CN115927255A - 多肽和抗含有该多肽的革兰氏阴性菌的抗生素 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有内溶素活性的新型多肽、包含该多肽和抗菌活性蛋白的融合蛋白、该多肽和/或融合蛋白的抗革兰氏阴性病原体的抗菌用途和/或用于预防和/或治疗革兰氏阴性病原体感染和/或与革兰氏阴性病原体感染相关的疾病或症状的用途。

Description

多肽和抗含有该多肽的革兰氏阴性菌的抗生素

技术领域

本发明提供了一种具有内溶素活性的新型多肽、包含内溶素肽和抗菌活性蛋白的融合蛋白，以及抗多肽和/或融合蛋白的革兰氏阴性病原体的抗生素和/或作为药物组合物用于预防和/或治疗革兰氏阴性病原体感染和/或与革兰氏阴性病原体感染相关的疾病或症状的用途。

背景技术

噬菌体是指感染特定细菌并抑制和阻碍受感染细菌生长的细菌特异性病毒。噬菌体具有在感染宿主细菌后以细菌细胞内增殖的方式杀死细菌，并当子代噬菌体在增殖后从细菌中出来时，使用内溶素(噬菌体的一种蛋白质)破坏宿主细菌的细胞壁。因此，具有噬菌体的内溶素活性的物质可以有效地用作抗生素候选物。

最近，抗生素耐药细菌迅速增加，不能用任何抗生素治疗的多药耐药细菌也在增加。特别是，革兰氏阴性菌之一的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是ESKAPE(屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌属(Enterobacter species))细菌中的一种，其在全球范围内迫切需要开发新的治疗方法，而大肠杆菌(Escherichia coli)也是一种参与各种感染的细菌。因此，需要开发一种不同于传统抗生素的治疗方法。

发明内容

技术问题

一方面提供了一种突变多肽，其中引入了一种突变，该突变中与选自由SEQ IDNO：2的氨基酸序列中的第39、43、45、73、81、101和113位组成的组中的至少一个位置对应的氨基酸被不同于原始氨基酸的氨基酸取代。

另一方面提供了一种融合多肽，包含含有杀菌肽A和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，或包含突变多肽。

另一方面提供了一种编码突变多肽或融合多肽的多核苷酸。

另一方面提供了一种包含多核苷酸的重组载体。

另一方面提供了一种重组细胞，包含多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体。

另一方面提供了一种抗生素，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：

编码突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一方面提供了一种用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物组合物，其包含选自由以下组成的组中的至少一种：

编码突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一方面提供了一种包含抗生素的饲料添加剂。

另一方面提供了一种包含抗生素的消毒剂。

另一方面提供了一种包含抗生素的洗涤剂。

技术方案

本发明提供了一种对革兰氏阴性病原体具有增强的抗菌活性以及与标准治疗抗生素一起使用时观察到协同效应的工程内溶素。

一方面提供了SEQ ID NO：2或6的多肽。该多肽可以作为革兰氏阴性菌的内溶素，并且可以用作抗生素。当通过重组合成多肽时，可在SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的N端添加甲硫氨酸(M)作为第一个氨基酸残基。

另一方面提供了一种融合多肽，其包含SEQ ID NO：2或6的多肽和抗生素蛋白，例如杀菌肽A(例如，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)。在融合多肽中，多肽和抗生素蛋白彼此可直接(无接头)或通过肽接头融合。例如，融合多肽可包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2(EC340)

VSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGHYGPDVTPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAAAHHSLTQAQFDAVCDLVYNAGAGVIAATTGTGKALRSGDIATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKG

SEQ ID NO：6(mtEC340)

VSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKG

SEQ ID NO：10(LNT113；杀菌肽A-GGGGSx3接头-mtEC340)

MKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAKGGGGSGGGGSGGGGSVSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKG

SEQ ID NO：8(杀菌肽A)

KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK

SEQ ID NO：9(杀菌肽A，M被添加到SEQ ID NO：8的N-端)

MKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK

另一方面提供了一种编码多肽或融合多肽的多核苷酸。

另一方面提供了一种包含多核苷酸的重组载体。重组载体可以是表达载体。

另一方面提供了一种包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。重组细胞可用于表达多核苷酸。

另一方面提供了一种抗生素，其包含选自由以下组成的组中的至少一种：

多肽，例如，SEQ ID NO：2或6；

融合多肽，例如，SEQ ID NO：10；

编码多肽或融合多肽的多核苷酸；

包含多核苷酸的重组载体；和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

该抗生素可对一种或多种(例如：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)革兰氏阴性菌具有抗菌活性。

另一方面提供了一种用于预防和/或治疗革兰氏阴性菌感染和/或与革兰氏阴性菌感染相关(由其引起)的症状或疾病的药物组合物，并且该药物组合物可以包含选自由以下组成的组中的一种或多种：

上述多肽，例如，SEQ ID NO：2或6；

上述融合多肽，例如，SEQ ID NO：10；

编码多肽或融合多肽的多核苷酸；

包含多核苷酸的重组载体；和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

该药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的载体。

另一方面提供了一种用于预防和/或治疗革兰氏阴性菌感染和/或与革兰氏阴性菌感染相关(由此引起)的症状或疾病的方法，包括通过口服或非肠道(例如，静脉注射、皮下注射、腹腔注射或肌肉注射等)给予包含选自由以下组成的组中的一种或多种的药物组合物：

上述多肽，例如，SEQ ID NO：2或6；

上述融合多肽，例如，SEQ ID NO：10；

编码多肽或融合多肽的多核苷酸；

包含多核苷酸的重组载体；和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

下文将更详细地描述本发明。

当可以通过将细菌增殖到宿主中作为天然抗生素使用的噬菌体穿透细菌并在内部完成增殖时，完成的噬菌体颗粒被释放到细菌的外部，然后，通过攻击和分解细菌的细胞壁来创建释放到外部的途径的酶是内溶素。所有噬菌体的基因组中都含有这种内溶素基因，并使用在增殖过程中表达的内溶素蛋白。使用细菌作为宿主增殖的噬菌体和从具有分解细胞壁特性的噬菌体衍生的内溶素可以用作天然抗生素。在本说明书中，分离出一种新型噬菌体，并测定该噬菌体及由其衍生的内溶素的抗菌作用，从而提供该噬菌体及由其衍生的内溶素的抗生素和/或其相关用途。

对于革兰氏阳性菌，由于细胞壁位于最外层，当从外部添加内溶素时，细胞壁立即受到攻击和分解。另一方面，对于革兰氏阴性菌，细胞外膜存在于最外部，细胞壁位于其内部，因此，即使从外部添加内溶素，它也必须首先穿过细胞外膜以与细胞壁接触。因此，已知内溶素基本上对革兰氏阴性菌没有影响。本说明书中提供的具有内溶素活性的多肽的特征在于具有杀死革兰氏阴性菌的作用。

噬菌体赖氨酸，也称内溶素或水解酶(murein hydrolase)，是噬菌体在裂解周期的后续阶段产生的一种水解酶，可以裂解宿主细胞壁，使噬菌体在宿主细菌内增殖，然后在宿主细菌中爆发。当从外部将赖氨酸作为重组蛋白应用于革兰氏阴性菌时，由于存在外膜，赖氨酸不容易到达细胞壁。在本申请中，从感染大肠杆菌的噬菌体PBEC131中获得的内溶素EC340被工程化以改善外膜通透性并增加对革兰氏阴性菌的活性。对工程化的内溶素LNT113与标准护理抗生素的潜在协同作用进行了测试。观察到与美罗培南、替加环素、氯霉素、阿奇霉素和环丙沙星具有相加作用，而与粘菌素具有协同作用。头孢他啶和卡那霉素与LNT113内溶素均未表现出协同或相加作用。此外，协同作用和相加作用不能通过所测试的每种抗生素的抗生素类型、外膜跨膜、分子量或杀菌性能来概括。

杀菌肽A是从刻克罗普斯蚕蛾(Hyalophora cecropia)的血淋巴中分离出来的一种37个氨基酸的肽，具有两亲性α-螺旋结构，通过与革兰氏阴性菌的外膜相互作用而表现出抗菌活性。在目前的应用中，杀菌肽A和mtEC340的融合使细胞膜通透性增加了1.8倍，抗菌活性增加了2～4log。据报道，杀菌肽A可诱导膜破裂，但尚未阐明公认的作用模式。有人提出，杀菌肽A通过自我促进吸收导致外膜变形。如本申请所证实的，外膜的变形可以促进杀菌肽融合的内溶素和杀菌肽本身的吸收，从而进一步提高融合蛋白的抗菌效果。

自20世纪90年代以来，粘菌素一直被用作对抗多药耐药病原体快速增加的最后手段。在棋盘试验(checkerboard assay)中，证实LNT113与粘菌素具有协同作用。粘菌素直接与脂多糖(PLS)的脂质A相互作用，并通过在合成的LPS/磷脂双层中形成LPS-粘菌素簇而在抗菌活性中发挥重要作用。参与脂质A生物合成的基因的突变产生LPS缺陷型细菌，导致粘菌素耐药性。另一种耐药机制是将磷酸乙醇胺添加到脂质A中，并干扰粘菌素的粘附，与磷酸乙醇胺转移酶家族成员MCR-1有关。粘菌素和脂质A的这种相互作用可以更有效地吸收内溶素，从而提高融合蛋白的抗菌效果。LNT113与除粘菌素外的其他抗生素之间未观察到协同作用。根据靶菌株的不同，相加作用也有所不同，这与之前的报告一致。这种差异与抗生素敏感性无关。多药耐药菌株CCARM1A746(表1)显示出较高的FICI值，这是由于存在多种耐药机制，这些机制以多种方式抑制LNT113的抗菌作用。不可能概括不同类型抗生素的联合作用。例如，两种受试β-内酰胺抗生素中的一种头孢他啶对LNT113的相加作用很小，而另一种β-内酰胺抗生素美罗培南具有轻微的相加作用。根据外膜跨膜机制，大环内酯类药物如阿奇霉素和氨基糖苷类药物如卡那霉素使用脂质介导的途径，而β-内酰胺使用孔蛋白介导的扩散。换言之，在本申请中，各组之间没有观察到一致的模式。此外，每种被测抗生素的分子量或抑菌或杀菌作用机制没有显示出一致的模式。

综上所述，在本申请中，制备了工程化的内溶素LNT113，并在体外证实了其抗菌功效。由于这种内溶素与粘菌素具有协同作用，并且与标准护理抗生素具有一些相加作用，因此它可以以一种新的方式用于克服当前的抗生素耐药性问题。

术语的定义

在本说明书中，多核苷酸(可与“基因”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”互换使用)“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成”可以指多核苷酸或多肽基本上包含特定核酸序列或氨基酸序列，并且可解释为包含“基本等效序列”，其中在维持多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内(或不排除突变)，向特定核酸序列或氨基酸序列添加突变(删除、取代、修饰和/或添加)。

在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成或表达为特定核酸序列或氨基酸序列”可以指多核苷酸或多肽(i)基本上包含特定核酸序列或氨基酸序列，或(ii)由与特定核酸序列或氨基酸序列具有96％或更高、96.3％或更高、97％或更高、97.7％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性(同一性)的氨基酸序列组成或基本上包含其，并保持原始功能和/或所需功能。在本说明书中，原始功能可以是内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)、杀菌肽A活性(例如，细胞膜溶解活性)和/或抗菌作用(在氨基酸序列的情况下)，或编码具有内溶素酶功能的蛋白质的功能，杀菌肽A活性和/或抗菌作用(在核酸序列的情况下)，以及所需功能可以指对革兰氏阴性菌的抗菌活性。

在本发明中，术语“同源性(同一性)”是指与给定核酸或氨基酸序列的对应程度，可以表示为百分比(％)。例如，在核酸序列的同源性的情况下，可以通过文献(见：Karlinand Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)或Pearson的FASTA(见：MethodsEnzymol，183，63，1990)使用算法BLAST来确定。基于此算法BLAST，开发了名为BLASTN或BLASTX的程序(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

本说明书中提供的蛋白质或多肽可从自然界中分离和/或纯化，或通过重组或化学合成。当本说明书中提供的蛋白质或多肽的氨基酸序列包含作为第一氨基酸残基的甲硫氨酸(Met，M)或Met-Ala-Ser(MAS)序列时，可以重组产生蛋白质或多肽，并且从N端开始的第一氨基酸位置的甲硫氨酸可以由起始密码子编码。因此，当本说明书中提供的蛋白质或多肽的氨基酸序列在N端通过重组生产包含甲硫氨酸时，如果蛋白质或多肽是通过其他方法获得的(例如，化学合成或从自然界分离)，可以解释为包含从通过重组生产不包括N端第一位置的甲硫氨酸的第二氨基酸残基开始的氨基酸序列或从MAS序列之后的氨基酸残基开始的氨基酸序列(例如，第四氨基酸残基)。

内溶素是指由噬菌体编码的肽聚糖水解酶。内溶素在噬菌体增殖裂解周期的后期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖介导从感染细胞释放子代病毒粒子。就酶活性而言，内溶素可具有选自由氨基葡萄糖苷酶、胞壁酸酶(muramidase)(一种溶菌酶(lysozyme))、转糖苷酶、酰胺酶、内肽酶等组成的组中的至少一种活性。

在本说明书中，多核苷酸(可与“基因”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”互换使用)“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成”可以指多核苷酸或多肽由特定核酸序列或氨基酸序列组成或基本上包含其，并可解释为包含“基本等效序列”，其中在维持多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内，向特定核酸序列或氨基酸序列添加突变(删除、取代、修饰和/或添加)。

在本说明书中，原始功能可以是内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)(在氨基酸序列的情况下)或编码具有内溶素酶功能的蛋白质的功能(在核酸序列的情况下)，并且所需功能可以指对假单胞菌属(Pseudomonas sp.bacteria)细菌(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))的抗菌活性。

本说明书中提供的多肽可能不是从自然界衍生的，并且可以通过重组或化学合成。当重组产生多肽时，其可以是共同信号肽、裂解位点、标签等组合用于纯化的形式。因此，在一个非限制性实施方式中，本说明书中提供的多肽，本说明书中提供的多肽可以是选自由在蛋白质的重组生产过程中常见的信号肽、裂解位点、标签(例如，His标签、GST(谷胱甘肽-s-转移酶)标签、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签等组成的组中的一种或多种的形式，或以其被去除的形式。

噬菌体

一种实施方式提供了一种新型噬菌体。

噬菌体可包含含有SEQ ID NO：1的核酸序列或由该序列组成的多核苷酸，或，

包含与SEQ ID NO：1的核酸序列具有96.5％或更高、97％或更高、97.5％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的核酸序列或由该序列组成的多核苷酸。

噬菌体可包含选自由野生型多肽、编码野生型多肽的多核苷酸、突变多肽、编码突变多肽的多核苷酸、融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸组成的组中的一种或多种，下文将对此进行描述。

下文将详细描述多肽和多核苷酸。

野生型多肽和编码该多肽的多核苷酸

一种实施方式提供了一种新型多肽。该多肽可包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

这种多肽可以从噬菌体中衍生。该多肽可以具有衍生自噬菌体的内溶素活性。该多肽的分子量可以为约19kDa(19kDa±2)。在一种实施方式中，所述多肽可衍生自包含SEQID NO：1的核酸序列的噬菌体。该多肽对革兰氏阴性菌可以具有抗菌活性。

另一实施方式提供了一种编码该多肽的多核苷酸。该多核苷酸可包含SEQ ID NO：3的核酸序列。

在本说明书中，除非另有说明，否则作为包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的具有内溶素活性的多肽可以是指

(1)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成或基本上包含其的多肽，和/或

(2)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有98.8％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.4％或更高、99.6％或更高或99.9％或更高同源性的氨基酸组成或基本上包含其的多肽，其具有(维持)内溶素功能(例如肽聚糖水解活性)和/或抗假单胞菌属细菌(例如，铜绿假单胞菌)的抗菌活性。

此外，在本说明书中，除非另有说明，否则编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸可以指

(a)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成或基本上包含该序列的多肽的多核苷酸，和/或

(b)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有98.8％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.4％或更高、99.6％或更高或99.9％或更高同源性的氨基酸序列组成的多核苷酸，其具有(维持)内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)和/或抗假单胞菌属细菌(例如，铜绿假单胞菌)的抗菌活性，和/或

(c)包含SEQ ID NO：3的核酸序列的多核苷酸，和

包含SEQ ID NO：3的核酸序列的多核苷酸可以指

(d)由SEQ ID NO：3的核酸序列组成或基本上包含该序列的多核苷酸。

突变多肽及编码其的多核苷酸

一种实施方式提供了一种新型突变多肽。突变多肽可以是以下突变多肽，其中将突变引入SEQ ID NO：为2的氨基酸序列的多肽。这种多肽可衍生自噬菌体。该多肽可以具有衍生自噬菌体的内溶素活性。该多肽对革兰氏阴性菌可以具有抗菌活性。

突变多肽可以是其中至少一个氨基酸残基被取代、删除或插入到包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的突变多肽。多肽可以重组或合成(例如化学合成)制备。

作为本申请的突变引入对象的多肽可由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且具有内溶素活性，但不限于此。换言之，它不排除在SEQ IDNO：2的氨基酸序列之前或之后的无意义序列添加，或可能自然发生的突变，或其沉默突变，以及当与包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质具有相同或相应的活性时，它可以对应于作为本申请的突变引入对象的蛋白质。例如，作为本申请的突变引入对象的蛋白质可以是由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其具有98.8％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.4％或更高、99.6％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。此外，只要是具有该同源性或同一性并显示出与蛋白质对应的功效的氨基酸序列，则具有其中一些序列被删除、修改、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质可以包含在作为本申请的主题的蛋白质的范围内。

在另一实施方式中，多肽可以是突变多肽，其中与选自由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端的第39、43、45、73、81、101和113位组成的组中的至少一个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个或全部7个)位置对应的氨基酸被取代为与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的原始氨基酸不同的另一种氨基酸。

具体而言，该多肽可以是突变多肽，其中将选自以下1)到7)中的突变中的至少一种(例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种或全部7种)引入SEQ ID NO：2的氨基酸序列：

1)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第39位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代；

2)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第43位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代；

3)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第45位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代；

4)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第73位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即缬氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代；

5)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第81位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即丝氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代；

6)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第101位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代；和

7)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中从N端开始的第113位残基对应的氨基酸被其他氨基酸(即缬氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代。

在一种实施方式中，在突变多肽中，选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39位残基、第43位残基、第45位残基、第73位残基、第101位残基和第113位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代。

在一种实施方式中，在突变多肽中，选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N-端开始的第39位残基、第72位残基、第101位残基和第113位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代。

在一种实施方式中，在突变多肽中，选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第43位残基和第45位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种或氨基酸被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代。

在一种实施方式中，在突变多肽中，

(1)选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39位残基、第72位残基、第101位残基和第113位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸被不同于SEQID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代，和

(2)选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第43位残基、第45位残基和第81位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸进一步被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代。

在一种实施方式中，在突变多肽中，

(1)选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第43位残基和第45位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代，和

(2)选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39位残基、第73位残基、第81位残基和第101位残基相对应的的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸进一步被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代。

在一种实施方式中，在突变多肽中，

(1)选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39位残基、第43位残基、第35位残基、第72位残基、第101位残基和第113位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代，和

(2)选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第81位残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸进一步被不同于SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的原始氨基酸的氨基酸取代。

在一个具体实施方式中，突变可以包含：

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39位残基相对应的氨基酸被丝氨酸取代，

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第43位残基相对应的氨基酸被组氨酸取代，

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第45位残基相对应的氨基酸被谷氨酸取代，

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第73位残基相对应的氨基酸被缬氨酸取代，

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第81位残基相对应的氨基酸被丝氨酸取代，

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第101位残基相对应的氨基酸被丙氨酸取代，以及

与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第113位残基相对应的氨基酸被缬氨酸取代，可以被引入SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，突变多肽可以

(1)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成，或

(2)包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.3％或更高、97％或更高、97.7％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成。

很明显，只要其显示内溶素活性，即使在突变多肽中选自由与从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39、43、45、73、81、101和113位氨基酸残基相对应的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸除外的某些氨基酸序列被删除、修饰、取代或添加，其也可包含在本申请的突变多肽中。

例如，在添加或删除不改变本申请的突变多肽功能的序列、在氨基酸序列的N端、C端和/或内部能够自然发生的突变、沉默突变或保守取代的情况下。

“保守取代”是指一种氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。通常，保守取代几乎不会影响或不影响蛋白质或多肽的活性。

换言之，本申请的突变多肽可以具有或包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.3％或更高、97％或更高、97.7％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列，其中，与选自由从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39、43、45、73、81、101和113位组成的组中的至少一个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个或全部7个)位置对应的氨基酸被不同于原始氨基酸的其他氨基酸取代；或由或基本上由与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.3％或更高、97％或更高、97.7％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.5％或更高或99.9％的氨基酸序列组成，但不限于此。

此外，在一种实施方式中，本申请的突变多肽：

可以具有或包含其中与选自由从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39、43、45、73、81、101和113位组成的组中的至少一个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个或全部7各)位置对应的氨基酸被不同于与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有98.8％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.4％或更高、99.6％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列中的原始氨基酸的其他氨基酸取代的序列，或

可以由或基本上由其中与选自由从SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N端开始的第39、43、45、73、81、101和113位组成的组中的至少一个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个或全部7个)位置对应的氨基酸被不同于与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有98.8％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.4％或更高、99.6％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列中的原始氨基酸的其他氨基酸取代的序列组成，但不限于此。

在一种实施方式中，突变多肽可以

(1)包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成，或

(2)包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有96％或更高、96.3％或更高、97％或更高、97.7％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列。

在另一实施方式中，提供了一种编码突变多肽的多核苷酸。

该多核苷酸可包含SEQ ID NO：12的核酸序列。

在本说明书中，除非另有说明，否则编码包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列或由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸可以指

(a)编码由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成或基本上包含其的多肽的多核苷酸，和/或

(b)编码由与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有98.5％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性的氨基酸序列组成或基本上包含其，并具有(维持)内溶素酶功能(例如，肽聚糖水解活性)和/或抗假单胞菌属细菌(例如，铜绿假单胞菌)的抗菌活性的多肽的多核苷酸，和/或

(c)包含SEQ ID NO：12的核酸序列的多核苷酸，和

包含SEQ ID NO：12的核酸序列的多核苷酸可以指

(d)由SEQ ID NO：12的核酸序列组成或基本上包含其的多核苷酸。

融合多肽及编码其的多核苷酸

另一实施方式提供了一种新型融合多肽。该融合多肽可包含野生型多肽或突变多肽(下文称为“野生型或突变多肽”)和杀菌肽A。杀菌肽A可衍生自蛾(Hyalophoracecropia)，例如，可包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成。该多肽可对革兰氏阴性菌具有抗菌活性。

在一种实施方式中，该融合多肽可进一步包含

野生型多肽或突变多肽，和

杀菌肽A。

在融合多肽中，杀菌肽A(例如，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)和野生型或突变型多肽(例如，包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽)可以连接而不考虑顺序。换言之，在融合多肽中，杀菌肽A和野生型或突变型多肽可以从N端按杀菌肽A和多肽的顺序或按多肽和杀菌肽A的顺序连接，例如，可以按杀菌肽A和多肽的顺序连接。

此外，杀菌肽A(例如，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)和多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)可通过肽接头连接或在没有接头的情况下直接连接。

在一种实施方式中，该融合多肽可以

(1)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成，或

(2)包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有96％或更高、96.3％或更高、97％或更高、97.7％或更高、98％或更高、98.5％或更高、99％或更高、99.2％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成。

与多肽或杀菌肽A相比，融合多肽可具有优异的抗革兰氏阴性菌的抗菌活性和/或优异的外膜通透性。融合多肽、多肽或杀菌肽A可通过重组或合成(例如，化学合成)制备。

在本说明书中提供的融合多肽中，杀菌肽A和多肽可通过肽接头连接或在没有肽接头的情况下直接连接。肽接头可以是由1至100、2至50、1至30、2至20或2至10个任何氨基酸组成的多肽，并且所包含的氨基酸的种类不限于此。肽接头可包括例如分别选自由Gly、Ser、Leu、Gln、Asn、Thr和Ala组成的组中的至少一种氨基酸残基。适用于肽接头的氨基酸序列是本领域已知的。另一方面，接头的长度可以在不影响融合蛋白的结构和/或功能的限度内不同地确定。例如，肽接头可由包含选自由1至100、2至50、1至30、2至20或2至10个的Gly、Ser、Leu、Gln、Asn、Thr和Ala组成的组中的至少一种组成。在一种实施方式中，肽接头可表达为GSGSGS(SEQ ID NO:12)、(G)_4～10(如GGGGGG,GGGGGGGG等)、(GGGGS)_1～5(如(GGGGS)₁等)、(EAAAK)_1-5(如(EAAAK)₃、(EAAAK)₅等)、(EAAAK)₄(GGGGS)₁等，但不限于此。

另一实施方式提供了一种编码融合多肽的多核苷酸。

该多核苷酸可包含SEQ ID NO：13的核酸序列。

另一实施方式提供了一种编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13)。

重组载体和重组细胞

另一实施方式提供了一种包含编码前述野生型或突变多肽(例如，包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽)或前述融合多肽(例如，SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11)的多核苷酸的重组载体。该重组载体可用作表达载体。

另一实施方式提供了一种制备野生型或突变多肽或融合多肽的方法，包括在适当的宿主细胞中表达野生型或突变多肽或融合多肽。可通过培养包含多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体的重组细胞来在适当宿主细胞中表达野生型或突变多肽或融合多肽。制备内溶素的方法可进一步包括在表达后分离和/或纯化表达的内溶素。

本领域技术人员可通过适当选择已知的转化方法将多核苷酸或载体引入宿主细胞。在本说明书中，术语“转化”是指将包含编码该多肽(野生型或突变多肽，或融合多肽，以下相同)的多核苷酸的载体引入宿主细胞，以使该多核苷酸编码的多肽可以被表达。可以包括所有转化的多核苷酸，无论是插入并定位在宿主细胞的染色体中还是位于染色体外，只要它们可以在宿主细胞中表达。引入的多核苷酸的形式不受限制，只要该多核苷酸可以被引入宿主细胞并表达。例如，可将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是包含自表达所必需的所有元件的基因结构。表达盒通常可包括表达调控元件，例如可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号等。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以其自身形式引入宿主细胞，并可操作地连接到在宿主细胞中表达所必需的序列。如本文所用，术语“可操作地连接”可以指表达调节元件(例如启动子)和多核苷酸在功能上连接以执行多核苷酸的转录调节(例如转录起始)。可使用本领域已知的基因重组技术进行可操作地连接。

将多核苷酸转化到宿主细胞中的方法可以通过将核酸引入细胞(微生物)的任何方法来执行，并且可以通过根据宿主细胞适当选择本领域已知的转化技术来执行。作为已知的转化方法，可以举例说明电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、微量注射、聚乙二醇(PEG)沉淀(聚乙二醇介导的摄取)、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法、脂质转染、醋酸锂-DMSO方法等，但不限于此。

在本说明书中，术语“载体”是指包含可操作地连接到适当调节序列的多核苷酸的核苷酸序列的DNA结构，以便在适当宿主中表达靶蛋白质。调节序列可包括能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵序列(operator sequence)、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列和/或调节转录和/或翻译终止的序列。在转化至适当的宿主细胞后，该载体可以不考虑宿主细胞的基因组而表达或整合到宿主细胞的基因组中。

只要可以在宿主细胞中复制，本说明书中可用的载体就不受特别限制，并且可以从所有常用载体中选择。常用载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，作为载体，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体，并且pBR基、pUC基、pBluescriptII基、pGEM基、pTZ基、pCL基和pET基等可以用作质粒载体。具体而言，可以举例说明pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但不限于此。

载体还可以包括用于确认是否插入染色体的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即确认多核苷酸的插入，并且可以通过选择给予可选表型，例如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的耐药性或表面蛋白的表达的基因来使用。在处理选择剂的环境中，只有表达选择标记的细胞存活或表现出不同表型特征，因此可以选择转化细胞。

抗生素

另一实施方式提供了一种抗生素，其包含选自由以下组成的组中的至少一种：

野生型或突变多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)或融合多肽(例如，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)，

编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种用于在选自由以下组成的组中的至少一种的抗革兰氏阴性菌的抗菌作用(阻碍(抑制)革兰氏阴性菌的生长(或生长和发育)、革兰氏阴性菌的杀菌和害虫控制等)中的用途：

野生型或突变多肽或融合多肽，

编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种革兰氏阴性菌的灭菌方法(或害虫控制方法(pestcontrol method)、生长抑制方法)，包括将有效剂量的选自由以下组成的组中的至少一种：

野生型或突变多肽或融合多肽，

编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞

施用(或给药)于需要对革兰氏阴性菌进行抗菌(或革兰氏阴性菌的灭菌、害虫控制等)的受试者。

另一实施方式提供了一种用于制备或制造选自由以下组成的组中的至少一种的抗生素的用途：

野生型或突变多肽或融合多肽，

编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

这种抗生素可以对革兰氏阴性菌有抗菌作用。

革兰氏阴性菌可以是选自由假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)细菌、埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)细菌、肠杆菌属(Enterobacter sp.)细菌、克雷伯菌属(Klebsiella sp.)等组成的组中的至少一种(例如，1种、2种、3种、4种或5种)。

例如，假单胞菌属细菌可以是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，不动杆菌属细菌可以是鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，埃希氏杆菌属细菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)，肠杆菌属细菌可以是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(也称为产气克雷伯杆菌(Klebsiella aerogenes))或阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，克雷伯菌属细菌可以是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，但不限于此。

在一种实施方式中，大肠杆菌可以是粘附侵袭性大肠杆菌(或大肠杆菌AIEC(粘附侵袭性大肠杆菌)菌株)、大肠杆菌ATCC(美国典型培养物保藏中心)菌株、大肠杆菌UPEC(泌尿致病性大肠杆菌)菌株、大肠杆菌CCARM(耐抗菌性微生物保藏中心)菌株、大肠杆菌FORC81菌株(耐粘菌素的大肠杆菌)或大肠杆菌临床菌株，但不限于此。在一种实施方式中，大肠杆菌可以是选自由以下组成的组中的至少一种：ATCC8739、ATCC25922、ATCC51739、CCARM 1A746、CCARM 1G490、F485、F524、F576、F716、F852、FORC81、UPEC90、UPEC3038、UPEC3042、UPEC3051、UPEC3150、UPEC3151、UPEC3163、UPEC3164、UPEC3168、UPEC3181、ECOR1、ECOR2、ECOR9、ECOR15、ECOR35、ECOR36、ECOR43、ECOR45、ECOR52和ECOR69等、但不限于此。

在一种实施方式中，鲍曼不动杆菌可以是选自由ATCC19606、ATCC17978、CCARM12001、F4、F65、F66和F67等组成的组中的至少一种，但不限于此。

在一种实施方式中，铜绿假单胞菌可以是选自由PA01、ATCC15522、F102、F125、F141、F171和F388等组成的组中的至少一种，但不限于此。

在一种实施方式中，产气肠杆菌(或也称为产气克雷伯杆菌)可以是选自由CCARM1606、CCARM16008、CCARM16010和F276等组成的组中的至少一种，但不限于此。

在一种实施方式中，阴沟肠杆菌可以是选自由ATCC13047、CCARM0252和CCARM16003等组成的组中的至少一种，但不限于此。

除了选自由上述野生型或突变多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：7)或融合多肽(例如，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)、编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体和包含该多核苷酸的重组细胞，以及包含该多核苷酸或重组载体的重组细胞(以下称为第一种抗生素)组成的组中的至少一种之外，本说明书中提供的抗生素还可以包括另一种抗生素(第二种抗生素)。

第二种抗生素可以是从常用抗生素中选择的至少一种，例如，对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的抗生素。在一种实施方式中，第二种抗生素可以是多粘菌素基抗生素、美罗培南、卡那霉素、替加环素、氯霉素、阿奇霉素、环丙沙星或从中选择的至少一种的组合，但不限于此。

在一种实施方式中，第二种抗生素可以是多粘菌素基抗生素，例如，可以是多粘菌素B、粘菌素或其组合，但不限于此。

这样，通过将抗生素(第一种抗生素)与另一抗生素(第二种抗生素)结合使用，其优点是可以通过第一种抗生素本身的抗菌作用表现出协同效应，并且即使在低浓度下使用第二种抗生素也能表现出优异的抗菌作用。因此，可以减少副作用，例如使用高浓度抗生素等的毒性(例如，肾毒性、肝毒性等)。此外，通过结合使用不同机制的抗生素，可以抑制耐抗生素细菌的出现。

因此，一种实施方式提供了一种组合抗生素，包括

选自由野生型或突变多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)或融合多肽(例如，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)、编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸、包含多核苷酸的重组载体，以及包含重组载体的重组细胞(以下称为第一种抗生素)组成的组中的至少一种；和(b)第二种抗生素。

在本说明书中，术语“抗生素”包括对革兰氏阴性菌具有生长抑制能力和/或杀伤能力的所有类型的试剂，并且除非另有说明，否则其可与抗菌剂、防腐剂、杀菌剂等互换使用。

在一种实施方式中，在组合使用第一种抗生素和第二种抗生素的情况下的组合比率中，当第二种抗生素的浓度(μg/ml)为1时，组合使用的第一种抗生素的比率可以是0.01-1024μg/ml、0.01-512μg/ml、0.01-128μg/ml、0.01-16μg/ml、0.01-1μg/ml、0.03125-1024μg/ml、0.03125-512μg/ml、0.03125-128μg/ml、0.03125-16μg/ml、0.03125-1μg/ml、0.5-1024μg/ml、0.5-512μg/ml、0.5-128μg/ml、0.5-16μg/ml、0.5-1μg/ml、1-1024μg/ml、1-512μg/ml、1-256μg/ml、1-128μg/ml、1-64μg/ml、1-32μg/ml、1-16μg/ml、1-8μg/ml、1-4μg/ml、1-2μg/ml、2-1024μg/ml、2-512μg/ml、2-256μg/ml、2-128μg/ml、2-64μg/ml、2-32μg/ml、2-16μg/ml、2-8μg/ml、2-4μg/ml、4-1024μg/ml、4-512μg/ml、4-256μg/ml、4-128μg/ml、4-64μg/ml、4-32μg/ml、4-16μg/ml、4-8μg/ml、8-1024μg/ml、8-512μg/ml、8-256μg/ml、8-128μg/ml、8-64μg/ml、8-32μg/ml、8-16μg/ml、16-1024μg/ml、16-512μg/ml、16-256μg/ml、16-128μg/ml、16-64μg/ml、16-32μg/ml、32-1024μg/ml、32-512μg/ml、32-256μg/ml、32-128μg/ml、32-64μg/ml、64-1024μg/ml、64-512μg/ml、64-256μg/ml、64-128μg/ml、128-1024μg/ml、128-512μg/ml、128-256μg/ml、256-1024μg/ml、256-512μg/m或512-1024μg/ml，但不限于此。

药物组合物

另一实施方式提供了一种用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物组合物，

包含选自由以下组成的组中的一至少种：

野生型或突变多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)或融合多肽(例如，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)，

编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种用于或在制备用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物中的用途，

包含选自由以下组成的组中的至少一种：

野生型多肽或突变多肽或融合多肽，

编码野生型多肽或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种用于在制备用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的组合物中的用途，

包含选自由以下组成的组中的一种或多种：

野生型多肽或突变多肽或融合多肽，

编码野生型多肽或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

本说明书中提供的药物组合物除了选自由前述组成的组中的至少一种外，还可以包含另一种抗生素(第二种抗生素)：

野生型多肽或突变多肽或融合多肽，

编码野生型多肽或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的抗生素或组合抗生素。

另一实施方式提供了一种用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的方法，包括向需要预防和/或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的受试者给药药物有效剂量的抗生素或组合抗生素。预防或治疗方法还可包括在给药前确认需要预防和/或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的受试者。革兰氏阴性菌如上所述。

革兰氏阴性菌引起的疾病可以选自由革兰氏阴性菌感染引起的所有疾病，例如，可以选自由假单胞菌属细菌引起的疾病，例如皮肤感染、褥疮、肺炎、菌血症、败血症、心内膜炎、脑膜炎、外耳炎、中耳炎、角膜炎、骨髓炎、肠炎、腹膜炎或囊性纤维化等；由不动杆菌属细菌引起的疾病，如皮肤感染、肺炎、菌血症或败血症等；由埃希氏杆菌属细菌引起的疾病，如肠炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾、泌尿道感染、皮肤感染、菌血症或败血症等组成的组，但不限于此。

如在本说明书中所使用的，药物有效剂量是指所含的能够获得预期效果的活性成分的量或剂量。药物组合物中所含的活性成分的量或剂量可根据制备方法、给药方法、患者年龄、体重、性别、发病率、食物、给药时间、给药间隔、给药途径、排泄率和反应敏感性等因素而不同。例如，当活性成分为多肽时，单次剂量可在0.001-1000mg/kg、0.01-100mg/kg、0.01-50mg/kg、0.01-20mg/kg、0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.1-100mg/kg、0.1-50mg/kg、0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg、0.1-5mg/kg、1-100mg/kg、1-50mg/kg、1-20mg/kg、1-10mg/kg、1-10mg/kg或1-5mg/kg的范围内，但不限于此。

在另一实施方式中，基于药物组合物的总重量，药物组合物中活性成分的含量可为0.01％重量-99.9％重量、0.01％重量-90％重量、0.01％重量-80％重量、0.01％重量-70％重量、0.01％重量-60％重量、0.01％重量-50％重量、0.01％重量-40％重量、0.01％重量-30％重量、1％重量-99.9％重量、1％重量-90％重量、1％重量-80％重量、1％重量-70％重量、1％重量-60％重量、1％重量-50％重量、1％重量-40％重量、1％重量-30％重量、5％重量-99.9％重量、5％重量-90％重量、5％重量-80％重量、5％重量-70％重量、5％重量-60％重量、5％重量-50％重量、5％重量-40％重量、5％重量-30％重量、10％重量-99.9％重量、10％重量-90％重量、10％重量-80％重量、10％重量-70％重量、10％重量-60％重量、10％重量-50％重量、10％重量-40％重量或10％重量-30％重量，但不限于此。

此外，除活性成分外，药物组合物还可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可指通常用于制备包含蛋白质、核酸或细胞的药物的载体，并且不刺激生物体并且不抑制活性成分的生物活性和/或性质。在一种实施方式中，载体可以是选自由乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、褐藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等组成的组中的至少一种，但不限于此。药物组合物还可以包括选自由稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等组成的组中的至少一种，它们通常用于另外制备药物组合物。

用于给药药物组合物的受试者可以是选自包括灵长类动物(如人和猴子)、啮齿动物(如小鼠和大鼠)、家畜(如狗、猫、猪、牛、马、绵羊和山羊)、家禽(如鸡、鸭、鹅、雉鸡、鹌鹑和火鸡等)的哺乳动物，或其衍生的细胞、组织或其培养物组成的组中的至少一种。

药物组合物可以通过口服给药或肠外给药来给药，或者通过接触细胞、组织或体液来给药。具体而言，在肠外给药的情况下，可以通过皮下注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药和直肠内给药等进行给药。在口服给药的情况下，当蛋白质或肽被消化时，应配制口服组合物以包覆活性剂或防止其降解。在经鼻给药的情况下，可通过鼻喷雾给药药物组合物，使得药物组合物通过稀释经喷雾器或喷雾系统吸收到鼻腔中，并且鼻喷雾器或用于鼻喷雾的呼吸制剂可包括气溶胶等。

此外，药物组合物可以油或水介质溶液、注射液、悬浮液、糖浆、乳液、包衣剂、贴剂、提取物、粉末、粉末、颗粒、片剂、胶囊、气溶胶等形式配制，并且它还可以另外包括用于配制的分散剂或稳定剂。

另一实施方式提供了一种饲料添加剂

包含选自由以下组成的组中的至少一种：

野生型多肽或突变多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)或融合多肽(例如，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)，

编码野生型或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种饲料添加剂，其包含作为活性成分的抗生素或组合抗生素。

另一实施方式提供了一种包含食品添加剂组合物的饲料。

饲料可以通过以饲料添加剂的形式单独制备抗生素或组合抗生素以混合到饲料中，或在饲料制备过程中直接添加来制备。

饲料中的抗生素或组合抗生素可以是液体或干燥形式，例如，它可以是干燥的粉末形式。包含的抗生素的量可为饲料总重量的0.005至10％重量、0.05至10％重量、0.1至10％重量、0.005至5％重量、0.05至5％重量、0.1至5％重量、0.005至2％重量、0.05至2％重量或0.1至2％重量，但不限于此。此外，除了抗生素或组合抗生素外，饲料还可以包括常见添加剂，其可以提高饲料的储藏性。

在本说明书中，可以添加抗生素或组合抗生素的饲料可以选自由市售饲料或谷物、根果、食品加工副产品、藻类、纤维、药物副产品、油脂、淀粉、葫芦、谷物副产品、蛋白质、无机物、矿物质、单细胞蛋白质、浮游动物、剩饭等组成的组，但不限于此。

另一实施方式提供了一种食品添加剂或饮用水添加剂，其包含作为活性成分的抗生素或组合抗生素。通过在饮用水中混合提供抗生素或组合抗生素，可以减少饮用水中革兰氏阴性菌的数量。革兰氏阴性菌如上所述。

另一实施方式提供了一种消毒剂，

包含选自由以下组成的组中的至少一种：

野生型多肽或突变多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)或融合多肽(例如，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)，

编码野生型多肽或突变多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含多核苷酸的重组载体，和

包含多核苷酸或重组载体的重组细胞。

另一实施方式提供了一种消毒剂，其包含作为活性成分的抗生素或组合抗生素。

另一实施方式提供了一种消毒方法，包括向需要消毒的受试者施用抗生素或组合抗生素。消毒剂是防止病原体感染的药剂的通称，可用于一般生活消毒剂、食品和烹饪场所及设施的消毒剂以及建筑物消毒剂(例如家禽养殖场和牲畜舍)，以及各种生长供应品(包括牲畜尸体、饮用水、垃圾、蛋盘(egg seats)、运输车辆、餐具等)的消毒。

另一实施方式提供了一种洗涤剂，其包含作为活性成分的抗生素或组合抗生素。另一实施方式提供了一种清洁方法，包括将抗生素或组合抗生素应用于需要清洁的受试者。由于抗生素对革兰氏阴性菌具有抗菌作用，因此可用于清洁(清洗)暴露或可能暴露于革兰氏阴性菌的皮肤表面或每个身体部位灯。革兰氏阴性菌与上述相同。

有益效果

本说明书中提供的野生型多肽或突变多肽或融合多肽对各种革兰氏阴性菌具有极好的抗菌功效，因此，其可用作抗生素以及药物组合物。

附图说明

图1是表达感染大肠杆菌的噬菌体EC340-M-11-12的内溶素(EC340)基因的表达载体的裂解图。

图2示出了衍生自噬菌体EC340-M-11-12的内溶素(EC340)的纯化过程。

图3示出了衍生自噬菌体EC340-M-11-12的内溶素(EC340)在体外对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌作用的图。

图4a和图4b示出了本申请中使用的内溶素的组成和酶活性。

图4a示出了EC340、mtEC340和LNT113的结构域结构。它有一个预测的溶菌酶结构域，没有细胞壁结合结构域(CBD)。大肠杆菌噬菌体PBEC131的EC340接受了若干个氨基酸的取代(mtEC340)。指出了取代氨基酸的位置。在mtEC340中，杀菌肽A融合到N端，命名为LNT113。

图4b示出了纯化的内溶素、EC340(19.5kDa)、mtEC340(18.2kDa)和LNT113(23.2kDa)在SDS-PAGE和后续酶谱分析中的分析结果。

图5a至图5d示出了内溶素的抗菌活性。

图5a至图5d示出了内溶素(2μM)在20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中2小时对大肠杆菌菌株(图5a、图5c；ATCC 8739、ATCC 25922、CCARM1A746、CCARM 1B684)和肺炎克雷伯菌菌株(图5b、图5d；ATCC 700603、KCTC 2208、CCARM 10143、F85)的抗菌活性。Tris缓冲液用作阴性对照组(对照组)。虚线表示检测限。除t检验外，还进行了双因素方差分析，由垂直条上方的水平条表示(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图6a至图6e示出了LNT113的细胞渗透性和抗菌活性。

图6a：通过NPN分析测定革兰氏阴性大肠杆菌ATCC 8739的外膜通透性。CecA-EGFP、与EGFP融合的杀菌肽A；将cecA+mtEC340、杀菌肽A和mtEC340分别添加到2μM的混合物中；PMB，多粘菌素B。

图6b示出了与杀菌肽A和/或mtEC340相比，LNT113对大肠杆菌ATCC8739的增强的抗菌活性。所有药物均在最终浓度为0.5mM的条件下进行处理。

图6c示出了LNT113(0.1、0.3、0.9或2.7μM)在不同浓度下对大肠杆菌ATCC 8739的抗菌活性。

图6d示出了在不同时间长度下添加内溶素(0.5μM)后，细菌(大肠杆菌ATCC8739)的存活率降低。虚线表示检测限。

图6e示出了LNT113对MCR-1阳性大肠杆菌C81的抗菌活性。用浓度为0.2或2μM的LNT113或粘菌素处理细胞2小时。虚线表示检测限。星号示出与对照组的统计差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图7a至图7b示出了LNT113的细胞毒性和溶血活性。

图7a示出了LNT113在Huh7细胞系中的细胞毒性分析。将细胞与不同浓度的LNT113培养24小时或48小时。作为细胞毒性的阳性对照组，使用Triton X-100。

图7b示出了LNT113的溶血活性。通过在37℃下用PBS或LNT113培养红细胞1小时并在570nm处测量上清液的吸光度来确认溶血活性。作为溶血活性的阳性对照组，使用0.1％Triton X-100。

图8示出了LTN113与粘菌素联合处理对三种不同的大肠杆菌菌株的协同作用。等高线图。LNT113和粘菌素的FIC指数(FICI)示出了LNT113和粘菌素的FIC(分级抑菌浓度)之和。

图9示出了用于EC340(CLUSTAL omega)的定点诱变的推定内溶素的氨基酸序列比对(使用CLUSTAL omega(版本1.2.4)的EC340内溶素样蛋白的多序列比对)。

图10a和图10b示出了内溶素对大肠杆菌ATCC8739(图10a)和肺炎克雷伯菌KCTC2208(图10b)的抗菌活性。在两种不同的缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 7.5或20mMHEPES，pH 7.5)中，在存在或不存在150mM NaCl的情况下，于37℃下用2μM内溶素培养指数生长的细菌细胞2小时。虚线表示检测限。除t检验外，还进行了双因素方差分析，由垂直条上方的水平条表示(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。

以下实施例仅旨在说明本发明，并不被解释为限制本发明。

材料和方法

制备例1.噬菌体EC340-M-11-12的分离和EC340内溶素的纯化

1.1.菌株的培养条件

使用大肠杆菌(ATCC 8739)作为宿主，在37℃条件下，在LB(Luria Bertani)培养基中振荡培养。

1.2.噬菌体的分离

为了选择感染大肠杆菌的噬菌体，从韩国京畿道果川区果川污水处理厂(Gwacheon Sewage Treatment Plant in Gwacheon-si,Gyeonggi-do,Korea)收集样品。将收集的样品和大肠杆菌在37℃下振荡培养3小时，然后以500rpm离心20分钟以收集上清液。之后，用0.45μm过滤，然后进行双琼脂层菌斑测定(double agar layer plaque assay)。

简要描述测定，将宿主细菌大肠杆菌和噬菌体的培养液与0.1M.O.I.混合至顶部琼脂5ml，并倒入琼脂板中，在37℃下培养24小时以获得斑块。通过重复执行该过程可以获得纯化的纯噬菌体，该噬菌体被命名为噬菌体EC340-M-11-12。

1.3.噬菌体EC340-M-11-12的基因组分离与分析

对制备例1.2中获得的噬菌体EC340-M-11-12的基因组进行测序。在200ml的LB培养基中将大肠杆菌培养至OD₆₀₀＝0.5后，通过感染过滤的噬菌体10⁹pfu/ml或0.1M.O.I.进行裂解。之后，添加氯化钠，使最终浓度为1M，然后将其在4℃下放置1小时。随后，在11000×g下离心10分钟后，向沉淀中添加10％(w/v)的PEG(聚乙二醇8000)，并将其在4℃下放置1小时。随后，在11000×g下离心10分钟后，去除上清液，并用SM缓冲溶液[100mM NaCl，10mMMgSO₄(七水)，50mM Tris-HCl，pH 7.5]悬浮沉淀物。此处以1:1的比例添加三氯甲烷，并进行旋涡混合，然后在3000×g下离心15分钟以获得上清液。

将3ml的40％(w/v)甘油添加到聚碳酸酯试管中，然后添加4ml的5％(w/v)甘油而不混合。在此，添加制备的上清液并且以11000×g在4℃下离心1小时。随后，去除上清液，然后用SM缓冲液重新悬浮沉淀物，以获得噬菌体基因组DNA。根据制造商手册，使用噬菌体DNA分离试剂盒(Norgen biotek corp.)分离噬菌体基因组DNA。使用如上分离的基因组样本分析基因组序列(LAS，Illumina-MiSeq平台)。

最终分析的噬菌体EC340-M-11-12基因组的总核酸序列长度为42751bp。噬菌体EC340-M-11-12基因组的全长核酸序列以SEQ ID NO：1表示。基于基因组核酸序列信息，使用在线BLAST研究了与传统已知噬菌体基因组序列的相似性。BLAST研究结果证实，噬菌体EC340-M-11-12的基因组序列与大肠杆菌噬菌体vB_EcoS-Golestan(GenBank登录号：NC_042084.1)的序列同源性为查询覆盖率：80％，同一性：93.45％。基于这一事实，证实噬菌体EC340-M-11-12是一种传统上未知的新噬菌体。

1.4.EC340M内溶素的克隆与纯化

通过对所分析的噬菌体EC340-M-11-12的基因组序列(SEQ ID NO：1)的ORF搜索，假设489bp(SEQ ID NO：3)的ORF是内溶素基因，衍生自噬菌体EC340-M-11-12的内溶素和编码该内溶素的基因分别被命名为EC340内溶素和EC340基因。

对于噬菌体EC340-M-11-12的基因组，使用引物(F:5'-AAGGATCCGTGTCTCGAAACATTAGCAACAATGGC-3'(SEQ ID NO：4)，R:5'-AACTCGAGACCTTTCACCGCGCGCC-3'(SEQ ID NO：5))进行PCR(聚合酶链式反应)以获得EC340基因(SEQ ID NO：1中的核酸序列长度为489bp)。由EC340基因编码的EC340内溶素的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2(162aa)中。PCR在以下条件下进行：步骤1：94℃，5分钟；步骤2：94℃，30秒；步骤3：52℃，45秒；步骤4：72℃，1分钟；步骤5：重复步骤2-4 30次；步骤6：72℃，10分钟。将获得的PCT产物克隆到具有N末端6X His标签的pET-21a载体(Novagen)的BamHI/XhoI位点，以制备表达EC340内溶素的表达载体(pET-EC340质粒)。制备的表达载体pET-EC340如图1所示。

将制备的pET-EC340质粒转化到大肠杆菌BL21 pLysS菌株(Novagen)，然后在LB肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)NaCl)中培养至OD₆₀₀＝0.5。然后，添加1mM IPTG(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)，然后在37℃下振荡培养4小时。细胞收获后，用裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑)重新悬浮，添加1mM PMSF和1mg/ml溶菌酶，并将其放在冰上30分钟。通过超声波裂解细胞，并在13000rpm下离心40分钟以获得上清液。将其通过填充Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)的柱。之后，在用洗涤缓冲液(50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、30mM咪唑)洗涤后，用洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、300mM咪唑)洗脱，以纯化EC340蛋白质(包含6xHis标签)。

EC340蛋白的纯度通过15％SDS-PAGE确认，EC340蛋白的浓度通过Bradford分析测定。确认纯化过程中获得的每种反应物的结果如图2所示。经SDS-PAGE证实，纯化的EC340蛋白的分子量约为19kDa。

制备例2.细菌菌株及培养条件

本研究中使用的菌株来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，USA)、韩国典型培养物保藏中心(KCTC，Korea)和耐抗生素微生物培养物保藏中心(CCRM，Korea)。由KwanSoo Ko教授(成均馆大学医学院(Sungkyunkwan University,College of Medicine))临床分离并提供F株和泌尿致病性大肠杆菌(UPEC)株。由Christel Neut教授提供粘附侵袭性大肠杆菌(粘附侵袭性大肠杆菌(AIEC))收集(ECOR)菌株(Rahmouni等，2018)。由Sangryoul Rye教授(首尔国立大学)提供MCR-1阳性大肠杆菌FORC81菌株(Kim等，2019)。本研究中使用的所有菌株均在37℃的LB(溶原性肉汤)或CAA培养基(5g/l酪蛋白氨基酸、5.2mM K₂HPO₄和1mMMgSO₄)中生长。

制备例3.噬菌体和内溶素

在以下实施例中使用的噬菌体PBEC131与在制备例1中获得的噬菌体相同。

从噬菌体PBEC131中获得了表达假定内溶素(SEQ ID NO：3)的基因，并通过BLASTp发现了假定的溶菌酶样超家族结构域。

制备例4.分子克隆

使用BamHI和XhoI限制位点将编码噬菌体PBEC131的假定内溶素(SEQ ID NO：3)的基因克隆到pET21a+(Novagen,USA)，并命名为EC340基因。EC340多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示。

突变EC340(mtEC340；SEQ ID NO：6)是通过取代SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的7个氨基酸产生的(图4a；H39S、D43H、T45E、A73V、A81S、T101A和I113V)。

LNT113(SEQ ID NO：10)是通过将抗菌肽杀菌肽A(NCBI PRF 0708214A；SEQ IDNO：8)与突变EC340(mtEC340；SEQ ID NO：6)的N端的(GGGGS)₃接头融合而构建的。(换言之，在以下实施例中，包含杀菌肽A和突变多肽(mtEC340)的融合多肽被命名为LNT113。)

本申请实施例中使用的所有成分都具有用于亲和纯化的C端六组氨酸标签(HHHHHH)。此外，编码富集的绿色荧光蛋白(EGFP；GenBank登录号AAB02576.1)的基因在5'端用编码杀菌肽A(CecA)的基因克隆到pET21a+载体中。

使用的序列：

具有His(6H)标签[甲硫氨酸(Met)+mtEC340(SEQ ID NO：6)+His标签(HHHHHH)]的重组mtEC340(SEQ ID NO：7)

MVSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKGLEHHHHHH(SEQ ID NO：7)

重组融合蛋白LNT113[甲硫氨酸(Met)+杀菌肽A+GGGGSx3接头+mtEC340+His标签(HHHHHH)](SEQ ID NO：11)

MKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAKGGGGSGGGGSGGGGSVSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKGLEHHHHHH(SEQ ID NO：11)

制备例5.重组蛋白纯化

为了表达蛋白质，将内溶素表达载体引入大肠杆菌BL21(DE3)Star(Invitrogen,USA)。为了表达保留编码杀菌肽A(CecA)融合EGFP的基因的质粒，将其导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)。在LB肉汤中将细胞生长到指数期(OD₆₀₀＝0.4-0.5)后，用异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；Duchefa,The Netherlands)在25℃下以0.5mM的浓度诱导细胞5小时。通过离心收获细菌细胞，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤沉淀物。用溶解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，300mM NaCl和20mM咪唑)重新悬浮细胞，并用超声波(Sonics,USA)破坏细胞5分钟。通过在15000×g下离心30分钟从细胞裂解液中获得上清液。使用FPLC(AKTA go，Cytiva，UK)将提取物负载在Ni-NTA亲和色谱柱中。使用20至500mM咪唑线性梯度洗脱蛋白质。然后将蛋白质负载到HiTrap SP HP柱(Cytiva)上进行阳离子交换色谱，并在pH 7.5的20mM Tris-HCl中用0到1M NaCl线性梯度洗脱。然后用储存缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl缓冲溶液(pH 7.5))透析蛋白质。

制备例6.酶谱分析

酶谱分析是在对上述方法进行一些修改后进行的(Khakhum等，2016)。换言之，获取大肠杆菌ATCC 8739的过夜培养物，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤一次，然后通过在4000×g下离心15分钟收获。然后，将沉淀物重新悬浮在3ml去离子水中。在聚合之前，将细胞高压灭菌并添加到15％的SDS-PAGE凝胶中。然后，将3μg纯化的内溶素(EC340、mtEC340或LNT113)与2×样品缓冲液(0.5mM Tris-HCl，pH 6.8，20％甘油，0.2％溴酚蓝)混合并负载在SDS-PAGE上。电泳后，用去离子水洗涤凝胶1小时，并在室温下在反应缓冲液(1％TritonX-100，20mM Tris-HCl，pH 7.5)中孵育。在含有大肠杆菌裂解物的凝胶的透明区域观察到内溶素的酶活性。

制备例7.抗菌活性分析

对大肠杆菌和各种肺炎克雷伯菌菌株的纯化蛋白进行了抗菌活性测试。细菌生长到指数期(OD₆₀₀＝0.5)，并通过在12000×g下离心3分钟进行收获。然后，用反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5)洗涤沉淀物，并在缓冲液中稀释至约10⁶细胞/ml。然后，将100μl细菌悬浮液与100μl纯化的内溶素在反应缓冲液中混合，并在37℃下培养2小时。最后，用PBS稀释混合物并将其负载在LB板上。37℃培养过夜后，计数菌落数。所有分析均一式三份进行。

在20mM HEPES NaOH、150mM NaCl[pH 7.4]中对所选受试细菌进行相同反应，并排除Tris的独特抗菌活性和内溶素对膨胀压力的依赖性(图10a和图10b)。图10a示出了NaCl对大肠杆菌ATCC 8739的内溶素的抗菌活性的影响和图10b示出了NaCl对肺炎克雷伯菌KCTC 2208的内溶素的抗菌活性的影响。将几何生长的细菌细胞与2μM内溶素在37℃下在低张力缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5或20mM HEPES，pH 7.5)或高张力缓冲液(包含150mMNaCl的缓冲溶液)中培养2小时。用储存缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl缓冲液(pH 7.5))处理的细胞用作阴性对照组。虚线表示检测限(1Log CFU/ml)。

制备例8. 1-N-苯基萘胺(NPN)吸收分析

NPN吸收分析采用上述方法进行(Helander和Mattila Sandholm，2000)。换言之，洗涤生长到指数期(OD₆₀₀＝0.4)的大肠杆菌ATCC 8739并用缓冲溶液(5mM HEPES，pH 7.2)重新悬浮至约10⁸个细胞/ml。将50μl的40μM NPN(Sigma-Aldrich)与50μl纯化的内溶素或杀菌肽A(AbClon，Korea)混合，使在96孔的黑色平板中的最终浓度为2μM。使用外膜渗透剂、1mM EDTA(Duchefa)和2μM多粘菌素B(Sigma-Aldrich)作为阳性对照组。然后，向每个孔中加入100μl细胞悬浮液，并在37℃下培养5分钟。单独使用缓冲液、缓冲液+NPN、细胞悬浮液+缓冲液和细胞悬浮液+缓冲液+NPN作为阴性对照组。使用微孔板读取器(SpectraMax iD3，Molecular Devices，USA)在激发(350nm)和发射(420nm)下测量荧光。通过将背景去除后的荧光值(该值为从与样品的细胞混合物的荧光值中减去的不含NPN的值)除以含缓冲液的细胞悬浮液的荧光值(从不含NPN的缓冲液的荧光值中减去的值)，计算NPN吸收因子。

制备例9.溶血分析

用绵羊红细胞(绵羊RBC)进行体外溶血活性测试。用9ml PBS稀释1ml红细胞(MBCell,Korea)。然后，将180μl红细胞溶液添加到20μl LNT113(最终浓度，2～128μg/ml)、PBS(阴性对照组)或0.1％Triton X-100(阳性对照组)中，并在37℃下培养30分钟。将混合物在500x g下离心5分钟，并将上清液转移到96孔微孔板上。在570nm处测量吸光度。使用下面的公式1计算溶血率。

[公式1]

制备例10.体外细胞毒性分析

使用人肝癌细胞系Huh7(从韩国细胞系库获得的)进行细胞毒性分析。首先，将1×10⁴个Huh7细胞接种在96孔板中。24小时后，将LNT113(最终浓度125或250μg/ml)、1％Triton X-100(阳性对照组)或PBS(阴性对照组)添加到细胞中并培养24小时或48小时。然后，向每个孔中添加10μl WST-8细胞活力测定试剂盒(Dyne Bio，Korea)的四氮唑盐溶液。在37℃、5％CO₂培养箱中培养1小时后，在450nm处测量甲瓒(formazan)的产量。

制备例11.最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测量

LNT113或抗生素的MIC是根据之前描述的方法，在96孔圆底微孔板中使用肉汤微量稀释法的改进方法来测定的(Heselpoth等，2019)。将指数生长的细胞在CAA培养基中稀释至10⁶CFU/ml，然后在35℃下与重组LNT113(1-64μg/ml)或抗生素培养20小时。MIC值被确定为完全抑制的细菌生长的最低抗菌浓度。MBC被定义为在平板上没有生长的抗菌剂的最低浓度。所有分析均一式两份地进行。

制备例12.棋盘测定(Checkerboard Assay)

如前所述，使用连续稀释法进行棋盘测定(Thummepak等，2016)。LNT113垂直稀释2倍，抗生素在96孔板中水平连续稀释。将浓度为10⁶CFU/ml的细菌添加到CAA培养基中的每个孔中。在35℃下培养20小时后，目测确认MIC为非生长细胞。LNT113或抗生素的分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)是通过将两种药物的MIC除以其与单独每种药物的MIC联用来计算的。为了确认两种药物的相互作用，使用FIC指数(FICI)，即每种药物的FIC之和。FICI被认为是协同效应≤0.5，相加作用>0.5～≤1，独立效应(无差异)>1.0～≤2，以及拮抗效应(拮抗作用)>2。

制备例13.统计分析

所有统计分析均使用Prism版本9(GraphPad软件)。对于体外研究，所有实验均一式三份进行，结果以平均值±平均值标准误差(SEM)提供。使用双因素方差分析(Anova)和Tukey的多重比较检验比较每个数据集之间的差异。

实验结果

实施例1.内溶素EC340对革兰氏阴性菌的杀伤活性的研究

在本实施例中，为了确认内溶素EC340对鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、铜绿假单胞菌(ATCC 13388)和大肠杆菌(ATCC 8739)的抗菌活性，测试了细菌杀伤活性。

体外测试

为此，将浓度为2μM的内溶素EC340和每种测试细菌添加到反应缓冲液(20mMTris-Cl，pH 7.5)中，使最终浓度为200μl，并在37℃下放置2小时。2小时后，确认鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的菌落数，结果如图3所示。如图3所示，已证实内溶素EC340对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌具有杀伤活性。

实施例2.噬菌体PBEC131衍生的内溶素及其修饰物

由噬菌体PBEC131的162个氨基酸组成的ORF用推定内溶素注释。该内溶素，命名为EC340(SEQ ID NO：2)，具有噬菌体相关溶菌酶(胞壁酸酶)结构域(pfam00959)(图4a)。将该基因克隆到表达载体中并表达，通过使用纯化的内溶素进行酶谱分析来观察酶活性(参见制备例6)(图4b的EC340)。

为了增强内溶素的活性，使用8种具有与EC340(GenBank登录号QQNO11705.1、QNO11629.1、QNO11777.1、QBJ02951.1、HAM5207786.1、YP_009168880.1、QIG59335.1和YP_009113200.1)非常相似的序列的蛋白质进行BLASTp(图9)。此外，蛋白质的计算机辅助建模在https://swissmodel.expasy.org/进行。特别是，认为，暴露于外部的氨基酸H39S、A73V、T101A和I113V的变化可以通过增加蛋白质的疏水性而导致更好的跨膜。D43H和T45E的改变发生在外部暴露的铰链区，其中带电荷的氨基酸的转换可以导致相应区域的空间稳定性更高。位于蛋白质的第三螺旋区的A81S的变化可能不会导致蛋白质的特性的显著变化。在EC340的酶活性域的7个氨基酸位置引入突变(图4a；H39S、D43H、T45E、A73V、A81S、T101A和I113V)，并对GRAVY(亲水性指数的总平均值；用于指示肽的疏水性值的指数)进行了一些更改。换言之，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的突变多肽mtEC340是在由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的EC340中引入H39S、D43H、T45E、A73V、A81S、T101A和I113V突变的多肽。

当对各种大肠杆菌或肺炎克雷伯菌的菌株(包括模式菌株、耐药菌株和临床分离菌株)进行测试时，mtEC340突变示出了抗菌活性增加高达1log(图5a至图5d)(耐药谱见下表1)。在大肠杆菌中观察到对内溶素的抗菌效果高于肺炎克雷伯菌。这与之前的报告一致，即肺炎克雷伯菌的荚膜厚度是大肠杆菌的16倍或更多。

表1各种抗生素对耐药菌株的MIC

来源：http://knrrb.ccarm-bio.or.kr

-：未确定

换言之，如图5a至图5d所示，作为对大肠杆菌ATCC8739、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌CCARM1A746、大肠杆菌CCARM1B684、肺炎克雷伯菌ATCC700603、肺炎克雷伯菌KCTC2208、肺炎克雷伯菌CCARM10143和肺炎克雷伯菌F85菌株进行不处理(对照)、EC340处理、mtEC340处理和LNT113处理的情况下测量细菌数量的结果，所有EC340、mtEC340和LNT113均表现出良好的抗菌活性。结果表明，mtEC340和LNT113示出了更加优异的抗菌活性。

此外，本实验中使用的肺炎克雷伯菌菌株之一ATCC700603具有荚膜结构。厚荚膜有可能阻碍内溶素进入肽聚糖细胞壁。据报道，肺炎克雷伯菌荚膜多糖可介导对抗菌肽的耐药性。为了进一步提高活性，将作为抗菌肽的杀菌肽A的37个氨基酸的序列(SEQ ID NO：8)融合到mtEC340的N端，从而构建内溶素LNT113(SEQ ID NO：10)。这表明，与mtEC340相比，活性最大增加4log。所有测试菌株培养2小时后均未检测到活菌细胞。由于内溶素的抗菌活性可能取决于膨胀压力(turgor pressure)，并且Tris本身可以作为外膜渗透剂，因此在各种生理条件下进行了额外的抗菌分析(Tris缓冲液包含150mM NaCl或Hepes缓冲液包含150mM NaCl(图10a和图10b))。出乎意料的是，Hepes缓冲液中的抗菌活性高于不含NaCl的Tris缓冲液。然而，添加NaCl几乎使EC340和mtEC340失活。然而，如前所述，当使用杀菌肽A融合的内溶素(LNT113)时，盐存在的负面影响显著减少。

实施例3.LNT113的细胞通透性增强的抗菌效果

一般来说，由于革兰氏阴性菌中存在外膜，外部内溶素很难到达肽聚糖层。与杀菌肽A融合(与外膜相互作用)应增加膜透性。

通过NPN(1-N-苯基萘胺)分析(见制备例8)，比较了包括杀菌肽A和/或内溶素在内的各种组分的跨膜能力(图6a)。

如图6a(大肠杆菌ATCC 8739的外膜通透性)可以证实的，观察到经与杀菌肽A融合的LNT113处理的细胞中膜渗透性增加了1.8倍(图6a的LNT113)。其也是单独使用杀菌肽A的1.3倍(图6a的CecA)。此外，当联合使用mtEC340和杀菌肽A(图6a中的CecA+mtEC340)时，膜通透性增加。相反，与LNT113相比，融合到EGFP的杀菌肽A(图6a的CecA+EGFP)显示出有限的渗透膜的能力，这表明AMP和内溶素的伙伴关系显示出强大的渗透膜能力是实现额外效果所必需的。

图6b所示的每种结构的杀菌效果与如图6a所示的其渗透膜的能力成比例。在体外，LNT113根据剂量和时间表现出抗菌活性(大肠杆菌ATCC 8739(图6c)和图6d)。对大肠杆菌FORC81(抗粘菌素菌株)进行了对LNT113敏感性的测试(大肠杆菌FORC81(图6e))。在浓度为2μM的粘菌素处理的细胞中观察到减少1.2log，而在相同浓度下，LNT113成功地将细菌细胞的量减少到检测限以下。

实施例4.最小抑制浓度(MIC)的测定

大肠杆菌与人类和动物的各种疾病有关。致病性大肠杆菌通过在人体的不同部位形成菌落引起疾病，例如泌尿道、肾脏、血液等。通过MIC测量(见制备例11)，确认LNT113在各种大肠杆菌菌株中的抗菌活性(表2)。

表2LNT113对各种大肠杆菌菌株的MIC和MBC

目标菌株包括模式菌株、耐药菌株(CCRM和FORC81)、临床分离菌株(F)、泌尿致病菌株(UPEC)和粘附侵袭菌株(ECOR)。大多数菌株的MIC为4-64μg/ml(1mM的LNT113为23.2mg/ml，1mg/ml的LNT113为0.0431mM)。内溶素EC340或mtEC340的MIC>128mg/ml(表3)。

此外，最小杀菌浓度(MBC)与MIC相同，表明作用模式为灭菌。LNT113的MIC被证实用于各种革兰氏阴性菌，如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌(表4)。

表3大肠杆菌菌株中内溶素与粘菌素结合的MIC(μg/ml)

表4LNT113对各种革兰氏阴性菌的MIC(μg/ml)

该菌株包括模式菌株(type strains)、临床分离菌株和耐药菌株。所用耐药菌株的抗生素的MIC如上表1所示。MIC范围为4-32μg/ml。对于鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)，MIC为大于64μg/ml。

实施例5.LNT113的细胞毒性和溶血活性

为了证实LNT113的细胞毒性，对人肝癌细胞系Huh7进行WST-1分析(见制备例10)。当用250或125μg/ml处理LNT113 48小时时，未观察到细胞存活率降低(图7a)。

为了测量溶血活性，将LNT113以2～128μg/ml的浓度添加到红细胞中。未观察到LNT113的溶血活性(图7b)。

实施例6.LNT113与各种抗生素的协同作用

为了确认LNT与各种抗生素结合的效果，进行棋盘测定(见制备例12)。首先，测量FICI(分级抑菌浓度指数)，以观察LNT113和粘菌素在大肠杆菌菌株中的联合作用。图8示出了由等高线表示的棋盘分析结果，包括LNT113和粘菌素的FIC浮动。当在大肠杆菌ATCC8739中处理粘菌素和LNT113时，两个值的总和(FICI)为0.25。这表明了两种药剂的协同作用。对于UPEC 3150菌株，FICI为0.375，并显示出协同效应。对于大肠杆菌FORC81，FICI为0.5，并显示出另一种协同效应。值得注意的是，当与4mg/ml的LNT113联合处理时，在粘菌素耐药的大肠杆菌FORC81中粘菌素的MIC从16mg/ml降至1mg/ml(表3)。

通过测定FICI，证实LNT113和8种不同抗生素对5种不同的大肠杆菌菌株具有协同作用(表5)。

表5使用各种抗生素的LNT113的分级抑菌浓度指数(FICI)

(*：未确定

FICI：≤0.5，协同；>0.5-≤1.0，加成；>1.0至≤2、无差异；>2.0，拮抗)

尽管在5个菌株中的4个菌株中观察到了与粘菌素的协同作用，但在所有其他组合中观察到了相加作用(additive effect)或无差异作用(indifferent effect)。

此外，观察到当内溶素EC340或mtEC340的MIC大于128mg/ml时，粘菌素的MIC显著降低(表3)。

从以上描述中，本申请所属技术领域的人员将能够理解，本申请可以以其他特定形式体现，而不改变其技术精神或基本特征。在这方面，应当理解，上述实施例在所有方面都是说明性的，而不是限制性的。本申请的范围应解释为包括从随后描述的权利要求书的含义和范围以及其等效概念中而非详细描述中衍生的所有更改或修改形式。

Claims (24)

1.一种多肽，包含：

(1)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或

(2)在选自由SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第39、43、45、73、81、101和113位组成的组中的至少一个位置的突变。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述突变为选自由以下1)到7)组成的组中的至少一种：

1)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第39位残基相对应的氨基酸被丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代；

2)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第43位残基相对应的氨基酸被组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代；

3)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第45位残基相对应的氨基酸被谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代；

4)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第73位残基相对应的氨基酸被缬氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代；

5)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第81位残基相对应的氨基酸被丝氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代；

6)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第101位残基相对应的氨基酸被丙氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代；和

7)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第113位残基相对应的氨基酸被缬氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述突变包含：

1)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第39位残基相对应的氨基酸被丝氨酸取代，

2)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第43位残基相对应的氨基酸被组氨酸取代，

3)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第45位残基相对应的氨基酸被谷氨酸取代，

4)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第73位残基相对应的氨基酸被缬氨酸取代，

5)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第81位残基相对应的氨基酸被丝氨酸取代，和

6)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第101位残基相对应的氨基酸被丙氨酸取代。

4.根据权利要求3所述的多肽，其中，所述突变进一步包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第113位残基相对应的氨基酸被缬氨酸取代。

5.根据权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其进一步包含在N端或C端的杀菌肽A。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中，所述杀菌肽A包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

8.根据权利要求6所述的多肽，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其具有抗革兰氏阴性菌的抗菌活性。

10.根据权利要求6所述的多肽，其具有抗革兰氏阴性菌的抗菌活性。

11.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的多肽或包含所述多肽和杀菌肽A的融合多肽。

12.一种噬菌体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至5中任一项所述的多肽或包含所述多肽和杀菌肽A的融合多肽。

13.根据权利要求12所述的噬菌体，其包含SEQ ID NO：1的核酸序列。

14.一种抗生素，其包括选自由以下组成的组中的至少一种：

根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，或包含所述多肽和杀菌肽A的融合多肽，

编码所述多肽或融合多肽的多核苷酸，

包含所述多核苷酸的重组载体，和

包含所述多核苷酸或重组载体的重组细胞。

15.根据权利要求14所述的抗生素，其进一步包含多粘菌素基抗生素。

16.根据权利要求15所述的抗生素，其中，所述多粘菌素基抗生素为多粘菌素B、粘菌素或其组合。

17.根据权利要求14所述的抗生素，其具有抗革兰氏阴性菌的抗菌活性。

18.根据权利要求14所述的抗生素，其中，所述革兰氏阴性菌为选自由假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)细菌、埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)细菌、肠杆菌属(Enterobacter sp.)细菌和克雷伯菌属(Klebsiellasp.)细菌组成的组中的至少一种。

19.选自由以下组成的组中的至少一种在制备用于预防或治疗革兰氏阴性菌感染或由革兰氏阴性菌引起的疾病的药物中的用途：

根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，

编码所述多肽的多核苷酸，

包含所述多核苷酸的重组载体，和

包含所述多核苷酸或重组载体的重组细胞。

20.根据权利要求19所述的用途，其中，所述革兰氏阴性菌为选自由假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌、埃希氏杆菌属细菌、肠杆菌属细菌和克雷伯菌属细菌组成的组中的至少一种。

21.根据权利要求19所述的用途，其中，

所述革兰氏阴性菌是假单胞菌属细菌，并且由假单胞菌属细菌引起的疾病为皮肤感染、褥疮、肺炎、菌血症、败血症、心内膜炎、脑膜炎、外耳炎、中耳炎、角膜炎、骨髓炎、肠炎、腹膜炎或囊性纤维化；

所述革兰氏阴性菌是不动杆菌属细菌，并且由不动杆菌属细菌引起的疾病为皮肤感染、肺炎、菌血症或败血症；或

所述革兰氏阴性菌为埃希氏杆菌属细菌，并且由埃希氏杆菌属细菌引起的疾病为肠炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾、泌尿道感染、皮肤感染、菌血症或败血症。

22.一种饲料添加剂，其包含权利要求14所述的抗生素。

23.一种消毒剂，其包含权利要求14所述的抗生素。

24.一种洗涤剂，其包含权利要求14所述的抗生素。

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