CZ32750U1 - Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky - Google Patents
Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ32750U1 CZ32750U1 CZ2019-35904U CZ201935904U CZ32750U1 CZ 32750 U1 CZ32750 U1 CZ 32750U1 CZ 201935904 U CZ201935904 U CZ 201935904U CZ 32750 U1 CZ32750 U1 CZ 32750U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- skin
- stage
- preparation
- oil
- microorganisms
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 62
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 66
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 50
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 37
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 21
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 19
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 17
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 16
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 15
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 15
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 15
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 15
- 241000605122 Nitrosomonas Species 0.000 claims description 14
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 14
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 14
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 claims description 13
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 12
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 12
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 11
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 11
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 10
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 9
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims description 8
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241001622897 Pythium nunn Species 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 8
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- -1 famesol Chemical compound 0.000 claims description 6
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 claims description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 5
- 241000233639 Pythium Species 0.000 claims description 5
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 5
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 244000005706 microflora Species 0.000 claims description 5
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 claims description 5
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 claims description 5
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 claims description 4
- OCUCCJIRFHNWBP-IYEMJOQQSA-L Copper gluconate Chemical compound [Cu+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O OCUCCJIRFHNWBP-IYEMJOQQSA-L 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 4
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019485 Safflower oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 4
- WHMDKBIGKVEYHS-IYEMJOQQSA-L Zinc gluconate Chemical compound [Zn+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O WHMDKBIGKVEYHS-IYEMJOQQSA-L 0.000 claims description 4
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims description 4
- 229940108925 copper gluconate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 4
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 4
- 235000008524 evening primrose extract Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000010475 evening primrose oil Substances 0.000 claims description 4
- 229940089020 evening primrose oil Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002737 fructose Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000010460 hemp oil Substances 0.000 claims description 4
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims description 4
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 claims description 4
- 229960001983 magnesium aspartate Drugs 0.000 claims description 4
- RXMQCXCANMAVIO-CEOVSRFSSA-L magnesium;(2s)-2-amino-4-hydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [H+].[H+].[Mg+2].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O.[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O RXMQCXCANMAVIO-CEOVSRFSSA-L 0.000 claims description 4
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 4
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 4
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003813 safflower oil Substances 0.000 claims description 4
- 235000005713 safflower oil Nutrition 0.000 claims description 4
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000306 zinc gluconate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011670 zinc gluconate Substances 0.000 claims description 4
- 235000011478 zinc gluconate Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 claims description 3
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 3
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 claims description 3
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 3
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000010497 wheat germ oil Substances 0.000 claims description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NCZPCONIKBICGS-UHFFFAOYSA-N 3-(2-ethylhexoxy)propane-1,2-diol Chemical compound CCCCC(CC)COCC(O)CO NCZPCONIKBICGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 claims description 2
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940100524 ethylhexylglycerin Drugs 0.000 claims description 2
- 229940075529 glyceryl stearate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 claims description 2
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 claims description 2
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 claims description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 claims 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 claims 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 claims 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- 239000000306 component Substances 0.000 claims 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 claims 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000171 lavandula angustifolia l. flower oil Substances 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 claims 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 claims 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 claims 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 claims 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 244000005714 skin microbiome Species 0.000 description 5
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 4
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 3
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 3
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 3
- 230000001914 calming effect Effects 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 2
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000751182 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Species 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 2
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- CRDAMVZIKSXKFV-FBXUGWQNSA-N (2-cis,6-cis)-farnesol Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CO CRDAMVZIKSXKFV-FBXUGWQNSA-N 0.000 description 1
- 239000000260 (2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trien-1-ol Substances 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 description 1
- PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N (e)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazine Chemical compound C1=CC=C2S\C(=N\N)N(C)C2=C1 PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N 0.000 description 1
- LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 1-(1,2-Diphosphanylethyl)pyrrolidin-2-one Chemical compound PCC(P)N1CCCC1=O LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZBPKYOVPCNPJY-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(allyloxy)-2-(2,4-dichlorophenyl)ethyl]imidazole Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1C(OCC=C)CN1C=NC=C1 PZBPKYOVPCNPJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKEQOUMMGPBKMM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-[2-(2-hydroxy-3-octadecanoyloxypropoxy)-2-oxoethyl]butanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O NKEQOUMMGPBKMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 1
- 244000217177 Anacolosa luzoniensis Species 0.000 description 1
- 235000007911 Anacolosa luzoniensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000008697 Cannabis sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108090000365 Cytochrome-c oxidases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000005795 Imazalil Substances 0.000 description 1
- 238000012773 Laboratory assay Methods 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 244000178870 Lavandula angustifolia Species 0.000 description 1
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 1
- 235000004496 Oenothera biennis Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 241001303601 Rosacea Species 0.000 description 1
- 206010039897 Sedation Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150017815 TCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000973887 Takayama Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 208000015532 congenital bilateral absence of vas deferens Diseases 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 244000000068 cutaneous pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229960002125 enilconazole Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940043259 farnesol Drugs 0.000 description 1
- 229930002886 farnesol Natural products 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 229940126602 investigational medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 description 1
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 description 1
- 238000011542 limb amputation Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N reduced coenzyme Q9 Natural products COC1=C(O)C(C)=C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1OC NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000036280 sedation Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036559 skin health Effects 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- CRDAMVZIKSXKFV-UHFFFAOYSA-N trans-Farnesol Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCO CRDAMVZIKSXKFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000007195 tryptone soya broth Substances 0.000 description 1
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
Oblast techniky
Technické řešení se týká mikrobiálních bezbuněčných přípravků, které jsou účinné zejména pro posílení biologické komponenty kožní bariéry a udržení dobré kondice mikrobiálních komunit v kůži. Mohou být využity jako přípravky kosmetické i léčivé.
Dosavadní stav techniky
Koncepce rovnováhy mikrobiálních komunit v různých částech těla a blahodárného vlivu majoritních komensálních mikroorganismů na zdraví kůže a formování normální imunity v této části těla pochází již ze 60. a 70. let minulého století, kdy byly základy tohoto oboru položeny vědci bádajícími na pomezí mikrobiologie a imunologie. V tomto raném období byly objeveny základní principy mikrobiálních rovnováh, avšak jejich přesná povaha zůstala skryta vzhledem k metodickým omezením (detekce jednotlivých mikroorganismů pouze na základě kultivačních a biochemických metod). K dramatické změně této situace došlo během prvých dvou desetiletí nového milénia, kdy získal vědecký výzkum nové možnosti využívající kultivačně nezávislé analýzy jednotlivých přítomných mikroorganismů pomocí PCR amplifikace identifikačních sekvencí (nejčastěji ITS sekvencí nacházejících se v genech pro ribosomální RNA) v kombinaci s významným urychlením DNA sekvenace pomocí zařízení využívajících principu DNA sekvenování nové generace (NGS, z angl. Next Generation Sequencing). Kromě metodického pokroku pak k vědeckému poznání a upřesnění mikrobiálních komunit v různých částech lidského těla přispěl mezinárodní projekt Human Microbiome Project garantující zejména nasazení dostatečné vědecké a finanční kapacity pro řešení jednotlivých úkolů. Počátkem současné dekády tak mohly být publikovány prvé výsledky popisující lidský mikrobiom u normálních jedinců a u jedinců trpících různými onemocněními souvisejícími s mikrobiální nerovnováhou (dysbiosou) (Grice a Segre 2011, Human Microbiome Project Consortium 2012, Sanford a Gallo 2013). Pokud jde o onemocnění na kůži a sliznicích, bylo ukázáno, že oslabení dominantního komensálního mikroorganismu kůže, bakterie Staphylococcus epidermidis (dále S. epidermidis), může vést k oslabení biologické komponenty kožní bariéry a kůže se pak stává náchylnou k infekcím obávaným patogenem kůže, bakterií Staphylococcus aureus (dále S. aureus).
Vzhledem k nákladům a úsilí vloženým do projektu Human Microbiome Project očekávala veřejnost řadu praktických výstupů, zejména však uvedení na trh mnoha různých prostředků na řešení dysbiotických stavů a chorob s těmito stavy spojených. Doposud se však praktických řešení spojených s uplatněním nových poznatků objevilo velmi málo. Smoragiewicz a spol. (US2011/195057) popisují inhibiční vliv vybraných kmenů laktobacilů na methicillin-rezistentní S. aureus. Gallo aNakatsuji (US2015/290209) popisují nové antimikrobiální činidlo pocházející z mikroorganismu S. epidermidis označené jako firmocidin. Kleinberg a Zhang (US2016/263154) vyvinuli jednoduchou chemickou kompozici působící jako prebiotikum modifikující lidský kožní mikrobiom mechanismem snížení proliferace dominantního patogena kůže bakterie S. aureus na úkor kožní komensální bakterie S. epidermidis. Park a spol. (KR2017/3478) popisují vynález založený na kmenech S. epidermidis rozrušujících biofilmy tvořené na kůži patogenními mikroorganismy. Takayama a Yuko (CN2018/107922956) popisují modifikovaný kmen S. epidermidis produkující zvýšená množství antimikrobiálních peptidů a jeho použití pro ochranu kůže. Podobný je i vynález Nakatsuji a Galo (US2018/289751) navrhující antimikrobiální terapii založenou na kmenech bakterie S. epidermidis produkujících hogicidinové peptidy nazývané SH-lantibiotika a též patent Kazue a spol. (CN2018/107922956).
Využití nových poznatků o mikrobiotách lidské kůže je dále předmětem několika publikací uveřejněných během posledních let. Naik a spol. (2012) ukázali, že kožní mikrobiota mají
- 1 CZ 32750 U1 autonomní úlohu při tvorbě lokálního imunitního systému a obranu proti mikrobiálním patogenům. Skutečnost, že dysbiosa je společně s infekcí patogenní bakterií S. aureus hlavním hnacím motorem zánětu u atopické dermatitidy byla prokázána Kobayashim a spol (2015) na modelu ADAM17-deficientních myší. Vztah dysbiosy a různých problémů citlivé kůže je ve studiích opakovaně prokazován - například Kong a spol. (2012) a Ganju a spol. (2016).
Různé publikované studie konečně předkládají velké množství důkazů z hlediska identifikace konkrétních skupin a typů látek, jejichž nepřítomnost se může podílet na vzniku problematické pokožky. Většinou se jedná o látky produkované dominantním kožním komensálním mikroorganismem S. epidermidis chybějící v případě deficience tohoto mikroorganismu na kožních lezích postižených dysbiosami. Specifická proteinasa tohoto mikroorganismu štěpící cílové proteiny za zbytkem kyseliny glutamové podobná V8 proteinase je označena Esp a byla prokázána její úloha při eliminaci (inhibici) patogenních biofilmů na kůži a též při degradaci specifických povrchových proteinů patogena S. aureus (Iwase a spol. 2010, Sugimoto a spol. 2013). Jako typický protizánětlivý faktor se ukázala být kyselina lipoteichoová sekretovaná bakterií S. epidermidis (Lai a spol. 2009). Novější studie ovšem prokázaly, že řada přirozených komensálních kmenů tohoto mikroorganismu isolovaných z kožních stěrů není dobrým producentem této látky, na rozdíl od netoxického a biofilmy netvořícího sbírkového kmene S. epidermidis ATCC_12228 (Garcia-Gomez a spol. 2017). Vposledku byla identifikována kritická úloha antimikrobiálních peptidů produkovaných některými kmeny S. epidermidis, z nich potom zejména γ-modulinu a peptidů náležících do SH-lantibiotik (Cohen a spol. 2010a, Cohen a spol. 2010b, Nakatsuji a spol, 2017).
Všechna výše navržená řešení mají řadu významných omezení. Mnohá z těchto řešení byla odzkoušena pouze na laboratorní úrovni a jejich spolehlivé fungování tedy není opřeno o náležité praktické testy. Mnohé přípravky obsahují živé mikrobiální kmeny, což umožňuje jejich zařazení pouze mezi léčiva. Vzhledem ke složitému registračnímu procesu ovšem není doposud na trhu jediný přípravek tohoto druhu, tyto přípravky jsou pouze ve stádiu klinických zkoušek (a tedy nedostupné pro většinu postižené populace). Použití autologních kmenů přenesených na postižená místa autologní transplantací může být též problematické, protože kmeny v přirozených isolátech nemusí mít očekávané látky a účinky (Garcia-Gomez a spol. 2017).
Podstata technického řešení
Výše uvedené nedostatky částečně nebo úplně odstraňuje přípravek podle předloženého technického řešení, kdy jsou oproti předcházejícím řešením zejména nově uplatněny poznatky a principy získané přihlašovateli během výzkumu a praktického ověřování technického řešení.
Jako nej důležitější nový princip vystupuje v předkládaném technickém řešení několikastupňový návrh řešení problémů vyskytujících se na kůži náchylných jedinců, kdy je potřeba nejdříve kůži důkladně očistit a zbavit ji patogenů ukrytých v obtížně dostupných biofilmech před tím, než je provedena modulace zánětu způsobeného rozbouřeným imunitním systémem a jeho postupné uklidnění spojené s účinnou eliminací patogenů uvolněných z biofilmových deposit. Teprve po vyčištění kůže, eliminaci patogenů, zklidnění imunitního systému a zejména též normalizaci mikrobiální nerovnováhy a nastolení normálního složení kožní mikroflóry jsou aplikovány látky způsobující dlouhodobé posílení biologické komponenty kožní bariéry. Látky ve formě mikrobiálních extraktů, lyzátů nebo částečně puntíkovaných směsí jsou získány zejména z komensálních kožních a z půdních mikroorganismů, včetně takových vyskytujících se na kůži moderního člověka pouze sporadicky. Toto mnohastupňové řešení je možno si představit jako sérii po sobě následujících vln, kdy následná aplikace plynule navazuje na předcházející aplikaci a tímto způsobem umožňuje potřebné snížení koncentrace jedné vlny účinných látek a postupné zvýšení koncentrace jiných látek vlny následující. Počet a časování jednotlivých vln byl přihlašovatelem neustále zdokonalován až do podoby systému čtyř vln s následnou aplikací dalších prostředků dlouhodobé stabilizace mikrobiomu kůže s použitím vhodných výživných
-2CZ 32750 U1 a podpůrných látek a prebiotik.
Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle předloženého technického řešení tedy obsahuje čtyři stupně přípravku, které se užijí postupně, přičemž první stupeň přípravku obsahuje účinné látky schopné rozrušit biofilmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačit viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů, druhý stupeň přípravku obsahuje účinné látky schopné uklidnit zánět způsobený rozbouřeným imunitním systémem a obnovit účinnou biologickou bariéru, třetí stupeň přípravku obsahuje účinné látky schopné dosáhnout obnovy normální fyziologické mikroflóry porušené dysbiosou, a čtvrtý stupeň přípravku obsahuje alespoň jednu účinnou látku podílející se na dlouhodobé nespecifické ochraně a přispívající k posílení náležité lyzikálně-chemické bariéry kůže a její výživě.
Řešení uváděná ve stavu techniky jsou založená převážně na aplikaci živých (viabilních) mikroorganismů včetně jejich kolonizace a následného sledování na jednotlivých místech aplikace. Takový postup je ovšem náročný zejména z pohledu registračních a regulačních řízení: živé mikroorganismy samozřejmě ovlivňují fyziologické a imunologické procesy na kůži a regulačně se tedy jedná o léčivé přípravky s živými mikroorganismy. Regulačně je tato kategorie jedna z nejnáročnějších a ke dni podání přihlášky tohoto technického řešení neexistuje na trhu jediný přípravek tohoto druhu. Do pozdních fází klinických zkoušek se zatím dostalo jen několik takových přípravků. Z praktického pohledu znamená tento problém významné zpoždění na cestě k jednotlivým uživatelům. Naopak řešení navrhované v předkládaném technickém řešení je založené na použití mikrobiálních extraktů bez obsahu živých mikroorganismů, které je možno použít jako komponenty kosmetických přípravků pro posílení kožní bariéry bez významných regulačních omezení (příslušné extrakty jsou v kosmetické regulativě označené názvem příslušného původového mikroorganismu a přídavkem “ferment ”).
Účinné látky pro první stupeň několikastupňového přípravku obsahují jako aktivní komponenty zejména směsi hydrolytických enzymů s proteolytickými a glykohydrolytickými aktivitami, kdy toto složení je dáno známým složením patogenních biofilmů skládajících se ze směsi mikroorganismů spojených vzájemně adhezivními proteiny a kryjící se polysacharidovým filmem podobným svoji strukturou celofánu (tento film je tvořen zejména B-l,3-glukanem odpovídajícím svoji strukturou polysacharidu laminarinu, dále celulosou a chitinem). Kožní komensální mikroorganismy jsou podle publikovaných literárních dat schopné do určité míry rozrušit patogenní biofilmy tvořené kožními patogeny, přičemž tuto schopnost mají zejména proteinázy a v menší míře laminarinázy sekretované těmito mikroorganismy. Aktivní látky pro první stupeň přípravku lze získat z kožních komensálních mikroorganismů, konkrétně z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacteriiim a Proteobacterium. Pro předkládané technické řešení byly cílové enzymové aktivity získány zejména z mikroorganismu S. epidermidis.
Pro zvýšení účinnosti bylo spektrum potřebných enzymových aktivit doplněno o hydrolázy nedostatečně zastoupené u komensálních mikroorganismů (celulázy, chitinázy). Vhodným zdrojem potřebných enzymů mohou být půdní bakterie rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas aMycobacterium, jejichž extrakty jsou komerčně dostupné. Pro předkládané technické řešení byly cílové enzymové aktivity získány zejména z mikroorganismu Pythium nunn (dále P. nunn), který je v literatuře popsaný společně s Trichodermou jako hojný zdroj těchto enzymů (3). Pro praktickou aplikaci v kosmetických přípravcích se jako kritické jevilo získání homogenních šarží enzymových preparátů a tento úkol byl přihlašovateli úspěšně vyřešen, jak je detailně uvedeno v příkladu 1. Dávkování enzymových aktivit ve finálním přípravku pro první stupeň vycházelo jednak z publikovaných poznatků v enzymových terapiích, jednak z našich vlastních laboratorních dat rozrušení biofilmů uvedených v příkladu 4. Účinné látky pro první stupeň přípravku tedy jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacterium a Proteobacterium a půdních mikroorganismů vybraných z mikroorganismů rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium, výhodně z rodu Staphylococcus
-3 CZ 32750 U1 a Pythium, nej výhodněji z mikroorganismů Staphylococcus epidermidis ά Pythium nunn. Účinné látky pro první stupeň zahrnují proteinázy, laminarinázy, celulázy a chitinázy.
Pokud jde o účinné látky pro druhý stupeň až čtvrtý stupeň, tyto látky byly v posledních letech identifikovány buď naším empirickým zkoušením, nebo jsou publikovány ve vědeckých studiích uvedených ve stavu techniky. Dobrá antimikrobiální aktivita a schopnost rozrušovat biofilmy byla prokázána laboratorními testy popsanými v příkladu 4. Testy byly důležité pro určení ředicích poměrů účinných látek pro jejich přidání do finálních přípravků a přinesly též některé překvapivé poznatky, zejména z hlediska schopnosti snižovat viabilitu mikroorganismů uvolněných z biofilmů (kombinovaný efekt rozrušení biofilmů a zabití patogenů). Účinné látky pro druhý stupeň přípravku jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacterium a Proteobacterium, výhodně rodu Staphylococcus, nejvýhodněji Staphylococcus epidermidis. Účinné látky pro druhý stupeň zahrnují kyselinu lipoteichoovou, antimikrobiální peptidy SH-lantibiotikového typu, antimikrobiální peptid γ-modulin a Esp proteinázu.
Účinné látky pro třetí stupeň přípravku jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z půdních bakterií vybraných z mikroorganismů rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium, výhodně rodu Nitrosomonas a nej výhodněji Nitrosomonas europea. Účinné látky pro třetí stupeň zahrnují jak nízkomolekulámí látky, tak i proteiny, zejména proteiny obsahující membránový komplex oxidující močovinu a produkující oxid dusnatý.
Účinné látky pro čtvrtý stupeň jsou látky, které přispívají k hydrataci a regeneraci kůže a stabilizaci kožní mikroflóry a mohou být vybrány z následujících látek: xylitol, famesol, L-arginin, světlicový olej, pupalkový olej, konopný olej, řepkový olej, olej z pšeničných klíčků, laktát, glycin, fruktosa, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý. Alespoň jedna z těchto látek může být také přítomna ve formulacích pro kterýkoliv z prvního až třetího stupně vícestupňového přípravku.
Výše uvedené účinné látky je možné formulovat do přípravků, výhodně ve formě pleťového mléka, krému, gelu nebo pěny, a v případě léčivých přípravků ve formě kožní emulze, krému, kožní pěny nebo gelu. Výhodné formy jsou pleťové mléko a kožní emulze, které mohou být případně i ve formě spreje.
Výsledný přípravek, resp. každý stupeň vícestupňového přípravku, obsahuje účinné množství příslušných výše uvedených účinných látek. Účinné množství odborník stanoví na základě testů popsaných v předkládané přihlášce nebo testů, které jsou odborníkům všeobecně známé. Výhodná účinná množství jsou uvedena v příkladech provedení technického řešení.
Za standardní aplikační dávku kožní emulze nebo pleťového mléka lze považovat dávku o objemu 1 až 5 ml, výhodně 3 ml. Aplikační dávka může být výhodně definována dávkovači pumpičkou, která může být součástí obchodního balení.
Obchodní balení vícestupňového přípravku může obsahovat pro každý stupeň samostatné balení o objemu např. 30 ml, 75 ml, 150 ml, 300 ml, 400 ml nebo 500 ml. Maloobjemová balení (30 ml, 75 ml, 150 ml) mohou být výhodně ve formě tuby, velkoobjemová (300 až 500 ml) ve formě lahvičky s dávkovači pumpičkou. Jiným výhodným balením je rozprašovač (sprej).
Uvedení připravených účinných látek do prostředí přípravku (kosmetického a/nebo léčivého) ve formě olejové emulze (kožní emulze, pleťového mléka) se ukázalo jako poměrně obtížné. Poměrně dlouhý proces zkoušení vedl nakonec k získání směsí s dostatečnou kompatibilitou a dlouhodobou stabilitou vhodné pro kosmetické aplikace. Finální optimalizovaná kompozice obsahovala vodu jako solvent, triethylamonium acetát jako pufrující komponentu poskytující optimální pH kůže kolem 4,7 až 4,8, glyceryl stearát jako emulgátor a polyakrylát crosspolymer 6
-4CZ 32750 U1 a xanthanovou gumu jako regulátory viskozity. Stanovená stabilita této kompozice v přítomnosti aktivních komponent činila více než 12 měsíců, z čehož byla odvozena i stabilita příslušného kosmetického přípravku. Během uvádění účinných látek do prostředí kosmetického přípravku byla překvapivým způsobem zjištěna významná stabilizace použitých enzymových aktivit v prostředí olejové emulze, kdy byly jak hodnoty změřených enzymových aktivit, tak i dlouhodobé stability až dvojnásobné.
V počátečních experimentech praktického testování byla ověřena účinnost formulovaných kosmetických přípravků na cílových skupinách uživatelů. Vzhledem k tomu, že se jednalo o kompozice plánované pro uvedení na trh zejména jako kosmetické přípravky, nebylo úplné odstranění zdravotního problému požadováno (a také k němu vždy nedošlo). Nicméně, ve všech aplikacích byly přípravky hodnoceny uživateli pozitivně i oproti mnoha alternativním přípravkům na trhu, kdy bylo oceňováno zejména úplné nebo částečné zlepšení visuálního vzhledu poškozené kůže, zklidnění situace na místech aplikace z hlediska svědění a jiných nežádoucích jevů a pozitivní účinek vůči některým skupinám mikroorganismů (stalýlokoky, plísně). Zcela originálním poznatkem potom je použití u popálenin a mechanických zranění kůže, kde se může uplatňovat jak efekt čištění, tak i stimulace růstu při obnově nové kůže.
Přípravek podle předloženého technického řešení obsahující čtyři stupně se výhodně aplikuje tak, že jednotlivé stupně se aplikují postupně ve čtyřech obdobích, přičemž v prvním období se aplikuje první stupeň přípravku, ve druhém období se aplikuje druhý stupeň přípravku, ve třetím období se aplikuje třetí stupeň přípravku a ve čtvrtém období se aplikuje čtvrtý stupeň přípravku, přičemž každé z prvního, druhého a třetího období trvá jeden až dva týdny a čtvrté období trvá jeden až šest týdnů. Přitom aplikace je prováděna alespoň jednou denně, výhodně ráno a večer, pomocí rozstřiku nebo rozetřením příslušného stupně přípravku na postižená místa a případně i jejich okolí, nebo v případě výskytu velmi citlivých ložisek se aplikuje pouze do okolí těchto ložisek.
Objasnění výkresů
Technické řešení je dále podrobně popsáno na příkladných provedeních a blíže osvětleno na připojených schématických výkresech:
Obr. 1 Způsob přípravy a reprodukovatelnost přípravy účinných látek pro fázi čištění a disrupce (první stupeň), přičemž podrobněji ukazuje obr. 1A analýzu jednotlivých šarží proteinů sekretovaných bakterií S. epidermidis kmene ATCC 12228 po jejich koncentraci a převedení do konzervačního pufiru pro uvedení do kosmetického přípravku, kdy ve drahách 1 a 10 jsou umístěny molekulové standardy ave drahách 2 až 9 potom osm jednotlivých popisovaných šarží, obr. 1B analýzu jednotlivých šarží proteinů sekretovaných půdním mikroorganismem P. nunn kmene CBS 808.96 po jejich koncentraci a převedení do konzervačního pufiru pro uvedení do kosmetického přípravku, kdy ve drahách 1 a 10 jsou umístěny molekulové standardy a ve drahách 2 až 9 potom osm jednotlivých šarží.
Obr. 2 Způsob přípravy a průkaz přítomnosti a koncentrace jednotlivých účinných látek pro fázi zklidnění imunitního systému (druhý stupeň), přičemž podrobněji ukazuje obr. 2A celkové schéma firakcionace lyzátů bakterií S. epidermidis kmene ATCC_12228 založené na vysolování síranem amonným, přičemž jsou poté rozpustné látky v supernatantu po centrifůgaci (“sup.”) dále děleny chromatografií na sloupci fenyl-Sepharosy HR, zatímco látky nacházející se v sedimentu po centrifůgaci (“sed.”) jsou dále děleny chromatografií na sloupci octadecylsilikagelu. Jednotlivé frakce získané po těchto chromatograflích jsou
-5 CZ 32750 U1 uvedeny zkratkou “F”, obr. 2B až 2E elektroforetickou a imunochemickou analýzu separovaných látek metodou elektroforesy ve 20 % polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), přičemž na obr. 2B a obr. 2C jsou analyzovány látky v supematantu a na obr. 2C potom specificky kyseliny lipoteichoová (LTA, lipoteichoic acid) a na obr. 2D a 2E látky v sedimentu, specificky potom na obr. 2E peptidy typu lantibiotik. Přibližná molekulární velikost látek separovaných na gelu je indikována pomocí molekulového markéru ukázaného vždy v pravé části obrázku. Prošlé frakce F1 a F2 z RPLC18 chromatografie bylo třeba též analyzovat na 12 % gelu a zóna odpovídající Esp proteinase je vyznačena.
Obr. 3 Laboratorní testy antimikrobiální účinnosti připravených aktivních látek vůči kritickým patogenům na kůži a sliznicích s tím, že podrobněji ukazuje obr. 3A diskový test účinnosti připravených antimikrobiálních látek vůči patogenní bakterii S. aureus kmene ATCC 6538, s tím, že na disky byly postupně aplikovány následující látky: v prvé, horní řadě SEF2K1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x, ve druhé řadě SELY ředěný 102x, 103x, 104x a 105x, ve třetí řadě NIE1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x a v poslední řadě tetracyklin o koncentraci 0,5 pg/nil, 1 pg/nil, 2 pg/ml a 4 pg/nil, obr. 3B kvantitativní MIC (minimum inhibitory concentration) test prováděný pro čtyři různé šarže SEF2 (vzorky 1 až 4), čtyři různé šarže SELY (vzorky 2 až 5) a čtyři různé šarže směsi rozpustných proteinů směsi průmyslových bakterií s obsahem bakterie rodu Nitrosomonas označené NIE1, NIE2, NIE3 a NIE4, obr. 3C a 3D diskový test účinnosti připravených látek vůči patogenní kvasince Candida albicans kmene ATCC 10231, přičemž Petriho miska na obr. 3C byla inkubována 24 h při 30 °C a Petriho miska na obr. 3D byla inkubována při této teplotě 48 h. Na disky byly postupně aplikovány následující látky: v prvé, horní řadě SEF2K1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x, ve druhé řadě SELY ředěný 102x, 103x, 104x a 105x, ve třetí řadě NIE1 ředěný lOx, 102x, 103x a 104x a v poslední řadě enilkonazol (chemická látka potlačující plísně a kvasinky) v koncentraci 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml a 8 mg/ml.
Obr. 4 Laboratorní test rozrušení biofilmu tvořeného patogenní bakterií S. aureus kmene ATCC_6538 s tím, že podrobněji ukazuje obr. 4A příklad mikrotitrační destičky po inkubaci s látkami po dobu 24 hodin, promytí a detekci nerozrušeného biofilmu krystalovou violetí s tím, že jednotlivé experimenty byly prováděny v kvadruplikátu ve čtvercovém uspořádání vždy na čtyřech sousedních jamkách, obr. 4B ukazuje průměrné hodnoty kvadruplikátních vyšetření, kdy byla tvorba biofilmů měřena pouze v konzervačním pufiru (K) nebo v konzervačním pufiru obsahujícím PNF1K1 (PN) nebo v konzervačním pufru obsahujícím SEF2K1 (SE) nebo v konzervačním pufiru obsahujícím SELY (LY), nebo v konzervačním pufiru obsahujícím různé indikované kombinace výše uvedených látek (experiment PNSELY a PNSE), přičemž výše uvedené látky byly testovány jednak v neředěné podobě (lx), jednak v podobě roztoků sériově ředěných médiem pro tvorbu biofilmů (lOx, lOOx, lOOOx), obr. 4C s identickými daty jako na obr. 4B, pouze vyjádřené jako % inhibice tvorby biofilmu vypočtené podle vzorce: % inhibice = (A595 pro neznámý vzorek - A595 pozadí) / (A595 pro kontrolu - A595 pro pozadí) x 100, obr. 4D ukazuje viabilitu ve vzorcích bakterie S. aureus kmene ATCC_6538 stanovenou kultivačně (CFU, kolonie tvořící jednotky) ve vzorcích supematantu po inkubaci s jednotlivými látkami odebraného před promývacím krokem.
-6CZ 32750 U1
Obr. 5. Průběh aplikace u pacienta (muž, 29 let) s celoživotním atopickým ekzémem v posledních letech lokalizovaným do oblasti kotníku. Na fotografiích je znázorněn stav před aplikací přípravku (panely A a B) a po skončení 4 týdnů aplikace se čtyřstupňovým přípravkem (panely C a D). Stav po aplikaci byl charakterizován jako významné zklidnění.
Obr. 6. Průběh aplikace u 22 let staré ženy s atopickým ekzémem na ruce a předloktí. Na fotografiích je znázorněn stav před aplikací přípravku (panely A a B) a po skončení 4 týdnů aplikace se čtyřstupňovým přípravkem (panely C a D). Stav po aplikaci byl charakterizován jako mírné zlepšení s významným zklidněním, přičemž ustalo pálení a svědění.
Obr. 7 Průběh aplikace u 74 let staré ženy s dlouhodobými problémy s plísňovými a kvasinkovými infekcemi na chodidlech a nártu. Na fotografiích je znázorněn stav před aplikací přípravku (panely A a B) a po skončení dvou týdnů aplikace zahrnujících první a druhý stupeň (panely C a D). Stav po aplikaci byl charakterizován jako významné zlepšení v situaci, kdy se dlouhodobě nedařilo situaci zlepšit pomocí standardní léčby.
Obr. 8 Průběh aplikace samotného přípravku pro první stupeň na popáleninu ruky u 58-letého muže. Přípravek ve formě pleťového mléka byl aplikován dvakrát denně ráno a večer na prsteník obsahující rozsáhlejší a hlubší popáleninu, zatímco sousední prostředník s významně mírnějším popálením byl použit jako kontrolní plocha znázorňující postup hojení bez jakéhokoliv ošetření. Fotografie ukazují stav před aplikací (obr. 8a) a poté 3 dni, 7 dní a 12 dní po zahájení aplikací (obr. 8b, 8c a 8d) s použitím jen přípravku pro první stupeň. Stav po aplikaci uváděn jako dokonalé vyhojení kůže bez jizev nebo změny pigmentace.
Příklady uskutečnění technického řešení
Podstata technického řešení je dále demonstrována pomocí příkladných řešení popisujících a ukazujících způsob biotechnologické výroby potřebných účinných látek, laboratorní testování jejich antimikrobiálních účinků na kritické patogeny na kůži a sliznicích a konečně příklady praktických aplikací pro řešení některých vybraných problémů poškozené kůže. Pomocí příkladných provedení je demonstrována povaha, podstata a praktické ověření technického řešení, které však není těmito příkladnými provedeními omezováno. Tato příkladná provedení jsou uvedena, aby popis byl důkladný a úplný a plně zprostředkoval podstatu technického řešení v rozsahu nároků na ochranu.
Provedení příkladných řešení je založeno na metodách běžných v oboru řešení. Pro kultivaci použitých mikroorganismů byla použita jednak běžná média doporučená poskytovatelem jednotlivých mikroorganismů, byla však též odzkoušena nová originální média vyhovující specifickým požadavkům některých kultivací. Kultivace mikroorganismů sloužících jako zdroj účinných látek byla prováděna jak v laboratorních třepačkách, tak i za vysoce kontrolovaných podmínek s využitím 2 paralelních laboratorních fermentorů o objemu 5 1. Mikroorganismy byly separovány od fermentačního média v průtokové centrifuze a biomasa byla použita jako zdroj látek bakteriálního lyzátu. Médium bylo koncentrováno diafiltrací na polyestersulfonátových koncentračních membránách s molekulárním vylučovacím limitem 10 kDa. Po zakoncentrování byly rozpustné látky sekretované do média stejným způsobem převedeny do konzervačního pufru o pH 4,7, který obsahoval zejména stabilizátory a konzervanty. Ve směsi proteinů sekretovaných do média byl stanoven protein metodou podle Bradforda, aktivita proteináz azokaseinovou metodou a aktivita glykohydroláz stanovením množství redukujících sacharidů po inkubaci s příslušným polysacharidovým substrátem. Jedna enzymová jednotka byla definována jako množství enzymu schopné rozštěpit 1 nmol substrátu za minutu za daných experimentálních podmínek. Tato enzymová jednotka odpovídá jedné tisícině mezinárodní enzymové jednotky (U). Bakteriální biomasa po kultivaci S. epidermidis byla lyžována opakovanou sonikací do konzervačního média obsahujícího detergenty se sacharidovou hydrofilní komponentou
-7 CZ 32750 U1 a vysokou hodnotou kritické micelámí koncentrace: methyl-6-O-(N-heptylkarbamoyl)-a-D-glukosid, N-oktanoyl- N-methylglukamin a 2-cyklohexylethyl-3-D-maltosid. Extrahované komponenty byly dále frakcionovány vysolováním síranem amonným do 75 % koncentrace a následnou separací pomocí hydrofobní chromatografie na fenyl-Sepharose a oktadecylsilikagelu. Pro stanovení antimikrobiální účinnosti vůči klíčovým patogenům na kůži a sliznicích byly použity laboratorní testy jako je diskový test, test minimální inhibiční koncentrace (MIC, cit. 8) a test tvorby biofilmu na mikrotitračních destičkách (cit. 16).
Praktické testování přípravků bylo provedeno u jedinců se symptomy a problémy souvisejícími s porušením kožní bariéry a mikrobiální nerovnováhou. Jednalo se zejména o atopickou dermatitidu (atopický ekzém), kožní infekce způsobené bakterií S. aureus, kožní infekce způsobované plísněmi a kvasinkami a též jiná poškození kůže bez přímého napojení na mikrobiální rovnováhy, například popáleniny. Veškeré testy proběhly na základě podepsaného informovaného souhlasu s tím, že účastníkům testu byl k dispozici kromě testovacího přípravku též návod k použití tohoto přípravku a dále aplikační protokol sloužící pro vedení pacienta během studie a zapisování získaných výsledků. Veškeré údaje získané během studie jsou anonymní, identita testujících osob nebyla přihlašovateli vyjevena. Výsledky studie ve formě dotazníků vyplněných uživateli a poskytnuté fotodokumentace jsou uchovány v bezpečném úložišti na pracovišti přihlašovatele a budou použity výlučně pro potřeby přihlašovatele.
Příklad 1
Příprava účinných látek potřebných pro první stupeň přípravku rozrušujících biofilmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačujících viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů
V případě mikroorganismu S. epidermidis nebylo bohaté médium tryptone soya broth optimální zejména z pohledu nedefinovaného složení a přítomnosti nežádoucích nespecifických enzymových aktivit. Z tohoto důvodu bylo odzkoušeno dosti komplexní plně syntetické medium obsahující běžné živiny společně s koktejlem minerálů a vitamínů doporučovaným pro tuto bakterii. V případě mikroorganismu P. nunn byla potom modifikace vynucena zejména zařazením požadovaných induktorů cílových enzymových aktivit, tj. peptidů a oligosacharidových fragmentů polysacharidů mikrobiálních buněčných stěn. Zatímco laminarin (induktor laminarinázy, endo-β-1,3-glukosidasy) a methylcelulosa (induktor celulázy, cndo-β-1,4-glul<osidasy) jsou v literatuře pro tyto účely běžně zmiňované a používané, v případě induktoru chitinázy nebylo možné použít běžný polysacharid chitin nerozpustný ve vodě, ale bylo třeba provést jeho kyselou hydrolýzu na oligomery A-acetyl-D-glukosaminu. Tento postup pro účely fermentace vyhovoval, neboť materiál sloužící jako zdroj chitinu ve formě hrubě rozemletých skořápek krevet obsahoval též poměrně vysoká množství proteinů téhož původu. Směs peptidů achitinových oligomerů po kyselé hydrolýze tohoto materiálu proto dobře posloužila jak pro indukci chitináz a proteináz, tak jako zdroj dusíkatých živin. Po skončení fermentace bylo vyčeřené medium získáno průtokem fermentačni směsi průtokovou centrifugou, zatímco sedimentované mikroorganismy byly získány na fólii vložené do válce průtokové centrifugy. Celkem byly pro komensálni kožní bakterii provedeny čtyři fermentace v 5 1 fermentoru, a následně bylo zpracováno 20 1 fermentačni směsi ve formě osmi šarží. Čiré medium po centrifugaci v průtokové centrifuze bylo okyseleno na pH 4,7 kyselinou octovou, byly do něj přidány konzervanty a po sterilní filtraci bylo medium zamraženo. Vždy 2,5 1 tohoto materiálu bylo po rozmražení koncentrováno metodou filtrace v tangenciálním toku s použitím zařízeni Minimate TFF a kazety s polyestersulfonátovou membránou s vylučovacím limitem 10 kDa (obojí od firmy PALL lne.) na celkový objem cca 100 ml, tj. asi 25x. Téže metody bylo také použito k převedení do konzervačního pufru pomocí opakovaných cyklů naředěni a zpětného koncentrování. Finální směs proteinů o koncentraci cca 1 mg/ml byla sterilně filtrována (filtry Coming s membránou 0,22 mm) a uložena při -20 °C v mrazáku až do dalšího použití. Reprodukovatelnost složení jednotlivých šarží sekreto váných proteinů komensálni bakterie S. epidermidis byla potvrzena metodou SDS elektroforesy s detekcí stříbrným
-8CZ 32750 U1 komplexem. Byl potvrzen identický proteinový profil s výjimkou šarže č. 4 (SEF2K4) (Obr. 1A), která byla z dalšího postupu vyřazena. Sekretované proteiny půdního mikroorganismu P. nunn ve formě 8 šarží (Obr. 1B) byly získány identickým postupem. V získaných proteinových extraktech byla změřena koncentrace proteinu, a dále byly změřeny enzymové aktivity hydrolytických enzymů proteináz, laminarináz, celuláz a chitináz. Souhrnné výsledky ukázaly v těchto sledovaných parametrech dobrou reprodukovatelnost s relativní odchylkou v intervalu 10 až 20 % pro hodnoty specifických enzymových aktivit a výtěžků až 30 % pro hodnoty stanovení proteinu. Pro první stupeň několikastupňového přípravku se sledují hodnoty proteinu a enzymových aktivit ve finálním aplikačním přípravku, které dosahují hodnot: 15 pg/ml proteinu, 0,23 mU/ml proteináz, 0,56 mU/ml laminarináz, 0,27 mU/ml celuláz a 0,47 mU/ml chitináz.
Příklad 2
Příprava účinných látek potřebných pro druhý stupeň přípravku uklidňujících zánět a obnovujících účinnou biologickou bariéru kůže
V počátečních zkouškách byl do olejové emulze pro druhý stupeň zahrnut hrubý detergentový extrakt bakteriálních buněk S. epidermidis kmene ATCC_12228 a hrubý γ-modulin (modifikovaný N-terminální formylací) z peptidové syntézy. Nicméně tato prvá kompozice způsobovala nežádoucí reakce na jemné kůži jedinců s atopickým ekzémem a bylo žádoucí ji dále upravit. Purifikace jednotlivých komponent byla provedena podle schématu na Obr. 2A zahrnujícího srážení detergentového extraktu síranem amonným do koncentrace 3 mol/1 (75 % nasycení) a následné zpracování nevysráženého podílu i sraženiny separátním postupem zahrnujícím kolonovou chromatografii na vhodných nosičích s obrácenou fází: fenyl-Sepharosou a oktadecylsilikagelem. Nesražený podíl byl filtrován a přímo v 3 mol/1 síranu amonném nanesen na kolonu fenyl-Sepharosy (1,6x11 cm, 22 ml) ekvilibrovanou ve 3 mol/1 síranu amonném v prostředí 0,05 mol/1 sodno acetátového pufru pH 4,7. Po aplikaci vzorku byla kolona tímto pufrem promyta a následovala eluce samotným acetátovým pufirem. Na konci chromatografie byla kolona promyta 80 % ethanolem v acetátovém pufru. Sraženina ze síranového srážení byla rozpuštěna v acetátovém pufru a nastavena na koncentraci síranu amonného 1 mol/1 a po centrifůgací a filtraci byla takto upravená sraženina nanesena na kolonu oktadecylsilikagelu (velikost částic 60 až 130 pm, modifikace oktadecylem v rozsahu 20 až 22 % hmotn., 1,6 x 13 cm, 26 ml) ekvilibrovanou v identickém prostředí. Po promytí byla kolona v jednom kroku převedena do výše uvedeného acetátového pufru a poté následovala gradientová eluce ethanolem v rozsahu 0 až 95 % objemu v tomto pufru. Byly odebírány 10 ml frakce a byla provedena analýza na obsah účinných komponent elektroforesou v prostředí 20 % polyakrylamidového gelu s obsahem dodecylsulfátu sodného. Gely byly zpracovány duplicitně s tím, že na jednom gelu byla provedena detekce látek barvením stříbrným komplexem, zatímco látky z druhého gelu byly elektropřenosem převedeny na PVDF membránu (0,2 pm), která byla po blokování odtučněným mlékem inkubována se specifickými protilátkami proti detekovaným komponentám značenými biotinem a imunologická reaktivita byla detekována pomocí streptavidin-peroxidasového komplexu a 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazonu s 4-chloro-l-naphtholem za tvorby hnědočerveného nerozpustného komplexu (Obr. 2B až 2E). Pro detekci Esp proteinasy byl též použit 12 % polyakrylamidový gel z důvodu velikosti této komponenty. Odhad koncentrace jednotlivých aktivních látek byl proveden oproti standardu zpracovanému za identických podmínek. γ-Modulin ve formě hrubého produktu peptidové syntézy s obsahem cílového peptidu cca 75 % byl přečištěn od meziproduktů syntézy a činidel chromatografii na fenyl-Sepharose podle publikované metodiky (16) a jeho koncentrace byla stanovena spektrofotometricky s použitím teoreticky předpovězeného molámího absorpčního koeficientu (nástroj ProtParam na web.expasy.org). Koncentrace Esp proteinasy byla odhadnuta přímo z intenzity signálu na gelu. Pro aplikaci ve druhém stupni byl připraven ze 4 účinných látek tisícinásobný koncentrát oproti optimálním aplikačním koncentracím zjištěným z vědecké literatury uvedené ve stavu techniky. Pro druhý stupeň finální přípravek obsahoval směs látek
-9CZ 32750 U1 obsahující 10 pg/ml lipoteichoové kyseliny bakterie S. epidermidis, 5 pg/ml specifické serinové proteinasy Esp bakterie S. epidermidis, 12 pg/ml SH-lantibiotických peptidů baktérie
S. epidermidis a 38 pg/ml γ-modulinu bakterie S. epidermidis. Reprodukovatelnost přípravy jednotlivých šarží byla z hlediska obsahu výše uvedených látek dostačující (s relativní odchylkou do 10 %).
Příklad 3
Příprava účinných látek potřebných pro třetí stupeň přípravku působících obnovení normální fyziologické mikroflóry
Výchozí materiál pro bakteriální extrakt sestával z mikrobiální komunity charakteristické pro čističky vod a byl laskavě poskytnut na Centru aplikovaného výzkumu Dobříš (CAVD) Mgr. Jakubem Hejnicem PhD a Ing. Pavlem Píchou PhD z Ústavu technologie vody a prostředí Vysoké školy chemicko-technologické (VSCHT) Praha. Obsah bakterií rodu Nitrosomonas extenzivně odstraněných z mikrobiomu lidské kůže v důsledku používání mýdel a detergentů (www.aobiome.com) byl odhadnut na 25 až 30 %. Membránový komplex obsahující asi 50 % buněčného proteinu a 90 % ubiquinonu a cytochrome c oxidasy byl isolován popsaným postupem (8) zahrnujícím opakované zmražení a rozmražení následované centrifůgací při 20000 x gav po dobu 20 min. Čirý supernatant byl odlit a membránový complex několikrát promyt, centrifůgován při 3000 x gav 20 min a resuspendován na koncentraci 5 mg/ml. Nízkomolekulámí látky obsažené s supematantu po prvé centrifůgaci byly purifikovány na koloně oktadecylsilikagelu stejně jako v příkladu provedení č. 2. Frakce eluovaná z kolony 30% ethanolem byla opatrně odpařena a získaný materiál byl přidán do membránové frakce do finální koncentrace 15 mg/ml. Postup extrakce byl opakován celkem čtyřikrát a byly tak získány extrakty NIE1, NIE2, NIE3 a NIE4. Na specializovaném pracovišti VŠCHT Praha byla též potvrzena schopnost získaných extraktů rozkládat močovinu vylučovanou lidskou kůží na amoniak a dále na oxidy dusíku, jmenovitě oxid dusnatý. Extrakty byly přidány do přípravku pro třetí stupeň po jejich stonásobném naředění ve finální sumární koncentraci 20 pg/inl.
Příklad 4
Výběr látek zajišťujících výživu kůže a další propagaci a stabilizaci normální mikroflóry ve čtvrtém stupni přípravku
Před přípravou finálních formulací se jevilo jako vhodné vyzkoušet různé formulace látek uváděných v literatuře jako vhodné komponenty pro výživu kůže a další propagaci a stabilizaci normální mikroflóry, respektive potlačení kožních patogenů. Z tohoto důvodu byla provedena rychlá optimalizace různých kompozic obsahujících sloučeniny jako je xylitol, famesol, L-arginin, světlicový olej, pupalkový olej, konopný olej, řepkový olej, olej z pšeničných klíčků, laktát, glycin, fruktosa, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý. Po provedení testů antimikrobiální a biofilmy rozrušující aktivity, jak je uvedeno v příkladech provedení č. 6 a 7, a za současného zhodnocení dostupnosti těchto sloučenin v kosmetické kvalitě a jejich ceny bylo rozhodnuto farnesol a světlicový olej do základu pleťového mléka nepřidávat a ostatní výše zmíněné sloučeniny potom zahrnout v následujících koncentracích (uváděno v pořadí snižujícího se obsahu): xylitol 6 % hmota., konopný olej 5 % hmota., řepkový olej 5 % hmota., L-arginin 1 % hmota., pupalkový olej 1 % hmota., olej z pšeničných klíčků 1 % hmotn. U minoritních komponent jako je laktát, glycin, fruktosa, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý se jejich přidání do 0,1 % hmotnosti ukázalo jako dostatečné.
- 10CZ 32750 U1
Příklad 5
Příklady vhodných kosmetických kompozic kompatibilních s účinnými látkami a výsledky testů stability.
Pro zajištění kompatibility a dlouhodobé stability po dobu nejméně jednoho roku byly zkoušeny různé kompozice (olejové emulze) jako základ pleťového mléka nebo kožní emulze. U jednoduchých olejových emulzí se objevily problémy s mikrobiologickou čistotou, resp. kontaminací i přes přidané konzervanty. U emulze komplexnějšího složení byla použita i vyšší koncentrace konzervačních látek. U této emulze se již problémy s mikrobiální kontaminací neobjevily a po přidání účinných látek se směs jevila stabilní po dobu 3 měsíců při doporučené teplotě skladování (15 až 25 °C). Poté však docházelo k viditelnému krémování (separace olejových látek ve vrchní vrstvě). Proto byla zkoušena ještě složitější kompozice obsahující mj. nové emulgátory a další pomocné látky. Výsledky s touto kompozicí byly již velmi dobré a dlouhodobá stabilita byla až po dobu 9 měsíců, problémem této kompozice však byla vysoká viskozita bránící účinné aplikaci. Finální olejová emulze (viz dále) vykazovala všechny vlastnosti nutné pro správnou a uživatelsky příjemnou aplikaci a současně stabilitu lepší než 12 měsíců (1 rok) za doporučených podmínek skladování (15 až 25 °C). Tato kompozice byla tedy použita pro přípravu všech testovacích přípravků ve všech stupních.
Při přípravě optimalizované testovací emulze se postupovalo standardním způsobem s prudkým mícháním vodné fáze obsahující komponenty rozpustné ve vodě (včetně detergentů) a olejové fáze (včetně emulgátorů) za zvýšené teploty a následným postupným ochlazením za neustálého prudkého míchání (laboratorní, popř. průmyslový mixer s otáčkami min. 10 000 ot/min).
Celkové složení připravené olejové emulze č. 4 dle kosmetického vyjádření tedy je (všechna uváděná čísla jsou procenta hmotnosti): voda 68,9397; xylitol 5,0; konopný (Cannabis sativa) olej 5,0; řepkový (Brassica campestris) olej 5,0; glycerol 4,0; močovina 4,0; glyceryl stearát citrát 2,0; olivový olej 1,0; olej z pšeničných klíčků 1,0; pupalkový (Oonothera biennis) olej 1,0; L-arginin 1; fenoxyethanol 0,9; levandulová silice 0,2; L-arginin 0,2; polyakrylátcrosspolymer-6 0,25; ethylhexylglycerin 0,1; Lactil® 0,1; Sepitonic® 0,1; D,L-a-tokoferol 0,01; a barvivo A12385 (E123) amaranth 0,003.
Praxe obvyklá při výrobě kosmetických nebo léčivých přípravků typu pleťových mlék nebo kožních přípravků vyžadovala, aby komponenty určené pro čtvrtý stupeň poskytující výživu kůži a stabilizující kožní mikroflóru byly přidány již do výše uvedené kompozice. Ta tedy představovala finální složení pro čtvrtý stupeň.
Kompozice pro první stupeň obsahovala v základu tvořeném výše popsanou kompozicí ještě enzymové aktivity přítomné po naředění přidaných mikrobiálních extraktů. Přípravek tak obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce příkladně 0,03 až 0,06 mg proteinu, 0,47 až 0,94 mU proteináz, 1,13 až 2,26 mU laminarináz, 0,53 až 1,06 mU celuláz a 0,93 až 1,86 mU chitináz (U je mezinárodní enzymová jednotka definovaná jako množství enzymu schopné rozštěpit 1 pmol substrátu za minutu).
Pro druhý stupeň bylo v typické 3 ml aplikační dávce přípravku obsaženo 8,0 až 12,0 pg kyseliny lipoteichoové (typ S. epidermidis), 30,0 až 40,0 pg antimikrobiálních peptidů SH-lantibiotikového typu, 16,0 až 20,0 pg antimikrobiálního peptidu γ-modulinu a 13,0 až 21,0 pg Esp proteinasy z S. epidermidis.
Konečně pro třetí stupeň ve 3 ml aplikační dávce pleťového mléka bylo obsaženo 60,0 pg směsi látek z Nitrosomonas, z toho 45,0 pg nízkomolekulámích látek a 15,0 pg proteinového komplexu.
- 11 CZ 32750 U1
Příklad 6
Stanovení antimikrobiálních aktivit v laboratorním testu
Faktické antimikrobiální aktivity a schopnost rozrušovat biofilmy byla pro získané mikrobiální extrakty testována s použitím standardních laboratorních testů, jmenovitě diskového testu na Petriho miskách (diskový test), testu minimální inhibiční koncentrace na mikrotitračních destičkách (MIC test) a testu rozrušení biofilmu s detekcí zbytkového biofilmu pomocí krystalové violeti (biofilmový test). Výsledky rozrušení biofilmů jsou popisovány v následujícím příkladu provedení č. 7.
Prvým testem byla zkouška na schopnost inhibovat růst majoritního kožního patogena baktérie
S. aureus kmene ATCC 6538. Tento kmen je velmi agresivní a je používaný jako standard ve studiích desinfekcí a antiseptických činidel. Nejvýznamnějších účinků bylo dosaženo v diskovém testu pro sekretované proteiny baktérie S. epidermidis ředěné stonásobně, lyzát připravený z těchto bakterií ředěný stonásobně a stonásobně ředěný extrakt průmyslových bakterií z čističek rodu Nitrosomonas (Obr. 3A). Tyto výsledky byly potvrzeny v MIC testu pro různé šarže těchto preparátů, kdy 3 ze 4 šarží sekretovaných proteinů S. epidermidis účinně inhibovaly růst baktérie S. aureus ještě v koncentraci (stanovené jako celkový protein) 0,1 pg/ml (a jedna šarže inhibovala při koncentraci 1 pg/ml). Podobně byl lyzát bakterií S. epidermidis schopen inhibovat růst patogenních bakterií ještě při koncentraci 0,1 pg/ml, čtvrtá šarže též inhibovala růst při koncentraci 1 pg/ml. Naopak inhibiční účinky směsi průmyslových bakterií s obsahem bakterií rodu Nitrosomonas byly asi o dva řády nižší, kdy tri šarže inhibovaly při koncentraci 10 pg/ml a jedna při koncentraci 100 pg/ml (Obr. 3B). Konečně byla antimikrobiální účinnost testována na kvasince Candida albicans, která může nabývat u jedinců s problematickou kůží agresivnější podoby, a kromě infekce dominantním patogenem S. aureus představuje koinfekce agresivní formou kvasinky Candida albicans nejčastější komplikující faktor u těchto jedinců. Byl použit rychle rostoucí agresivní kmen ATCC 10231 používaný při kontrolách sterility a pro testování protiplísňových látek. V případě této kvasinky omezily účinně její růst pouze rozpustné sekretované protein a lyzát z bakterie S. epidermidis, (Obr. 3C a D).
Příklad 7
Stanovení biofilmy rozrušujících aktivit v laboratorním testu
V biofilmovém testu byly zkoušeny schopnosti získaných účinných látek rozrušovat biofilmy tvořené patogenem S. aureus s cílem ověřit publikované výsledky a stanovit potenci těchto látek. Pro tyto experimenty byl použit standardní test rozrušení biofilmu s detekcí krystalovou violetí a vyhodnocení výsledků spektrofotometricky při 595 nm. Z důvodu variability biologických stanovení byl každý experiment nasazován paralelně ve čtyřech jamkách (kvadruplikát), prezentovaná data pak byla průměrem těchto čtyř stanovení (Obr. 4A). Schopnost testovaných účinných látek rozrušit biofilmy byla zkoušena ve čtyřech různých koncentracích, kdy překvapivě nejlepší výsledky poskytovaly látky ředěné lOx a ještě lépe lOOx (Obr. 4B). Při testování kombinací účinných látek se jako optimální v testu rozrušení biofilmů jevila kombinace rozpustných sekretovaných proteinů z bakterie S. epidermidis a půdního mikroorganismu P. nunn (označeno PNSE, Obr. 4B a Obr. 4C). Dalším významným laboratorním parametrem je viabilita patogenních mikroorganismů uvolněných z biofilmů: pokud zůstávají takto uvolněné bakterie viabilní, hrozí na místě aplikace nebezpečí rekolonizace i tvorby nových biofilmů po ukončení aplikace. Proto byly bakterie po 24 hodinové inkubaci před promytím a detekcí destičky odebrány a byla kultivačně testována jejich viabilita. Tento experiment jasně prokázal, že použité mikrobiální extrakty mají schopnost nejen biofilm rozrušit, ale i zabít (či alespoň významně snížit viabilitu) uvolněných patogenních bakterií. Nejlepších účinků opět bylo dosaženo směsí sekretovaných proteinů obou mikroorganismů při ředění lOOx a lOOOx (Obr. 4D).
- 12CZ 32750 U1
Příklad 8
Praktické zkoušky několikastupňových přípravků
Po dokončení výroby čtyřstupňového přípravku ve formě pleťového mléka (každý stupeň formulován do emulze č. 4 z příkladu 5) a získání potřebné Zprávy o bezpečnosti kosmetického přípravku probíhaly praktické studie v několika kolech.
V prvém kole testování byl přípravek aplikován v režimu čtyřtýdenní aplikace (každý stupeň po dobu jednoho týdne ráno a večer) u 10 zdravých jedinců s normální neporušenou kůží. S výjimkou velmi mírného svědění u přípravku pro první stupeň nebyly pozorovány po měsíční aplikaci žádné vedlejší ani nežádoucí reakce. Tyto výsledky společně s výsledky uvedenými ve Zprávě o bezpečnosti ukazovaly na bezpečnost přípravku při jeho aplikaci na zdravou kůži normálních j edinců.
Ve druhém kole byla provedena aplikace u rodinných příslušníků v okruhu známých, u nichž se vyskytly různé problémy kůže, ať již na základě dlouhodobě pozorované náchylnosti k určitým onemocněním (akné, atopický ekzém, růžovka, lupénka) nebo i na základě akutního popálení.
V tomto kole testování šlo o zjištění počáteční reakce v jednotlivých skupinách stejně jako o zjištění možného rozsahu aplikací. Přitom byla učiněna dvě důležitá pozorování: (1) u jedinců s citlivou a podrážděnou kůží se objevila reakce na komponentu druhého stupně, tento problém byl řešen další purifikací extraktu, jak je uvedeno v příkladu 2, (2) počáteční pocit, že přípravek je účinný i pro rychlejší hojení běžných mechanických nebo termických poškození kůže (pořezání, popálení) byl potvrzen nešťastným případem dělníka pracujícího na pracovišti přihlašovatele s rozsáhlou popáleninou ruky, kdy došlo ke zhoršení stavu po propuštění z kliniky popálenin spojeném s lokální sepsí, která nemohla být vyřešena ani podáním antibiotik a hrozila amputace končetiny. Nicméně po dvou týdnech aplikace zahrnující prostředky pro prvý a druhý stupeň došlo k velmi významnému zlepšení stavu a odeznění infekce.
Ve třetím kole bylo na základě počátečních zkušeností, detailního návodu k použití přípravku, aplikačního formuláře (dotazníku) a informovaného souhlasu pacienta přistoupeno k systematickému testování, do kterého byl zařazen čtyřfázový přípravek zahrnující všechny popsané účinné látky.
let starý muž uvedl problémy s výskytem atopického ekzému již od útlého věku, který v posledních letech lokalizoval do oblasti kotníku. Problém nemohl být vyřešen pomocí velkého množství prostředků nabízených na trhu kosmetiky. Čtyřfázový prostředek byl aplikován po dobu 4 týdnů dvakrát denně. Po aplikaci uživatel uvádí významné zlepšení stavu, které bylo možné sledovat i z fotodokumentace (Obr. 5). Subjektivně uživatel uvádí zklidňující působení, i když byla uvedena poměrně dlouhá doba na zasychání a vstřebání (která je zdůvodněna přítomností hydratujících komponent v aplikačním přípravku).
let stará žena trpěla dlouhodobě atopickým ekzémem na rukou, který nemohl být vyřešen pomocí běžných prostředků nabízených na trhu kosmetiky. Uživatelce byl nabídnut čtyřfázový prostředek, fakticky však došlo k aplikaci pouze pro prvý a druhý stupeň v rozsahu jednoho týdne pro každou kompozici. Užívátelka popisuje po dokončení poloviny aplikačního režimu částečné vyřešení problému spojené s významným zklidněním. Částečné zklidnění a menší zmenšení rozsahu afekce je patrné i na poskytnuté fotodokumentaci (Obr. 6).
let stará žena - diabetička s poškozením ledvin závislá na ošetření dialýzou třikrát týdně si stěžovala na dlouhodobé problémy s plísněmi na nohou a zrohovatěním a rozpraskáním kůže v oblasti nártu a plosky. Žena aplikovala čtyřstupňový přípravek po dobu 4 týdnů přesně podle návodu na přípravku. Po měsíční aplikaci byla uživatelka velmi spokojená, neboť se podařilo plísňovou infekci významně omezit a lokalizovat, pacientka uvádí vyřešení problému na 80 % původně zasažené plochy. Poskytnutý výzkumný přípravek se významně odlišoval od řady jiných
- 13 CZ 32750 U1 použitých přípravků a krémů, které neměly žádný účinek nebo bylo pozorováno pouze dočasné zlepšení a po několika dnech se opět stav zhoršil. Poskytnutá dokumentace (Obr. 7) odpovídá subjektivním pocitům uváděným uživatelkou.
let starý muž utrpěl popáleninu na ruce v důsledku nehody v laboratoři, která zasáhla prsteník levé ruky se vznikem hluboké, mokvající popáleniny a prostředník levé ruky s postižením menšího rozsahu (Obr. 8A). Aplikace kosmetického přípravku pouze pro první stupeň (monokompozice) byla prováděna po dobu dvou týdnů na hůře postižený prsteník, prostředník byl ponechán bez aplikace jako kontrola. Po 12 dnech aplikace byla obě místa zcela zhojena, s plně zacelenou kůží a mírným zčervenáním v místě postižení (Obr. 8D). Během dalších dvou týdnů došlo bez jakékoliv další aplikace k úplné normalizaci na původní stav, prsty byly bez jizev nebo jakýchkoliv známek poškození či změny pigmentace.
V době podání této přihlášky praktické testování organizované přihlašovatelem pokračuje ve formě aplikací u větších skupin uživatelů pod dohledem dermatologů. Cílem této části je shromáždit dostatečný soubor dat umožňující statistické vyhodnocení a získat zkušenosti pro přípravu klinických zkoušek se zkoušenými léčivými přípravky.
Průmyslová využitelnost
Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle předloženého technického řešení může být použit k výrobě souprav kosmetiky nebo i jednotlivých kosmetických přípravků vhodných pro aplikaci na problematickou kůži jedinců s atopickou dermatitidou, akné, růžovkou, lupénkou, vitiligo a jiných poškození kůže stejně jako pro výrobu kosmetických prostředků proti popáleninám. Dále mohou být jednotlivé zde uváděné kompozice nebo jejich kombinace použity pro prevenci kožních onemocnění a problémů pro posílení biologické složky ochranné bariéry kůže. Rovněž mohou být směsi a komponenty uváděné v tomto technickém řešení použity pro výrobu léčivých přípravků, zejména pro použití při léčení atopické dermatitidy, akné, růžovky, lupénky, vitiligo, poškození kůže mechanickým poraněním nebo popálením.
Citovaná literatura
1. Cohen AL, Yamasaki K, Sanchez KM a spol. (2010a) J Invest Dermatol 130: 192-196.
2. Cohen AL, Yamasaki K, Muto J a spol. (2010b) PLoS One 5: e8557.
3. Elad Y, Lifshitz R, Baker R (1985) Physiol Plant Pathol 27, 131-148.
4. Gallo RL, Nakatsuji T US2015/290209 AI (published on 15th October 2015).
5. Ganju P, Nagpal S, Mohammed MH a spol. (2016) Sci Rep 6: 18761.
6. Garcia-Gomez E, Miranda-Ozuna JFT, Diaz-Cedillo F a spol. (2017) J Med Microbiol 66: 864-873.
7. Grice EA, Segre JA (2011) Nat Rev Microbiol 9: 244-253.
8. Hooper AB, Erickson RH, Terry KR (1972) J B acteriol 110: 430-43 8.
9. Human Microbiome Project Consortium (2012) Nátuře 486, 207-214.
10. Iwase T, Uehara Y, Shinji H a spol. (2010) Nátuře 465: 346- 349.
11. Kazue T, Makioka Y CN2018/107922956 A (published on 17th Apríl 2018).
- 14CZ 32750 U1
12. Kleinberg I, Zhang Z US2016/263154 AI (published on 15th September 2016).
13. Kobayashi T, Glatz M, Horiuchi K a spol. (2015) Immunity 42, 756-766.
14. Kong HH, Oh J, Deming C a spol. (2012) Genome Res 22: 850-859.
15. Lai Y, DiNardo A, Nakatsuji T a spol. (2009) Nat Med 15, 1377-1386.
16. McKevitt AI, Bjornson GL, Mauracher CA a spol. (1990) Infect Immun 58, 1473-1475.
17. Naik S, Bouladoux N, Wilhelm C a spol. (2012) Science 337: 1115-1119.
18. Nakatsuji T, Chen TH, Narala S a spol. (2017) Sci Transl Med 9: eaah4680.
19. Nakatsuji T, Gallo RL US2018/289751 AI (published on 1 lth October 2018).
20. Park TH, Kim SH, Jin YJ, An SS, Lee JH KR2017/3478 A (published on 9th January 2017)
21. Sanford JA, Gallo RL (2013) Semin Immunol 25, 370-377.
22. Smoragiewics W, Karska-Wysocki B, Bazo M US2011/0195057 AI (published on llth August 2011).
23. Sugimoto S, Iwamoto T, Takada K a spol. (2013) J Bacteriol 195: 1645-1655.
24. Takayama K, Makioka Y CN2018/107922956 A (published on 17th April 2018).
Claims (12)
1. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek, vyznačující se tím, že je formulován do čtyř stupňů pro postupnou aplikaci na kůži; přičemž první stupeň přípravku jako účinné látky obsahuje látky rozrušující biofilmy tvořené patogenními mikroorganismy na kůži a potlačující viabilitu uvolněných patogenních mikroorganismů, kterými jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacterium a Proteobacterium a půdních mikroorganismů vybraných z mikroorganismů rodu Trichoderma, Pythium, Nitrosomonas a Mycobacterium;
druhý stupeň přípravku jako účinné látky obsahuje látky uklidňující zánět a obnovující účinnou biologickou bariéru kůže, kterými jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z kožních komensálních mikroorganismů vybraných z bakterií rodu Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacterium a Proteobacterium;
třetí stupeň přípravku jako účinné látky obsahuje látky obnovující normální fyziologickou mikroflóru, kterými jsou bezbuněčné extrakty nebo lyzáty připravené z půdních bakterií rodu Nitrosomonas nebo Mycobacterium;
a čtvrtý stupeň přípravku obsahuje látky poskytující výživu kůži a dále podporující rozvoj komensálních mikroorganismů za současného potlačení rozvoje patogenů, kdy se jako účinná látka vyskytuje alespoň jedna látka vybraná ze skupiny obsahující xylitol, famesol, L-arginin, světlicový olej, pupalkový olej, konopný olej, řepkový olej, olej z pšeničných klíčků, laktát, glycin, fruktosu, niacinamid, inositol, aspartát hořečnatý, glukonát zinečnatý a glukonát měďnatý.
2. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že bezbuněčné extrakty nebo lyzáty kožních komensálních mikroorganismů jsou připraveny z bakterie Staphylococcus epidermidis a extrakty nebo lyzáty připravené z půdních mikroorganismů jsou připraveny z oomycety Pythium nunn a/nebo bakterie Nitrosomonas europea.
3. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že první stupeň přípravku obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce aktivitu proteináz v množství 0,47 až 0,94 mU, laminarináz v množství 1,13 až 2,26 mU, celuláz v množství 0,53 až 1,06 mU a chitináz v množství 0,93 až 1,86 mU.
4. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že druhý stupeň přípravku obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce 8,0 až 12,0 pg kyseliny lipoteichoové, 30,0 až 40,0 pg antimikrobiálních peptidů SH-lantibiotikového typu, 16,0 až 20,0 pg antimikrobiálního peptidu γ-modulinu a 13,0 až 21,0 pg Esp proteinasy.
5. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že třetí stupeň přípravku obsahuje v jedné 3 ml aplikační dávce 60,0 pg směsi látek z Nitrosomonas europea, z toho je 45,0 pg nízkomolekulámích látek a 15,0 pg proteinového komplexu obsahujícího membránový komplex oxidující močovinu a produkující oxid dusnatý.
6. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5 pro použití jako kosmetický přípravek.
- 16CZ 32750 U1
7. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6 pro použití jako kosmetický přípravek ke zklidnění a regeneraci podrážděné nebo popálené kůže a/nebo posílení biologické komponenty kožní bariéry a udržení dobré kondice mikrobiálních komunit na kůži.
8. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5 pro použití jako léčivý přípravek.
9. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 8 pro použití jako léčivý přípravek při léčení nemocí nebo poranění kůže.
10. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 9 pro použití jako léčivý přípravek při léčení atopické dermatitidy, akné, růžovky, lupénky, vitiliga, poškození kůže způsobeného mechanickým poraněním nebo popálením.
11. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že každý stupeň přípravku je formulován do aplikační formy vybrané z kožní emulze, krému, masti, gelu, pěny, pleťového mléka nebo jiné kosmetické nebo farmaceutické kompozice s olejovou komponentou.
12. Kombinovaný několikastupňový mikrobiální přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že každý stupeň přípravku obsahuje vodu jako solvent, olivový olej jako olejovou komponentu, kyselinu citrónovou nebo kyselinu octovou nebo kyselinu mléčnou v kombinaci s triethanolaminem jako pufrující složku, glycerin a močovinu jako kondicionéry, fenoxyethanol, tokoferol a ethylhexylglycerin jako konzervanty, amaranth jako barevnou látku, glyceryl stearát a cetylalkohol jako emulgátor, polyakrylát crosspolymer-6 a xanthanovou gumu jako regulátory viskozity a levandulový olej jako vonnou komponentu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-35904U CZ32750U1 (cs) | 2019-02-11 | 2019-02-11 | Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-35904U CZ32750U1 (cs) | 2019-02-11 | 2019-02-11 | Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ32750U1 true CZ32750U1 (cs) | 2019-04-09 |
Family
ID=66097764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019-35904U CZ32750U1 (cs) | 2019-02-11 | 2019-02-11 | Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ32750U1 (cs) |
-
2019
- 2019-02-11 CZ CZ2019-35904U patent/CZ32750U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7189899B2 (ja) | 哺乳動物において健康な微生物フローラを促進するための組成物および方法 | |
| Spratt et al. | Evaluation of plant and fungal extracts for their potential antigingivitis and anticaries activity | |
| ES2670646T3 (es) | Utilización de un extracto de lino procedente de la hidrólisis de las proteínas de lino, como agente activo antimicrobiano | |
| KR20060114370A (ko) | 락토바실러스(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ) 추출물을이용한 피부 치료 방법 | |
| US20250295578A1 (en) | Methods and compositions for microbial treatment of skin disorders | |
| Kumari et al. | Wound healing activities of the bioactive compounds from Micrococcus sp. OUS9 isolated from marine water | |
| FI131136B1 (en) | Use of Nordic plant-based ingredients for supporting a healthy skin microbiome | |
| US20230049239A1 (en) | Combined multistage microbial preparations and method of their application | |
| Diouchi et al. | In vitro methods for assessing the antibacterial and antibiofilm properties of essential oils as potential root canal irrigants—A simplified description of the technical steps | |
| US20240277782A1 (en) | Compositions and methods for microbial treatment of skin disorders | |
| CN115227592A (zh) | 抑菌剂组合物及其应用 | |
| CZ32750U1 (cs) | Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky | |
| US20100111994A1 (en) | Anti-bacterial composition and method of using same | |
| Akatın et al. | Antimicrobial activities of some bryophytes collected from Trabzon, Türkiye and preparation of herbal soap and cream using Pellia epiphylla extract for the first time | |
| CN1067246C (zh) | N－乙酰－d－氨基葡萄糖在制备治疗皮肤癣菌的药物中的应用 | |
| de França Leite et al. | Antibacterial Activity of Melaleuca alternifolia (tea tree essential oil) on Bacteria of the Dental Biofilm | |
| CN111329862A (zh) | 一种消毒剂及其制备方法和用途 | |
| CN116635003A (zh) | 用于皮肤障碍的微生物治疗的方法和组合物 | |
| KR101326164B1 (ko) | 항균성 피부 외용제 조성물 | |
| KR20230043873A (ko) | 다당류가 풍부한 봄박스 코스타툼 꽃 추출물 | |
| RU2535052C1 (ru) | Фармацевтическая композиция, содержащая производные лизина, пролина и тритерпеновой кислоты для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых рнк и днк-содержащими вирусами, такими как: грипп, герпес, опоясывающий лишай, папиллома человека, аденоновирусы, а также бактериальных инфекций, вызываемых грам-положительными и грам-отрицательными микроорганизмами | |
| Garuba et al. | Production, characterization, and anti-biofilm activity of dextranase from Penicillium citrinum against Streptococcus mutans | |
| Mishra et al. | Quantitative and rapid antibacterial assay of Micromeria biflora Benth. leaf essential oil against dental caries causing bacteria using phylogenetic approach | |
| CA3100594A1 (fr) | Extrait et composition dermatologique le comprenant pour le traitement des peaux sensibles | |
| JP2003335696A (ja) | 水溶性キトサンと木香抽出物で構成された天然セル伝達体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20190409 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20230211 |