účinek vůči některým skupinám mikroorganismů (stafýlokoky, plísně). Zcela originálním poznatkem potom je použití u popálenin a mechanických zranění kůže, kde se může uplatňovat jak efekt čištění, tak i stimulace růstu při obnově nové kůže.
Přípravek podle předloženého vynálezu obsahující čtyři stupně se výhodně aplikuje tak, že jednotlivé stupně se aplikují postupně ve čtyřech obdobích, přičemž v prvním období se aplikuje první stupeň přípravku, ve druhém období se aplikuje druhý stupeň přípravku, ve třetím období se aplikuje třetí stupeň přípravku a ve čtvrtém období se aplikuje čtvrtý stupeň přípravku, přičemž každé z prvního, druhého a třetího období trvá jeden až dva týdny a čtvrté období trvá jeden až šest týdnů. Přitom aplikace je prováděna alespoň jednou denně, výhodně ráno a večer, pomocí rozstřiku nebo rozetřením příslušného stupně přípravku na postižená místa a případně i jejich okolí, nebo v případě výskytu velmi citlivých ložisek se aplikuje pouze do okolí těchto ložisek.
Objasnění výkresů
Vynález je dále podrobně popsán na příkladných provedeních a blíže osvětlen na připojených schématických výkresech:
Obr. 1 Způsob přípravy a reprodukovatelnost přípravy účinných látek pro fázi čištění a disrupce (první stupeň), přičemž podrobněji ukazuje obr. 1A analýzu jednotlivých šarží proteinů sekretovaných bakterií .S', epidermidis kmene ATCC_12228 po jejich koncentraci a převedení do konzervačního pufiru pro uvedení do kosmetického přípravku, kdy ve drahách 1 a 10 jsou umístěny molekulové standardy a ve drahách 2 až 9 potom osm jednotlivých popisovaných šarží, obr. 1B analýzu jednotlivých šarží proteinů sekretovaných půdním mikroorganismem P. nunn kmene CBS_808.96 po jejich koncentraci a převedení do konzervačního pufiru pro uvedení do kosmetického přípravku, kdy ve drahách 1 a 10 jsou umístěny molekulové standardy a ve drahách 2 až 9 potom osm jednotlivých šarží.
Obr. 2 Způsob přípravy a průkaz přítomnosti a koncentrace jednotlivých účinných látek pro fázi zklidnění imunitního systému (druhý stupeň), přičemž podrobněji ukazuje obr. 2A celkové schéma frakcionace lyzátů bakterií .S', epidermidis kmene ATCC_12228 založené na vysolování síranem amonným, přičemž jsou poté rozpustné látky v supematantu po centrifůgaci (“sup.”) dále děleny chromatografri na sloupci fenyl-Sepharosy HR, zatímco látky nacházející se v sediment po centrifůgaci (“sed.”) jsou dále děleny chromatografri na sloupci octadecylsilikagelu. Jednotlivé frakce získané po těchto chromatografňch jsou
-5 CZ 2019 - 75 A3 uvedeny zkratkou “F”, obr. 2B až 2E elektroforetickou a imunochemickou analýzu separovaných látek metodou elektroforesy ve 20% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), přičemž na obr. 2B a obr. 2C jsou analyzovány látky v supematantu a na obr. 2C potom specificky kyselina lipoteichoová (LTA, lipoteichoic acid) a na obr. 2D a 2E látky v sedimentu, specificky potom na obr. 2E peptidy typu lantibiotik. Přibližná molekulární velikost látek separovaných na gelu je indikována pomocí molekulového markéru ukázaného vždy v pravé části obrázku. Prošlé frakce Fl a F2 z RPLC18 chromatografie bylo třeba též analyzovat na 12% gelu a zóna odpovídající Esp proteináze je vyznačena.
Obr. 3 Laboratorní testy antimikrobiální účinnosti připravených aktivních látek vůči kritickým patogenům na kůži a sliznicích s tím, že podrobněji ukazuje obr. 3A diskový test účinnosti připravených antimikrobiálních látek vůči patogenní bakterii .S'. aureus kmene ATCC_6538, s tím, že na disky byly postupně aplikovány následující látky: v prvé, horní řadě SEF2K1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x, ve druhé řadě SELY ředěný 102x, 103x, 104x a 105x, ve třetí řadě NIE1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x a v poslední řadě tetracyklin o koncentraci 0,5 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml a 4 pg/ml, obr. 3B kvantitativní MIC (minimum inhibitory concentration) test prováděný pro čtyři různé šarže SEF2 (vzorky 1 až 4), čtyři různé šarže SELY (vzorky 2 až 5) a čtyři různé šarže směsi rozpustných proteinů směsi průmyslových bakterií s obsahem bakterie rodu Nitrosomonas označené NIE1, NIE2, NIE3 a NIE4, obr. 3C a 3D diskový test účinnosti připravených látek vůči patogenní kvasince Candida albicans kmene ATCC_10231, přičemž Petriho miska na obr. 3C byla inkubována 24 h při 30 °C a Petriho miska na obr. 3D byla inkubována při této teplotě 48 h. Na disky byly postupně aplikovány následující látky: v prvé, horní řadě SEF2K1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x, ve druhé řadě SELY ředěný 102x, 103x, 104x a 105x,ve třetí řadě NIE1 ředěný lOx, 10 x, lOxalOxav poslední řadě enilkonazol (chemická látka potlačující plísně a kvasinky) v koncentraci 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml a 8 mg/ml.
Obr. 4 Laboratorní test rozrušení biofilmu tvořeného patogenní bakterií .S', aureus kmene ATCC_6538 s tím, že podrobněji ukazuje obr. 4A příklad mikrotitrační destičky po inkubaci s látkami po dobu 24 hodin, promytí a detekci nerozrušeného biofilmu krystalovou violetí s tím, že jednotlivé experimenty byly prováděny v kvadruplikátu ve čtvercovém uspořádání vždy na čtyřech sousedních jamkách, obr. 4B ukazuje průměrné hodnoty kvadruplikátních vyšetření, kdy byla tvorba biofilmů měřena pouze v konzervačním pufiru (K) nebo v konzervačním pufru obsahujícím PNF1K1 (PN) nebo v konzervačním pufru obsahujícím SEF2K1 (SE) nebo v konzervačním pufru obsahujícím SELY (LY), nebo v konzervačním pufru obsahujícím různé indikované kombinace výše uvedených látek (experiment PNSELY a PNSE), přičemž výše uvedené látky byly testovány jednak v neředěné podobě (Ix), jednak v podobě roztoků sériově ředěných médiem pro tvorbu biofilmů (10x, lOOx, lOOOx), obr. 4C s identickými daty jako na obr. 4B, pouze vyjádřené jako % inhibice tvorby biofilmu vypočtené podle vzorce: % inhibice = (A595 pro neznámý vzorek - A595 pozadí) / (A595 pro kontrolu - A595 pro pozadí) x 100, obr. 4D ukazuje viabilitu ve vzorcích bakterie .S', aureus kmene ATCC_6538 stanovenou kultivačně (CFU, kolonie tvořící jednotky) ve vzorcích supematantu po inkubaci s jednotlivými látkami odebraného před promývacím krokem.
-6CZ 2019 - 75 A3
Obr. 5 Průběh aplikace u pacienta (muž, 29 let) s celoživotním atopickým ekzémem v posledních letech lokalizovaným do oblasti kotníku. Na fotografiích je znázorněn stav před aplikací přípravku (panely A a B) a po skončení 4 týdnů aplikace se čtyřstupňovým přípravkem (panely C a D). Stav po aplikaci byl charakterizován jako významné zklidnění.
Obr. 6 Průběh aplikace u 22 let staré ženy s atopickým ekzémem na ruce a předloktí. Na fotografiích je znázorněn stav před aplikací přípravku (panely A a B) a po skončení 4 týdnů aplikace se čtyřstupňovým přípravkem (panely C a D). Stav po aplikaci byl charakterizován jako mírné zlepšení s významným zklidněním, přičemž ustalo pálení a svědění.
Obr. 7 Průběh aplikace u 74 let staré ženy s dlouhodobými problémy s plísňovými a kvasinkovými infekcemi na chodidlech a nártu. Na fotografiích je znázorněn stav před aplikací přípravku (panely A a B) a po skončení dvou týdnů aplikace zahrnujících první a druhý stupeň (panely C a D). Stav po aplikaci byl charakterizován jako významné zlepšení v situaci, kdy se dlouhodobě nedařilo situaci zlepšit pomocí standardní léčby.
Obr. 8 Průběh aplikace samotného přípravku pro první stupeň na popáleninu ruky u 5 8-Jetého muže. Přípravek ve formě pleťového mléka byl aplikován dvakrát denně ráno a večer na prsteník obsahující rozsáhlejší a hlubší popáleninu, zatímco sousední prostředník s významně mírnějším popálením byl použit jako kontrolní plocha znázorňující postup hojení bez jakéhokoliv ošetření. Fotografie ukazují stav před aplikací (obr. 8A) a poté 3 dni, 7 dní a 12 dní po zahájení aplikací (obr. 8B, 8C a 8D) s použitím jen přípravku pro první stupeň. Stav po aplikaci uváděn jako dokonalé vyhojení kůže bez jizev nebo změny pigmentace.
Příklady uskutečnění vynálezu
Podstata vynálezu je dále demonstrována pomocí příkladných řešení popisujících a ukazujících způsob biotechnologické výroby potřebných účinných látek, laboratorní testování jejich antimikrobiálních účinků na kritické patogeny na kůži a sliznicích a konečně příklady praktických aplikací pro řešení některých vybraných problémů poškozené kůže. Pomocí příkladných provedení je demonstrována povaha, podstata a praktické ověření vynálezu, který však není těmito příkladnými provedeními omezován. Tato příkladná provedení jsou uvedena, aby popis byl důkladný a úplný a plně zprostředkoval podstatu vynálezu v rozsahu patentových nároků.
Provedení příkladných řešení je založeno na metodách běžných v oboru řešení. Pro kultivaci použitých mikroorganismů byla použita jednak běžná média doporučená poskytovatelem jednotlivých mikroorganismů, byla však též odzkoušena nová originální média vyhovující specifickým požadavkům některých kultivací. Kultivace mikroorganismů sloužících jako zdroj účinných látek byla prováděna jak v laboratorních třepačkách, tak i za vysoce kontrolovaných podmínek s využitím 2 paralelních laboratorních fermentorů o objemu 5 1. Mikroorganismy byly separovány od fermentačního média v průtokové centrifuze a biomasa byla použita jako zdroj látek bakteriálního lyzátu. Médium bylo koncentrováno diafiltrací na polyestersulfonátových koncentračních membránách s molekulárním vylučovacím limitem 10 kDa. Po zakoncentrování byly rozpustné látky sekreto váné do média stejným způsobem převedeny do konzervačního pufiru o pH 4,7, který obsahoval zejména stabilizátory a konzervanty. Ve směsi proteinů sekretovaných do média byl stanoven protein metodou podle Bradforda, aktivita proteináz azokaseinovou metodou a aktivita glykohydroláz stanovením množství redukujících sacharidů po inkubaci s příslušným polysacharidovým substrátem. Jedna enzymová jednotka byla definována jako množství enzymu schopné rozštěpit 1 nmol substrátu za minutu za daných experimentálních podmínek. Tato enzymová jednotka odpovídá jedné tisícině mezinárodní enzymové jednotky (U). Bakteriální biomasa po kultivaci .S', epidermidis byla lyžována opakovanou sonikací do konzervačního média obsahujícího detergenty se sacharidovou hydrofilní komponentou a
-7CZ 2019 - 75 A3 vysokou hodnotou kritické micelámí koncentrace: methyl-6-O-(N-heptylkarbamoyl)-a-Dglukosid, N-oktanoyl-N-methylglukamin a 2-cyklohexylethyl-P-D-maltosid. Extrahované komponenty byly dále frakcionovány vysolováním síranem amonným do 75% koncentrace a následnou separací pomocí hydrofobní chromatografie na fenyl-Sepharose a oktadecylsilikagelu. Pro stanovení antimikrobiální účinnosti vůči klíčovým patogenům na kůži a sliznicích byly použity laboratorní testy jako je diskový test, test minimální inhibiční koncentrace (MIC, cit. 8) a test tvorby biofílmu na mikrotitračních destičkách (cit. 16).
Praktické testování přípravků bylo provedeno u jedinců se symptomy a problémy souvisejícími s porušením kožní bariéry a mikrobiální nerovnováhou. Jednalo se zejména o atopickou dermatitidu (atopický ekzém), kožní infekce způsobené bakterií .S', aureus, kožní infekce způsobované plísněmi a kvasinkami a též jiná poškození kůže bez přímého napojení na mikrobiální rovnováhy, například popáleniny. Veškeré testy proběhly na základě podepsaného informovaného souhlasu s tím, že účastníkům testu byl k dispozici kromě testovacího přípravku též návod k použití tohoto přípravku a dále aplikační protokol sloužící pro vedení pacienta během studie a zapisování získaných výsledků. Veškeré údaje získané během studie jsou anonymní, identita testujících osob nebyla přihlašovateli vyjevena. Výsledky studie ve formě dotazníků vyplněných uživateli a poskytnuté fotodokumentace jsou uchována v bezpečném úložišti na pracovišti přihlašovatele a budou použita výlučně pro potřeby přihlašovatele.
Příklad 1
Příprava účinných látek potřebných pro první stupeň přípravku rozrušujících biofilmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačujícími viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů
V případě mikroorganismu .S', epidermidis nebylo bohaté médium tryptone soya broth optimální zejména z pohledu nedefinovaného složení a přítomnosti nežádoucích nespecifických enzymových aktivit. Z tohoto důvodu bylo odzkoušeno dosti komplexní plně syntetické medium obsahující běžné živiny společně s koktejlem minerálů a vitamínů doporučovaným pro tuto bakterii. V případě mikroorganismu P. nunn byla potom modifikace vynucena zejména zařazením požadovaných induktorů cílových enzymových aktivit, tj. peptidů a oligosacharidových fragmentů polysacharidů mikrobiálních buněčných stěn. Zatímco laminarin (induktor laminarinázy, endo-B-l,3-glukosidázy) a methylcelulóz (induktor celulázy, endo-B-1,4glukosidáz jsou v literatuře pro tyto účely běžně zmiňované a používané, v případě induktoru chitinázy nebylo možné použít běžný polysacharid chitin nerozpustný ve vodě, ale bylo třeba provést jeho kyselou hydrolýzu na oligomery N-acetyl-D-glukosaminu. Tento postup pro účely fermentace vyhovoval, neboť materiál sloužící jako zdroj chitinu ve formě hrubě rozemletých skořápek krevet obsahoval též poměrně vysoká množství proteinů téhož původu. Směs peptidů a chitinových oligomerů po kyselé hydrolýze tohoto materiálu proto dobře posloužila jak pro indukci chitináz a proteináz, tak jako zdroj dusíkatých živin. Po skončení fermentace bylo vyčeřené medium získáno průtokem fermentační směsi průtokovou centrifugou, zatímco sedimentované mikroorganismy byly získány na fólii vložené do válce průtokové centrifugy. Celkem byly pro komensální kožní bakterii provedeny čtyři fermentace v 5 1 fermentoru, a následně bylo zpracováno 20 1 fermentační směsi ve formě osmi šarží. Čiré medium po centrifůgaci v průtokové centrifůze bylo okysleno na pH 4,7 kyselinou octovou, byly do něj přidány konzervanty a po sterilní filtraci bylo medium zamraženo. Vždy 2,5 1 tohoto materiálu bylo po rozmražení koncentrováno metodou filtrace v tangenciálním toku s použitím zařízení Minimate TFF a kazety s polyestersulfonátovou membránou s vylučovacím limitem 10 kDa (obojí od firmy PALL lne.) na celkový objem cca 100 ml, tj. asi 25x. Téže metody bylo také použito k převedení do konzervačního pufiru pomocí opakovaných cyklů naředění a zpětného koncentrování. Finální směs proteinů o koncentraci cca 1 mg/ml byla sterilně filtrována (filtry Coming s membránou 0,22 mm) a uložena při -20 °C v mrazáku až do dalšího použití. Reprodukovatelnost složení jednotlivých šarží sekretovaných proteinů komensální bakterie .8' epidermidis byla potvrzena metodou SDS elektroforesy s detekcí stříbrným komplexem. Byl
- 8 CZ 2019 - 75 A3 potvrzen identický proteinový profil s výjimkou šarže č. 4 (SEF2K4) (Obr. 1A), která byla z dalšího postupu vyřazena. Sekretované proteiny půdního mikroorganismu P. num ve formě 8 šarží (Obr. 1B) byly získány identickým postupem. V získaných proteinových extraktech byla změřena koncentrace proteinu, a dále byly změřeny enzymové aktivity hydrolytických enzymů proteináz, laminarináz, celuláz a chitináz. Souhrnné výsledky ukázaly v těchto sledovaných parametrech dobrou reprodukovatelnost s relativní odchylkou v intervalu 10 až 20 % pro hodnoty specifických enzymových aktivit a výtěžků až 30 % pro hodnoty stanovení proteinu. Pro první stupeň několikastupňového přípravku se sledují hodnoty proteinu a enzymových aktivit ve finálním aplikačním přípravku, které dosahují hodnot: 15 pg/ml proteinu, 0,23 mU/ml proteináz, 0,56 mU/ml laminarináz, 0,27 mU/ml celuláz a 0,47 mU/ml chitináz.
Příklad 2
Příprava účinných látek potřebných pro druhý stupeň přípravku uklidňujících zánět a obnovujících účinnou biologickou bariéru kůže
V počátečních zkouškách byl do olejové emulze pro druhý stupeň zahrnut hrubý detergentový extrakt bakteriálních buněk .S', epidermidis kmene ATCC_12228 a hrubý γ-modulin (modifikovaný N-terminální formylací) z peptidové syntézy. Nicméně tato prvá kompozice způsobovala nežádoucí reakce na jemné kůži jedinců s atopickým ekzémem a bylo žádoucí ji dále upravit. Purifikace jednotlivých komponent byla provedena podle schématu na Obr. 2A zahrnujícího srážení detergentového extraktu síranem amonným do koncentrace 3 mol/1 (75% nasycení) a následné zpracování nevysráženého podílu i sraženiny separátním postupem zahrnujícím kolonovou chromatografii na vhodných nosičích s obrácenou fází: fenyl-Sepharosou a oktadecylsilikagelem. Nesražený podíl byl filtrován a přímo v 3 mol/1 síranu amonném nanesen na kolonu fenyl-Sepharosy (1,6 x 11 cm, 22 ml) ekvilibrovanou ve 3 mol/1 síranu amonném v prostředí 0,05 mol/1 sodno acetátového pufiru pH 4,7. Po aplikaci vzorku byla kolona tímto pufrem promyta a následovala eluce samotným acetátovým pufrem. Na konci chromatografie byla kolona promyta 80% ethanolem v acetátovém pufiru. Sraženina ze síranového srážení byla rozpuštěna v acetátovém pufiru a nastavena na koncentraci síranu amonného 1 mol/1 a po centrifůgaci a filtraci byla takto upravená sraženina nanesena na kolonu oktadecylsilikagelu (velikost částic 60 až 130 pm, modifikace oktadecylem v rozsahu 20 až 22 % hmota., 1,6 x 13 cm, 26 ml) ekvilibrovanou v identickém prostředí. Po promytí byla kolona v jednom kroku převedena do výše uvedeného acetátového pufiru a poté následovala gradientová eluce ethanolem v rozsahu 0 až 95 % objemu v tomto pufiru. Byly odebírány 10 ml frakce a byla provedena analýza na obsah účinných komponent elektroforézou v prostředí 20% polyakrylamidového gelu s obsahem dodecylsulfátu sodného. Gely byly zpracovány duplicitně s tím, že na jednom gelu byla provedena detekce látek barvením stříbrným komplexem, zatímco látky z druhého gelu byly elektropřenosem převedeny na PVDF membránu (0,2 pm), která byla po blokování odtučněným mlékem inkubována se specifickými protilátkami proti detekovaným komponentám značenými biotinem a imunologická reaktivita byla detekována pomocí streptavidin-peroxidasového komplexu a 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazonu s 4-chloro-l-naphthol za tvorby hnědočerveného nerozpustného komplexu (Obr. 2B až 2E). Pro detekci Esp proteinázy byl též použit 12% polyakrylamidový gel z důvodu velikosti této komponenty. Odhad koncentrace jednotlivých aktivních látek byl proveden oproti standardu zpracovanému za identických podmínek, γ-modulin ve formě hrubého produktu peptidové syntézy s obsahem cílového peptidu cca 75 % byl přečištěn od meziproduktů syntézy a činidel chromatografii na fenyl-Sepharose podle publikované metodiky (16) a jeho koncentrace byla stanovena spektrofotometricky s použitím teoreticky předpovězeného molámího absorpčního koeficientu (nástroj ProtParam na web.expasy.org). Koncentrace Esp proteinázy byla odhadnuta přímo z intenzity signálu na gelu. Pro aplikaci ve druhém stupni byl připraven ze 4 účinných látek tisícinásobný koncentrát oproti optimálním aplikačním koncentracím zjištěným z vědecké literatury uvedené ve stavu techniky tohoto vynálezu. Pro druhý stupeň finální přípravek obsahoval směs látek obsahující 10 pg/ml lipoteichoové kyseliny bakterie .S', epidermidis, 5 pg/ml specifické serinové proteinázy Esp bakterie .S', epidermidis, 12 pg/ml SH-lantibiotických peptidů bakterie .S', epidermidis a 38 pg/ml
-9CZ 2019 - 75 A3 γ-modulinu bakterie .S' epidermidis. Reprodukovatelnost přípravy jednotlivých šarží byla z hlediska obsahu výše uvedených látek dostačující (s relativní odchylkou do 10 %).
Příklad 3
Příprava účinných látek potřebných pro třetí stupeň přípravku působící obnovení normální fýziologické mikroflóry
Výchozí materiál pro bakteriální extrakt sestával z mikrobiální komunity charakteristické pro čističky vod a byl laskavě poskytnut na Centru aplikovaného výzkumu Dobříš (CAVD) Mgr. Jakubem Hejnicem PhD a Ing. Pavlem Píchou PhD z Ústavu technologie vody a prostředí Vysoké školy chemicko-technologické (VSCHT) Praha. Obsah bakterií rodu Nitrosomonas extenzivně odstraněných z mikrobiomu lidské kůže v důsledku používání mýdel a detergentů (www.aobiome.com) byl odhadnut na 25 až 30 %. Membránový komplex obsahující asi 50 % buněčného proteinu a 90 % ubiquinonu a cytochrome c oxidázy byl isolován popsaným postupem (8) zahrnujícím opakované zmražení a rozmražení následované centrifůgací při 20 000 x gav po dobu 20 min. Čirý supernatant byl odlit a membránový complex několikrát promyt, centrifůgován při 3000 x g;iv 20 min a resuspendován na koncentraci 5 mg/ml. Nízkomolekulámí látky obsažené s supematantu po prvé centrifůgací byly purifikovány na koloně oktadecylsilikagelu stejně jako v příkladu provedení č. 2. Frakce eluovaná z kolony 30% ethanolem byla opatrně odpařena a získaný materiál byl přidán do membránové frakce do finální koncentrace 15 mg/ml. Postup extrakce byl opakován celkem čtyřikrát a byly tak získány extrakty NIE1, NIE2, NIE3 a NIE4. Na specializovaném pracovišti VŠCHT Praha byla též potvrzena schopnost získaných extraktů rozkládat močovinu vylučovanou lidskou kůží na amoniak a dále na oxidy dusíku, jmenovitě oxid dusnatý. Extrakty byly přidány do přípravku pro třetí stupeň po jejich stonásobném naředění ve finální sumární koncentraci 20 pg/ml.
Příklad 4
Výběr látek zajišťujících výživu kůže a další propagaci a stabilizaci normální mikroflóry ve čtvrtém stupni přípravku
Před přípravou finálních formulací se jevilo jako vhodné vyzkoušet různé formulace látek uváděných v literatuře jako vhodné komponenty pro výživu kůže a další propagaci a stabilizaci normální mikroflóry, respektive potlačení kožních patogenů. Z tohoto důvodu byla provedena rychlá optimalizace různých kompozic obsahujících sloučeniny jako je xylitol, famesol, Larginin, světlicový olej, pupalkový olej, konopný olej, řepkový olej, olej z pšeničných klíčků, laktát, glycin, fruktosa, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý. Po provedení testů antimikrobiální a biofilmy rozrušující aktivity, jak je uvedeno v příkladech provedení č. 6 a 7, a za současného zhodnocení dostupnosti těchto sloučenin v kosmetické kvalitě a jejich ceny bylo rozhodnuto famesol a světlicový olej do základu pleťového mléka nepřidávat a ostatní výše zmíněné sloučeniny potom zahrnout v následujících koncentracích (uváděno v pořadí snižujícího se obsahu): xylitol 6 % hmoto., konopný olej 5 % hmota., řepkový olej 5 % hmota., L-arginin 1 % hmota., pupalkový olej 1 % hmota., olej z pšeničných klíčků 1 % hmota. U minoritních komponent, jako je laktát, glycin, fruktosa, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý, se jejich přidání do 0,1 % hmotnosti ukázalo jako dostatečné.
Příklad 5
Příklady vhodných kosmetických kompozic kompatibilních s účinnými látkami a výsledky testů stability
Pro zajištění kompatibility a dlouhodobé stability po dobu nejméně jednoho roku byly zkoušeny různé kompozice (olejové emulze) jako základ pleťového mléka nebo kožní emulze. U
- 10 CZ 2019 - 75 A3 jednoduchých olejových emulzí se objevily problémy s mikrobiologickou čistotou, resp. kontaminací i přes přidané konzervanty. U emulze komplexnějšího složení byla použita I vyšší koncentrace konzervačních látek. U této emulze se již problémy s mikrobiální kontaminací neobjevily a po přidání účinných látek se směs jevila stabilní po dobu 3 měsíců při doporučené teplotě skladování (15 až 25 °C). Poté však docházelo k viditelnému krémování (separace olejových látek ve vrchní vrstvě). Proto byla zkoušena ještě složitější kompozice obsahující mj. nové emulgátory a další pomocné látky. Výsledky s touto kompozicí byly již velmi dobré a dlouhodobá stabilita byla až po dobu 9 měsíců, problémem této kompozice však byla vysoká viskozita bránící účinné aplikaci. Finální olejová emulze (viz dále) vykazovala všechny vlastnosti nutné pro správnou a uživatelsky příjemnou aplikaci a současně stabilitu lepší než 12 měsíců (1 rok) za doporučených podmínek skladování (15 až 25 °C). Tato kompozice byla tedy použita pro přípravu všech testovacích přípravků ve všech stupních.
Při přípravě optimalizované testovací emulze se postupovalo standardním způsobem s prudkým mícháním vodné fáze obsahující komponenty rozpustné ve vodě (včetně detergentů) a olejové fáze (včetně emulgátorů) za zvýšené teploty a následným postupným ochlazením za neustálého prudkého míchání (laboratorní, popř. průmyslový mixer s otáčkami min. 10 000 ot/min).
Celkové složení připravené olejové emulze č. 4 dle kosmetického vyjádření tedy je (všechna uváděná čísla jsou procenta hmotnosti): voda 68,9397; xylitol 5,0; konopný (Cannabis sativa) olej 5,0; řepkový (Brassica campestris) olej 5,0; glycerol 4,0; močovina 4,0; glyceryl stearát citrát 2,0; olivový olej 1,0; olej z pšeničných klíčků 1,0; pupalkový (Oonothera biennis) olej 1,0; L-arginin 1; fenoxyethanol 0,9; levandulová silice 0,2; L-arginin 0,2; polyakrylátcrosspolymer-6 0,25; ethylhexylglycerin 0,1; Lactil® 0,1; Sepitonic® 0,1; D,L-a-tokoferol 0,0 l;a barvivo A12385 (E123) amaranth 0,003.
Praxe obvyklá při výrobě kosmetických nebo léčivých přípravků typu pleťových mlék nebo kožních přípravků vyžadovala, aby komponenty určené pro čtvrtý stupeň poskytující výživu kůži a stabilizující kožní mikroflóru byly přidány již do výše uvedené kompozice. Ta tedy představovala finální složení pro čtvrtý stupeň.
Kompozice pro první stupeň obsahovala v základu tvořeném výše popsanou kompozicí ještě enzymové aktivity přítomné po naředění přidaných mikrobiálních extraktů. Přípravek tak obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce příkladně 0,03 až 0,06 mg proteinu, 0,47 až 0,94 mU proteináz, 1,13 až 2,26 mU laminarináz, 0,53 až 1,06 mU celuláz a 0,93 až 1,86 mU chitináz (U je mezinárodní enzymová jednotka definovaná jako množství enzymu schopné rozštěpit 1 pmol substrátu za minutu).
Pro druhý stupeň bylo v typické 3 ml aplikační dávce přípravku obsaženo 8,0 až 12,0 pg kyseliny lipoteichoové (typ .S', epidermidis), 30,0 až 40,0 pg antimikrobiálních peptidů SHlantibiotikového typu, 16,0 až 20,0 pg antimikrobiálního peptidu γ-modulinu a 13,0 až 21,0 pg Esp proteinázy z .S', epidermidis.
Konečně pro třetí stupeň ve 3 ml aplikační dávce pleťového mléka bylo obsaženo 60,0 pg směsi látek z Nitrosomonas, z toho 45,0 pg nízkomolekulámích látek a 15,0 pg proteinového komplexu.
Příklad 6
Stanovení antimikrobiálních aktivit v laboratorním testu
Faktické antimikrobiální aktivity a schopnost rozrušovat biofilmy byla pro získané mikrobiální extrakty testována s použitím standardních laboratorních testů, jmenovitě diskového testu na Petriho miskách (diskový test), testu minimální inhibiční koncentrace na mikrotitračních destičkách (MIC test) a testu rozrušení biofilmů s detekcí zbytkového biofilmů pomocí
- 11 CZ 2019 - 75 A3 krystalové violeti (biofilmový test). Výsledky rozrušení biofílmů jsou popisovány v následujícím příkladu provedení č. 7.
Prvým testem byla zkouška na schopnost inhibovat růst majoritního kožního patogena baktérie .S'. aureus kmene ATCC_6538. Tento kmen je velmi agresivní a je používaný jako standard ve studiích desinfekcí a antiseptických činidel. Nej významnějších účinků bylo dosaženo v diskovém testu pro sekretované proteiny baktérie .S', epidermidis ředěné stonásobně, lyzát připravený z těchto bakterií ředěný stonásobně a stonásobně ředěný extrakt průmyslových bakterií z čističek rodu Nitrosomonas (Obr. 3A). Tyto výsledky byly potvrzeny v MIC testu pro různé šarže těchto preparátů, kdy 3 ze 4 šarží sekretovaných proteinů .S', epidermidis účinně inhibovaly růst baktérie .S', aureus ještě v koncentraci (stanovené jako celkový protein) 0,1 pg/ml (a jedna šarže inhibovala při koncentraci 1 pg/ml). Podobně byl lyzát bakterií .S', epidermidis schopen inhibovat růst patogenních bakterií ještě při koncentraci 0,1 pg/ml, čtvrtá šarže též inhibovala růst při koncentraci 1 pg/ml. Naopak inhibiční účinky směsi průmyslových bakterií s obsahem bakterií rodu Nitrosomonas byly asi o dva řády nižší, kdy tři šarže inhibovaly při koncentraci 10 pg/ml a jedna při koncentraci 100 pg/ml (Obr. 3B). Konečně byla antimikrobiální účinnost testována na kvasince Candida albicans, která může nabývat u jedinců s problematickou kůží agresivnější podoby, a kromě infekce dominantním patogenem .S', aureus představuje koinfekce agresivní formou kvasinky Candida albicans nejčastější komplikující faktor u těchto jedinců. Byl použit rychle rostoucí agresivní kmen ATCC_10231 používaný při kontrolách sterility a pro testování protiplísňových látek. V případě této kvasinky omezily účinně její růst pouze rozpustné sekretované proteiny a lyzát z bakterie .S', epidermidis, (Obr. 3C a 3D).
Příklad 7
Stanovení biofilmy rozrušujících aktivit v laboratorním testu
V biofilmovém testu byly zkoušeny schopnosti získaných účinných látek rozrušovat biofilmy tvořené patogenem .S', aureus s cílem ověřit publikované výsledky a stanovit potenci těchto látek. Pro tyto experimenty byl použit standardní test rozrušení biofilmu s detekcí krystalovou violetí a vyhodnocení výsledků spektrofotometricky při 595 nm. Z důvodu variability biologických stanovení byl každý experiment nasazován paralelně ve čtyřech jamkách (kvadruplikát), prezentovaná data pak byla průměrem těchto čtyř stanovení (Obr. 4A). Schopnost testovaných účinných látek rozrušit biofilmy byla zkoušena ve čtyřech různých koncentracích, kdy překvapivě nejlepší výsledky poskytovaly látky ředěné lOx, a ještě lépe lOOx (Obr. 4B). Při testování kombinací účinných látek se jako optimální v testu rozrušení biofílmů jevila kombinace rozpustných sekretovaných proteinů z bakterie .S', epidermidis a půdního mikroorganismu P. nunn (označeno PNSE, Obr. 4B a Obr. 4C). Dalším významným laboratorním parametrem je viabilita patogenních mikroorganismů uvolněných z biofílmů: pokud zůstávají takto uvolněné bakterie viabilní, hrozí na místě aplikace nebezpečí rekolonizace i tvorby nových biofílmů po ukončení aplikace. Proto byly bakterie po 24hodinové inkubaci před promytím a detekcí destičky odebrány a byla kultivačně testována jejich viabilita. Tento experiment jasně prokázal, že použité mikrobiální extrakty mají schopnost nejen biofilm rozrušit, ale i zabít (či alespoň významně snížit viabilitu) uvolněných patogenních bakterií. Nej lepších účinků opět bylo dosaženo směsí sekretovaných proteinů obou mikroorganismů při ředění lOOx a lOOOx (Obr. 4D).
Příklad 8
Praktické zkoušky několikastupňových přípravků
Po dokončení výroby čtyřstupňového přípravku ve formě pleťového mléka (každý stupeň formulován do emulze č. 4 z příkladu 5) a získání potřebné Zprávy o bezpečnosti kosmetického přípravku probíhaly praktické studie v několika kolech.
V prvém kole testování byl přípravek aplikován v režimu čtyřtýdenní aplikace (každý stupeň po
- 12 CZ 2019 - 75 A3 dobu jednoho týdne ráno a večer) u 10 zdravých jedinců s normální neporušenou kůží. S výjimkou velmi mírného svědění u přípravku pro první stupeň nebyly pozorovány po měsíční aplikaci žádné vedlejší ani nežádoucí reakce. Tyto výsledky společně s výsledky uvedenými ve Zprávě o bezpečnosti ukazovaly na bezpečnost přípravku při jeho aplikaci na zdravou kůži normálních j edinců.
Ve druhém kole byla provedena aplikace u rodinných příslušníků v okruhu známých, u nichž se vyskytly různé problémy kůže, ať již na základě dlouhodobě pozorované náchylnosti k určitým onemocněním (akné, atopický ekzém, růžovka, lupénka) nebo i na základě akutního popálení. V tomto kole testování šlo o zjištění počáteční reakce v jednotlivých skupinách stejně jako o zjištění možného rozsahu aplikací. Přitom byla učiněna dvě důležitá pozorování: (1) u jedinců s citlivou a podrážděnou kůží se objevila reakce na komponentu druhého stupně, tento problém byl řešen další purifikací extraktu jak je uvedeno v příkladu 2, (2) počáteční pocit, že přípravek je účinný i pro rychlejší hojení běžných mechanických nebo termických poškození kůže (pořezání, popálení) byl potvrzen nešťastným případem dělníka pracujícího na pracovišti přihlašovatele s rozsáhlou popáleninou ruky, kdy došlo ke zhoršení stavu po propuštění z kliniky popálenin spojeném s lokální sepsí, která nemohla být vyřešena ani podáním antibiotik a hrozila amputace končetiny. Nicméně po dvou týdnech aplikace zahrnující prostředky pro prvý a druhý stupeň došlo k velmi významnému zlepšení stavu a odeznění infekce.
Ve třetím kole došlo na základě počátečních zkušeností, detailního návodu k použití přípravku, aplikačního formuláře (dotazníku) a informovaného souhlasu pacienta k systematickému testování, do kterého byl zařazen čtyřfázový přípravek zahrnující všechny popsané účinné látky.
let starý muž uvedl problémy s výskytem atopického ekzému již od útlého věku, který v posledních letech lokalizoval do oblasti kotníku. Problém nemohl být vyřešen pomocí velkého množství prostředků nabízených na trhu kosmetiky. Čtyřfázový prostředek byl aplikován po dobu 4 týdnů dvakrát denně. Po aplikaci uživatel uvádí významné zlepšení stavu, které bylo možné sledovat i z fotodokumentace (Obr. 5). Subjektivně uživatel uvádí zklidňující působení, i když byla uvedena poměrně dlouhá doba na zasychání a vstřebání (která je zdůvodněna přítomností hydrátujících komponent v aplikačním přípravku).
let stará žena trpěla dlouhodobě atopickým ekzémem na rukou, který nemohl být vyřešen pomocí běžných prostředků nabízených na trhu kosmetiky. Uživatelce byl nabídnut čtyřfázový prostředek, fakticky však došlo k aplikaci pouze pro prvý a druhý stupeň v rozsahu jednoho týdne pro každou kompozici. Uživatelka popisuje po dokončení poloviny aplikačního režimu částečné vyřešení problému spojené s významným zklidněním. Částečné zklidnění a menší zmenšení rozsahu afekce je patrné i na poskytnuté fotodokumentaci (Obr. 6).
let stará žena - diabetička s poškozením ledvin závislá na ošetření dialýzou třikrát týdně si stěžovala na dlouhodobé problémy s plísněmi na nohou a zrohovatěním a rozpraskáním kůže v oblasti nártu a plosky. Zena aplikovala čtyřstupňový přípravek po dobu 4 týdnů přesně podle návodu na přípravku. Po měsíční aplikaci byla uživatelka velmi spokojená, neboť se podařilo plísňovou infekci významně omezit a lokalizovat, pacientka uvádí vyřešení problému na 80 % původně zasažené plochy. Poskytnutý výzkumný přípravek se významně odlišoval od řady jiných použitých přípravků a krémů, které neměly žádný účinek nebo bylo pozorováno pouze dočasné zlepšení a po několika dnech se opět stav zhoršil. Poskytnutá dokumentace (Obr. 7) odpovídá subjektivním pocitům uváděným užíváteIkou.
let starý muž utrpěl popáleninu na ruce v důsledku nehody v laboratoři, která zasáhla prsteník levé ruky se vznikem hluboké, mokvající popáleniny a prostředník levé ruky s postižením menšího rozsahu (Obr. 8A). Aplikace kosmetického přípravku pouze pro první stupeň (monokompozice) byla prováděna po dobu dvou týdnů na hůře postižený prsteník, prostředník byl ponechán bez aplikace jako kontrola. Po 12 dnech aplikace byla obě místa zcela zhojena, s plně zacelenou kůží a mírným zčervenáním v místě postižení (Obr. 8D). Během dalších dvou
- 13 CZ 2019 - 75 A3 týdnů došlo bez jakékoliv další aplikace k úplné normalizaci na původní stav, prsty byly bez jizev nebo jakýchkoliv známek poškození či změny pigmentace.
V době podání tohoto vynálezu praktické testování organizované přihlašovatelem pokračuje ve formě aplikací u větších skupin uživatelů pod dohledem dermatologů. Cílem této části je shromáždit dostatečný soubor dat umožňující statistické vyhodnocení a získat zkušenosti pro přípravu klinických zkoušek se zkoušenými léčivými přípravky.
Průmyslová využitelnost
Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle předloženého vynálezu může být použit k výrobě souprav kosmetiky nebo i jednotlivých kosmetických přípravků vhodných pro aplikaci na problematickou kůži jedinců s atopickou dermatitidou, akné, růžovkou, lupénkou, vitiligo a jiných poškození kůže stejně jako pro výrobu kosmetických prostředků proti popáleninám. Dále mohou být jednotlivé zde uváděné kompozice nebo jejich kombinace použity pro prevenci kožních onemocnění a problémů pro posílení biologické složky ochranné bariéry kůže. Rovněž mohou být směsi a komponenty uváděné v tomto vynálezu použity pro výrobu léčivých přípravků, zejména pro použití při léčení atopické dermatitidy, akné, růžovky, lupénky, vitiligo, poškození kůže mechanickým poraněním nebo popálením.
Citovaná literatura
1. Cohen AL, Yamasaki K, Sanchez KM a spol. (2010a) J Invest Dermatol 130: 192-196.
2. Cohen AL, Yamasaki K, Muto J a spol. (2010b) PLoS One 5: e8557.
3. Elad Y, Lifshitz R, Baker R (1985) Physiol Plant Pathol 27, 131-148.
4. Gallo RL, Nakatsuji T US2015/290209 Al (published on 15th October 2015).
5. Ganju P, Nagpal S, Mohammed MH a spol. (2016) Sci Rep 6: 18761.
6. Garcia-Gomez E, Miranda-Ozuna JFT, Diaz-Cedillo F a spol. (2017) J Med Microbiol 66: 864-87.
7. Grice EA, Segre JA (2011) Nat Rev Microbiol 9: 244-253.
8. Hooper AB, Erickson RH, Terry KR (1972) J Bacteriol 110: 430-438.
9. Human Microbiome Project Consortium (2012) Nature 486, 207-214.
10. Iwase T, Uehara Y, Shinji H a spol. (2010) Nature 465: 346 - 349.
11. Kazue T, Makioka Y CN2018/10792295 6 A (published on 17th April 2018).
12. Kleinberg I, Zhang Z US2016/263154 Al (published on 15th September 2016).
13. Kobayashi T, Glatz M, Horiuchi K a spol. (2015) Immunity 42, 756-766.
14. Kong HH, Oh J, Deming C a spol. (2012) Genome Res 22: 850-859.
15. Lai Y, DiNardo A, Nakatsuji T a spol. (2009) Nat Med 15, 1377-1386.
16. McKevitt Al, Bjomson GL, Mauracher CA a spol. (1990) Infect Immun 58, 1473-1475.
17. Naik S, BouladouxN, Wilhelm C a spol. (2012) Science 337: 1115-1119.
18. Nakatsuji T, Chen TH, Narala S a spol. (2017) Sci Transl Med 9: eaah4680.
19. Nakatsuji T, Gallo RL US2018/289751 Al (published on 11th October 2018).
20. Park TH, Kim SH, Jin YJ, An SS, Lee JH KR2017/3478 A (published on 9th January 2017)
21. Sanford JA, Gallo RL (2013) Semin Immunol 25, 370-377.
22. Smoragiewics W, Karska-Wysocki B, Bazo M US2011/0195057 Al (published on 11th August 2011).
23. Sugimoto S, Iwamoto T, Takada K a spol. (2013) J Bacteriol 195: 1645-1655.
24. Takayama K, Makioka Y CN2018/107922956 A (published on 17th April 2018).

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek, vyznačující se tím, že je formulován do 4 stupňů pro postupnou aplikaci na kůži; přičemž první stupeň přípravku jako účinné látky obsahuje látky rozrušující biofílmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačující viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů, kterými jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynehacterium, Propionibacterium a Proteobacterium a půdních mikroorganismů vybraných z mikroorganismů rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium;
    druhý stupeň přípravku jako účinné látky obsahuje látky uklidňující zánět a obnovující účinnou biologickou bariéru kůže, kterými jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynehacterium, Propionibacterium a Proteobacterium;
    třetí stupeň přípravku jako účinné látky obsahuje látky obnovující normální fyziologickou mikroflóru, kterými jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z půdních bakterií rodu Nitrosomonas nebo Mycobacterium;
    a čtvrtý stupeň přípravku obsahuje látky poskytující výživu kůži a dále podporující rozvoj komensálních mikroorganismů za současného potlačení rozvoje patogenů, kdy se jako účinná látka vyskytuje alespoň jedna látka vybraná ze skupiny obsahující xylitol, farnesol, L-arginin, světlicový olej, pupalkový olej, konopný olej, řepkový olej, olej z pšeničných klíčků, laktát, glycin, fruktózu, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý.
  2. 2. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že bezbuněčné extrakty nebo lyzáty kožních komensálních mikroorganismů jsou připraveny z bakterie Staphylococcus epidermidis a extrakty nebo lyzáty připravené z půdních mikroorganismů jsou připraveny z oomycety Pythium nunn a/nebo bakterie Nitrosomonas europea.
  3. 3. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že první stupeň přípravku obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce aktivitu proteináz v množství 0,47 až 0,94 mU, laminarináz v množství 1,13 až 2,26 mU, celuláz v množství 0,53 až 1,06 mU a chitináz v množství 0,93 až 1,86 mU.
  4. 4. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že druhý stupeň přípravku obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce 8,0 až 12,0 pg kyseliny lipoteichoové, 30,0 až 40,0 pg antimikrobiálních peptidů SH-lantibiotikového typu, 16,0 až 20,0 pg antimikrobiálního peptidu γ-modulinu a 13,0 až 21,0 pg Esp proteinázy.
  5. 5. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že třetí stupeň přípravku obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce 60,0 pg směsi látek z Nitrosomonas europea, z toho je 45,0 pg nízkomolekulámích látek a 15,0 pg proteinového komplexu obsahujícího membránový komplex oxidující močovinu a produkující oxid dusnatý.
  6. 6. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5 pro použití jako kosmetický přípravek.
    - 15 CZ 2019 - 75 A3
  7. 7. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6 pro použití jako kosmetický přípravek ke zklidnění a regeneraci podrážděné nebo popálené kůže a/nebo posílení biologické komponenty kožní bariéry a udržení dobré kondice mikrobiálních komunit na kůži.
  8. 8. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5 pro použití jako léčivý přípravek.
  9. 9. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 8 pro použití jako léčivý přípravek při léčení nemocí nebo poranění kůže.
  10. 10. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 9 pro použití jako léčivý přípravek při léčení atopické dermatitidy, akné, růžovky, lupénky, vitiliga, poškození kůže způsobeného mechanickým poraněním nebo popálením.
  11. 11. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10 pro postupnou aplikaci ve čtyřech obdobích tak, že v prvním období se aplikuje první stupeň přípravku, ve druhém období se aplikuje druhý stupeň přípravku, ve třetím období se aplikuje třetí stupeň přípravku a ve čtvrtém období se aplikuje čtvrtý stupeň přípravku, přičemž každé z prvního, druhého a třetího období trvá jeden až dva týdny a čtvrté období trvá jeden až šest týdnů.
  12. 12. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že každý stupeň přípravku je formulován do aplikační formy vybrané z kožní emulze, krému, masti, gelu, pěny, pleťového mléka nebo jiné kosmetické nebo farmaceutické kompozice s olejovou komponentou.
  13. 13. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 12, vyznačující se tím, že každý stupeň přípravku obsahuje vodu jako solvent, olivový olej jako olejovou komponentu, kyselinu citrónovou nebo kyselinu octovou nebo kyselinu mléčnou v kombinaci s triethanolaminem jako pufrující složku, glycerin a močovinu jako kondicionéry, fenoxyethanol, tokoferol a ethylhexylglycerin jako konzervanty, amaranth jako barevnou látku, glyceryl stearát a cetylalkohol jako emulgátor, polyakrylát crosspolymer-6 a xanthanovou gumu jako regulátory viskozity a levandulový olej jako vonnou komponentu.
  14. 14. Způsob kosmetického ošetření, vyznačující se tím, že se na kůži nebo sliznici aplikuje kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 postupně ve čtyřech obdobích tak, že v prvním období se aplikuje první stupeň přípravku, ve druhém období se aplikuje druhý stupeň přípravku, ve třetím období se aplikuje třetí stupeň přípravku a ve čtvrtém období se aplikuje čtvrtý stupeň přípravku, přičemž každé z prvního, druhého a třetího období trvá jeden až dva týdny a čtvrté období trvá jeden až šest týdnů.
  15. 15. Způsob ošetření podle nároku 14, vyznačující se tím, že aplikace je prováděna alespoň jednou denně, výhodně ráno a večer, pomocí rozstřiku nebo rozetřením příslušného stupně přípravku na postižená místa a případně i jejich okolí, nebo v případě výskytu velmi citlivých ložisek se aplikuje pouze do okolí těchto ložisek.
CZ2019-75A 2019-02-11 2019-02-11 Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace CZ201975A3 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-75A CZ201975A3 (cs) 2019-02-11 2019-02-11 Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace
EP20152571.4A EP3692980A1 (en) 2019-02-11 2020-01-19 Combined multistage microbial preparations and method of their application
US16/788,257 US20200254030A1 (en) 2019-02-11 2020-02-11 Combined Multistage Microbial Preparations and Method of Their Application
US17/809,702 US20230049239A1 (en) 2019-02-11 2022-06-29 Combined multistage microbial preparations and method of their application

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-75A CZ201975A3 (cs) 2019-02-11 2019-02-11 Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ308231B6 CZ308231B6 (cs) 2020-03-11
CZ201975A3 true CZ201975A3 (cs) 2020-03-11

Family

ID=69718663

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-75A CZ201975A3 (cs) 2019-02-11 2019-02-11 Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20200254030A1 (cs)
EP (1) EP3692980A1 (cs)
CZ (1) CZ201975A3 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ309480B6 (cs) * 2021-09-30 2023-02-15 BiomServ s.r.o Přípravky na ochranu mikrobiomu kůže a sliznic proti patogenním mikrobům a virům

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2373411T3 (es) 2006-12-22 2012-02-03 Bio-K Plus International Inc. Inhibición del crecimiento y eliminación del staphylococcus aureus resistente a la meticilina por bacterias ácido lácticas.
WO2012112548A2 (en) 2011-02-15 2012-08-23 The Regents Of The University Of California Firmocidin, an antimicrobial molecule produced by staphylococcus epidermidis
US9504739B2 (en) * 2011-03-01 2016-11-29 Quorum Innovations, Llc Method of identifying a biologically-active composition from a biofilm
WO2013122931A2 (en) * 2012-02-14 2013-08-22 The Procter & Gamble Company Topical use of a skin-commensal prebiotic agent and compositions containing the same
US10702558B2 (en) * 2014-05-30 2020-07-07 Azitra Inc Therapeutic treatment of skin disease with recombinant commensal skin microorganisms
WO2016054093A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 The Research Foundation For The State University Of New York Altering human cutaneous microbiome to increase growth of staphylococcus epidermidis and reduce staphylococcus aureus proliferation
CZ201523A3 (cs) * 2015-01-16 2016-07-27 Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí
CN115715781A (zh) 2015-05-05 2023-02-28 加利福尼亚大学董事会 抗微生物疗法
JP6845392B2 (ja) * 2015-06-01 2021-03-17 株式会社ピカソ美化学研究所 化粧料用組成物
KR102587334B1 (ko) 2015-06-30 2023-10-12 (주)아모레퍼시픽 피부 개선용 균주 및 이를 포함하는 피부 개선용 키트
FR3055799B1 (fr) * 2016-09-15 2020-06-19 Basf Beauty Care Solutions France Sas Nouvelle utilisation cosmetique et/ou nutraceutique ou dermatologique d'un extrait de levure

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ309480B6 (cs) * 2021-09-30 2023-02-15 BiomServ s.r.o Přípravky na ochranu mikrobiomu kůže a sliznic proti patogenním mikrobům a virům

Also Published As

Publication number Publication date
CZ308231B6 (cs) 2020-03-11
US20200254030A1 (en) 2020-08-13
US20230049239A1 (en) 2023-02-16
EP3692980A1 (en) 2020-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2705140B1 (de) Neue milchsäurebakterien und diese enthaltende zusammensetzungen
JP7624219B2 (ja) ニキビの治療のためのプロピオニバクテリウム・アクネスに対する細菌療法
ES2670646T3 (es) Utilización de un extracto de lino procedente de la hidrólisis de las proteínas de lino, como agente activo antimicrobiano
KR20060114370A (ko) 락토바실러스(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ) 추출물을이용한 피부 치료 방법
KR102270709B1 (ko) 복합 세라마이드 및 천연 추출물을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물
CN110585114A (zh) 一种调节皮肤微生物菌群的杀菌组合物及其应用
JP7624072B2 (ja) 皮膚障害の微生物治療のための方法及び組成物
US20250170050A1 (en) Use of Nordic plant-based ingredients for supporting a healthy skin microbiome
WO2025017520A1 (ko) 발명의 명칭: 마이크로코커스 루테우스의 선택적 항균 용도
US20230049239A1 (en) Combined multistage microbial preparations and method of their application
US20240277782A1 (en) Compositions and methods for microbial treatment of skin disorders
CN1067246C (zh) N－乙酰－d－氨基葡萄糖在制备治疗皮肤癣菌的药物中的应用
CZ32750U1 (cs) Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky
CN116635003A (zh) 用于皮肤障碍的微生物治疗的方法和组合物
TWI769404B (zh) 包含藻膽蛋白的組成物、其製備方法及用於抗發炎的用途
EP4096622A1 (en) Compositions and methods for microbial treatment of skin disorders
Garuba et al. Production, characterization, and anti-biofilm activity of dextranase from Penicillium citrinum against Streptococcus mutans
CA3100594A1 (fr) Extrait et composition dermatologique le comprenant pour le traitement des peaux sensibles
RU2535052C1 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая производные лизина, пролина и тритерпеновой кислоты для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых рнк и днк-содержащими вирусами, такими как: грипп, герпес, опоясывающий лишай, папиллома человека, аденоновирусы, а также бактериальных инфекций, вызываемых грам-положительными и грам-отрицательными микроорганизмами
KR102831223B1 (ko) 마이크로코커스 안탁티쿠스의 선택적 항균 용도
KR102708790B1 (ko) 마이크로코커스 포르시의 선택적 항균 용도
RU2535053C2 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая лизин и ферменты: лизоцим, дезоксирибонуклеазу и/или пероксидазу для наружного лечения и профилактики инфекций, вызванных вирусом герпеса типа 1,2 и бактериальных осложнений, вызываемых герпетической инфекцией
JP2003335696A (ja) 水溶性キトサンと木香抽出物で構成された天然セル伝達体
Gulzar et al. Preliminary evaluation of the anti-acne potential of herbal and fruit extracts and formulated creams
Gmyterco et al. Comparative study of a commercial formula containing natural antimicrobials versus oral cephalexin or topical chlorhexidine‐miconazole therapies for treating superficial pyoderma in dogs

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20230211