MX2010005908A - Turicina cd, un antmicrobiano para apuntar especificamente al clostridium difficile. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva bacteriocina, a cepas microbianas que pueden producirla y a usos de la bacteriocina y de las cepas. La bacteriocina es efectiva contra Clostridium difficile y Listeria monocytogenes entre otros organismos.

Description

TU RICINA CD, UN ANTMICROBIANO PARA APUNTAR I ESPECÍFICAMENTE AL CLOSTRIDIUM DIFFICILE j ! Campo de la invención La presente invención se refiere a una cepa microbiana, q ue produce una bacteriocina que tiene un efecto de inhibición estrecho, pero que es efectiva , particularmente contra C. difficile y Listeria monocytogenes y a la bacteriocina producida por la cepa . i Antecedentes de la invención i Con el recrudeci miento de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos y el aumento en infecciones adquiridas en el hospital tales como MRSA y C. difficile hay una urgencia renovada para descubrir novedosos compuestos antimicrobianos para combatir estas enfermedades. Descrito primero en 1 935, el C. difficile no fue reconocido como el agente causante de la diarrea noscomial hasta los años 1 970 (George et al, 1 978; Hall & O'Toole, 1935). Sin embargo, la I enfermedad asociada con Clostridium difficile (CDAD) es la diarrea adquirida en el hospital más común, y el problema principal de infección de gastroenteritis y diarrea asociada a los antibióticos en hogares de ancianos e instalaciones para las personas de edad avanzada . En efecto, el organismo de protección de salud en el Reino Unido reportó 32.1 89 casos de CDAD durante los primeros 6 mesjes de 2007 en el Reino Unido j (http://www.hpa .org.uk/infections/topics az/hai/tablesfonvebsite/Cdiff Querterlv Nov 2007.xls) El principal factor de descomposición para la adquisición de CDAD es el tratamiento con antibióticos. En los años 1970 la administración de clindamicina seguida por ampicilina y amoxicilina estuvo implicada como los agentes inductores de CDAD ; estos fueron reemplazados por las cefalosporinas en los años 80 y más recientemente por las fluoroquinolonas (Aronsson et at. , 1985; Bartlett, 2006; Winstrom et at. , 2001 ). También está el problema agregado de la cepa hiper virulenta de C. difficile PCR ribotipo 027, cuya incidencia está aumentando en Estados Unidos, Canadá y Europa (Bartlett, 2006). i Los péptidos antimicrobianos prod ucidos por bacterias, ahora ! denominados bacteriocinas, primero tuvieron prominencia ~ hace 80 años con el descubrimiento por Rogers y Whittier ( 1928) de la nisina por Lactococcus lactis subespecie lactis, que demostró un amplio espectro de actividad contra otras bacterias de ácido láctico (LAB ) y otros organismos Gram positivos. Aunque las bacteriocinas producidas por LAB son las más ampliamente estudiadas y tienden en lo principal a tener un amplio espectro de actividad , los compuestos antimicrobianos producidos por muchas otras especies bacterianas incluyen los organismos Gram positivos Bacillus (Ahern et al, 2003; Bizani et al, 2005; Cherif et al, 2003; Cherif et al, 2001 ; Seibi et al. 2007 , Teo & Tan , 2005); Clostridium (Kemperman ef al, 2003) , i organismos Gram negativos E. coli (Trautner et al, 2005), Shigella I (Padilla ef al, 2006). ¡ El trabajo llevado a cabo previamente en diversas cepas ele B. thuringiensis había producido una variedad de bacteriocinas (Ahern et al. 2003, Chehimi ef al. 2007, Cherif ef al. 2001 , Favret y Yousten 1989, Gray et al. 2006a, Gray et al. 2006b,) que demostraron propiedades bactericidas contra las cepas de B. thuringiensis, B. cereus y Listeria monocytogenes. Sin embargo, estas bacteriocinas no presentan actividad de dos componentes.

El trabajo previo por Yudina et al. describe proteínas de cristales de paraesporal (proteínas Cry) de bacteria entomopatógen'a ß. thuringiensis (subespecie Kurstaki, galleriae, tenebriois) así jcomo también algunos fragmentos de ellas, obtenidas por prote'ólisis limitada, que son capaces de acción antimicrobiana contra bacterias anaeróbicas y C. butyricum, C. acetobutylicum y Methanosarcina barkeri. La patente estadounidense N° 7,247,299 describe compuestos antimicrobianos estables al calor aislados de una nueva cepa de ß. subtilis (depositada el 8.5.05) aislada de GIT de aves de corral, que son efectivas contra C. perfringens, C. difficile, Campylobacter jejuni, Camp, coli y S. pneumoniae. La patente estadounidense N° 7,144,858 describe la síntesis de nuevos compuestos antibióticos para uso contra bacterias Gram positivas tales como Bacillus (incluyendo B. thuringiensis), Clostridium (incluyendo C. difficile), Streptococcus, Mycobacterium y Staphylococcus. La solicitud estadounidense 20080213430 describe la síntesis artificial y la expresión recombinante de péptidos antibacterianos contra bacterias tales como B. subtilis, C. difficile, E. coli, Staphylococcus y similares. Sin embargo, estos péptidos tienen un amplio espectro de inhibición contra una amplia gama de organismos Gram positivos. El trabajo previo usando los lantibióticos de origen natural lacticina y nisina ha demostrado que estos péptidos obtenidos microbianamente son efectivos en la eliminación de C. difficile en concentraciones que se comparanj bien con las de los antibióticos utilizados comúnmente, tales 'como I vancomicina y metronidazol (Bartoloni et al. , 2004; Rea et al. , 2007).

Sin embargo, estos lantibióticos tienen un amplio espectro de j inhibición contra una amplia gama de organismos Gram positivos incluyendo aquellos que son considerados beneficiosos para la jsalud de los intestinos humanos, tales como Lactobacillus y Bifidobacterium. Efectivamente, el trabajo previo en este laboratorio ha demostrado que la lacticina 31 47 afecta negativamente los niveles de Lactobacillus y Bifidobacterium en fermentación fecal (Rea et al. , 2007).

El objetivo de este estudio por lo tanto fue aislar bacterias que producen compuestos antimicrobianos de espectro estrecho que apuntan a C. difficile. Para este fin, se apuntó a bacterias que fojrman esporas en el intestino humano; esta podría no ser una fuente obvia de antimicrobianos contra C. difficile.

Objeto de la i nvención : i El objeto de la invención es proporcionar un agente efectivo i contra L. monocytogenes y C. difficile pero no contra organismos que se consideran beneficiosos para la salud humana o animal . Un objeto ¡ adicional es proporcionar composiciones que comprenden este agente, i que se puede usar como desinfectantes o antisépticos, como componentes probióticos en productos alimenticios o jcomo composiciones farmacéuticas . j Breve descripción de la invención : ! De acuerdo con la presente invención se proporciona una | cepa bacteriana de Bacillus thuringiensis 6431 depositada en la Colejcción Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (National Collectión of Industrial and Marine Bacteria) bajo el N° de Acceso 41490 y cepas que son sustancialmente similares a ella, que también codifican una bacteriocina efectiva contra Listeria monocytogenes y Clostridium difficile, pero no contra especies de Bifidobacterium y Lactobacillus. La cepa fue depositada el 9 de julio de 2007. Adecuadamente la cepa produce una bacteriocina que no es efectiva contra la flora jGram positiva del tracto gastrointestinal . ¡ La invención también proporciona una bacteriocina efectiva contra Listeria monocytogenes y Clostridium difficile, producida por esta cepa bacteriana. j En todavía un aspecto adicional la invención proporciona una bacteriocina denominada Turicina CD que contiene 2 péptidos, Trn-a y Trn-ß, Trn-a que tiene una masa molecular de aproximadamente 2763 y Trn-ß que tiene una masa molecular de aproximadamente 286jl . La bacteriocina es estable al calor hasta aproximadamente ! 85° Centígrados, con una reducción de actividad en aproximadamente 90° Centígrados y una pérdida de actividad en aproximadamente j 1 00° Centígrados después de una incubación de 1 5 minutos. Por estable al i calor se quiere decir que la bacteriocina no está sujeta fácilmente a destrucción o alteración por calor. La Turicina CD tiene la capacidad de inhibir a Clostridium difficile y Listeria monocytogenes. La Turicina CD está activa en la gama de pH de 2-1 0.

Adecuadamente, la bacteriocina no es efectiva contra especies de Bifidobacterium y Lactobacillus. La bacteriocina puede no ser efectiva contra organismos Gram positivos que se encuentran en el tracto gastrointestinal. Adecuadamente la bacteriocina también es efectiva contra Bacillus cereus, otras cepas de Bacillus thuringiensis, Clostridium perfringens, B. mycoides y B.firmus, Clostridium difficile ribotipo 027, C. tyrobutyricum, C. lithuseburense y C. indolis. Por no efectiva se quiere decir que la bacteriocina no afecta la viabilidad de estos organismos.

La bacteriocina puede tener un efecto bactericida contra C. difficile de aproximadamente 5 x 106 UFC de C. difficile por mi. siendo eliminado en un plazo de 60 minutos y de 180 minutos cuando la turicina CD está presente en una concentración de 5µ and 200 AU/ml respectivamente. La bacteriocina es efectiva en concentraciones nano moleculares. ¡ Se ha demostrado que la bacteriocina no afecta la viabilidad de las cepas probioticas Lactobacillus casei 338 o Bifidobacterium lactis Bbl 2. La bacteriocina puede tener un espectro de inhibición tal como se muestra en la Tabla 2.

Preferiblemente la bacteriocina es una en la cual el componente turicina Trn-c tiene una secuencia de aminoácidos en el terminal N GNAACVIGCIGSCVISEGIGSLVGTAFTLG y el componente de turicina I CD Trn-ß tiene la secuencia de aminoácidos en el terminal N GWVAVVGACGTVCLASGGVGTEFAAASYFL.

Preferiblemente, la bacteriocina es una en la cual los componentes Trn-a y Trn-ß tienen las secuencias de aminoácidos q ue I se muestran en la Figura 3, con o sin la secuencia de péptidos l íder, o secuencias que son sustancialmente similares a ellas y que también presenten actividad de bacteriocina.

En todavía un aspecto adicional la invención proporciona una célula huésped que contiene el componente de turicina CD Trn-q que codifica el gen o la Trn-ß que codifica el gen . La célula huésped también puede incluir el componente de turicina CD Trn-a y Trn-ß. -que codifica el gen . Preferiblemente, los genes tienen las secuencias de J ácido nucleico como se muestra en la Figura 3, o secuencias qué son sustancialmente similares a ellas y que también codifican actividad de bacteriocina. Por "sustancialmente similar" se quiere decir secuencias que debido a la degeneración del código genético, sustitución de un aminoácido por otro, o cambios en las regiones de la secuencia de aminoácidos que no son críticos para la actividad de la bacteriocina, todavía producen una molécula de bacteriocina que tiene las propiedades definidas aqu í. La invención también proporciona Componente de turicina CD Trn-a y Componente de turicina CD Trn-ß.

También se proporciona una composición desinfectante que contiene la cepa bacteriana , una célula huésped , una bacteriocina o un componente de Turicina CD Trn-a o Trn-ß según se define n lo anterior. La invención proporciona un cultivo probiótico que contiene células vegetativas o esporas de una cepa o una célula huésped según se define en lo anterior. La cepa o célula puede ser inactivada de tal forma que la cepa ya no sea viable. d También se proporciona una composición esporicida que contiene la cepa bacteriana, una célula huésped , una bacteriocina b un componente de Turicina CD Trn-a o Trn-ß según se define en lo anterior.

También se proporciona una composición farmacéutica que contiene la cepa bacteriana , una célula huésped , una bacteriocina o un componente de Turicina CD Trn-a o Trn-ß según se define n lo anterior, junto con portadores o excipientes efectivos farmacéuticamente. La composición farmacéutica puede ser formulada como una preparación para enema, como un péptido encapsulado con suministro dirigido al colon, como un probiótico encapsulado para el suministro dirigido al colon , como una preparación para animales o veterinaria para uso como un probiótico o péptido purificado.

El péptido Trn-a y/o Trn-ß se puede usar sin la presencia de un organismo vivo como ingrediente de alimentos para el control de L.

I monocytogenes en los alimentos. La invención también encuentra uso en el control de C. perfringens en aves de corral .

Las composiciones desinfectantes, farmacéuticas, esporicidas, alimenticias u otras se pueden formular junto con portadores o excipientes apropiados.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 : Inhibición de C. difficile ATCC 43593 por sobrenadante sin células de B. thuringiensis DPC 6431 (A) y demostración de su naturaleza proteínica mediante el efecto de Proteinasa K (B).

Figura 2. Cromatograma de RP-HPLC de turicina 6431 que I muestra la separación de P 1 y Trn-ß (A); cromatografía de MS MALDI-TOF de Trn-a (B) y Trn-ß (C) que muestra la masa molecular y WDA de ambos péptidos que muestra el efecto de concentraciones equimolares de péptidos en una gama de concentraciones (D).

Figura 3 Orientación de los genes que codifican los péptidos de turicina Trn-a y Trn-ß. j Figura 4 Concentración de Turicina CD Trn-a y Trn-ß requerida para inhibir el crecimiento de C. difficile ATCC 43493 en 50%.

Figura 5 Efecto de Turicina CD (200AU/ml) sobre el crecirniento i de C. difficile R027, L. monocytogenes, L. paracasei 338 y B. lactis Bbl 2 a 37 °C. (· Control; o +200 AU/ml de turicina).

Figura 6 Efecto de 500 pg/ml de Turicina CD sobre el crecirniento de C. difficile ribotipo 001 en un modelo de fermentación fecal cuando se añade a 0, 8 y 16h (A). Actividad de Turicina CD en el transcurso de la fermentación (B). Detección mediante RP-HPLC de péptidos de turicina Trn-a y Trn-ß a las 0 h (línea negra) y después de 4 ) h de fermentación en el modelo de ambiente fecal (C).

Figura 7 Estabilidad de Turicina CD en jugo gástrico estimulado i (A) después de 2h, jugo ileal estimulado (B) después de 5h, jugo de colon estimulado (C) después de 9h, jugo gástrico porcino (D) después de 2 h y jugo ileal porcino (E) después de 5 h de incubación a 37°C Descripción detallada de la invención Cepas bacterianas utilizadas Se usó C. difficile ATCC 42639 como cepa objetivo para Análisis de Difusión en Pocilio (WDA). Se usó C. difficile R027 NAPI ¡ para determinar las sensibilidades a la bacteriocina en estudios de eliminación en el tiempo. Una lista completa de organismos objetivo y I sus fuentes utilizados para la determinación del espectro de inhibición de los cultivos productores de bacteriocina, junto con los medios y condiciones de cultivo se menciona en la Tabla 1. Se usaron B. cereus NCIMB 700577 y B. thuringiensis NCI B 701157 como controles positivos para la reacción de PCR usando los cebadores gyrB.

Aislamiento de Cultivos productores de bacteriocina.

Se recibieron muestras fecales de individuos enfermos y sanos i en el laboratorio y se congelaron a - 80 °C. El día el análisis las muestras se descongelaron a temperatura ambiente y se mezclaron con volúmenes iguales de etanol y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante ~ 30 min. Posteriormente, las muestras se diluyeron en serie en diluyente anaeróbico, 100 µ? se dispersaron sobre la superficie de Agar Anaeróbico Wilkens Chargrin (WCAA) y se cultivaron durante 5 días a 37 °C en una cámara anaeróbica. Las colonias que se desarrollaron fueron revestidas con ~10 mi de Agar para Clostridium Reforzado (RCA) inoculado en cantidad de 1.25% con un cultivo en fase logarítmica de Clostridium difficile ATCC 43593. Las placas se incubaron durante otras 18h y se inspeccionaron para identificar las zonas de inhibición del cultivo revestido. Las colonias que muestran una clara zona de inhibición fueron subcultivadas en WCAA fresco al I que primero se le había eliminado el revestimiento de agar usando un escalpelo estéril. Se seleccionaron aproximadamente 30,000 colonias y una colonia que mostró potente actividad antimicrobiana contra la cepa i I I ? C. difficile recubierta se purificó y se almacenó a -80 °C en Perlas Microbank y se denominó DPC6431 y la sustancia inhibidora producida se denominó Turicina CD. I Caracterización genotípica Secuenciación de ADNr 16S de DPC 6431 Se aisló ADN genómico de los cultivos en caldo durante la oche de B. thuringiensis DPC 6431 y se amplificó mediante PCR como lo describe (Simpson et al., 2003). Se obtuvieron comparaciones de las secuencias de ADNr 1 6S usando el programa BLAST que permitió la asignación de una cepa a una especie en particular. j Identificación del nivel de especie usando cebadores gyrB | Se adquirieron cebadores oligonucleótidos específicos para la especie para el gen gyrB para B. cereus, B. thuringiensis y B. anthracis en MWG con las secuencias descritas por Yamada et al. , ( 1 999). Los productos de PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 1 .5% con escalera de 1 00 como marcador molecular y se visualizaron usando un Alfalmager 3400. Se usaron B. cereus NCIM B 700577 y B. thuringiensis NC I M B 701 1 57 como controles positivos. Debido al estado patógeno de B. anthracis no hubo ningún control positivo para B. anthracis.

Producción de Turicina CD de sobrenadantes sin célu las : Se cultivó 8. thuringiensis DPC 6431 de forma aeróbica de u na población durante - 6 h en caldo BHI y se subcultivaron en B H I fresco al 0.1 % durante 18h en BH I . Luego de ser cultivado, el cultivo se centrifugó dos veces a 8200 g durante 1 0 min . Se determinó la actividad usando el análisis de difusión en pocilio (WDA) como lo describe Ryan et al., (1996). La actividad contra una gama de organismos objetivo se determinó mediante WDA. Los cultivos fueron cultivados en diversos medios de caldo y temperaturas como se indica en la Tabla 1. Se inocularon veinte mi del medio agar apropiado con 100 µ? del organismo objetivo, y una vez solidificado, se le añadieron 50 µ? del sobrenadante sin células (CFS) de B. thuringiensis DPcl6431 a un pocilio hecho en el agar. Las placas se incubaron bajo condiciones apropiadas para los diversos organismos objetivo según se i indica en la Tabla 1. Se midieron las zonas de inhibición (mm)j y se determinó la sensibilidad relativa midiendo el diámetro de la zona. Las zonas de tamaño midiendo el diámetro de la zona. Las zonas de tamaño < 9 mm fueron denominadas +; las de 10-15 mm fueron denominadas + + ; las de 16-21 mm fueron denominadas +++; last de > 22 mm fueron denominadas ++++ Sensibilidad de Turicina CP a la degradación enzimática. al calor y al pH. i El sobrenadante sin células se analizó para determinar la sensibilidad a las siguientes enzimas en una concentración de I 25mg/ml: pepsina, tripsina, peptidasa, a-quimio tripsina de tipo yi11, a-qu'imiotripsina de tipo 11 y proteinasa . Todas las enzimas se adquirieron en Sigma. Los sobrenadantes sin células se incubaron con las enzimas durante 1 h a 37 °C. Se determinó la actividad posterior al tratamiento con enzimas usando el método de difusión en pocilio usando C. difficHe ATCC 43593 como organismo objetivo. . La sensibilidad del antimicrobiano a la Proteinasa K también fue determinada aplicando 5 µ ? de Proteinasa K (6.5mg/ml) al borde del i pocilio que contenía la muestra.

La actividad sobre una gama de pH se determinó en CFS ajustando el pH de 2 a 9 usando cualquiera de HCI 0.5 M o NaOH 1 . El efecto del ácido o base sobre el organismo objetivo se determinó usando medio de cultivo no inoculado ajustado a través del rango de pH . Se determinó la actividad usando el análisis WDA usando C. difficile ATCC 43593 como cepa objetivo. Se determinó la sensibilidad al calor calentando el CFS durante 1 5 min en una gama de temperaturas desde 37 °C hasta 1 00 °C ; el control se incubó a 37 °C. Se determinó la actividad usando WDA con C. difficile ATCC 43593 como organismo objetivo.

Determinación de la producción de Turicina CP durante el crecimiento.

B. thuringiensis DPC 6431 se subcultivó dos veces en caldo BHI y Í luego se inoculó de nuevo en 1 % en caldo B HI ; se hizo seguimiento al crecimiento midiendo la absorbancia a 600n m. Las muestras, tornadas durante el cultivo en intervalos para la determinación de la producción antimicrobiana , se centrifugaron dos veces a razón de 8200 g durante 10 min , se diluyeron en serie y se inocularon 50 µ? de cada dilución en receptáculos en placas con agar sembradas con C. difficile ATCC i 43593. Las unidades de actividad se determinaron mediante WDA.j I Purificación y determinación de masa molecular de Turicina CP Se realizó la producción de Turicina CD: Se constituyó Caldo de Cultivo de Levad ura Triptona (TYB) como sigue: Se disolvieron I Triptona (Oxoid) 2.5 g; Extracto de Levadura (Oxoid) 5.0 g; MgS047 H20 0.25 g; MnS04 4H20 0.05 g en 900 mi de H20 destilada. El medio se clarificó, antes de someterlo a autoclave a 121°C durante 15 minutos, haciéndolo pasar a través de una columna que contenía perlas XAD lavadas con propan-2-ol (Sigma- Aldrich). Antes de su uso, se le añadió glucosa esterilizada filtrada y ß-glicerofosfato para dar una concentración final de 10 g y 19 g/l respectivamente y un volumen final de 11. j Se subcultivó Bacillus thuringiensis DPC 6431 dos veces en ¡caldo BHI a 37°C antes de su uso. Se inocularon dos litros de TYB con el cultivo al 0.1% y se incubó agitando a 37°C durante la noche. El cultivo se centrifugó a 8,280 g durante 15 minutos. Se retuvo el granulado de células y el sobrenadante. Las células fueron resuspendidas en 200 mi de propan-2-ol al 70 % con pH 2.0 por litro de caldo y se agitó a 4°C durante 4h. El sobrenadante de cultivo se hizo pasar a través de perlas XAD, lavadas previamente con 1 I de H20 destilada. La columna se lavó con 500 mi de 30 % etanol y la actividad inhibidora se eluyó en 400 mi de 70% propan-2-ol pH 2.0 y se conservó (Si). Las células que habían sido resuspendidas en propan-2-ol a| 70% pH 2.0 fueron centrifugadas a 8,280 g durante 15 minutos y se conservó el sobrenadante (S2); Si y S2 se combinaron. El propan-2-ol se evaporó usando un evaporador rotativo (Buchi) y la muestra se aplicó a una columna Phenomenex C-18 de 6 g (20 mi) equilibrada previamente con metanol y agua. La columna se lavó con 2 volúmenes de columna de etanol al 30 % y la actividad inhibidora se eluyó en 1.5 volúmenes de columna de propan-2-ol al 70 % con pH de 2.0. Esta preparación se concentró usando evaporación rotativa antes de la separación de los péptidos usando HPLC como sigue: se aplicaron al ícuotas de aproximadamente 2ml a una columna para (RP)-HPLC de fase inversa con Ci8 Phenomenex (Phenomenex, Cheshire, UK) (Primesphere 10 µ C18-MC 30, 250x10.0 mm , 1 0 µ??) previamente i equilibrado con acetonitrilo al 45% , ácido trifluoroacético TFA al 0.1 %. La columna se reveló posteriormente en un gradiente de acetonitrilo al 45% que conten ía TFA al 0.1 % hasta acetonitrilo al 65 % que conten ía TFA al 0.1 % de 4 a 40 minutos en un caudal de 9.9 ml/mi n . Se identificaron las fracciones activas biológicamente usando C. difficile como organismo objetivo en WDA. Las fracciones que contenían los péptidos activos fueron agrupadas, secadas por congelación y reconstituidas en la concentración requerida en propan-2-ol al 70% con pH 2.0 y se congeló a -20 °C hasta su uso. Se realizaron diluciones posteriores en amortiguador fosfato 50 mM estéril con pH 6.5.

Determinación de masa molecular de Turicina CP Se realizó espectrometría de masas en fracciones activas biológicamente con una Axima CFR mas espectrómetro de masas MALDI TOF (Shimadzu Biotech, Manchester, UK). Una alícuota de 0.5 µ? de solución matriz (ácido ciano-4-hidroxi-cinámico, 1 0 mg/ml en acetonitrilo-ácido trifluoroacético al 0.1 % (v/v)) fue depositado jen el i objetivo y se dejó durante 5 segundos antes de ser eliminados. Cualquier solución residual se dejó secar al aire y la solución de muestra depositada en el punto de muestra recubierto previamente; se ? añadieron 0.5 µ? de solución matriz a la muestra depositada y se dejó secar al aire. La muestra fue analizada posteriormente en modo de reflectrón de ion positivo para determinar la masa molecular. ! Determinación de secuencia de aminoácidos de péptidos activos biológicamente. La determinación de aminoácidos en el terminal N de fracciones activas biológicamente se llevó a cabo mediante degradación Edman en la Instalación de Proteoma en Aberdeen , Universidad de Aberdeen, Aberdeen , Escocia , Reino Unido.

Determinación de secuencia de nucleótidos de Turicina CP ¡ Se diseñaron cebadores degenerados, con base en, las secuencias de aminoácidos parciales de los 2 péptidos, con las siguientes secuencias: Trn-a -F/FC 5' GGT TGG GTA GCA GTA; GTA GGT GCA TGT GGW ACA GTW ACC CAWCC; Trn-a -R/FC 5'CGT AAA CAT ACT GTA CCA CAT GCA CCT ACT ACW GCW ACC CAW CC; : Trn-ß - F/FC 5" GGT AAT GCA TGT GTA WTW GGW TGT WTW GG ; Trn-ß -R/FC 5' CCA ATA CGA CCA ATT ACA CAW GCW GCW TTW CC . Se extrajo el ADN cromosómico de B. thuringenisis usando el estuche QiAamp DNA Mini Kit de Qiagen .

Se realizó una PCR al ADN extra ído usando las siguientes condiciones: 94°C x 5 min ; 94°C x 1 min , 64.5°C x 1 min, 72°C x 1 min 25 ciclos con gradiente de temperatura de 64.5°C- 69.5°C; paso de extensión final 72eC x 7 min. La combinación de cebador Trn-a-F l /FC/ Trn- -R/FC dio como resultado un producto de PCR de -220 bp . ! Este producto se purificó usando el estuche de purificación para PCR Qiaquick de Qiagen y se clonó usando el estuche para clonación TOPO TA de Invitrogen (A). La presencia del fragmento clonado se confirmó mediante análisis de restricción de plásmidos recombinantes con ÉcoRI (NEB), utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se secuenció ADN plásmido recombinante disponible comercialmente en Lark (Windmili Road Headington 0X3 7BN Oxford, UK) usando los sitios de cebado T7 y T3. El ensamblaje de secuencia y el análisis se realizaron usando los programas SeqBuilder y Seqman del paquete de software Lasergene. (DNASTAR, Madison, Wl). La secuencia de consenso se analizó luego mediante búsquedas en base de datos usando los programas Blastn, Blastp y tBIastx disponibles en http:// www.ncbi.nlm.nlh.gov. PCR inversa para obtener las regiones de ADN circundantes.

Se diseñaron cebadores para PCR inversa, basados en la secuencia de ADN del fragmento que codifica los dos péptidos que fue aislado mediante PCR degenerado (arriba) con las siguientes secuencias: Cebador FCinl: 5' CAT GCA CCT ACT GCT ACC CAA CC 3' and Cebador FCin2: 5' CAG AGT TTG CAG CTG CAT CTT ATT TCC 3'. Se extrajo el ADN cromosómico de B. thuringenisis usando el estuche QiAamp DNA Mini Kit de Qiagen y se digirió con la enzima de restricción Hindlll (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego el ADN digerido se relegó en concentraciones conocidas para alentar la formación de moléculas monoméricas. Se realizó una PCR inversa usando ADN polimerasa Expand ¡Long Témplate (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto dio como resultado la amplificación de un producto de ~4500 bp. Este prod ucto se purifico usando el estuche de purificación para I PCR Qiaquick de Qiagen y se clonó usando el estuche de clonación TOPO j TA de Invitrogen (A). La presencia del fragmento clonado se confirmó mediante análisis de restricción de plásmidos recombinantes con EcoRI (NEB ), utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. L.uego se secuenció ADN plásmido recombinante disponible comercialmente en Lark (Windmill Road Headington 0X3 7BN Oxford , Reino Unido) I usando los sitios de cebado T7 y T3 y cebador caminando. Se réalizó i el ensamblaje y el análisis usando los programas SeqBuilder y Seqman del paquete de software Lasergene. (DNASTAR, Madison, Wl ). La secuencia de consenso se analizó luego mediante búsquedas en base de datos usando los programas Blastn , Blastp y tBIastx disponibles en http://www.ncbi .nlm .nih .gov.

Determinación de la actividad específica.

Se usaron placas para microtitulación de 96 receptáculosj para determinar la M IC 50 de la Turicina CD . La M IC 50 se definió como la concentración de péptidos en la cual ocurría el 50% de inhibición de crecimiento de C. difficile ATCC 43493. Ciento cincuenta microlitros de i 3 cultivos reproducidos durante la noche, se diluyeron 1 : 1 0 en medio reforzado para Clostridium (RCM) que había sido hervido previamente, fueron inoculados por triplicado en los pocilios de placas para microtitulación de 96 pocilios en una cámara anaeróbica. Se añadieron Turicina CD Trn-a y Trn-ß a los pocilios en concentraciones variables tanto solos como en combinación, y se constituyó el volumen firíal de i hasta 200 µ? con amortiguador fosfato 50 mM estéril . Los pocilios de control conten ían 1 50µ? de cultivo y 50 µ? de amortiguador (control positivo) o 1 50 µ? de medio de cultivo no inoculado y 50 µ? de amortiguador (testigo). La densidad óptica a 600n m fue registrada después de 5 h de incubación anaeróbica a 37°C. Se promediaron las lecturas triplicadas, y se restaron los valores de OD6oo n m para el medio no inoculado de cada valor. Se determinó una inhibición de crecimiento de 50% como la mitad de la OD6oo n m +/- 0.05 final del cultivo de control . Las concentraciones de Trn-a en combinación con Trn-ß que produjo el 50% de inhibición se graficaron para generar un isobolograma . Las actividades específicas y proporciones óptimas de los 2 péptidos se determinaron en el punto de intersección del eje x y el eje y.

Demostración de actividad de Turicina CP usando curvas de eliminación.

El efecto de turicina contra C. difficile R027 NAPI , L. monocytogenes NCTC 5348, Lb. casei 338 y B. lactis Bb 1 2 se I determinó en Medio para Clostridium Reforzado (RCM Merck), Cal'do de i Infusión de Corazón y Cerebro (Merck), medio MRS (de Mann-Rogosa-Sharpe) (Difco) y M RS que contenía cisteína al 0.05% respectivamente. Se prepararon tres cultivos independientes para cada cepa y se cultivaron durante la noche a 37°C. Se prepararon tres réplicas en volúmenes de un mi de medio en caldo estéril de doble concentración para cada cepa y se inocularon con los organismos de prueba para dar cantidades de células iniciales de 1 05- 106/ml . Se añadió Turicinaj para dar la concentración y el volumen requeridos hasta 2 mi con agua destilada estéril . La bacteriocina se omitió del control y el volumen se sustituyó con agua estéril. Las muestras se sacaron en intervalos, diluidos en serie y colocados en placas en RCA, agar BHI, agar MRS o ¡ agar MRS que contenía cisteína al 0.05% dependiendo de la cepa. Las placas se contaron después de 24 h (L. monocytogenes) o 48h (C. difficile, Lb. casei 338 y B. lactis Bbl2) incubación a 37°C.

Determinación de concentraciones inhibidoras mínimas i Se tomaron los ribotipos 001, 106 y 027 de C. difficile en existencia a -80 °C y se cultivaron en agar anaeróbico de Fastidious que contenía sangre de caballo desfibrinada al 7%. Antes del uso se transfirió una colonia en cada uno de tres volúmenes de 10ml de' RCM y se cultivaron durante la noche a 37°C. Luego los cultivos se subcultivaron en 10ml de RCM fresco al 1%.

Se montaron tres réplicas para cada cepa. Los cultivos se cultivaron durante 6h anaeróbicamente a 37°C. Se prepararon i soluciones de vancomicina y metronidazol en agua y soluciones de turicina diluidas a partir de la solución madre de amortiguador fosfato 50 mM con pH 6.5. Se prepararon diluciones en serie de dos veces de los compuestos antimicrobianos (100 µ?) en placas de microtitulación para cada compuesto. Se diluyeron cepas de C. difficile 1:10 en RCM de doble concentración y se le añadieron 100 µ? a dada pocilio. Se establecieron controles para cada cepa sin la adiciórt de antimicrobianos. Las placas de microtitulación se incubaron durante 16 h a 37°C anaeróbicamente y se leyó la OD de las placas después de la incubación usando un lector de placa de microtitulación. La MIC se definió como la concentración en la cual no hubo ninguna evidencia de crecimiento.

Demostración de lisis de C. difficile mediante Turicina CP.

I El efecto de la lisis de Turicina CD sobre C. difficile se llevó a cabo como lo describe Rea et al. (2007).

Determinación de estabilidad de turicina en fermentación fecal Preparación de inoculo de C. difficile Se tomó C. difficile DPC 6537 (PCR Ribotipo 001) de la existencia a -80 °C y se rayó sobre Agar Anaeróbico de Fastidibus y se incubó anaeróbicamente a 37°C. La noche anterior al experimento se inoculó ~ 1 colonia en 10 mi de RCM que había sido hervido y enfriado previamente y se incubó anaeróbicamente a 37°C.

Preparación de Medio fecal Se preparó medio de cultivo fecal como lo describe Fooks y Gibson (2003) con las siguientes modificaciones menores. Los ingredientes se constituyeron hasta 800 mi, se ajustó el pH a 6.8. Se le añadieron ciento sesenta mi a cada tanque de fermentación y se sometió a autoclave a 121 °C durante 15 min. Antes de la inoculación, el medio fecal se roció con 02-nitrógeno libre durante -1 h. Se elaboró una suspensión fecal al 20% a partir de una muestra fecal fresca en amortiguador fosfato 50 mM que contenía cisteina al 0.05% que se había hervido y enfriado previamente justo antes de su uso, y se mezcló usando un homogenizador Stomacher durante no más de 1 min. i Se inocularon dos tanques termentadores con 35 mi de la preparación en suspensión y 2 mi del cultivo que se hizo durante la noche de C. difficile. Se le añadió al tanque de prueba 1 mi de 100 mg/ml de i turicina a O, 8 y 1 6 h de incubación y ambos tanques se muestrearon a las 0, 4, 8, 1 2, 1 6, 20 y 24 h para los análisis microbianos de C. difficile and Bifidobacteria sp. También se tomaron muestras para el análisis de actividad de turicina usando WDA y MS MALD I-TOF.

Estabilidad de la turicina Se midió la estabilidad de la turicina d urante la fermentación usando WDA utilizando placas de agar RCM sembradas con C. difficile como se describió previamente. También se centrifugaron muestras de un mi y se hicieron pasar a través de columnas SPE con C 1 8 de 1 mi y los péptidos se eluyeron con propan-2-ol al 70%. La presencia de péptidos individuales se midió usando RP-HPLC como se describe previamente en este documento.

Análisis microbiológicos Se enumeró a C. difficile en agar CCEY (LabM) y Bifidobacterium sp. en agar MRS modificado que conten ía cisteína al 0.05% y 50 mg i de mupirocina/1 después de incubación durante 48 h y 72 h a l 37°C respectivamente. Estos experimentos se llevaron a cabo por duplicado.

Estabilidad de Turicina CP jugos gástricos simulado v porcino Efecto de jugo gástrico simulado, jugo ileal v de colon sobre la estabilidad de Turicina CP Se cultivó C. difficile 64539 durante la noche y se inoculó al 1 .25% en Agar para Clostridium Reforzado (RCA). Se prepararon jugo gástrico simulado, ileal y de colon tal como lo indica Breumer et al ( 1 992). Se constituyó Turicina CD hasta 1 00 mg/ml en 70% IPA. Se añadieron setenta µ? (concentración final 1 mg/ml) de turicina a 7000 µ? I de jugo gástrico porcino y jugo ileal y se incubó a 37°C. En intervalos I. se tomaron muestras y se midió la actividad usando el WDA utilizando placas sembradas con C. difficile. Las muestras también se analizaron para determinar la presencia de los péptidos Trn-a y Trn-ß usando MS MALDI-TOF.

Efecto de jugo gástrico porcino y jugo ileal ex vivo sobre la estabilidad de la Turicina CP Se cultivó C. difficile 64539 durante la noche y se inoculó al 1.25% en Agar para Clostridium Reforzado (RCA). Se preparó Turicina CD purificada como se describe en lo anterior. Se centrifugaron siete mi de jugo gástrico e ileal porcino durante 15 min a 12,000 rpm para eliminar los desechos. Se le añadieron setenta µ? (1 mg/ml) de turicina a 7000 µ? de jugo gástrico y jugo de íleo porcino y se incubaron a 37°C. Se tomaron muestras en intervalos y se midió la actividad usando el WDA y se verificó la presencia de los péptidos de Trn-a y Trn-ß usando MS MALDI-TOF.

Resultados El objetivo de este trabajo fue aislar el espectro estrecho de organismos productores de bacteriocina desde dentro del tracto Gl, con alto grado de actividad contra C. difficile, que pudieran producir la mínima perturbación de la flora residente en el GIT.

Selección inicial de productores de bacteriocina De - 30,000 colonias seleccionadas de una gama de muestras fecales de adultos sanos y enfermos, una colonia demostró( que I produce una zona de inhibición grande del cultivo revestido con C. (Figura 1 ). Esta colonia se aisló de la muestra fecal de un paciente con I BS . La purificación de esta colonia y el cultivo en caldo BH I mostraron que un compuesto antimicrobiano potente, activo contra C. difficile, fue producido en el medio de fermentación ; la actividad se perdió en el tratamiento con Proteinasa K, lo que indica que la sustancia antimicrobiana fue de naturaleza proteinácea (Figura 1 ). Este cultivo se almacenó en la colección de cultivo del Centro de Investigación de Alimentos Moorepark (Moorepark Food Research Centre) y se denominó DPC 6431 ; la bacteriocina se denominó Turicina CD .

Identificación de DPC 6431 a nivel de especies La secuenciación de ADNr 16S de DPC 6431 indicó la mayor homología (96%) de la cepa con B. cereus/B. thuringiensis/B. anthracis. La Duc et al (2004) han declarado que B. anthracis, B. cereus y B. thuringiensis se agrupan todos dentro de un ciado muy apretado (grupo B. cereus) filogenéticamente, y por lo tanto son indistinguibles unos de otros por medio de secuenciación de ADNr 1 6s. Se identificó posteriormente DPC 6431 como B. thuringiensis usando cebadores gyrB . Se obtuvieron los productos de PCR que correspond ían al tamaño correcto para B. cereus o B. thuringiensis (365 y 368 respectivamente) con controles positivos para cada uno de estos organismos. No se obtuvo ningún producto de PCR cuando los cebadores gyrB para B. cereus o B. anthracis se analizaron con ADN de B. thuringiensis DPC 6431 . Debido a la naturaleza patógena del B. anthracis no hubo ningún control positivo para ese cebador.

Caracterización de bacteriocina de DPC 6431 I I ' La mayor concentración de la Turicina CD se produjo durante la fase logarítmica tardía y la fase estacionaria de crecimiento probablemente coincidente con el inicio de la esporulación. J La actividad permaneció estable durante la fase de crecimiento estacionaria. El pH disminuyó durante la fase de crecimiento exponencial a -5.8 desde un pH inicial de -7.5; durante la fase estacionaria el pH se elevó de nuevo para cerrar su valor inicial (no se muestran datos): La incubación del extracto sin células con 25mg/ml de a-q!uimio tripsina y Proteinasa K dio como resultado una pérdida de actividad completa; la incubación con pepsina o tripsina mostró una reducción de 50% o de 20% en la actividad respectivamente después de 1 h de incubación a 37°C.

Los sobrenadantes sin células de turicina fueron activos en todo el rango de pH de 2-10 y estables al calor hasta 85°C, hubó una reducción en la actividad a 90 °C y la actividad se perdió a 100 °C ? después de 15 minutos de incubación a las temperaturas respectivas.

Espectro de inhibición de B. thuringiensis 6431 Cuando el sobrenadante sin células de B. thuringiensis 6431, se analizó contra una gama de bacterias Gram positivas y Gram negativas usando el método WDA, mostró un espectro de inhibición estrechó que inhibió especies de Bacillus muy relacionadas, tales como B. céreus, otras cepas de B. thuringiensis, B. mycoides y B. firmus; no se détectó ninguna inhibición contra B. subtilis o B. coagulans. Dentro del Clostridium sp. todos los aislados de C. difficile analizados, incluyendo Bacillus firmus LMG BHI 30°C ++;++ I 7125T Bacillus mycoides DPC BHI 30°C +++ 6335 Bacillus subtilis LMG BHI 30°C 8198 Bacillus subtilis DPC BHI 30°C 3344 Bacillus thuringiensis IBS 14 BHI 37°C | Bacillus thuringiensis LMG BHI 37°C +++ 7138 Bacteroides fragihs LMG BA 37°C 10263 Bifidobacterium DPC mMRS2 37°C adolescensis 6169 Bifidobacterium DPC mMRS 37°C animalis 5420 Bifidobacterium breve DPC mMRS 37°C 6166 Bifidobacterium breve BB12 mMRS 37°C Bifidobacterium DSMZ mMRS 37°C longum 20097 Bifidobacterium DSMZ mMRS 37°C merycicum 6493 Bifidobacterium DSMZ mMRS 37°C pseudolongum 20092 Campylobacter jejuni Cl 120 CA3 37°C Clostridium difficile ATCC RCA4 37°C + + + + 600 Clostridium difficile ATCC RCA 37°C + + + + 43594 I Clostridium difficile R027 RCA 37°C + + ++ NCTC 13366 Clostridium difficile 6220 RCA 37°C + +++ Clostridium difficile 6221 RCA 37°C + + ++ Clostridium difficile 6219 RCA 37°C + + + + Clostridium difficile 6350 RCA 37°C + + ++ Clostridium difficile 6351 RCA 37°C + + ++ Clostridium difficile I BS 1 6 RCA 37°C + +'++ Clostridium difficile Cr 1 5 RCA 37°C + + + + Clostridium difficile UC 38 RCA 37°C + + + + Clostridium difficile UC 38 RCA 37°C + + + + Clostridium difficile CR 79 RCA 37°C + + + + Clostridium difficile UC 47 RCA 37°C + +.'+ + I I Clostridium difficile CRI I RCA 37°C + + + + Clostridium difficile UC 29 RCA 37°C + +++ Clostridium difficile CR 02 RCA 37°C + +++ Clostridium difficile UC 59 RCA 37°C + +++ Clostridium difficile UC 27 RCA 37°C + +'+ + Clostridium difficile H 76 RCA 37°C + + ++ Clostridium difficile BS 47 RCA 37°C + + + + Clostridium NCI MB RCA 37°C histolyticum Clostridium indolis Clostridium lituseburense Clostridium sporogenes Clostridium tyrobutyricum Enterobacter sakazaki Enterobacter sakazaki Enterococcus casseliflavus Enterococcus durans Enterococcus faecalis LMG TSA 37°C 7973T Enterococcus faecium LMG TSA 37°C 7973T Enterococcus hirae LMG TSA 37°C 6399T Eschericia coli 3786 BHI 37°C Lactobacillus NCDO MRS 37°C acidopuilus 1697 Lactobacillus LMG MRS 37°C bulgaricus 6901 ' Lactobacillus casei ATCC MRS 30°C 334 Lactobacillus crispatus LMG MRS 37°C + 9479T Lactobacillus curvatus LMG MRS 37°C ÷ 12009 ' I Lactobacillus LMG MRS 37°C +{+ fermentum 6902 Lactobacillus LMG MRS 37°C gallinarum 9435T Lactobacillus LH I MRS 37°C t helveticus \ i Lactobacillus johnsomi DSM MRS 37°C + 10533T Lactobacillus 338 MRS 37°C paracasei Lactobacillus reuteri NCIMB MRS 37°C - 1 1 951 | Lactobacillus GG MRS 37°C I rhamnosus Lactobacillus ruminis DSM MRS 37°C 20403T Lactobacillus salivatus UCC MRS 37°C ÷ 1 1 8 | Lactococcus lactis DPC LMI 7 30°C f Lactococcus lactis H P LMI 7 30°C Leuconostoc DPC MRS 30°C 139 Leuconostoc DPC MRS 30°C 240 Listeria innocua DPC BH I 37°C + + + 3572 Listeria DPC BH I 37°C + + + monocytogenes 1 768 Listeria DPC BH I 37°C + + + monocytogenes 3437 Listeria Scott A BH I 37°C + + + monocytogenes Micrococcus luteus DPC BH I 37°C 6275 Micrococcus luteus LMG BH I 30°C 3293 Pediococcus LMG MRS 30°C pentasaceus 1 1488 Propionibacterium LMG SLAB 37°C avidium Proprionibacterium LMG SLA 37°C acné Propionibacterium NCFB SLA 30°C Q jensenu 565 Propionibacterium NCFB SLA 30°C jensenu 850T Pseudomonas putida ATCC BH I 37°C Pseudomonas putida ATCC BHI 37°C ÷ 17522 Salmonella entérica DPC BHI 37°C j serovar Typhimurium 6046 Salmonella entérica DPC BH I 37°C serovar Derby 6049 Staphylococcus aureus ATCC TSA 37°C 25923 Staphylococcus aureus DPC TSA 37°C 7 3767 Staphylococcus DPC BHI 37°C saphrophyticus 6289 Streptococcus LMG TSA 37°C algalactiae 14694' Streptococcus bovis DPC BH I 37°C 5244 Streptococcus DPC BH I 37°C dysgalactia 5345 Steptococcus mutans DPC TSA + 37°C 61 59 61 59 sacarosa7 Steptococcus mutans DPC TSA + 37°C 61 55 61 55 sacarosa Steptococcus mutans DPC TSA + 37°C 6143 6143 sacarosa 1 Caldo para infusión de corazón y cerebro 2MRS modificado q ue conten ía ci steína al 0.05% ; 3Agar para Campylobacter 4Agar para Clostridium Reforzado; 5Agar de Tripticasa de soya ; 6Agar de lactato de sodio; 7 Agar de Tripticasa de soya que contenía sacarosa 25m .

(Se midieron las zonas de inhibición (mm) y se determinó la sensibilidad relativa midiendo el diámetro de la zona. Las zonas de tamaño < 9 mm fueron denominadas +; las de 1 0- 1 5 mm fueron denominadas + + ; las de 1 6- 21 mm fueron denominadas ++ + ; las de > 22 mm fueron denominadas ++++) Caracterización de Turicina CP. j La purificación de la turicina usando perlas XAD y separación de componentes activos usando RP-HPLC dio como resultado 2 ¡picos separados por pocilio a los 26 minutos y a los 34 mi nutos (Figura 2 A) con masas moleculares de 2786 y 2883 respectivamente. Estos péptidos hidrofóbicos fueron denominados Turicina CD Trn-a (masa molecular 2883) y Trn-ß (masa molecular 2786) ( Figura 2 B y C). La actividad estuvo presente tanto en el sobrenadante sin células como también por extracción con propan-2-ol del granulado celular, ló que indica que la turicina también se une a la pared celular. Los estudios con WDA de ambos péptidos muestra que esta es una bacteriocina de dos componentes; el Trn-a tiene actividad cuando está presente solo, sin embargo su actividad es mejorada por la presencia de Trn-ß. En bajas concentraciones (~ 2.5µ ?) se requieren ambos péptidos para la actividad usando el WDA (Figura 2 D). ¡ Dilucidación de la secuencia de aminoácidos. j i La degradación Edman identificó la secuencia de aminoácidos de los primeros 22 aminoácidos para la Turicina CD Trn-a (G-N-A-Á-C-V- [l/L]-G-C-[l/L]-G-S-C-V-[l/L]-S-E-G-[l/L]-C-N- E) y 22 aminoácidos para la Turicina CD Trn-ß (G-W-V-A-V-V-G-A-C-G-T-V-C-L-A- S-G-G-V-C-E-C-F). A pesar de los repetidos esfuerzos, no fue posible determinar secuencia de datos adicionales usando esta técnica. Nó se identificaron secuencias homologas cuando se compararon las secuencias anteriores con la base de datos de NCBI en http :// www.ncbi .nlm .nlh .gov Determinación inicial de la secuencia de nucleótidos La orientación de los genes que codifican los dos péptidos se muestra en la Figura 3. El producto de PCR obtenido contiene el extremo terminal C del péptido Trn-ß y el sitio de unión ribosómica y las secuencias promotoras para Trn-ß, así como también contiene su codón de inicio metionina y la secuencia de aminoácidos del terminal N .

Análisis de secuencia del producto de PCR inversa La secuencia de nucleótidos completa de los dos péptidos se determinó junto con el codón de inicio metionina y la secuencia de péptido l íder como se indica a continuación.

Secuencia de ADN de Trn-a ATGGAAGTTATGAACAATGCTTTAATTACAAAAGTAGATGAGGAGATTG GAGGAAACGCTGCTTGTGTAATTGGTTGTAT TGGCAGTTGCGTAATTAGTGAAGGAATTGGTTCACTTGTAGGAACAGCA TTTACTTTAG GTTA Secuencia de ADN de Trn-ß ATGGAAGTTTTAAACAAACAAAATGTAAATATTATTCCAGAATCTGAAG AAGTAGGTGGTTGGGTAGCAGTAGTAGGTGC ATGTGGTACAGTATGCTTAGCTAGTGGTGGTGTTGGAACAGAGTTTGCA GCTGCATCTTATTTCCTATAA Las secuencias de aminoácidos completas de ambos péptidos se i determinaron y se muestran más adelante junto con el péptido l íder. Los péptidos l íder se escinden en GG Secuencia de proteína de Trn-c MEVM NNALITKVDEE I GGNAACVIGCIGSCVISEG IGSLVGTAFTLG Secuencia de proteína de Trn-ß ' MEVLN KQNVN I IPESEEVGGWVAVVGACGTVCLASGGVGTEFAAASYFL El análisis de la secuencia de las regiones circundantes revela un supuesto promotor corriente arriba ubicado antes de una proteína hipotética seguido por dos sistemas transportadores ABC y luego los péptidos de Trn-a y Trn-ß. Tres proteínas inusuales están ubicadas corriente abajo de los péptidos, dos proteínas SAM S-adenosilmetionina radicales y una proteasa en el terminal C. ¦ Actividad específica de turicina.

El isobolgrama (Fig. 3) muestra que la M IC5o de la turicina ¡Trn-ß (0.5 µ ?) es 10 veces menor q ue la de Trn-a (5µ ?) cuando están presentes como péptidos individuales, sin embargo cuando los péptidos se combinan, la M IC50 de Trn-ß se reduce a 0.05 µ? cuando se combina con 0.025 µ Trn-a , lo que indica que la turicina Trnra se puede elaborar 1 00 veces más activa cuando se le añaden bajas concentraciones de Trn-a. Estos resultados muestran q ue cuando se combi nan los 2 péptidos en bajas concentraciones (< 1 µ?) son muy inhibidores para C. difficile cuando se combinan en una proporción de 2: 1 Trn-ß: Trn-a.

La naturaleza bactericida de la Turicina CD se demuestra jen la Figura 5; los experimentos iniciales determinaron la concentración de turicina requerida para eliminar C. difficile usando curvas de eliminación. Doscientas UA de turicina/ml red ujeron las células viables de C. difficile PCR ribotipo 027 de ~ 106/m l a cero en un periodo de 2 h . La misma concentración de turicina redujo las cantidades de células de L. monocytogenes en 1 .5 ciclos log y no tuvo efecto sobre la viabilidad de los probióticos Lb. casei 338 y B . lactis BB 1 2 en el mismo periodo de tiempo (Figura 5). La adición de Turicina CD al C. difficile en crecimiento logarítmico produjo una reducción gradual de OD 600 nm ; esta disminución de OD fue correlacionada con una liberación concomitante de la enzima intracelular acetato cinasa en el medio de t cultivo. En contraste, no hubo disminución en la concentración de acetato cinasa en la muestra de control sin turicina .

La Turicina CD también es efectiva contra C. difficile ribotipp 001 en un modelo de ambiente fecal cuando se añade a 0, 8 y 1 6 h (Fig . 6A). Las fermentaciones fecales reforzadas con 106 U FC de C. difficile ribotipo 001 /ml mostraron que cuando se le añadieron 500 (Jg de turicina a as 0, 8 y 1 6 h , se redujo el C. más de 1 000 veces en ! comparación con el control después de 16 h de incubación. La actividad de la Turicina CD se mapeó en el transcurso de la fermentación como se demuestra en la Figura 6B. Como se puede ver claramente, la adición de 500 pg de turicina a las 0, 8 y 16 h produjo la reducción de crecimiento de C. difficile. Los péptidos de turicina Trn-a y Trn-ß fueron detectados mediante RP-HPLC después de 0 h (línea negra) y 4 h de fermentación en el modelo de fermentación fecal (Fig. 6C). La presencia de turicina no afectó las cantidades de BifidobaCteria i con relación al control hasta 16 h de incubación. j Los estudios estabilidad de los péptidos de turicina Trn-a y jTrn-ß en jugo gástrico simulado (Fig. 7A), ¡leal (Fig. 7B) y de colon (Fig. 7C) demostraron que no hubo reducción de actividad en ninguno de los ambientes intestinales simulados cuando la Turicina CD se incubó durante 2, 4, o 9 horas en jugo gástrico, ¡leal y de colon, respectivamente. Además, la incubación de péptidos de turicina Trn-a y Trn-ß durante 2 h y 5 h en jugo gástrico porcino ex vivo (Fig. 7D) y en jugo ileal (Fig. 7E), respectivamente, también demostró que no hubo reducción alguna en la actividad. Los resultados de determinación de la concentración mínima inhibidora de turicina muestran que los ribotipos significativos clínicamente de C. difficile son más sensibles a la turicina en comparación con los antibióticos vancomicina y metronidazol!, que se usan actualmente para el tratamiento, tal como se muestra en la Tabla 2 siguiente. Los ribotipos 001 y 106 comúnmente están asociados con brotes de CDAD en los hospitales irlandeses y del Reino Unido, respectivamente, mientras que el ribotipo 027 está asociado con aumento en la intensidad de los síntomas y en la morbilidad debido a la ? elevada producción de toxinas resultante en la enfermedad que es más resistente al tratamiento.

Tabla 2. Comparación de concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) para turicina. vancomicina y metronidazol contra una gama de ribotipos significativos clínicamente de C. difficile.

Discusión Debido a la alta incidencia de C. difficile en los hospitales e instalaciones para personas de edad avanzada a nivel mundial, se tienen que considerar enfoques radicales para el tratamiento dej esta enfermedad, el lantibiótico de dos componentes lanticina 3147 ha demostrado ser muy efectivo para eliminar C. difficile en bajas concentraciones, sin embargo, dado su amplio espectro antibiótico también afecta a las poblaciones de Lactobacillus y Bifidobacterium (en 3 ciclos log) en fermentaciones fecales simples en las concentraciones requeridas para eliminar C. difficile (Rea et al., 2007). j El trabajo reportado aquí se enfocó en la búsqueda dentro del tracto Gl de fuentes de bacterias productoras de antimicrobianos para enfrentar este problema. El objetivo fue aislar un espectro estrecho de productores de bacteriocina, que pudiera tener actividad potente contra C. difficile y al mismo tiempo perturbar la microbiota intestinal tan poco como sea posible. Como resultado de la selección de -30,000 colonias de muestras fecales, se detectó una colonia que mostró inhibición del recubrimiento con C. difficile. Las muestras fecales habían sido tratadas previamente con etanol para facilitar el aislamiento de bacterias formadoras de esporas. El hecho de que sólo se aislara una colonia productora de antimicrobiano de solo una muestra en una baja dilución, podría sugerir que la cepa de B. thuringiensis DPC 6431 aislada no era un constituyente principal de la microbiota intestinal.

La caracterización del péptido antimicrobiano producido por DPC 6431, Turicina CD, demostró que su espectro de inhibición i antimicrobiana (usando WDA) es estrecho y al mismo tiempo es muy efectivo contra aislados de C. difficile, incluyendo el ribotipo PCR 027 que tiene poca o ninguna actividad contra la microflora beneficiosa, como en el caso de las poblaciones de Lactobacillus y Bifidobacterium.

B. thuringiensis es un patógeno de insecto Gram positivo formador de esporas que se ha usado extensamente durante muchos años en el control biológico de plagas. Previamente se han identificado bacteríocinas de una cantidad de cepas de B. thuringiensis (Ahern et al., 2003; Barboza-Corona et al, 2007; Chechimi et al. 2007; Cherif et al, 2003; Cherif et al., 2001; Favret & Yousten, 1989; Gray et al., 2006a; Gray et al. 2006b; Kamoun et al., 2005). Ahern et al. ¡ 2003 Í caracterizaron una sustancia BLIS de una cepa de B. thuringiensis q ue produjo 2 péptidos activos denominados turicina 439a y turicina 439b; I ambos péptidos mostraron actividad antimicrobiana, sin embargo ho se reportó actividad de los 2 componentes. A partir de una investigación en la bibliografía, la secuencia y la masa molecular de la turicina | 6431 es la más similar a la producida por B. thuringiensis 439. Ahern et al (2003) reportaron que las secuencias de aminoácidos de los dos péptidos 439a y 439b fueron idénticas pero los péptidos tienen pesos moleculares diferentes. La secuencia reportada para la turicina 439a/b tiene 2 aminoácidos no identificados (x) los cuales los autores sugieren i que probablemente sean cisteína, por lo tanto, hay justo 2 aminoácidos distinguibles (una cisteína en lugar de una valina y un ácido glutámico í en lugar de valina) en los primeros 19 aminoácidos de los péptidos de i B. thuringiensis 6431 y 439. Sin embargo, el Trn-a de Turicina CD es significativamente diferente del péptido turicina 439. La Turicina CD demostró que es muy activa contra una gama de especies dé i Clostridium, mientras que no se reportó ninguna actividad j anti- Clostridium para la turicina 439 (Ahern et al, 2003). Una comparación i entre las secuencias de aminoácidos y las masas moleculares; y el I espectro de actividad de Turicina CD y 439 se muestra a continuación en la Tabla 3. ¡ Tabla 3. Comparación de tu rici na ide ntificada en este estu dio con la tu rici na 439 de Aherne et al (2003) I ! Bacterioci na Secuencia de Masa Acti idad aminoácido molar inhibidora (Da) contra especies de Clostridium I I Turicina CD G-N-A-A-C-V-l-G-C-l-G- 2763 Si ! Trn-a S-C-V-l-S-E-G-l-G- SLVGTAFTLG Turicina CD G-W-V-A-V-V-G-A-C-G- 2861 SÍ ; Trn-ß T-V-C-L-A-S-G-G-V-G-T- E-F-A-A-A-S-Y-F-L G-W-V-A-X-V-G-A-X-G- 2919.9 No T-V-V-L-A-S-G-G-V-V G-W-V-A-X-V-G-A-X-G- 2803.8 No ; T-V-V-L-A-S-G-G-V-V i La secuencia de ácido nucleico y la orientación de los genes que codifican los péptidos del péptido 1 y el péptido 2 de turicina se muestran en la Figura 3. Una búsqueda en la base de daos del NCBI no mostró secuencias homologas a las secuencias identificadas aquí. Las discrepancias entre las masas moleculares determinadas por MS MALDI-TOF (2763 y 2861) y de la secuencia de aminoácidos (2770 y 2864) de la Turicina CD podría parecer que es el resultado de modificación post traduccional. La masa predicha para la secuencia de ADN de los péptidos Trn-a y Trn-ß, 2769 Da y 2876 Da, respectivamente, difiere en 6 unidades de masa de la que se obtuvo ! de la MS (espectrometría de masas). Para Trn-a, las diferencias en masa indican una pérdida de dos átomos de hidrógeno para cada una de Ser 21 , Thr 25 y Thr 28 y para Trn-ß es sugestivo q ue Thr 21 , Ala 25 y Tyr 28 son todas unidades de masa más ligeras de lo esperado. Los residuos de Cys para ambos péptidos están en las mismas posiciones (residuos 5, 9 y 1 3), mientras que las modificaciones j post traduccionales ocurren en las mismas posiciones (residuos 21 , 25 y 28) La Turicina CD es activa en una amplia gama de pH y conserva actividad moderadamente estable con el calor hasta 95 °C durante 1 5 minutos. Los estudios de M IC50 muestran que este es un inhibidor potente de C. difficile en concentraciones tan bajas como 0.5 y 5 µ (Trn-a y Trn-ß respectivamente) cuando están presentes como pépTidos solos en M IC50 se reduce hasta 0.05 µ ? cuando ambos péptidos están presentes indicando que la turicina es una bacteriocina de 2 componentes altamente activa contra C. difficile en bajas concentraciones. Las curvas de eliminación demostraron que la Turicina CD es muy efectiva para reducir las cantidades de células de C. difficile ribotipo 027 (NAP 1 ) en bajas concentraciones y también es de naturaleza lítica. La eficacia de la turicina contra C. difficile 027 es significativa dado que esta cepa ha demostrado ser hiper virulenta, la incidencia de la misma está aumentando a nivel mundial lo que produce una mayor intensidad , alta tasa de recaídas y mortalidad significativa (Kuiper et al 2007). Las comparaciones de los valores de MIC para la turicina con los obtenidos para la vancomicina y el metronidazol , que son los anti bióticos actuales utilizados para tratar infecciones de C. i difficile son significativas cl ínicamente. De manera interesante, una concentración de Turicina CD similar no afectó la viabilidad de L. casei 338 o de B . lactis Bb 12 en contraste con el efecto de la lacticina' (Rea et al. , 2007) lo que podría indicar que la flora beneficiosa en los intestinos podría no ser perturbada por este anti microbiano.

Cuando se evalúan los péptidos obtenidos microbianamente; para el tratamiento o prevención de enfermedad , es necesario abordar el problema de la biodisponibilidad . La degradación demostrada de la actividad antimicrobiana de Turicina CD in vitro con la a-quimiotrijpsina y la pepsina y la tripsina podrían sugerir que esta bacteriocina podría no sobrevivir al tránsito gástrico sin protección , tal como encapsulación . Sin embargo, la estrategia alternativa de alimentar esporas o células vegetativas de este organismo como probióticos se podría investigar como método para apuntar el suministro de este péptido dentro del G IT. Los cultivos de probióticos usual mente están asociados con especies de bacterias que son habitantes normales del G IT tales como las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium. Sin embargo, S. boulardii, que no es un constituyente normal de la microbiota intestinal humana, actualmente se usa como probiótico! en el tratamiento de CDAD. Actualmente se usan especies de Bacillus como cultivos probióticos para uso humano y animal (para revisiones ver Hong et al 2005 y Sanders et al 2003). ¿ Debido a q ue las esporas pueden sobrevivir en ambientes hostiles la pregunta ha sido planteada para su hábitat verdadero? Aunque se podría asumir que ellas llegan al intestino humano como consecuencia de la ingestión de la espora del medio ambiente, Hong ef al (2005) declaran , sin embargo, q ue hay la posibi lidad de que las especies de Bacillus existan en una relación endosi mbiótica, siendo su huésped capaz de sobrevivir temporalmente y proliferar en el intestino. La ventaja de administrar esporas sobre células vegetativas es su estabilidad y su capacidad de pasar a través del entorno hostil del estómago. En estudios en ratones se ha demostrado que aunque las células vegetativas de B. subtllús no sobrevivieron al paso a través del estómago, casi todas las esporas administradas sobrevivieron al tránsito gástrico y fueron recuperadas en el intesti no delgado (Due et al 2003).

En un estudio en trabajadores de i nvernadero que excretaron B. thuringiensis debido a la exposición ocupacional a plaguicidas a base de B. thuringiensis ningún síntoma gastrointestinal se correlaciono con la presencia de B. thuringiensis en las muestras fecales (Jensen et al. 2002). Un estudio de B. thuringiensis en el intesti no de ratas asociadas a la flora humana que habían sido alimentadas con esporas de B. thuringiensis y células vegetativas, no detectó ningún efecto adverso sobre la composición de la flora intestinal autóctona ni efecto citotóxico alguno en muestras de intestino mediante el análisis de células! Vero (Wilkes et al., 2006).

Aunque hay una discrepancia entre los resultados usando las enzimas proteolíticas y el resultado en los diversos ambientes G l , una explicación para esto puede ser que la concentración de enzimas purificadas utilizada es mucho mayor que la presente en los ambientes Gl . Nótese que estos resultados se refieren a los péptidos de tu'ricina solamente y no a las células o esporas vegetativas.

En conclusión este trabajo ha demostrado que la cepa de B. thuringiensis DPC 6431 produce una potente bacteriocina dej dos componentes estable al calor que tiene potencial como nuevo agente terapéutico CDAD ya sea en forma de péptido o como probiótico en i cualquier formato de célula vegetativa o espora. I La bacteriocina de la invención tiene numerosas ventajas'. La sustancia antimicrobiana denominada Turicina CD se produjo en el medio de fermentación ( 1 litro de medio produjo 350 mg de turicijna) y el sobrenadante sin células mostró un espectro de inhibición estrecho que inhibió las especies de Bacillus, C. difficile incluyendo el ribotipo PCR 027, C. perfringens y Listeria monocytogenes. Las especies de Bifidobacterium y Lactobacillus no fueron inhibidas, con excepción de Lb. fermentum y Lb. crispatus y Lb. johnsonii, que fueron inhibidas muy débilmente. La bacteriocina es estable al calor, activa en una amplia i gama de pH y es sensible a una gama de enzimas proteolíticas,. Es una bacteriocina de dos componentes en la que los péptidos tienen masas moleculares de 2763 (Trn-a) y 2861 (Trn-ß) . La Turicina CD presentó una M IC50 de 0.5 µ? y 5µ? para Trn-ß y Trn-ct respectivamente, cuando ambos péptidos estuvieron presentes solos.

Cuando los péptidos estuvieron presentes juntos, la M IC5d fue de 50 nM ! de Trn-ß en combinación con 25 nM de Trn-a; una proporción de 2¡: 1 . El efecto bactericida de la Turicina CD se demostró a través de experimentos de eliminación en el tiempo en los cuales fueron i eliminadas -5 x 1 06 UFC de C. difficile por mi en un periodo de 1 80 min en una concentración de 200 UA/ml. La Turicina CD es una bacteriocina de dos componentes activa en concentraciones I nanomolares.

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Claims (27)

REIVINDICACIONES

1 . B. thuringiensis 6431 depositada en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria bajo el N ° de Acceso 41 490 y cepas que son sustancialmente similares a ella , que también codifican u na bacteriocina efectiva contra Clostridium difficile y Listeria monocytogenes.

2. Una bacteriocina efectiva contra Listeria monocytogenes y Clostridium difficile, producida por una cepa bacteriana tal y como se describe en la reivindicación 1 .

3. Una bacteriocina denominada Turicina CD que contiene 2 péptidos, Trn-a y Trn-ß, Trn-a tiene una masa molecular de aproximadamente 2763 y Trn-ß tiene una masa molecular de aproximadamente 2861 .

4. Una bacteriocina tal y como se describe en la reivindicación 3 que es estable en calor de hasta aproximadamente 85° Centígrados.

5. Una bacteriocina tal y como se describe en las reivindicaciones 3 o 4 que tiene reducción de actividad en aproximadamente 90° Centígrados y una pérdida de actividad en aproximadamente 1 00° Centígrados después de 1 5 minutos de incubación .

6. Una bacteriocina tal y como se describe en las reivindicaciones 3 hasta 5 que tiene la capacidad de inhibir Bacillus cereus, otros Bacillus thuringiensis Clostridium difficile, Listeria monocytogenes, B. mycoides, B. firmus, C. difficile ribotipo 027 , C. tyrobutyricum, C. lithuseburense, C. ¡ndolis y C. perfringens.

7. Una bacteriocina tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 3 hasta 6 que es activa en el rango de pH de 2 a 10.

8. Una bacteriocina tal y como se describe eJ las reivindicaciones 2 hasta 7 que tiene un efecto bactericida contra C. difficile de aproximadamente 5 x 106 UFC de C. difficile por mi siendo eliminado en un plazo de 180 minutos cuando la turicina CD, está presente en una concentración de 200 AU/ml. j

9. Una bacteriocina tal y como se describe en la reivindicación 2 hasta 8 que tiene un espectro de inhibición tal como se muestra en la Tabla 2.

10. Una bacteriocina tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 hasta 8 en la cual el componente Trn- aitiene una secuencia de aminoácidos de GNAACVIGCIGSCVISEGIGSLVGTAFTLG y un componente de turicina CD Trn-ß tiene la secuencia de aminoácidos GWVAVVGACGTVCLASGGVGTEFAAASYFL. I i

11. Una célula huésped que contiene al menos uno del componente de turicina CD que codifica el gen Trn-a o el componente de turicina CD que codifica el gen Trn-ß.

12. Componente de turicina CD Trn-a que contiene la secuencia denominada Trn-alfa como se muestra en la Figura 3.

13. Componente de turicina CD Trn-ß que contiene la secuencia denominada Trn-beta como se muestra en la Figura 3.

14. Una célula huésped tal y como se describe en la reivindicación 1 1 caracterizada además porque los genes tienen las secuencias de ácido nucleico que se muestran en la Figura 3, o secuencias que son sustancialmente similares a ellas y que también codifican actividad de bacteriocina.

15. Un componente de Turacina que tiene cualquiera d las secuencias de aminoácidos denominados Trn-alfa o Trn-beta como se muestra en la Figura 3, o secuencias que son sustancialmente similares a ellas y que también presentan actividad de bacteriocina .

16. Una composición desinfectante que contiene la cepa bacteriana tal y como se describe en la reivindicación 1 , 22 o 23, una célula huésped tal y como se describe en la reivindicación 1 1 ; una i bacteriocina tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 - 1 0, o un componente de Turicina CD tal y como se describe en la reivindicación 12 o en la reivindicación 1 3.

17. Un cultivo probiótico que contiene células vegetativas o esporas de una cepa tal y como se describe en la reivindicación 1 o una célula huésped tal y como se describe en la reivindicación 1 1 .

18. Una composición esporicida que contiene una cepa tal y como se describe en la reivindicación 1 , 22 o 23, o una célula huésped tal y como se describe en la reivindicación 1 1 o una bacteriocina tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 - 1 0 o un componente de Turicina CD tal y como se describe en la reivindicación 12 o 1 3.

19. Una composición farmacéutica que contiene una cepa bacteriana tal y como se describe en la reivindicación 1 , 22 o 23, una bacteriocina tal y como se describe en las reivindicaciones 2 - 1 0, ó una célula huésped tal y como se describe en la reivindicación 1 1 , o un componente de Turicina CD tal y como se describe en la reivindicación 12 o 1 3, junto con un portador aceptable farmacéuticamente.

20. Una composición farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 19 formulada como una preparación para enema .

21 . Una composición farmacéutica tal y como se describe |ß? la reivindicación 1 9 que contienen péptidos encapsulados adaptadosj para apuntar al colon . j

22. Una cepa bacteriana que produce turicina CD, o un péptido que contiene las secuencias de turicina Trn-a o Trn-ß .

23. Capas recombinantes incluyendo probióticos aislados del intestino que han sido diseñados para producir el péptido o péptidos de turicina CD.

24. Una composición probiótica que contiene preparaciones de cultivos vivos o muertos de las cepas tal y como se describe en la reivindicación 1 , 22 o 23, la célula huésped tal y como se describe en las reivindicaciones 1 1 o la bacteriocina tal y como se describe en las reivindicaciones 2-1 0 o un componente de Turicina CD tal y como se describe en la reivindicación 1 2 o 1 3 para uso en aplicaciones veterinarias, en seres humanos o aves de corral , incluyendo inhibición de Clostridium en aves de corral . ,'

25. Composiciones tópicas que contienen una cepa bacteriana tal y como se describe en la reivindicación 1 , 22 o 23, una bacteriocina tal y como se describe en las reivindicaciones 2 - 10, o una célula huésped tal y como se describe en la reivindicación 11, p un componente de Turicina CD tal y como se describe en la reivindicación 12 o 13, junto con un portador, para el tratamiento de heridas e infecciones de la piel por gangrena gaseosa producida por Clostridium spp.

26. Una célula bacteriana sustancialmente como se describe aquí con referencia a los Ejemplos o los dibujos anexos.

27. Una bacteriocina sustancialmente como se describe! aquí con referencia a los Ejemplos o los dibujos anexos.