JP2011505126A - Clostridiumdifficileを特異的に標的とする抗菌薬である、ツリシンCD - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の目的は、L.monocytogenesおよびC.difficileに対して有効であるが、ヒトまたは動物の健康に有用であると考えられる細菌に対しては有効でない薬剤を提供することである。さらなる目的は、消毒薬または防腐薬として、食料品中のプロバイオティクス成分として、または医薬品組成物として使用し得る、そのような薬剤を含む組成物を提供することである。
C.difficile ATCC42639を、Well Diffusion Assay(WDA)の標的菌株として使用した。C.difficile R027 NAP1を、タイムキル研究(time kill study)におけるバクテリオシン感受性のために使用した。バクテリオシン産生培養物の阻害スペクトルを決定するために使用した標的細菌およびその供給源の完全なリストを、培地および増殖条件と共に表1に概略を示す。B.cereus NCIMB700577およびB.thuringiensis NCIMB701157を、gyrBプライマーを用いたPCR反応の陽性コントロールとして使用した。
バクテリオシン産生培養物の単離
病気のおよび健康な個人双方からの糞便サンプルを、研究室において受け取り、そして−80℃で凍結した。分析の日に、サンプルを室温で解凍し、そして等しい容量のエタノールと混合し、そして室温で約30分間置いた。サンプルを続いて、嫌気性希釈剤で連続的に希釈し、100μlをWilkens Chargrin Anaerobic Agar(WCAA)の表面に広げ、そして嫌気性チャンバー中で、37℃で5日間増殖させた。生じたコロニーを、Clostridium difficile ATCC43593の対数期培養物を1.25%で播種した約10mlのReinforced Clostridium Agar(RCA)を用いて覆った。そのプレートをさらに18時間インキュベートし、そして覆った培養物の阻害ゾーンを検査した。明らかな阻害ゾーンを示すコロニーを、滅菌メスを用いて寒天の覆いを最初に除去して、新しいWCAA上に継代培養した。約30,000コロニーをスクリーニングし、そして覆ったC.difficile菌株に対して強力な抗菌活性を示す1つのコロニーを精製し、そしてMicrobank Beads上で、−80℃で保存し、そしてDPC6431と命名し、そして産生される阻害物質をツリシンCDと命名した。
DPC6431の16SrDNA配列決定
Simpsonら、2003によって記載されたように、B.thuringiensis DPC6431の一晩のブロス培養物からゲノムDNAを単離し、そしてPCRによって増幅した。16SrDNA配列の比較を、菌株を特定の種に帰属させることを可能にするBLASTプログラムを用いて得た。
Yamadaら(1999)によって記載されたような配列を有する、B.cereus、B.thuringiensis、およびB.anthracisのgyrB遺伝子に対する種特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、MWGから購入した。PCR産物を、分子マーカーとして100bpラダーを用いて1.5%アガロースゲルで分析し、AlphaImager3400を用いて視覚化した。B.cereus NCIMB700577およびB.thuringiensis NCIMB 701157を、陽性コントロールとして使用した。B.anthracisが病原性の特質(pathogenic status)であるため、B.anthracisの陽性コントロールは無かった。
B.thuringiensis DPC6431を、BHIブロスにおいて約6時間、ストックから好気的に増殖させ、そしてBHIにおいて18時間、0.1%で新しいBHIに継代培養した。増殖後、培養物を8200gで10分間、2回遠心した。Ryanら(1996)によって記載されたように、ウェル拡散アッセイ(well diffusion assay)(WDA)を用いて活性を決定した。ある範囲の標的細菌に対する活性を、WDAによって決定した。培養物を、表1に概略を示すような様々なブロス培地および温度で一晩増殖させた。20mlの適する寒天培地に、100μlの標的細菌を播種し、そして一旦凝固したら、50μlのB.thuringiensis DPC6431の細胞を含まない上清(CFS)を寒天に作ったウェルに加えた。プレートを、表1に概略を示したような様々な標的細菌に適当な条件下でインキュベートした。阻害ゾーン(mm)を測定し、そしてゾーンの直径を測定することによって、相対的な感受性を決定した。≦9mmのサイズのゾーンを+とし、10−15mmを++とし、16−21mmを+++とし、≧22mmを++++とした。
細胞を含まない上清を、25mg/mlの濃度で、以下の酵素に対する感受性に関して試験した:ペプシン、トリプシン、ペプチダーゼ、α−キモトリプシンV111型、α−キモトリプシン11型およびプロテイナーゼK。全ての酵素を、Sigmaから購入した。細胞を含まない上清を、酵素と37℃で1時間インキュベートした。酵素処理後の活性を、C.difficile ATCC43593を標的細菌として用いて、ウェル拡散法を用いて決定した。5μlのプロテイナーゼK(6.5mg/ml)を、サンプルを含むウェルの端に適用することによって、抗菌剤のプロテイナーゼKに対する感受性も決定した。
B.thuringiensis DPC6431を、BHIブロスにおいて2回継代培養し、そして次いで再び1%でBHIブロスに播種した;600nmにおける吸光度を測定することによって増殖をフォローした。抗菌剤産生の決定のために増殖中間隔をおいて取ったサンプルを、8200gで10分間、2回遠心し、連続希釈し、そして各希釈物の50μlを、C.difficile ATCC43593をまいた寒天プレートのウェルに播種した。活性単位をWDAによって決定した。
ツリシンCDの産生:Tryptone Yeast Broth(TYB)を以下のように作製した:Tryptone(Oxoid)2.5g;酵母抽出物(Oxoid)5.0g;MgSO47H2O 0.25g;MnSO44H2O 0.05gを、900mlの蒸留水に溶解した。121℃で15分間オートクレーブする前に、プロパン−2−オール洗浄XADビーズ(Sigma−Aldrich)を含むカラムを通すことによって、培地を清澄にした。使用前に、フィルターで滅菌したグルコースおよびβ−グリセロリン酸塩を加えて、それぞれ10gおよび19g/lの最終濃度および1lの最終容量を得た。
生物学的に活性な画分のN末端アミノ酸決定を、Aberdeen Proteome Facility、University of Aberdeen、Aberdeen、Scotland、UKにおいて、エドマン分解によって行った。
2つのペプチドの部分的なアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを、以下の配列でデザインした:
縮重PCR(上記)によって単離された、2つのペプチドをコードする断片のDNA配列に基づいて、インバースPCRプライマーを以下の配列でデザインした:
96穴マイクロタイタープレートを用いて、ツリシンCDのMIC50を決定した。MIC50は、C.difficile ATCC43493の増殖の50%阻害が起こるペプチドの濃度として定義した。前に沸騰および冷却した強化クロストリジウム培地(RCM)で1:10に希釈した、150マイクロリットルの3つの一晩の同型培養物を、嫌気性チャンバー中で、96穴マイクロタイタープレートのウェルに3組で播種した。ツリシンCDTrn−αおよびTrn−βを、単独でおよび組み合わせて、様々な濃度でウェルに加え、そして滅菌50mMリン酸塩緩衝液で最終的な容量を200μlにした。コントロールウェルは、150μlの培養物および50μlの緩衝液(陽性コントロール)、または150μlの未播種ブロス培地および50μlの緩衝液(ブランク)を含んでいた。37℃で5時間の嫌気性インキュベーション後、600nmにおける吸光度を記録した。3組の測定値を平均し、そして未播種培地のOD600nm値を、各値から引いた。50%増殖阻害を、コントロール培養物の最終的なOD600nm+/−0.05の半分として決定した。50%阻害を引き起こす、Trn−βと組み合わせたTrn−αの濃度をプロットして、アイソボログラムを作成した。2つのペプチドの比活性および最適な比を、x軸およびy軸の交点で決定した。
C.difficile R027NAP1、L.monocytogenesNCTC5348、Lb.casei338およびB.lactis Bb12に対するツリシンの効果を、Reinforced Clostridium Medium(RCM Merck)、Brain Heart Infusionブロス(Merck)、MRS(de Mann−Rogosa−Sharpe)培地(Difco)および0.05%システインを含むMRSにおいてそれぞれ決定した。3つの独立な培養物を各菌株に関して調製し、そして37℃で一晩増殖させた。3つの複製物の1ml容量の滅菌2倍強度ブロス培地を各菌株に関して調製し、そしてテスト細菌を播種して、105−106/mlの最初の細胞数を得た。ツリシンを加え、必要な濃度にして、そして滅菌蒸留水で容量を2mlにした。コントロールではバクテリオシンを加えず、容量を滅菌水で置き換えた。間隔をあけてサンプルを抜き取り、連続的に希釈し、そして菌株によって、RCA、BHI寒天、MRS寒天または0.05%システインを含むMRS寒天にまいた。37℃でインキュベートした24時間(L.monocytogenes)後または48時間(C.difficile、Lb.casei338およびB.lactis Bb12)後に、プレートを計測した。
C.difficileリボタイプ001、106、および027を、−80℃のストックから取り、そして7%の繊維素を除去したウマ血液を含むFastidious Anaerobic Agar上で増殖させた。使用前に、コロニーを3つの10ml容量のRCMのそれぞれに移し、そして37℃で一晩増殖させた。次いで培養物を、10mlの新しいRCMに1%で継代培養した。3つの複製物を各菌株に関して設定した。培養物を嫌気的に37℃で6時間増殖させた。バンコマイシンおよびメトロニダゾールの溶液を水中で調製し、そしてツリシンの溶液をストック溶液から50mMのリン酸塩緩衝液pH6.5で希釈した。抗菌化合物の3組の連続2倍希釈物(100μl)を、各化合物に関してマイクロタイタープレート内に調製した。C.difficile菌株を2倍強度のRCM中で1:10に希釈し、そして100μlを各ウェルに加えた。各菌株のコントロールを、抗菌薬を加えずに設定した。そのマイクロタイタープレートを、嫌気的に37℃で16時間インキュベートし、そしてマイクロタイタープレートリーダーを用いて、インキュベーション後にプレートのODを測定した。MICを増殖の証拠が存在しない濃度として定義した。
C.difficileに対するツリシンCDの溶解効果を、Reaら(2007)によって記載されたように行った。
C.difficile接種材料の調製:C.difficile DPC6537(PCRリボタイプ001)を、−80℃のストックから取り、そしてFastidious Anaerobic Agar上に画線し、そして嫌気的に37℃でインキュベートした。実験前の夜に、約1コロニーを、前に沸騰および冷却した10mlのRCMに播種し、そして嫌気的に37℃でインキュベートした。
微生物学的分析:C.difficileをCCEY寒天(LabM)上で、そしてBifidobacterium種を0.05%のシステインおよび50mgのムピロシン/lを含む修飾MRS寒天上で、37℃におけるインキュベーションの48時間および72時間後にそれぞれ数えた。
ツリシンCDの安定性に対する、模擬の胃液、回腸液、および結腸液の影響
C.difficile64539を一晩増殖させ、そしてReinforced Clostridium Agar(RCA)に1.25%で播種した。Breumerら(1992)によって概略が述べられたように、模擬の胃液、回腸液、および結腸液を調製した。精製ツリシンCDを、70%IPA中で100mg/mlにした。70μl(1mg/mlの最終濃度)のツリシンを、7000μlのブタ胃液および回腸液に加え、そして37℃でインキュベートした。間隔をおいてサンプルを取り、そしてC.difficileを播種したプレートを用いたWDAによって活性を測定した。サンプルを、MALDI−TOF MSを用いて、Trn−αおよびTrn−βペプチドの存在に関してもアッセイした。
C.difficile64539を一晩増殖させ、そしてReinforced Clostridium Agar(RCA)に1.25%で播種した。精製ツリシンCDを、上記で記載したように調製した。7mlのブタ回腸液および胃液を、12,000rpmで15分間遠心して残屑を除去した。70μl(1mg/ml)のツリシンを、7000μlのブタ胃および回腸液に加え、そして37℃でインキュベートした。間隔をおいてサンプルを取り、そしてWDAを用いて活性を測定し、そしてMALDI−TOF MSを用いてTrn−αおよびTrn−βペプチドの存在に関してチェックした。
この研究の目的は、胃腸管内から、C.difficileに対して高い活性を有するが胃腸管の常在菌叢の最少の混乱しか引き起こさない、狭いスペクトルのバクテリオシンを産生する細菌を単離することであった。
健康および病気の成人の両方からの、ある範囲の糞便サンプルからスクリーニングした約30,000のコロニーから、1つのコロニーが、C.difficileオーバーレイ培養の大きな阻害ゾーンを生じることを示した(図1)。このコロニーを、IBSを有する患者の糞便サンプルから単離した。このコロニーの精製およびBHIブロスにおける増殖は、C.difficileに対して活性な、強力な抗菌化合物が、発酵培地中に産生されたことを示した;活性はプロテイナーゼKによる処理で失われ、その抗菌物質はタンパク質性の性質であることを示した(図1)。この培養物を、Moorepark Food Research Centreの培養コレクションにストックし、そしてDPC6431と命名した;そのバクテリオシンをツリシンCDと命名した。
DPC6431の16SrDNA配列決定は、B.cereus/B.thuringiensis/B.anthracisに対する、その菌株の最も高い相同性(96%)を示した。La Ducら(2004)は、B.anthracis、B.cereus、およびB.thuringiensisは全て、系統学的に非常に密接なクレイド(B.cereusグループ)にクラスター化しており、そして従って16srDNA配列決定によっては、お互いに区別できないと述べた。続いてgyrBプライマーを用いて、DPC6431をB.thuringiensisと同定した。B.cereusまたはB.thuringiensisの正確なサイズ(それぞれ365および368)に対応するPCR産物を、これらの細菌それぞれの陽性コントロールによって得た。B.cereusまたはB.anthracisのgyrBプライマーを、B.thuringiensisDPC6431由来のDNAで試験した場合には、PCR産物は得られなかった。B.anthracisが病原性の特質であるために、そのプライマーの陽性コントロールは無かった。
最も高い濃度のツリシンCDが、おそらく胞子形成の開始と一致して、増殖の対数期後期および定常期の間に産生された。増殖の定常期の間、活性は安定なままであった。指数関数的増殖期の間に、pHは最初の約7.5のpHから約5.8まで低下した;定常期の間に、pHは再びその最初の値近くまで上昇した(データは示していない)。
B.thuringiensis6431の細胞を含まない上清は、WDA法を用いてある範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して試験した場合、B.cereus、他のB.thuringiensis菌株、B.mycoidesおよびB.firmusのような、密接に関連したBacillus種を阻害する、狭い阻害スペクトルを示した;B.subtilisまたはB.coagulansに対して阻害は検出されなかった。Clostridium種では、C.difficileリボタイプ027(NCTC13366)を含む試験した全てのC.difficile分離菌は、DPC6431の培養上清に対して非常に感受性であり、大きな阻害ゾーンを示した。C.tyrobutyricum、C.lithuseburense、およびC.indolisも阻害されたが、試験した他のClostridium種は阻害されなかった(C.sporogenes)または弱く阻害されるのみであった(C.histolyticumおよびC.perfringens)。試験した他のグラム陽性病原体のうち、Listeria monocytogenesのみがツリシンCDに感受性であった。試験したlactobacillus種のうち、L.fermentumのみが、ツリシンCDによって強力に阻害され、全ての他の種は非常に弱く阻害されるのみであった(L.crispatusおよびL.johnsonii)か、または全く阻害されなかった。試験したビフィズス菌株は、ツリシン6431に対して感受性ではなかった。ツリシンCDは、試験したあらゆるグラム陰性細菌に対して活性を示さなかった。B.thuringiensis6431の完全な阻害スペクトルを、表1で概略を示す。
(阻害ゾーン(mm)を測定し、そしてゾーンの直径を測定することによって、相対的な感受性を決定した。サイズ≦9mmのゾーンを+、10−15mmを++、16−21mmを+++;≧22mmを++++とした)
ツリシンCDの特徴付け
XADビーズを用いたツリシンの精製およびRP−HPLCを用いた活性成分の分離は、それぞれ2786および2883の分子量を有する、26分および34分における2つのよく分離したピークを生じた(図2A)。これらの疎水性ペプチドを、ツリシンCD Trn−α(分子量2883)およびTrn−β(分子量2786)と命名した(図2BおよびC)。活性は、細胞を含まない上清および細胞ペレットのプロパン−2−オール抽出物の両方に存在し、ツリシンは細胞壁にも結合することを示した。両方のペプチドのWDA研究は、それは二成分バクテリオシンであることを示す;Trn−αは単独で存在する場合に活性を有するが、その活性はTrn−βの存在によって増強される。低い濃度(約2.5μM)では、WDAを用いた活性に対して両方のペプチドが必要である(図2D)。
アミノ酸配列の解明
エドマン分解により、ツリシンCDTrn−αの最初の22個のアミノ酸のアミノ酸配列
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
と比較した場合に、相同的な配列は同定されなかった。
2つのペプチドをコードする遺伝子の方向を、図3に示す。得られたPCR産物は、Trn−βペプチドのC’末端およびリボソーム結合部位およびTrn−βのプロモーター配列、および開始コドンメチオニンおよびN末端アミノ酸配列を含む。
2つのペプチドの完全なヌクレオチド配列を、下記で概略を示すような、開始コドンメチオニンおよびリーダーペプチド配列と共に決定した。
アイソボログラム(図3)は、個々のペプチドとして存在する場合、ツリシンTrn−βのMIC50(0.5μM)は、Trn−α(5μM)より10倍低いが、それらのペプチドを組み合わせた場合、0.025μMのTrn−αと組み合わせたときのTrn−βのMIC50は0.05μMに低下することを示し、低濃度のTrn−αを加えた場合にツリシンTrn−αを100倍より活性にし得ることを示す。これらの結果は、低濃度(<1μM)で組み合わせた場合、2:1のTrn−β:Trn−αの比で組み合わせた場合、2つのペプチドは、C.difficileに対して非常に阻害性であることを示す。
病院および高齢者のための施設における、世界的なC.difficileの高い発生率のために、この疾患の治療に対する根治的なアプローチを考えなければならない。二成分ランチビオティクス、ラクチシン3147は、低い濃度でC.difficileを殺菌するのに非常に有効であることが示されたが、それは広域スペクトルの抗生物質であるので、単純な糞便発酵において、C.difficileを殺菌するために必要な濃度で、LactobacillusおよびBifidobacterium集団にも影響を与えた(3log サイクル)(Reaら、2007)。
Claims (27)
- 受託番号41490の下、the National Collection of Industrial and Marine Bacteriaに寄託された、B.Thuringiensis6431、ならびに実質的にそれに類似であり、Clostridium difficileおよびListeria monocytogenesに対して有効であるバクテリオシンをもコードする、菌株。
- 請求項1に記載の細菌の菌株によって産生された、Listeria monocytogenesおよびClostridium difficileに対して有効である、バクテリオシン。
- 2つのペプチド、Trn−αおよびTrn−βを含むツリシンCD(thuricin CD)と呼ばれるバクテリオシンであって、Trn−αは約2763の分子量を有し、そしてTrn−βは約2861の分子量を有する、バクテリオシン。
- 約85℃まで熱安定性である、請求項3に記載のバクテリオシン。
- 約90℃で15分間のインキュベーション後に活性が減少し、そして約100℃で15分間のインキュベーション後に活性を失う、請求項3または4に記載のバクテリオシン。
- Bacillus cereus、他のBacillus thuringiensis、Clostridium difficile、Listeria monocytogenes、B.mycoides、B.firmus、C.difficileリボタイプ027、C.tyrobutyricum、C.lithuseburense、C.indolis、およびC.perfringensを阻害する能力を有する、請求項3〜5に記載のバクテリオシン。
- pH2〜10の範囲で活性である、請求項3〜6のいずれか一項に記載のバクテリオシン。
- ツリシンCDが200AU/mlの濃度で存在する場合、1mlあたりC.difficileの約5×106CFUが180分以内に死滅させられる、C.difficileに対して殺菌効果を有する、請求項2〜7のいずれか一項に記載のバクテリオシン。
- 表2に示される阻害スペクトルを有する、請求項2〜8に記載のバクテリオシン。
- 前記成分Trn−αが、
- 遺伝子Trn−αをコードするツリシンCD成分または遺伝子Trn−βをコードするツリシンCD成分のうちの少なくとも一つを含む、宿主細胞。
- 図3に示される、Trn−αと記された配列を含む、ツリシンCD成分Trn−α。
- 図3に示される、Trn−βと記された配列を含む、ツリシンCD成分Trn−β。
- 前記遺伝子が、図3に示される核酸配列を有するか、または該核酸配列に実質的に類似であり、そしてまたバクテリオシン活性をコードする配列を有する、請求項11に記載の宿主細胞。
- 図3に示されるTrn−αまたはTrn−βと記されたアミノ酸配列、または該配列に実質的に類似であり、そしてまたバクテリオシン活性を示す配列のいずれかを有する、ツラシン(Thuracin)成分。
- 請求項1、22、または23に記載の細菌の菌株、請求項11に記載の宿主細胞、請求項2〜10のいずれか一項に記載のバクテリオシン、または請求項12または13に記載のツリシンCD成分を含む、消毒剤組成物。
- 請求項1に記載の菌株の栄養細胞もしくは芽胞、または請求項11に記載の宿主細胞を含む、プロバイオティク培養物。
- 請求項1、22、または23に記載の菌株、請求項11に記載の宿主細胞、請求項2〜10のいずれか一項に記載のバクテリオシン、あるいは請求項12または13に記載のツリシンCD成分を含む、殺芽胞性組成物。
- 請求項1、22、または23に記載の細菌の菌株、請求項2〜10のいずれか一項に記載のバクテリオシン、あるいは請求項11に記載の宿主細胞、あるいは請求項12または13に記載のツリシンCD成分を、薬剤学的に許容できる担体と共に含む、医薬品組成物。
- 注腸調製物として調合される、請求項19に記載の医薬品組成物。
- 結腸を標的にするために適合されるカプセル化ペプチドを含む、請求項19に記載の医薬品組成物。
- ツリシンCD、またはツリシンTrn−α配列もしくはTrn−β配列を含むペプチドを産生する、細菌の菌株。
- ツリシンCDペプチドを産生するために設計されたプロバイオティクス消化管単離物を含む組換え菌株。
- 家禽におけるClostridiumの阻害を含む、獣医学的使用、ヒトまたは家禽への適用のための、請求項1、22、または23に記載の菌株、請求項11に記載の宿主細胞、または請求項2〜10に記載のバクテリオシン、あるいは請求項12または13に記載のツリシンCD成分の生存培養物または死滅培養物のいずれかの調製物を含む、プロバイオティクス組成物。
- Clostridium spp.によって引き起こされるガス壊疽に対する創傷および皮膚感染症の治療のための、請求項1、22、または23に記載の細菌の菌株、請求項2〜10に記載のバクテリオシン、あるいは請求項11に記載の宿主細胞、あるいは請求項12または13に記載のツリシンCD成分を、担体と共に含む、局所的組成物。
- 実施例または添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載される細菌細胞。
- 実施例または添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるバクテリオシン。
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