KR102534221B1

KR102534221B1 - 신규한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제

Info

Publication number: KR102534221B1
Application number: KR1020220070371A
Authority: KR
Inventors: 명희준; 김민수; 홍혜원; 김영득; 장재연
Original assignee: 주식회사 라이센텍; 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2022-06-09
Publication date: 2023-05-18
Also published as: KR20230028132A

Abstract

엔도라이신 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 및 항생활성 단백질을 포함하는 융합 폴리펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드 및/또는 융합 폴리펩타이드의 그람 음성 병원균에 대한 항생 용도 및/또는 그람 음성 병원균 감염 및/또는 그람 음성 병원균 감염과 관련된 질병 또는 증상의 예방 및/또는 치료 용도를 제공한다.

Description

신규한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제{Antibiotics against novel polypeptides and Gram-negative bacteria containing the same}

본 개시내용은 엔도라이신 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드, 엔도라이신 펩타이드와 항생 활성 단백질을 포함하는 융합 단백질, 및 상기 폴리펩타이드 및/또는 융합 단백질의 그람 음성 병원균에 대한 항생제 및/또는 그람 음성 병원균 감염 및/또는 그람 음성 병원균 감염과 관련된 질병 또는 증상의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물로서의 용도를 제공한다.

박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 자신의 숙주 박테리아에 감염(infection)한 후 세균 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 박테리오파지의 단백질인 엔도라이신을 이용하여 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖는다. 따라서, 박테리오파지의 엔도라이신 활성을 가지는 물질은 항생제 후보물질로서 유용하게 적용될 수 있다.

근래 항생제 내성세균이 급속히 증가하고 있고, 어떤 항생제로도 치료가 되지 않는 다제내성세균도 늘어나고 있다. 특히, 그람음성균 중 하나인 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)는 전 세계적으로 새로운 치료수단의 개발이 시급한 ESKAPE(Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter species) bacteria 중 하나이며, 대장균(Escherichia coli)은 다양한 감염증에 관여하는 bacteria이다. 따라서 기존의 항생제와는 차별화되는 치료수단의 개발이 요구된다.

일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열에 39번째, 43번째, 45번째, 73번째, 81번째, 101번째, 및 113번째로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 위치에 상응하는 아미노산이 본래와 다른 아미노산으로 치환된 변이가 도입된, 변이형 폴리펩타이드를 제공한다.

다른 양상은, 세크로핀 A (Cecropin A) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 변이형 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드를 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포를 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드,

상기 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항생제를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 항생제를 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 항생제를 포함하는, 소독제를 제공한다.

또 다른 양상은, 상기 항생제를 포함하는, 세척제를 제공한다.

표준 치료 항생제와 함께 사용할 때 관찰된 상승 효과뿐만 아니라 그람 음성 병원체에 대한 향상된 항균 활성을 가진 조작된 엔도라이신을 제공한다.

일 양상은 서열번호 2 또는 6의 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 그람 음성균에 대한 엔도라이신(endolysin)으로 작용할 수 있으며, 항생제로서 유용할 수 있다. 폴리펩타이드를 재조합으로 합성하는 경우, 서열번호 2 또는 6의 아미노산 서열의 N-말단에 첫 번째 아미노산 잔기로 메티오닌(M)이 부가될 수 있다.

다른 양상은 서열번호 2 또는 6의 폴리펩타이드와 항생제 단백질, 예를 들어, 세크로핀 A(예를 들어, 서열번호 8, 또는 서열번호 9)를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 융합 폴리펩타이드에서, 폴리펩타이드와 항생제 단백질은 직접(링커 없이) 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

서열번호 2 (EC340)

VSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGHYGPDVTPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAAAHHSLTQAQFDAVCDLVYNAGAGVIAATTGTGKALRSGDIATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKG

서열번호 6 (mtEC340)

VSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKG

서열번호 10 (LNT113; Cecropin A-GGGGSx3 linker-mtEC340)

MKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAKGGGGSGGGGSGGGGSVSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKG

서열번호 8 (Cecropin A)

KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK

서열번호 9 (Cecropin A, M is added to N-terminus of 서열번호 8)

MKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK

다른 양상은 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 양상은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 재조합 벡터는 발현 벡터일 수 있다.

다른 양상은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 재조합 세포는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위해 사용될 수 있다.

다른 양상은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 항생제를 제공한다:

상기 폴리펩타이드, 예를 들어, 서열번호 2 또는 6;

상기 융합 폴리펩타이드, 예를 들어 서열번호 10;

상기 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.

항생제는 하나 또는 복수의 (예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20) 그람 음성균에 대해 항생 효과가 있을 수 있다.

다른 양상은 그람-음성 세균의 감염 및/또는 그람-음성 세균 감염과 관련된(이에 의해 유발되는) 증상 또는 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다:

앞서 설명한 폴리펩타이드, 예컨대, 서열번호 2 또는 6;

앞서 설명한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 서열번호 10;

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및

약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

다른 양상은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 약학적 조성물을 경구 또는 비경구로 (예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 등) 투여하는 단계를 포함하는, 그람-음성 세균의 감염 및/또는 그람-음성 세균 감염과 관련된(이에 의해 유발되는) 증상 또는 질병을 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다:

앞서 설명한 폴리펩타이드, 예컨대, 서열번호 2 또는 6;

앞서 설명한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 서열번호 10;

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

세균을 숙주로 증식하여 천연의 항생제로 사용될 수 있는 박테리오파지가 세균에 침투하여 내부에서 증식을 마치면 완성된 파지입자들이 세균 외부로 방출되며, 이 때, 세균의 세포벽을 공격하여 분해하여 외부로 방출될 통로를 만들어 주는 효소가 엔도라이신이다. 모든 박테리오파지는 유전체(genome) 내에 이러한 엔도라이신 유전자를 가지고, 증식 시에 발현된 엔도라이신 단백질을 이용한다. 세균을 숙주로 증식하는 박테리오파지와 세포벽을 분해하는 특성을 가지는 박테리오파지 유래의 엔도라이신은 천연의 항생제로 이용될 수 있다. 본 명세서에서는 신규한 박테리오파지를 분리하고, 상기 박테리오파지와 이로부터 유래한 엔도라이신의 항생 효과를 입증하여, 상기 박테리오파지와 이로부터 유래한 엔도라이신의 항생제 및/또는 이와 관련된 용도를 제공한다.

그람 양성세균의 경우에는 가장 외벽에 세포벽이 위치하므로, 외부에서 엔도라이신을 첨가하면 세포벽이 바로 공격당하여 분해된다. 반면에, 그람 음성세균의 경우에는 가장 외부에 외세포막이 존재하고, 그 내부에 세포벽이 위치하므로, 외부에서 엔도라이신을 첨가하더라도 먼저 외세포막을 통과하여야 세포벽을 만나게 된다. 따라서, 기본적으로 엔도라이신은 그람 음성세균에는 효과가 없다고 알려져 왔다. 본 명세서에서 제공되는 엔도라이신 활성을 가지는 폴리펩타이드는 그람음성균을 사멸시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

엔도라이신 또는 뮤레인 가수분해효소라고도 하는 박테리오파지 리신은 용균 주기의 마지막 단계에서 박테리오파지에 의해 생성되는 가수분해 효소로 숙주의 세포벽을 통해 절단할 수 있으므로 파지가 내부에서 증식한 후 숙주 박테리아에서 터질 수 있다. 외부에서 그람음성균에 재조합 단백질로 적용하면 외막의 존재로 인해 라이신이 세포벽에 쉽게 도달할 수 없다. 본 출원에서, 대장균을 감염시키는 파지 PBEC131에서 얻은 엔도라이신 EC340은 외막 투과성을 개선하고 그람 음성 박테리아에 대한 활성을 증가시키도록 조작되었다. 조작된 엔도라이신인 LNT113은 표준 치료 항생제와의 잠재적인 상승 효과에 대해 테스트되었다. 메로페넴, 티게사이클린, 클로람페니콜, 아지트로마이신 및 시프로플록사신에서 부가 효과가 나타난 반면 콜리스틴에서 상승 효과가 입증되었다. ceftazidime과 kanamycin 모두 LNT113 endolysin과 시너지 효과나 상가 효과를 나타내지 않았다. 더욱이, 시너지 효과와 부가 효과는 항생제 종류, 외막 통과 메커니즘, 분자량 또는 테스트한 각 항생제의 살균 특성에 의해 일반화될 수 없었다.

Hyalophora cecropia의 hemolymph에서 분리된 Cecropin A는 37개의 아미노산 펩타이드로 양친매성 alpha-helix 구조를 가지고 있으며 그람음성균의 외막과 상호작용하여 항균활성을 보인다. 본 출원에서, cecropin A와 mtEC340의 융합은 세포막 투과성을 1.8배 증가시켰고 항균성을 2~4 log 증가시켰다. Cecropin A는 막 파괴를 유도하는 것으로 보고되었지만 일반적으로 동의된 작용 방식은 아직 밝혀지지 않았다. cecropin A는 자가 촉진 흡수에 의해 외막을 가로질러 막의 왜곡을 일으키는 것으로 제안된다. 외막의 왜곡은 본 출원에서 입증된 바와 같이 cecropin-fused endolysin 및 cecropin 자체의 흡수를 촉진하여 융합 단백질의 항균 효능을 훨씬 더 높일 수 있다.

1990년대부터 콜리스틴은 다제내성 병원체의 급격한 증가에 대한 최후의 수단으로 사용되었다. LNT113은 체커보드 분석에서 콜리스틴과 시너지 효과가 있는 것으로 확인되었다. 콜리스틴은 지질다당류(LPS)의 지질 A와 직접 상호작용하며, 합성 LPS/인지질 이중층에서 LPS-콜리스틴 클러스터를 형성하여 항균 활성에 중요한 역할을 한다. 지질 A 생합성에 관여하는 유전자의 돌연변이는 LPS 결핍 박테리아를 생성하여 콜리스틴 내성을 유발한다. 또 다른 내성 기전은 phosphoethanolamine transferase enzyme family의 구성원인 MCR-1과 관련되어 phosphoethanolamine을 지질 A에 첨가하여 colistin의 부착을 방해한다. 이러한 콜리스틴과 지질 A의 상호작용은 엔도라이신의 보다 효율적인 흡수를 가능하게 하여 융합 단백질의 더 높은 항균 효능을 초래할 수 있다. LNT113과 콜리스틴 이외의 항생제 사이에는 시너지 효과가 관찰되지 않았다. 부가효과 역시 대상 균주에 따라 다르게 나타나 이전 보고서와 일치하였다. 이러한 차이는 항생제 감수성과 무관하였다. MDR 균주 CCARM 1A746 (표 1)은 LNT113의 항균 효과를 여러 가지 방식으로 억제하는 다중 내성 메커니즘의 존재로 인해 더 높은 FICI 값을 보여주었다. 다른 종류의 항생제에 따른 병용 효과의 일반화는 불가능하였다. 예를 들어, 테스트한 두 가지 베타-락탐 항생제 중 하나인 세프타지딤은 LNT113과 거의 상가 효과를 나타내지 않은 반면, 다른 베타-락탐 항생제인 메로페넴은 약간의 상가 효과를 나타냈다. 외막 통과 기전에 따라 아지트로마이신과 같은 마크로라이드와 카나마이신과 같은 아미노글리코사이드는 지질 매개 경로를 사용하는 반면 베타 락탐은 포린 매개 확산을 사용한다. 다시 말하자면, 본 출원에서 그룹 간에 일관된 패턴이 관찰되지 않았다. 또한 테스트한 각 항생제의 분자량이나 정균 또는 살균 작용 메커니즘도 일관된 패턴을 나타내지 않았다.

요약하면, 본 출원에서 조작된 엔도라이신 LNT113을 생산하고 시험관 내에서 항균 효능을 확인하였다. 이 엔도라이신은 콜리스틴과의 시너지 효과와 표준 치료 항생제와의 일부 추가 효과를 가지고 있기 때문에 현재의 항생제 내성 문제를 극복하기 위한 새로운 방식으로 사용될 수 있다.

용어의 정의

본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.

일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표시된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 96% 이상, 96.3% 이상, 97% 이상, 97.7% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 본래의 기능은, 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성), 세크로핀 A 활성 (예컨대, 세포막 용해 활성), 및/또는 항생 작용이거나 (아미노산 서열의 경우), 또는 엔도라이신 효소 기능, 세크로핀 A 활성, 및/또는 항생 작용을 가지는 단백질 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있고, 상기 목적하는 기능은 그람음성균에 대한 항생 활성을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "상동성(identity)"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

본 명세서에서 제공되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연에서 분리 및/또는 정제되거나, 재조합적 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 N-말단으로부터 첫 번째 아미노산 잔기로서 메티오닌(Met, M) 또는 Met-Ala-Ser(MAS) 서열을 포함하는 경우, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드가 재조합적으로 생산된 것일 수 있고, 상기 N-말단으로부터 첫 번째 아미노산 위치의 메티오닌은 개시코돈에 의하여 코딩된 것일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 N-말단에 재조합적 생산에 의한 메티오닌을 포함하는 경우, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드가 다른 방법 (예컨대, 화학적 합성 또는 천연에서 분리)으로 얻어지는 경우에는 상기 재조합적 생산에 의한 N-말단 첫 번째 위치의 메티오닌을 제외한 두 번째 아미노산 잔기로부터 시작되는 아미노산 서열 또는 MAS 서열 다음의 아미노산 잔기 (예컨대, 4번째 아미노산 잔기)부터 시작되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

상기 엔도라이신은 박테리오파지가 암호화하는 펩티도글리칸 가수분해효소를 의미한다. 엔도라이신은 박테리오파지 증식의 용해 회로에서 후기 유전자 발현 동안 합성되고 박테리아성 펩티도글리칸의 분해를 통해 감염된 세포로부터 자손 비리온의 방출을 매개한다. 효소적 활성의 측면에서, 엔도라이신은 통상적으로 글루코사미니다아제 (Glucosaminidase), 무라미다아제 (muramidase) (lysozyme의 일종), 트랜스글리코실라아제 (transglycosylase), 아미다아제 (amidase), 엔도펩티다아제 (endopeptidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서, 상기 본래의 기능은, 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) (아미노산 서열의 경우), 또는 엔도라이신 효소 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있고, 상기 목적하는 기능은 슈도모나스 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 활성을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드는 천연 유래의 것이 아닐 수 있으며, 재조합적 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 재조합적으로 생산되는 경우, 정제를 위하여 통상의 시그날 펩타이드, 절단부위, tag 등이 결합된 형태일 수 있다. 따라서, 비제한적인 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드는 단백질의 재조합적 생산 과정에 통상적으로 사용 가능한 시그날 펩타이드, 절단부위, tag (예컨대, His tag, GST (glutathione-s-transferase) tag, MBP (maltose binding protein) tag 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 형태이거나, 이들이 제거된 정제된 형태일 수 있다.

박테리오파지

일 예는 신규한 박테리오파지를 제공한다.

상기 박테리오파지는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드, 또는,

서열번호 1의 핵산 서열과 96.5% 이상, 97% 이상, 97.5% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

상기 박테리오파지는 하기에서 설명할 야생형 폴리펩타이드, 상기 야생형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 변이형 폴리펩타이드, 상기 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 융합 폴리펩타이드, 및 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

이하, 상기 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 대하여 상세하게 설명한다.

야생형 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

일 예는 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 박테리오파지로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 박테리오파지로부터 유래한 엔도라이신 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 분자량이 약 19 kDa (19 kDa±2)인 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 박테리오파지로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 다르게 기재되지 않는 한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서 엔도라이신 활성을 갖는 폴리펩타이드는,

(1) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드, 및/또는

(2) 서열번호 2의 아미노산 서열과 98.8% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.4% 이상, 99.6% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고, 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) 및/또는 슈도모나스 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 활성을 갖는 (유지하는) 폴리펩타이드

를 의미하는 것일 수 있다.

또한, 본 명세서에서, 다르게 기재되지 않는 한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는,

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(b) 서열번호 2의 아미노산 서열과 98.8% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.4% 이상, 99.6% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) 및/또는 슈도모나스 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 활성을 갖는 (유지하는) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(c) 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있고,

서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는

(d) 서열번호 3의 핵산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미하는 것일 수 있다.

변이형 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

일 예는 신규한 변이형 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩타이드에 변이가 도입된 변이형 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 박테리오파지로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 박테리오파지로부터 유래한 엔도라이신 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 것일 수 있다.

상기 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입된 변이가 도입된 변이형 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 재조합적 또는 합성적(예컨대, 화학적 합성)으로 제조된 것일 수 있다.

본 출원의 변이 도입의 대상이 되는 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 엔도라이신 활성을 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 즉, 서열번호 2의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 변이 도입의 대상이 되는 단백질에 해당될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 변이 도입의 대상이 되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 98.8% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.4% 이상, 99.6% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함될 수 있다.

다른 예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열에, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째, 43번째, 45번째, 73번째, 81번째, 101번째, 및 113번째로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 또는 7종 모두)의 위치에 상응하는 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이가 도입된 변이형 폴리펩타이드일 수 있다.

구체적으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열에 하기 1) 내지 7) 중에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 또는 7종 모두)의 변이가 도입된 변이형 폴리펩타이드일 수 있다:

1) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 세린, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환;

2) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 43번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환;

3) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 45번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환;

4) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 73번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환;

5) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 81번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 세린, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환;

6) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 101번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 알라닌, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환; 및

7) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 113번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환.

일 예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 아미노산 서열에, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기, 43번째 잔기, 45번째 잔기, 73번째 잔기, 101번째 잔기, 및 113번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 아미노산 서열에, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기, 72번째 잔기, 101번째 잔기, 및 113번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 아미노산 서열에, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 43번째 잔기, 및 45번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이가 도입된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 아미노산 서열에,

(1) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기, 72번째 잔기, 101번째 잔기, 및 113번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되고,

(2) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 43번째 잔기, 45번째 잔기, 및 81번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 추가로 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이가 도입된 것일 수 있다.

(1) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 43번째 잔기, 및 45번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되고,

(2) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기, 73번째 잔기, 81번째 잔기, 및 101번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 추가로 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이가 도입된 것일 수 있다.

(1) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기, 43번째 잔기, 35번째 잔기, 72번째 잔기, 101번째 잔기, 및 113번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되고,

(2) 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 81번째 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산이 추가로 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열에, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째 잔기에 상응하는 아미노산이 세린으로, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 43번째 잔기에 상응하는 아미노산이 히스티딘으로, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 45번째 잔기에 상응하는 아미노산이 글루탐산으로, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 73번째 잔기에 상응하는 아미노산이 발린으로, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 81번째 잔기에 상응하는 아미노산이 세린으로, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 101번째 잔기에 상응하는 아미노산이 알라닌으로, 및 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 113번째 잔기에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 변이가 도입된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는,

(1) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는,

(2) 서열번호 6의 아미노산 서열과 96% 이상, 96.3% 이상, 97% 이상, 97.7% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 변이형 폴리펩타이드 중 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째, 43번째, 45번째, 73번째, 81번째, 101번째, 및 113번째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 엔도라이신 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이형 폴리펩타이드에 포함될 수 있음은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 본 출원의 변이형 폴리펩타이드의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩타이드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

즉, 본 출원의 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째, 43번째, 45번째, 73번째, 81번째, 101번째, 및 113번째로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 또는 7종 모두)의 위치에 상응하는 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되고, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열과 96% 이상, 96.3% 이상, 97% 이상, 97.7% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 96% 이상, 96.3% 이상, 97% 이상, 97.7% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 일 예에서, 본 출원의 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 98.8% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.4% 이상, 99.6% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째, 43번째, 45번째, 73번째, 81번째, 101번째, 및 113번째로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상(예컨대, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 또는 7종 모두)의 위치에 상응하는 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 서열을 가지거나, 포함하거나, 또는

서열번호 2의 아미노산 서열과 98.8% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.4% 이상, 99.6% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서, 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 39번째, 43번째, 45번째, 73번째, 81번째, 101번째, 및 113번째로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상(예컨대, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 또는 7종 모두)의 위치에 상응하는 아미노산이 본래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 변이형 폴리펩타이드는,

(1) 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는,

(2) 서열번호 6의 아미노산 서열과 96% 이상, 96.3% 이상, 97% 이상, 97.7% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성(identity) 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

다른 예는, 상기 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 다르게 기재되지 않는 한, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는,

(a) 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(b) 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 98.5% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) 및/또는 슈도모나스 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 활성을 갖는 (유지하는) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(c) 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있고,

서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는

(d) 서열번호 12의 핵산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미하는 것일 수 있다.

융합 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

다른 예는 신규한 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 야생형 폴리펩타이드 또는 상기 변이형 폴리펩타이드(이하, "야생형 또는 변이형 폴리펩타이드"로 기재한다), 및 세크로핀 A (Cecropin A)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세크로핀 A는 나방 (Hyalophora cecropia)에서 유래한 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 융합 폴리펩타이드는,

상기 야생형 폴리펩타이드 또는 변이형 폴리펩타이드, 및

상기 세크로핀 A를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 융합 폴리펩타이드에서, 상기 세크로핀 A (예컨대, 서열번호 8 또는 서열번호 9) 및 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)은 순서에 무관하게 연결된 것일 수 있다. 즉, 상기 융합 폴리펩타이드에서, 상기 세크로핀 A과 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드는, N-말단부터, 세크로핀 A 및 상기 폴리펩타이드의 순서 또는 상기 폴리펩타이드 및 세크로핀 A의 순서로 연결된 것일 수 있으며, 예컨대, 세크로핀 A 및 상기 폴리펩타이드의 순서로 연결된 것일 수 있다.

또한, 상기 세크로핀 A (Cecropin A) (예컨대, 서열번호 8 또는 서열번호 9) 및 상기 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7)은 펩타이드 링커를 통하여 연결되거나 링커 없이 직접 연결된 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 융합 폴리펩타이드는,

(1) 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는,

(2) 서열번호 10의 아미노산 서열과 96% 이상, 96.3% 이상, 97% 이상, 97.7% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.2% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성(identity) 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 융합 폴리펩타이드는, 상기 폴리펩타이드 또는 세크로핀 A과 비교하여, 그람음성균에 대하여 우수한 항생 활성 및/또는 우수한 세포외막 투과 (outer membrane permeabilization) 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 또는 세크로핀 A은 재조합적 또는 합성적(예컨대, 화학적 합성)으로 제조된 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 융합 폴리펩타이드에 있어서, 세크로핀 A와 폴리펩타이드는 펩타이드 링커를 통하여 연결되거나 펩타이드 링커 없이 직접 연결된 것일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개, 2 내지 50개, 1 내지 30개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 10개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Ser, Leu, Gln, Asn, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 잔기를 각각 하나 이상 포함할 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 융합 단백질의 구조 및/또는 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Ser, Leu, Gln, Asn, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 1 내지 30개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 10개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 GSGSGS (서열번호 12), (G)_4~10(예, GGGGGG, GGGGGGGG, 등), (GGGGS)_1~5 (예, (GGGGS)₁, 등), (EAAAK)_1-5 (예, (EAAAK)₃, (EAAAK)₅, 등), (EAAAK)₄(GGGGS)₁ 등으로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는, 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 서열번호 3, 서열번호 12, 또는 서열번호 13)를 제공한다.

재조합 벡터 및 재조합 세포

다른 예는, 앞서 설명한 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드) 또는 앞서 설명한 융합 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 10 또는 서열번호 11)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 발현 벡터로 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 적절한 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 적절한 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 엔도라이신의 제조 방법은, 상기 발현시키는 단계 이후에, 발현된 엔도라이신을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 숙주세포로의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 상기 폴리펩타이드(상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드, 이하 같다.)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드가 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전법, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 구조체를 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.

본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

항생제

다른 예는,

상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7) 또는 상기 융합 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 10 또는 서열번호 11),

상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항생제를 제공한다.

다른 예는, 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드,

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 그람음성균에 대한 항생(예컨대, 그람음성균의 성장(또는 생장)의 저해(또는 억제), 그람음성균의 살균, 방제 등)에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유효량을 그람음성균에 대한 항생(또는 그람음성균의 살균, 방제 등)을 필요로 하는 대상에게 적용(또는 투여)하는 단계를 포함하는, 그람음성균의 살균방법(또는 방제방법, 성장 저해 방법)을 제공한다.

다른 예는, 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드, 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 항생제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

상기 항생제는 그람음성균에 대하여 항생효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 클렙시엘라 속 세균 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 1종, 2종, 3종, 4종, 또는 5종)일 수 있다.

예를 들어, 상기 슈도모나스 속 세균은 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 일 수 있고, 상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)일 수 있고, 상기 에스케리챠 속 세균은 대장균(Escherichia coli)일 수 있고, 상기 엔테로박터 속 세균은 엔테로박터 에어로지너스(Enterobacter aerogenes; 또는 Klebsiella aerogenes로도 알려짐) 또는 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae) 일 수 있고, 상기 클렙시엘라 속 세균은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 대장균은 adherent-invasive E.coli (또는 대장균 AIEC(Adherent-invasive E. coli) 균주), 대장균 ATCC(American type culture collection) 균주, 대장균 UPEC(Uropathogenic E. coli) 균주, 대장균 CCARM(Culture collection of antimicrobial resistance microbes) 균주, 대장균 FORC81 균주(콜리스틴 내성 대장균), 또는 대장균 Clinical 균주일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 대장균은 ATCC8739, ATCC25922, ATCC51739, CCARM 1A746, CCARM 1G490, F485, F524, F576, F716, F852, FORC81, UPEC90, UPEC3038, UPEC3042, UPEC3051, UPEC3150, UPEC3151, UPEC3163, UPEC3164, UPEC3168, UPEC3181, ECOR1, ECOR2, ECOR9, ECOR15, ECOR35, ECOR36, ECOR43, ECOR45, ECOR52, 및 ECOR69 등으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 ATCC19606, ATCC17978, CCARM12001, F4, F65, F66, 및 F67 등으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)는 PA01, ATCC15522, F102, F125, F141, F171, 및 F388 등으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 엔테로박터 에어로지너스(Enterobacter aerogenes; 또는 Klebsiella aerogenes로도 알려짐)는 CCARM16006, CCARM16008, CCARM16010, 및 F276 등으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae)는 ATCC13047, CCARM0252, 및 CCARM16003 등으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 항생제는 앞서 설명한 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7) 또는 상기 융합 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 10 또는 서열번호 11), 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (이하, 제1 항생제)에 더하여, 다른 항생제 (제2 항생제)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 제2 항생제는 통상적으로 사용되는 항생제, 예를 들어 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 항생제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 제2 항생제는 폴리믹신 (polymyxin) 계열 항생제, 세프타지딤(ceftazidime), 메로페넴(meropenem), 카나마이신(kanamycin), 티게사이클린(tigecycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 아지트로마이신(azithromycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 또는 이들로부터 선택된 1종 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 제2 항생제는 폴리믹신 (polymyxin) 계열 항생제일 수 있으며, 예컨대, 폴리믹신 B(polymyxin B), 콜리스틴 (Colistin), 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이와 같이, 항생제 (제1 항생제)를 다른 항생제 (제2 항생제)와 함께 병용함으로써, 제1 항생제 자체의 항생 효과에 의한 상승 효과 및 낮은 농도의 제2 항생제로도 우수한 항생 효과를 발휘할 수 있도록 하는 이점을 갖는다. 이로 인하여, 높은 농도의 항생제 사용에 의한 독성 (예컨대, 신장 독성, 간 독성 등) 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한, 다른 기전의 항생제 병용을 통한 항생제 내성균의 출현을 억제할 수 있다.

이에, 일 예는,

상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7) 또는 상기 융합 폴리펩타이드(예컨대, 서열번호 10 또는 서열번호 11), 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (이하, 제1 항생제); 및

(b) 상기 제2 항생제

를 포함하는 병용 항생제를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "항생제"는 그람음성균에 대하여 성장 저해능 및/또는 사멸능을 갖는 모든 형태의 제제를 포괄하는 것으로, 특별한 언급이 없는 한, 항균제, 방부제, 살균제 등과 호환적으로 사용될 수 있다.

일 예에서, 상기 제1 항생제 및 상기 제2 항생제가 조합되어 사용되는 경우의 조합비는, 상기 제2 항생제의 농도 (μg/ml)를 1로 하였을 때, 상기 제1 항생제를 0.01 내지 1024μg/ml, 0.01 내지 512μg/ml, 0.01 내지 128μg/ml, 0.01 내지 16μg/ml, 0.01 내지 1μg/ml, 0.03125 내지 1024μg/ml, 0.03125 내지 512μg/ml, 0.03125 내지 128μg/ml, 0.03125 내지 16μg/ml, 0.03125 내지 1μg/ml, 0.5 내지 1024μg/ml, 0.5 내지 512μg/ml, 0.5 내지 128μg/ml, 0.5 내지 16μg/ml, 0.5 내지 1μg/ml, 1 내지 1024μg/ml, 1 내지 512μg/ml, 1 내지 256μg/ml, 1 내지 128μg/ml, 1 내지 64μg/ml, 1 내지 32μg/ml, 1 내지 16μg/ml, 1 내지 8μg/ml, 1 내지 4μg/ml, 1 내지 2μg/ml, 2 내지 1024μg/ml, 2 내지 512μg/ml, 2 내지 256μg/ml, 2 내지 128μg/ml, 2 내지 64μg/ml, 2 내지 32μg/ml, 2 내지 16μg/ml, 2 내지 8μg/ml, 2 내지 4μg/ml, 4 내지 1024μg/ml, 4 내지 512μg/ml, 4 내지 256μg/ml, 4 내지 128μg/ml, 4 내지 64μg/ml, 4 내지 32μg/ml, 4 내지 16μg/ml, 4 내지 8μg/ml, 8 내지 1024μg/ml, 8 내지 512μg/ml, 8 내지 256μg/ml, 8 내지 128μg/ml, 8 내지 64μg/ml, 8 내지 32μg/ml, 8 내지 16μg/ml, 16 내지 1024μg/ml, 16 내지 512μg/ml, 16 내지 256μg/ml, 16 내지 128μg/ml, 16 내지 64μg/ml, 16 내지 32μg/ml, 32 내지 1024μg/ml, 32 내지 512μg/ml, 32 내지 256μg/ml, 32 내지 128μg/ml, 32 내지 64μg/ml, 64 내지 1024μg/ml, 64 내지 512μg/ml, 64 내지 256μg/ml, 64 내지 128μg/ml, 128 내지 1024μg/ml, 128 내지 512μg/ml, 128 내지 256μg/ml, 256 내지 1024μg/ml, 256 내지 512μg/ml, 또는 512 내지 1024μg/ml의 비율로 조합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

약학 조성물

다른 예는 상기 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 7) 또는 상기 융합 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 10 또는 서열번호 11),

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,

그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는, 상기 항생제 또는 병용 항생제를 유효성분으로 포함하는, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항생제 또는 병용 항생제의 약학적 유효량을 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 예방 또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 그람음성균은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 그람음성균에 의하여 유발되는 질병은 그람음성균의 감염이 원인이 되는 모든 질병들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 피부감염, 욕창, 폐렴, 균혈증, 패혈증, 심내막염, 수막염, 외이도염, 중이염, 각막염, 골수염, 장염, 복막염, 낭포성섬유증 등과 같은 슈도모나스 속 세균에 의하여 유발되는 질병; 피부감염, 폐렴, 균혈증, 패혈증 등과 같은 아시네토박터 속 세균에 의하여 유발되는 질병; 장염, 크론병, 궤양성 대장염, 세균성이질, 요로감염증, 피부감염, 균혈증, 패혈증 등과 같은 에스케리챠 속 세균에 의하여 유발되는 질병 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 바로서, 약학적 유효량은 소망하는 효과를 얻을 수 있는 유효성분의 함유량 또는 투여량을 의미한다. 상기 약학 조성물 내의 유효 성분의 함유량 또는 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 유효성분이 폴리펩타이드인 경우, 1회 투여량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 50 mg/kg, 0.01 내지 20 mg/kg, 0.01 내지 10mg/kg, 0.01 내지 5mg/kg, 0.1 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 20 mg/kg, 0.1 내지 10mg/kg, 0.1 내지 5mg/kg, 1 내지 100 mg/kg, 1 내지 50 mg/kg, 1 내지 20 mg/kg, 1 내지 10mg/kg, 또는 1 내지 5mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 약학 조성물 내 유효 성분의 함량은, 전체 약학 조성물 중량 기준으로, 0.01중량% 내지 99.9중량%, 0.01중량% 내지 90중량%, 0.01중량% 내지 80중량%, 0.01중량% 내지 70중량%, 0.01중량% 내지 60중량%, 0.01중량% 내지 50중량%, 0.01중량% 내지 40중량%, 0.01중량% 내지 30중량%, 1중량% 내지 99.9중량%, 1중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 80중량%, 1중량% 내지 70중량%, 1중량% 내지 60중량%, 1중량% 내지 50중량%, 1중량% 내지 40중량%, 1중량% 내지 30중량%, 5중량% 내지 99.9중량%, 5중량% 내지 90중량%, 5중량% 내지 80중량%, 5중량% 내지 70중량%, 5중량% 내지 60중량%, 5중량% 내지 50중량%, 5중량% 내지 40중량%, 5중량% 내지 30중량%, 10중량% 내지 99.9중량%, 10중량% 내지 90중량%, 10중량% 내지 80중량%, 10중량% 내지 70중량%, 10중량% 내지 60중량%, 10중량% 내지 50중량%, 10중량% 내지 40중량%, 또는 10중량% 내지 30중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 약학 조성물은, 상기 유효 성분 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 단백질, 핵산, 또는 세포를 포함하는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 생물체를 자극하지 않고 유효성분의 생물학적 활성 및/또는 특성을 저해하지 않는 담체를 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 등의 가축류, 닭, 오리, 거위, 꿩, 메추리, 칠면조 등의 가금류등을 포함하는 포유류에서 선택된 1종 이상, 또는 이들로부터 유래하는 세포, 조직, 또는 이들의 배양물일 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구적 투여에 의하여 투여되거나, 세포, 조직, 또는 체액에 접촉시킴으로써 투여되는 것일 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여인 경우에는 피하 주입, 근육 주입, 정맥내 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 비내 투여시, 상기 약학 조성물을 희석하여 분무기나 분무 시스템을 통해 비강으로 흡수되도록 하는 비강 분무를 통하여 투여될 수 있으며, 상기 비강 분무를 위한 비강 분무제 또는 호흡기용 제형으로는 에어로졸제 등을 들 수 있다.

또한 상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 주사제, 현탁액, 시럽제, 유화액 형태, 도포제, 패치, 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제, 에어로졸제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,

사료 첨가제를 제공한다.

다른 예는, 상기 항생제 또는 병용 항생제를 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.

다른 예는 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공한다.

상기 사료는 상기 항생제 또는 병용 항생제를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합하거나, 사료 제조 시 직접 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 사료 내 항생제 또는 병용 항생제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예컨대, 건조된 분말형태일 수 있다. 상기 항생제는 전체 사료 중량의 0.005 내지 10 중량%, 0.05 내지 10 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.005 내지 5 중량%, 0.05 내지 5 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.005 내지 2 중량%, 0.05 내지 2 중량%, 또는 0.1 내지 2 중량%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사료는 상기 항생제 또는 병용 항생제 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 항생제 또는 병용 항생제가 첨가될 수 있는 사료는 시판되는 사료, 또는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류, 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 상기 항생제 또는 병용 항생제를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다. 상기 항생제 또는 병용 항생제를 음용수에 혼합하여 공급함으로써, 음용수 내의 그람음성균의 숫자를 감소시킬 수 있다. 상기 그람음성균은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,

소독제를 제공한다.

다른 예는, 상기 항생제 또는 병용 항생제를 유효성분으로 포함하는, 소독제를 제공한다.

다른 예는 상기 항생제 또는 병용 항생제를 소독이 필요한 대상에 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다. 상기 소독제는 병원균 감염을 막기 위한 제제를 총칭하는 것으로, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 항생제 또는 병용 항생제를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다. 다른 예는 상기 항생제 또는 병용 항생제를 세척이 필요한 대상에 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다. 상기 항생제가 그람음성균에 대하여 항생 효과를 가지므로, 그람음성균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 개체의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척(세정)하는 용도로 적용될 수 있다. 상기 그람음성균은 앞서 설명한 바와 같다.

본 명세서에서 제공되는 야생형 또는 변이형 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드는 다양한 그람-음성균에 대해 우수한 항균 효능을 가지므로, 약학적 조성물뿐만 아니라 항생제로서 유용하다.

도 1은 에스케리챠 콜라이를 감염하는 박테리오파지 EC340-M-11-12의 엔도라이신(EC340) 유전자를 발현하는 발현벡터의 개열지도이다.
도 2는 박테리오파지 EC340-M-11-12 유래의 엔도라이신(EC340)의 정제과정을 보여준다.
도 3은 박테리오파지 EC340-M-11-12 유래의 엔도라이신(EC340)의 시험관 내 에스케리챠 콜라이, 아시네토박터 바우마니 및 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 본 출원에서 사용된 엔도라이신의 구성과 효소 활성을 나타낸다.
도 4a는 EC340, mtEC340 및 LNT113의 도메인 구조를 나타낸다. 그것은 세포벽 결합 도메인(CBD)이 없는 예측된 리소자임 도메인을 가지고 있다. E. coli 파지 PBEC131의 EC340은 아미노산의 여러 치환을 받았다 (mtEC340). 치환된 아미노산의 위치가 표시되었다. mtEC340은 cecropin A가 N-말단에 융합되었고 LNT113으로 명명되었다.
도 4b는 SDS-PAGE 및 후속 자이모그램 분석에서 정제된 엔도라이신, EC340(19.5kDa), mtEC340(18.2kDa) 및 LNT113(23.2kDa)의 분석 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 엔도라이신의 항균 활성을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d에 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에서 2시간 동안 E. coli 균주(도 5a, 도 5c; ATCC 8739, ATCC 25922, CCARM 1A746, CCARM 1B684) 및 K. pneumoniae 균주(도 5b, 도 5d; ATCC 700603, KCTC 2208, CCARM 10143, F85)에 대한 엔도라이신(2 μM)의 항균 활성을 나타내었다. Tris 버퍼는 음성 대조군(Control)으로 사용되었다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. t-검정 외에도 양방향 ANOVA가 수행되었으며 수직 막대 위에 수평 막대로 표시되었다(* p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 6a 내지 도 6e는 LNT113의 세포 침투 및 항균 활성을 나타낸다.
도 6a: 그람 음성 E. coli ATCC 8739의 외막 투과성은 NPN 분석에 의해 결정되었다. CecA-EGFP, EGFP에 융합된 세크로핀 A; cecA+mtEC340, cecropin A 및 mtEC340을 각각 2 μM 혼합물에 별도로 첨가하였다; PMB, 폴리믹신 B.
도 6b는 LNT113은 Cecropin A 및/또는 mtEC340에 비해 E. coli ATCC8739에 대해 향상된 항균 활성을 보였다. 모두 0.5 mM의 최종 농도로 처리하였다.
도 6c는 대장균 ATCC 8739에 대한 다양한 농도의 LNT113(0.1, 0.3, 0.9 또는 2.7μM)의 항균 활성을 나타낸다.
도 6d는 여러 가지 시간 길이에서 엔도라이신(0.5 μM)을 첨가한 후 세균(E. coli ATCC8739) 생존율이 감소함을 나타낸다. 점선은 검출 한계를 나타낸다.
도 6e는 MCR-1 양성 대장균 FORC81에 대한 LNT113의 항균 활성을 나타낸다. 세포를 2시간 동안 0.2 또는 2 μM 농도의 LNT113 또는 콜리스틴으로 처리하였다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. 별표는 대조군과의 통계적 차이를 나타낸다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 7a 내지 도 7b는 LNT113의 세포독성 및 용혈 활성을 나타낸다.
도 7a는 Huh7 세포주에서 LNT113의 세포독성 분석을 나타낸다. 세포를 다른 농도의 LNT113과 함께 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성의 양성 대조군으로 Triton X-100을 사용하였다.
도 7b는 LNT113의 용혈 활성을 나타낸다. 적혈구를 PBS 또는 LNT113과 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양하고 570 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하여 용혈 활성을 확인하였다. 용혈 활성의 양성 대조군으로 Triton X-100 0.1%를 사용하였다.
도 8은 세 가지 다른 E. coli 균주에 대한 LNT113은 colistin과 병용 처리 시 상승 효과를 나타낸다. E. coli에서 LNT113과 colistin의 isobologram. FIC 지수(FICI)는 LNT113 및 콜리스틴의 FIC(Fractional Inhibitory Concentration)의 합계를 나타낸다.
도 9는 EC340의 부위 지정 돌연변이 유발에 사용되는 추정 엔도라이신의 아미노산 서열 정렬(CLUSTAL 오메가)(CLUSTAL 오메가를 사용하는 EC340 엔도라이신과 유사한 단백질의 다중 서열 정렬(버전 1.2.4))을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 E. coli ATCC8739(도 10a) 및 K. pneumoniae KCTC2208(도 10b)에 대한 엔도라이신의 항균 활성을 나타낸다. 기하급수적으로 성장한 박테리아 세포를 37 ℃에서 2시간 동안 150 mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 2개의 상이한 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5 또는 20 mM HEPES, pH 7.5)에서 2 μM의 엔도라이신과 함께 배양하였다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. t-검정 외에도 양방향 ANOVA가 수행되었으며 수직 막대 위에 수평 막대로 표시되었다(* p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.

재료 및 방법

준비예 1. 박테리오파지 EC340-M-11-12 분리 및 EC340 엔도라이신 정제

1.1. 균주의 배양조건

에스케리챠 콜라이(ATCC 8739)를 숙주로 사용하였으며, LB(Luria-Bertani) 배지에서 37℃ 조건으로 진탕배양 하였다.

1.2. 박테리오파지의 분리

에스케리챠 콜라이에 감염하는 박테리오파지를 선별하기 위하여, 대한민국 경기도 과천시 과천하수처리장에서 샘플을 채취하였다. 상기 채취한 샘플과 에스케리챠 콜라이를 37℃에서 3시간 진탕배양 한 후, 500 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이어 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한 후, 이중 아가층 플라크 분석법(double agar layer plaque assay)을 수행하였다.

상기 분석법을 간략히 설명하면, 상층(top) 아가 5 ml에 상기 숙주 박테리아 에스케리챠 콜라이와 박테리오파지의 배양액을 0.1 M.O.I.로 섞어 아가플레이트에 붓고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하여 플라크를 수득하였다. 상기 과정의 반복수행을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 EC340-M-11-12로 명명하였다.

1.3. 박테리오파지 EC340-M-11-12의 유전체 분리 및 분석

상기 준비예 1.2.에서 확보된 박테리오파지 EC340-M-11-12의 유전체에 대한 서열분석을 실시하였다. 200 ml의 LB 배지에 에스케리챠 콜라이를 OD₆₀₀=0.5까지 배양한 후, 여기에 여과한 박테리오파지 10⁹ pfu/ml 또는 0.1 M.O.I.로 감염시켜 용균하였다. 이후 여기에 염화나트륨을 최종농도 1 M이 되도록 추가한 후 4 ℃에 1시간 방치하였다. 이어 11,000xg에서 10분간 원심분리 한 후, 침전물에 PEG(Polyethylene glycol 8000)를 10%(w/v)로 넣고, 4 ℃에 1시간 두었다. 이어, 11,000xg에서 10분간 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고, 침전물을 SM 완충액[100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄(heptahydrate), 50 mM Tris-HCl, pH 7.5]으로 현탁하였다. 여기에 클로로포름을 1:1의 비율로 넣고 볼텍스한 후 3,000xg으로 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었다.

폴리카보네이트 시험관에 40%(w/v) 글리세롤 3 ml을 넣고, 이어 5%(w/v) 글리세롤 4 ml을 섞이지 않게 넣었다. 여기에 상기 준비한 상층액을 넣고 4℃에서 11,000xg로 1시간 원심분리하였다. 이어 상등액을 제거한 후 침전물을 SM 완충액으로 재현탁하여 박테리오파지 유전체 DNA를 얻었다. 박테리오파지 유전체 DNA는 phage DNA isolation kit (Norgen biotek corp.)를 제조사 매뉴얼에 따라 사용하여 분리하였다. 상기와 같이 분리된 유전체 시료를 이용하여 유전체에 대한 염기서열을 분석하였다 (엘에이에스, Illumina MiSeq platform).

최종적으로 분석된 박테리오파지 EC340-M-11-12 유전체는 전체 핵산 서열 길이가 42,751 bp이다. 상기 박테리오파지 EC340-M-11-12 유전체의 전장 핵산 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 상기 유전체 핵산 서열 정보를 기반으로 Web 상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사하였다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 EC340-M-11-12의 유전체 서열은 이스케리챠 박테리오파지 vB_EcoS-Golestan (GenBank accession No.: NC_042084.1)과 query coverage: 80%, identity: 93.45%의 서열 상동성을 가진 것으로 확인되었다. 이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 EC340-M-11-12는 기존에 알려지지 않은 새로운 박테리오파지임을 확인하였다.

1.4. EC340M 엔도라이신의 클로닝 및 정제

상기 분석된 박테리오파지 EC340-M-11-12의 유전체 서열(서열번호 1)에 대한 ORF search를 통해 489 bp(서열번호 3)의 ORF가 엔도라이신 유전자일 것으로 추정하고, 상기 박테리오파지 EC340-M-11-12 유래의 엔도라이신 및 이를 암호화하는 유전자를 각각 EC340 엔도라이신 및 EC340 유전자로 명명하였다.

Primer (F: 5'- AAGGATCCGTGTCTCGAAACATTAGCAACAATGGC -3’(서열번호 4), R: 5’- AACTCGAGACCTTTCACCGCGCGCC -3' (서열번호 5))를 이용하여 박테리오파지 EC340-M-11-12의 유전체에 대하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 EC340 유전자(서열번호 1 내의 489 bp길이의 핵산 서열)를 얻었다. 상기 EC340 유전자에 의하여 암호화되는 EC340 엔도라이신의 아미노산 서열을 서열번호 2 (162 aa)에 나타내었다. 상기 PCR은 다음 조건에서 수행하였다: step 1: 94℃, 5분; step 2: 94℃, 30초; step 3: 52℃, 45초; step 4: 72℃, 1분; step 5: step2-4를 30회 반복; step 6: 72℃, 10분. 상기 얻어진 PCR 산물을 N-terminal 6X His-tag를 가진 pET-21a vector(Novagen)의 BamHI/XhoI site로 cloning 하여, EC340 엔도라이신 발현을 위한 발현 벡터(pET-EC340 plasmid)를 준비하였다, 상기 준비된 발현벡터 pET-EC340를 도 1에 모식적으로 나타내었다.

상기 준비된 pET-EC340 plasmid를 대장균 BL21-pLysS strain(Novagen)에 transformation 한 후, LB broth (1% Tryptone, 0.5%(w/v) Yeast extract, 0.5%(w/v) NaCl)에서 OD₆₀₀=0.5까지 배양하였다. 이후 1 mM IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid)를 첨가한 후 37℃에서 4 시간 동안 진탕배양하였다. Cell harvest 후, lysis buffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)로 재현탁하고, 1 mM PMSF 및 1 mg/ml lysozyme을 넣고 얼음에서 30 분간 정치하였다. Sonication으로 세포를 용해하고, 13,000 rpm에서 40분 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이를 Ni-NTA 아가로오스 레진 (Qiagen)이 packing된 column에 통과시켰다. 이후 wash buffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole)로 wash 후, elution buffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole)로 elution하여, EC340 단백질 (6xHis tag 포함)을 정제하였다.

15% SDS-PAGE로 EC340 단백질의 순도를 확인하고 Bradford assay로 EC340 단백질의 농도를 측정하였다. 상기 정제과정 중에 얻어진 각각의 반응물을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. SDS-PAGE를 통해 확인한 상기 정제한 EC340 단백질의 분자량은 약 19 kDa이었다.

준비예 2. 박테리아 균주 및 배양 조건

본 연구에 사용된 균주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA), Korean Collection for Type Cultures(KCTC, Korea) 및 Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes(CCRM, Korea)에서 입수하였다. F 균주와 요로병원성 (uropathogenic) 대장균 (UPEC) 균주는 임상적으로 분리되었으며 고관수(성균관대학교 의과대학) 교수로부터 제공되었다. 부착성 침습성 대장균 (Adherent invasive E. coli (AIEC)) 수집 (ECOR) 균주는 Christel Neut 교수로부터 제공되었다 (Rahmouni et al., 2018). MCR-1 양성 E. coli FORC81 균주는 류상렬 교수 (서울대학교)로부터 제공되었다(Kim et al., 2019). 이 작업에 사용된 모든 균주는 LB (lysogeny broth) 또는 CAA 배지(5 g/l casamino acid, 5.2 mM K2HPO4 및 1 mM MgSO4)에서 37 ℃에서 성장시켰다.

준비예 3. 박테리오파지 및 엔도라이신

하기 실시예에서 사용한 박테리오파지 PBEC131은 준비예 1에서 얻은 것과 같다.

추정 엔도라이신 (putative endolysin)을 발현하는 유전자 (서열번호 3)는 박테리오파지 PBEC131에서 얻었고, 추정 라이소자임 유사 슈퍼패밀리 도메인 (putative lysozyme-like superfamily domain)은 BLASTp를 통해 발견되었다.

준비예 4. 분자 클로닝

BamHI 및 XhoI 제한 부위를 사용하여 박테리오파지 PBEC131의 추정 엔도라이신을 암호화하는 유전자 (서열번호 3)를 pET21a+ (Novagen, USA)에 클로닝하고 EC340 유전자로 명명하였다. EC340 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시된다.

돌연변이 EC340 (mtEC340; 서열번호 6)은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 7개의 아미노산을 대체하여 생성되었다 (도 4a; H39S, D43H, T45E, A73V, A81S, T101A, 및 I113V).

LNT113 (서열번호 10)은 항균성 펩타이드 세크로핀 A (NCBI PRF 0708214A; 서열번호 8)를 돌연변이 EC340 (mtEC340; 서열번호 6)의 N-말단에 (GGGGS)₃ 링커와 융합하여 구축하였다. (즉, 아래 실시예에서 세크로핀 A 및 변이형 폴리펩타이드 (mtEC340)을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 LNT113으로 명명하였다.)

본 출원의 실시예에서 사용한 모든 구성물에는 친화성 정제를 위한 C-말단 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH)를 갖는다. 또한, 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP; GenBank accession no. AAB02576.1)을 코딩하는 유전자를 pET21a+ 벡터에 5' 말단에 cecropin A(CecA)를 코딩하는 유전자와 함께 클로닝하였다.

사용된 서열:

His(6H) 태그가 있는 재조합 mtEC340 [메티오닌(Met) + mtEC340 (서열번호 6) + His tag(HHHHHH)] (서열번호 7)

MVSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKGLEHHHHHH (서열번호 7)

재조합 융합 단백질 LNT113 [메티오닌(Met) + 세크로핀 A + GGGGSx3 linker + mtEC340 + His tag(HHHHHH)] (서열번호 11)

MKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAKGGGGSGGGGSGGGGSVSRNISNNGIKFTAAFEGFRGTAYRATPNEKYLTIGYGSYGPHVEPGKTITPGQGLLLLNRDMAKAVAAVDAVAHHSLTQSQFDAVCDLVYNAGAGVIAAATGTGKALRSGDVATLRAKLALFINQNGKPLLGLRRRTAGRLALFDGKPWQEAEAIGRAVKGLEHHHHHH (서열번호 11)

준비예 5. 재조합 단백질 정제

단백질 발현을 위해 E. coli BL21 (DE3) Star (Invitrogen, USA)에 Endolysin 발현 벡터를 도입하였다. 세크로핀 A(CecA) 융합 EGFP를 인코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 발현을 위해 E. coli BL21(DE3) pLysS(Novagen)에 도입하였다. 세포를 LB 브로쓰에서 지수기(OD600=0.4-0.5)로 성장시킨 후 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG; Duchefa, The Netherlands)로 25 ℃에서 5시간 동안 0.5 mM 농도로 유도하였다. 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수확하고 펠렛을 인산완충식염수(PBS)로 세척하였다. 세포를 용해 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸)에 재현탁하고 5분 동안 초음파 처리(Sonics, USA)로 파괴하였다. 세포 용해물로부터 30분 동안 15,000xg에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. 추출물을 FPLC(AKTA go, Cytiva, UK)를 사용하여 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 20 내지 500 mM의 이미다졸의 선형 구배를 사용하여 단백질을 용리하였다. 그런 다음 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피를 위해 HiTrap SP HP 컬럼(Cytiva)에 로딩하고 20 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 0에서 1 M으로 NaCl의 선형 구배로 용리하였다. 그런 다음 단백질을 저장 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl 완충액(pH 7.5))에서 투석하였다.

준비예 6. 자이모그램 분석 (Zymogram Assay)

자이모그램 분석은 이전에 설명된 방법을 일부 수정하여 수행하였다 (Khakhum et al., 2016). 즉, E. coli ATCC 8739의 밤새 배양물을 수확하고 인산완충식염수 (PBS)로 한 번 세척한 다음 4,000xg에서 15분 동안 원심분리하여 수확하였다. 그 다음, 펠렛을 3 ml의 탈이온수에 재현탁시켰다. 세포를 오토클레이브하고 중합 전에 15% SDS-PAGE 겔에 첨가하였다. 그런 다음 3 μg의 정제된 엔도라이신(EC340, mtEC340 또는 LNT113)을 2x 샘플 버퍼(0.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% 글리세롤, 0.2% 브로모페놀 블루)와 혼합하고 SDS-PAGE에 로딩하였다. 전기영동 후, 겔을 1시간 동안 탈이온수로 세척하고 반응 완충액(1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 실온에서 인큐베이션하였다. 엔도라이신의 효소 활성은 E. coli 용해물을 함유하는 겔의 투명한 영역에서 관찰되었다.

준비예 7. 항균 활성 분석

정제된 단백질의 항균 활성은 E. coli 및 여러 K. pneumoniae 균주에 대해 테스트되었다. 세균을 지수기(OD600 = 0.5)로 성장시키고 12,000xg에서 3분 동안 원심분리하여 수확하였다. 그 다음, 펠렛을 반응 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 세척하고 완충액에서 약 10⁶ cells/ml로 희석하였다. 다음으로, 100 μl의 세균 현탁액을 반응 완충액에 100 μl의 정제된 엔도라이신과 혼합하고 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 혼합물을 PBS로 희석하고 LB 플레이트에 로딩하였다. 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 세균 콜로니를 계수하였다. 모든 분석은 삼중으로 수행되었다.

동일한 반응을 20 mM HEPES-NaOH, 150 mM NaCl[pH 7.4]에서 선택된 대상 세균에 대해 수행하여 Tris의 가능한 고유 항균 활성과 turgor 압력에 대한 엔도라이신의 의존성을 배제하였다 (도 10a 및 도 10b). 도 10은 E. coli ATCC 8739(A) (도 10a) 및 K. pneumoniae KCTC 2208(B) (도 10b)에 대한 엔도라이신의 항균 활성에 대한 NaCl의 효과를 나타낸다. 기하급수적으로 성장한 세균 세포를 37 ℃에서 2시간 동안 낮은 긴장성 완충액 (low tonicity buffers) (20 mM Tris-HCl, pH 7.5 또는 20 mM HEPES, pH 7.5) 또는 높은 긴장성 완충액 (high tonicity buffers) (150 mM NaCl이 포함된 완충액)에서 2 μM의 엔도라이신과 함께 배양하였다. 저장 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl 완충액(pH 7.5))으로 처리된 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 점선은 검출 한계 (1 Log CFU/ml)를 나타낸다.

준비예 8. 1-N-페닐나프틸아민(NPN) 흡수 분석

NPN 흡수 분석은 이전에 설명한 방법으로 수행되었다(Helander and Mattila-Sandholm, 2000). 즉, 지수기(OD600 = 0.4)로 성장한 E. coli ATCC 8739를 세척하고 완충액 (5 mM HEPES, pH 7.2)에 약 10⁸ cells/ml로 재현탁시켰다. 40 μM NPN(Sigma-Aldrich) 50 μl를 96웰 블랙 플레이트에서 최종 농도 2 μM이 되도록 정제된 엔도라이신 또는 세크로핀 A (AbClon, 한국) 50 μl와 혼합하였다. 외막 투과제, 1 mM EDTA(Duchefa) 및 2 μM Polymyxin B(Sigma-Aldrich)를 양성 대조군으로 사용하였다. 그런 다음 각 웰에 세포 현탁액 100 μl를 첨가하고 37 ℃에서 5분간 배양하였다. 완충액 단독, 완충액 + NPN, 세균 현탁액 + 완충액 및 세균 현탁액 + 완충액 + NPN을 음성 대조군으로 사용하였다. 형광은 마이크로플레이트 리더(SpectraMax iD3, Molecular Devices, USA)를 사용하여 여기(350 nm) 및 방출(420 nm)에서 측정되었다. NPN 흡수 인자는 배경 제거 후 형광 값(샘플이 있는 세포 혼합물의 형광 값에서 NPN이 없는 값으로 뺀 값)을 NPN이 없는 버퍼의 형광 값에서 뺀 버퍼가 있는 세포 현탁액의 형광 값으로 나누어 계산하였다.

준비예 9. 용혈 분석

시험관내 용혈 활성 시험에 양의 적혈구(Sheep RBC)를 사용하였다. 1 ml의 적혈구(MB Cell, Korea)를 9 ml의 PBS로 희석하였다. 그런 다음, 180 μl의 RBC 용액을 20 μl의 LNT113(최종 농도, 2~128 μg/ml), PBS(음성 대조군) 또는 0.1% Triton X-100(양성 대조군)에 첨가하고 37 ℃에서 30 동안 배양하였다. 혼합물을 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 흡광도는 570 nm에서 측정되었다. 용혈률은 하기 수학식 1을 사용하여 계산되었다.

[수학식 1]

준비예 10. 시험관내 세포독성 분석

인간 간세포 암종 세포주 Huh7(한국세포주은행에서 입수하였음)을 LNT113의 세포독성 분석에 사용하였다. 먼저, 1x10⁴ Huh7 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, LNT113(최종 농도, 125 또는 250 μg/ml), 1% Triton X-100(양성 대조군) 또는 PBS(음성 대조군)를 세포에 첨가하고 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음 WST-8 Cell Viability Assay Kit(Dyne Bio, Korea)의 테트라졸륨염 용액 10 μl를 각 웰에 첨가하였다. 5% CO2 배양기에서 37 ℃, 1시간 배양 후 450 nm에서 formazan의 생성을 측정하였다.

준비예 11. 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC) 측정

LNT113 또는 항생제의 MIC는 이전에 설명된 방법(Heselpoth et al., 2019)에 따라 96웰, 둥근 바닥, 마이크로플레이트에서 브로쓰 미세희석 방법의 수정을 사용하여 결정되었다. 기하급수적으로 성장한 세포를 CAA 배지에 10⁶ CFU/ml의 농도로 희석한 다음, 재조합 LNT113(1-64 μg/ml) 또는 항생제와 함께 35 ℃에서 20시간 동안 배양하였다. MIC 값은 박테리아 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 항균 농도로 결정되었다. MBC는 LB 한천에 MIC 테스트 플레이트의 각 웰에서 혼합물 10 μl를 스폿팅하여 결정하였다. MBC는 플레이트에 성장이 없는 가장 낮은 항균제의 농도로 정의되었다. 모든 분석은 이중으로 수행되었다.

준비예 12. 체커보드 어세이 (Checkerboard Assay)

이전에 설명한 대로 연속 희석 방법을 사용하여 체커보드 어세이(Checkerboard Assay)를 수행하였다(Thummeepak et al., 2016). LNT113은 수직으로 2배 희석되었고 항생제는 96웰 마이크로플레이트에서 수평으로 연속 희석되었다. 각 웰에 CAA 배지에서 10⁶ CFU/ml 농도의 박테리아를 첨가하였다. 35 ℃에서 20시간 동안 인큐베이션한 후, 성장하지 않은 세포에 대해 MIC를 시각적으로 확인하였다. LNT113 또는 항생제에 대한 부분 억제 농도(FIC)는 두 약물의 MIC를 각 약물 단독의 MIC와 조합하여 나누어 계산하였다. 두 약물의 상호작용을 확인하기 위해 각 약물의 FIC를 합한 FIC 지수(FICI)를 사용하였다. FICI는 시너지 효과(synergitic effect) ≤0.5, 상가효과(additive) >0.5 ~ ≤1, 인디펜던트 효과(indifference) >1.0 ~ ≤2, 길항효과(antagonism) >2로 간주하였다.

준비예 13. 통계 분석

모든 통계 분석에는 Prism 버전 9(GraphPad 소프트웨어)가 사용되었다. 시험관내 연구의 경우, 모든 실험은 3중으로 수행되었으며 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 제공되었다. Tukey의 다중 비교 테스트가 있는 양방향 Anova를 사용하여 각 데이터 세트 간의 차이점을 비교하였다.

실험결과

실시예 1. 엔도라이신 EC340의 그람음성균에 대한 사멸능 조사

본 실시예에서는 엔도라이신 EC340의 아시네토박터 바우마니(ATCC19606), 슈도모나스 에루기노사(ATCC 13388) 및 에스케리챠 콜라이(ATCC 8739)를 대상으로 항균활성을 확인하기 위해 박테리아 사멸능을 시험하였다.

In vitro 시험

이를 위하여, 2 μM 농도의 엔도라이신 EC340과 각각의 시험균을 reaction buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5)에 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 넣고, 37℃에서 2 시간 동안 정치하였다. 2시간 후, 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 에루기노사 및 에스케리챠 콜라이의 콜로니 수를 확인하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 엔도라이신 EC340은 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 에루기노사 및 에스케리챠 콜라이에 대한 사멸능을 가짐을 확인하였다.

실시예 2. 박테리오파지 PBEC131 유래의 엔도라이신 및 이의 변형

박테리오파지 PBEC131의 162개 아미노산으로 구성된 ORF는 추정 엔도라이신으로 주석이 달렸다. EC340 (서열번호 2)으로 명명된 이 엔도라이신에는 파지 관련 리소자임 (muramidase, 무라미다제) 도메인 (pfam00959)을 갖는다 (도 4a). 이 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 발현시키고, 정제된 엔도라이신으로 자이모그램 분석 (zymogram assay)을 수행하여 (준비예 6 참조) 효소 활성을 관찰하였다 (도 4b의 EC340).

엔도라이신의 활성을 향상시키기 위해 EC340과 서열이 매우 유사한 8개의 단백질 (GenBank accession no. QQNO11705.1, QNO11629.1, QNO11777.1, QBJ02951.1, HAM5207786.1, YP_009168880.1, QIG59335.1, 및 YP_009113200.1)로 BLASTp를 수행하였다 (도 9). 또한 https://swissmodel.expasy.org/에서 단백질의 컴퓨터 지원 모델링을 실행하였다. 특히, 외부에 노출된 아미노산 H39S, A73V, T101A 및 I113V의 변화가 단백질의 소수성을 증가시켜 더 나은 막통과를 초래할 수 있다고 생각되었다. D43H 및 T45E 변경은 외부에 노출된 힌지 영역에 있는 것으로, 여기에서 하전된 아미노산의 스위치는 해당 영역에 대해 입체적으로 더 안정적인 특성을 초래할 수 있다. 단백질의 세 번째 나선 영역에 위치한 A81S의 변화는 단백질의 특성에 눈에 띄는 변화를 일으키지 않았을 수 있다. EC340의 효소 활성 도메인 내 7개 아미노산 위치에 돌연변이가 도입되어 (도 4a; H39S, D43H, T45E, A73V, A81S, T101A, 및 I113V) GRAVY(Grand average of hydropathicity index; 펩타이드의 소수성 값을 나타내는데 사용되는 지표)에 약간의 변화가 생겼다. 즉, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 변이형 폴리펩타이드 mtEC340은, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 EC340에서, H39S, D43H, T45E, A73V, A81S, T101A, 및 I113V 변이가 도입된 폴리펩타이드이다.

mtEC340 돌연변이는 유형 균주, 약물 내성 균주 및 임상적으로 분리된 균주를 포함하여 E. coli 또는 K. pneumoniae의 다양한 균주에 대해 테스트할 때 최대 1 log (도 5a 내지 도 5d)까지 증가된 항균 활성을 나타내었다 (저항 프로파일은 아래 표 1에 표시됨). 엔도라이신에 대한 더 높은 항균 효능은 K. pneumoniae보다 E. coli에서 관찰되었다. 이는 K. pneumoniae의 캡슐 두께가 E. coli에서 볼 수 있는 것의 16배 이상이라는 이전 보고서와 일치한다.

상기 표 1은 약물 내성 균주에 대한 다양한 항생제의 MIC에 관한 것이다.

Source : http://knrrb.ccarm-bio.or.kr

- : not determined

즉 도 5a 내지 도 5d에서 확인할 수 있는 바와 같이, E.coli ATCC8739, E.coli ATCC25922, E.coli CCARM1A746, E.coli CCARM1B684, K. pneumoniae ATCC700603, K. pneumoniae KCTC2208, K. pneumoniae CCARM10143, 및 K. pneumoniae F85 균주에 아무 것도 처리하지 않은 경우 (Control), EC340을 처리한 경우, mtEC340을 처리한 경우, 및 LNT113을 처리한 경우에 세균 수를 측정한 결과, EC340, mtEC340, 및 LNT113 모두 우수한 항균 활성이 나타났다. 그 중 mtEC340 및 LNT113은 더욱 우수한 항균 활성이 나타남을 확인하였다.

또한, 본 실험에 사용된 K. pneumoniae 균주 중 하나인 ATCC700603은 캡슐 구조를 갖는 것으로 알려져 있다. 두꺼운 캡슐은 펩티도글리칸 세포벽에 대한 엔도라이신의 접근을 방해할 가능성이 있다. K. pneumoniae 캡슐 다당류는 polymyxin 및 lactoferrin과 같은 항균 펩타이드에 대한 내성을 매개하는 것으로 보고되었다. 활성을 더욱 증가시키기 위해 mtEC340의 N-말단에 항균성 펩타이드인 cecropin A의 37개 아미노산 서열 (서열번호 8)을 융합하여 엔도라이신 LNT113 (서열번호 10)을 구축하였다. 이것은 mtEC340과 비교할 때 활동에서 최대 4-log 증가를 보여주었다. 테스트한 모든 균주에 대해 2시간 배양 후 생존 가능한 세균 세포가 검출되지 않았다. 엔도라이신의 항균 활성은 잠재적으로 팽압에 의존하고 Tris 자체가 외막 투과제로 작용할 수 있기 때문에 다양한 생리적 조건(150 mM NaCl을 포함하는 Tris 버퍼 또는 150 mM NaCl을 포함하는 Hepes 버퍼 (도 10a 및 도 10b))에서 추가 항균 분석을 수행하였다. 예상외로, 항박테리아 활성은 NaCl이 없는 Tris 버퍼보다 Hepes 버퍼에서 더 높았다. 그러나 NaCl을 추가하면 EC340 및 mtEC340이 거의 비활성화되었다. 그러나 이전에 보고된 바와 같이 cecropin A-fused endolysin(LNT113)을 사용한 경우 염 존재의 부정적인 영향이 크게 감소하였다.

실시예 3. LNT113의 향상된 세포 투과성으로 향상된 항균 효능

일반적으로 외용 엔도라이신은 그람음성균에 외막이 존재하기 때문에 펩티도글리칸층에 도달하기 어렵다. 외막과 상호작용하는 세크로핀 A와의 융합은 막 침투를 증가시켜야 한다.

NPN (1-N-페닐나프틸아민) 분석을 통해 (준비예 8 참조) 세크로핀 A 및/또는 엔도라이신을 포함하는 여러 구성물의 막 관통 능력을 비교하였다 (도 6a).

도 6a(E. coli ATCC 8739의 외막 투과성)에서 확인할 수 있는 바와 같이, mtEC340에 비해 세크로핀 A가 융합된 LNT113(도 6a의 LNT113)을 처리한 세포에서 막 침투가 1.8배 증가하는 것으로 관찰되었다. 이것은 또한 cecropin A 단독(도 6a의 CecA)보다 1.3배 더 높았다. 또한, mtEC340과 cecropin A를 병용투여하였을 때(도 6a의 CecA+mtEC340) 막투과도가 증가하였다. 반대로, EGFP에 융합된 세크로핀 A(도 6a의 CecA+EGFP)는 LNT113과 비교할 때 멤브레인을 투과하는 능력이 제한되어 있음을 보여주었으며, 이는 AMP와 멤브레인을 투과하는 강력한 능력을 보여주는 엔도라이신의 파트너링이 추가 효과를 달성하는 데 필요함을 시사한다.

도 6b에 나타낸 각 구조물의 살균 효능은 도 6a에 나타낸 바와 같이 막을 투과하는 능력에 비례하였다. 시험관 내에서 LNT113은 용량 및 시간에 따라 항균 활성을 나타내었다 (대장균 ATCC 8739(도 6c) 및 도 6d). 콜리스틴 내성 균주인 E.coli FORC81은 LNT113에 대한 감수성에 대해 테스트되었다 (E.coli FORC81(도 6e)). 2 μM의 농도에서 콜리스틴 처리된 세포에서 1.2-log 감소가 관찰된 반면, 동일한 농도에서 LNT113은 검출 한계 이하로 박테리아 세포의 양을 감소시키는 데 성공하였다.

실시예 4. 최소 억제 농도(MIC)의 결정

E. coli는 인간과 동물의 다양한 질병과 관련이 있다. 병원성 대장균은 요로, 신장, 혈류 등 인체의 다양한 부위에 군집을 형성하여 질병을 유발한다. MIC 측정을 통해 (준비예 11 참조) 다양한 E. coli 균주에서 LNT113의 항균 활성을 확인하였다 (표 2).

상기 표 2는 다양한 대장균 균주에 대한 LNT113의 MIC 및 MBC에 관한 것이다.

표적 균주에는 유형 균주, 약물 내성 균주(CCRM 및 FORC81), 임상적으로 분리된 균주(F), 요로병원성 균주(UPEC) 및 부착성 침습성 균주(ECOR)가 포함되었다. MIC는 대부분의 균주에서 4-64 μg/ml인 것으로 나타났다 (1 mM의 LNT113은 23.2 mg/ml이고 1 mg/ml의 LNT113은 0.0431 mM임). 엔도라이신 EC340 또는 mtEC340에 대한 MIC는 >128 mg/ml이었다 (표 3).

또한, 최소 살균 농도(MBC)는 MIC와 동일하여 작용 방식이 살균임을 시사한다. LNT113의 MIC는 A. baumannii, P. aeruginosa, K. pneumoniae와 같은 다양한 그람음성균에 대해 확인되었다 (표 4).

상기 표 3은 대장균 균주에서 콜리스틴과 조합된 엔도라이신의 MIC (μg/ml)에 관한 것이다.

상기 표 4는 다양한 그람 음성균에 대한 LNT113의 MIC (μg/ml)에 관한 것이다.

균주에는 유형 균주, 임상적으로 분리된 균주 및 약물 내성 균주가 포함된다. 사용된 약물 내성 균주에 대한 항생제의 MIC는 상기 표 1에 기재되어 있다. MIC는 4-32 μg/ml 범위였다. Salmonella typhimurium 및 Salmonella enteritidis의 경우 MIC는 >64 μg/ml였다.

실시예 5. LNT113의 세포독성 및 용혈 활성

LNT113의 세포 독성을 확인하기 위해 인간 간암 세포주 Huh7에 대해 WST-1 분석을 수행하였다 (준비예 10 참조). LNT113을 48시간 동안 250 또는 125 μg/ml로 처리한 경우 세포 생존율의 감소가 관찰되지 않았다 (도 7a).

용혈 활성을 측정하기 위해 LNT113을 2~128 μg/ml의 농도로 적혈구에 첨가하였다. LNT113의 용혈 활성은 관찰되지 않았다 (도 7b).

실시예 6. LNT113과 다양한 항생제의 시너지 효과

LNT113을 다양한 항생제와 결합하는 효과를 확인하기 위해 체커보드 어세이(checkerboard assay)를 수행하였다 (준비예 12 참조). 먼저, FICI(fractional inhibitory concentration index)를 측정하여 대장균 균주에서 LNT113과 colistin의 조합 효과를 관찰하였다. LNT113 및 콜리스틴의 FIC 플로팅을 포함하여 isobologram으로 표시되는 checkerboard 분석 결과는 도 8에 나타내었다. E. coli ATCC 8739에서 콜리스틴과 LNT113을 모두 처리했을 때 두 값의 합(FICI)은 0.25였다. 이는 두 제제의 시너지 효과를 나타낸다. UPEC 3150 균주의 경우 FICI는 0.375로 상승효과를 보였다. E. coli FORC81의 경우 FICI는 0.5로 또 다른 상승효과를 나타냈다. 콜리스틴 내성 대장균 FORC81에서 콜리스틴의 MIC가 4 mg/ml의 LNT113과 조합하여 처리될 때 16 mg/ml에서 1 mg/ml로 감소했다는 점은 주목할 만하다 (표 3).

LNT113과 8개의 다른 항생제 사이의 시너지 효과는 FICI를 결정함으로써 5개의 다른 E. coli 균주에 대해 확인되었다 (표 5).

상기 표 5는 다양한 항생제를 사용한 LNT113의 부분 억제 농도 지수(FICI)에 관한 것이다.

(*: not determined

FICI: ≤ 0.5, synergy; >0.5 - ≤ 1.0, additive; >1.0 to ≤ 2, indifference; >2.0, antagonism)

5개 균주 중 4개 균주에서 콜리스틴과의 시너지 효과가 관찰된 반면, 다른 모든 조합에서는 부가 (additive) 또는 무관한 (indifferent) 효과가 관찰되었다.

또한 MIC가 >128 mg/ml인 엔도라이신 EC340 또는 mtEC340이 있을 때 콜리스틴의 MIC가 현저하게 감소한다는 것을 관찰하였다 (표 3).

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> LyseNTech Hankuk University OF Foreign Studies Research and Business Foundation <120> Antibiotics against novel polypeptides and Gram-negative bacteria containing the same <130> DPP20220317KR <150> KR 10-2021-0109266 <151> 2021-08-19 <150> KR 10-2022-0012566 <151> 2022-01-27 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 42751 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Bacteriophage EC340-M-11-12 whole genome <400> 1 gttctcgtcg gtagatgtgt cggtgttcga tggctccacg ccgttgcgtt gcgatactct 60 caccatcacc aacgacaacg gagcttccgc gcagttcgaa ctcggtaaca gtagcgtggc 120 gttcgtcgaa cgtggacgcg cagctaacac attctctatc tctggcaagc tgtacgacat 180 ggcgatgatt cagaagttta tcaacgagca gcaggtagag attaactcta ttctggcagg 240 ggtaaacggg gctatgtctt tcagtttgaa acgtgcagag cttacggcgg ttacacctga 300 gattggtggg cctgagtcaa tcactcagtc cattgaaggc caggctaccg gcaatcagta 360 ccagtcgtct atcgtaattc aacgtatcac ctacgcataa aactaaggcc cctttcgggg 420 cctttttctt acaaacctaa ttttaaagca atgtctataa cgttcgattt aacgtcaccc 480 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agtgcatctg acccggtaat gattaatgct gcggggctgg ttacattcaa caccgcgggt 40500 aactatgccg ttcgcatcaa gttacaggcc ggtcgctccg gcgctagcgg aacgtctatc 40560 ctgttgtcgc gtatcctcat taacggcgct cagtacggct caccagcagc tacgaaactt 40620 gttagctcgg aaaccaccat ccctattgaa tcccgtgtag tgattaaccc aaccgccggg 40680 caaacattcg ccgttcagat tatgcgagat agcgccggga ctaacttcgg aggcgtatac 40740 ccgcaggtgg ctactgtaac tgcatggggc acggcaccgt ccgcgctact ggttatttcg 40800 agactggagg ctgcctgatg agcactgctt tcagtaaacg tatgcaaggc gtgggtacac 40860 gcctgctaac caaattcggc agcacggtat ctttggttcg cgctggctcg aaagtgtggg 40920 acgaagttct cggtgagtac atctggtccg ccgatgaagt tctgccgttg aaagccgtgc 40980 ctgttccggt taacgcaggt ttggttaacg gcacaaccat tcaggccgga gacatgattg 41040 tcaaagccga ttgcagcgtc gttccgaaga tggaggacaa ggtgcaattc ggcggcgagc 41100 aatggtccgt cgtagccatt gagaagaagg tggttaacga tgatgttgtg gcctacttta 41160 ttcaggtgag aaaatgagtt tcgcgctgga cgtctctaag ttcgtggaaa aggcgaagaa 41220 gaaccctgag aaggtgatgc gtcaggtgtc tatcaagctg ttttccgcta 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tcccgctgta acccgcgatg 42120 cactgacttc caacgaactg gacggcagcc gtgaaactac atccatccga accggtaaca 42180 agcaggttag cggggagtat gccatcgaac ttagctctcg tagccaggat gatttccttg 42240 cgggagcgat gacttctacg tggaaagctg gggtagagat tactggcgcc gaaattacgg 42300 tcgccccagc aggtaaaaca ttcacccgcg ctgctggtaa cttcattact gacggtgtag 42360 aagttggcga ccttattgcg ttcaccgact taaccggcga caacgcaaaa ccgtttatcg 42420 tgaccgcggt ttccgctctg gtagttacgg gcgcaggtat tcagcacacg ctgacagcag 42480 agacagtaac cactgacgca aaaactggcg acaagctgga aaccggtaac gcgtgtaaga 42540 cgttctccat cctgacgtgg ttcaagggcc agtgtggtaa cctggacgcg tacatgctga 42600 ccaaaggtgt ggaaatctct ggctttaccg tagagcaggc ggttaacgcc atggtcaccg 42660 gcagcttccc gttcatcggc ctgagtcagg agattcttac cgcgccgccg tctggctctg 42720 atttctctca ggttacgttc accgatgagc c 42751 <210> 2 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_EC340 <400> 2 Val Ser Arg Asn Ile Ser Asn Asn Gly Ile Lys Phe Thr Ala Ala Phe 1 5 10 15 Glu Gly Phe Arg Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Thr Pro Asn Glu Lys Tyr 20 25 30 Leu Thr Ile Gly Tyr Gly His Tyr Gly Pro Asp Val Thr Pro Gly Lys 35 40 45 Thr Ile Thr Pro Gly Gln Gly Leu Leu Leu Leu Asn Arg Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Ala Ala His His Ser Leu Thr Gln 65 70 75 80 Ala Gln Phe Asp Ala Val Cys Asp Leu Val Tyr Asn Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Val Ile Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Lys Ala Leu Arg Ser Gly Asp 100 105 110 Ile Ala Thr Leu Arg Ala Lys Leu Ala Leu Phe Ile Asn Gln Asn Gly 115 120 125 Lys Pro Leu Leu Gly Leu Arg Arg Arg Thr Ala Gly Arg Leu Ala Leu 130 135 140 Phe Asp Gly Lys Pro Trp Gln Glu Ala Glu Ala Ile Gly Arg Ala Val 145 150 155 160 Lys Gly <210> 3 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_gene encoding EC340 <400> 3 gtgtctcgaa acattagcaa caatggcatc aaattcaccg ccgcgttcga ggggttccgc 60 ggaactgcgt atcgtgctac gccaaatgag aagtacctga ctattgggta cggtcattat 120 gggccagacg taacgccagg caagaccatc accccgggac aaggcctcct gttactgaat 180 cgtgatatgg ccaaggcagt agcggcggtt gatgctgcag cgcaccattc attgacacag 240 gcacagttcg acgcagtgtg cgacctggtg tataacgcgg gtgccggtgt gattgcggct 300 actactggca caggtaaggc actgcgttct ggtgatattg caacgctgcg ggctaagctg 360 gcgctgttca tcaaccagaa cggcaaaccg ttactaggcc tgcgtcgccg taccgccggt 420 cgtctggcgc tgttcgacgg taaaccgtgg caggaggctg aggctatcgg gcgcgcggtg 480 aaaggttga 489 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_primer1 <400> 4 aaggatccgt gtctcgaaac attagcaaca atggc 35 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_primer2 <400> 5 aactcgagac ctttcaccgc gcgcc 25 <210> 6 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_mtEC340 <400> 6 Val Ser Arg Asn Ile Ser Asn Asn Gly Ile Lys Phe Thr Ala Ala Phe 1 5 10 15 Glu Gly Phe Arg Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Thr Pro Asn Glu Lys Tyr 20 25 30 Leu Thr Ile Gly Tyr Gly Ser Tyr Gly Pro His Val Glu Pro Gly Lys 35 40 45 Thr Ile Thr Pro Gly Gln Gly Leu Leu Leu Leu Asn Arg Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Val Ala His His Ser Leu Thr Gln 65 70 75 80 Ser Gln Phe Asp Ala Val Cys Asp Leu Val Tyr Asn Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Val Ile Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ala Leu Arg Ser Gly Asp 100 105 110 Val Ala Thr Leu Arg Ala Lys Leu Ala Leu Phe Ile Asn Gln Asn Gly 115 120 125 Lys Pro Leu Leu Gly Leu Arg Arg Arg Thr Ala Gly Arg Leu Ala Leu 130 135 140 Phe Asp Gly Lys Pro Trp Gln Glu Ala Glu Ala Ile Gly Arg Ala Val 145 150 155 160 Lys Gly <210> 7 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Met+mtEC340+His tag <400> 7 Met Val Ser Arg Asn Ile Ser Asn Asn Gly Ile Lys Phe Thr Ala Ala 1 5 10 15 Phe Glu Gly Phe Arg Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Thr Pro Asn Glu Lys 20 25 30 Tyr Leu Thr Ile Gly Tyr Gly Ser Tyr Gly Pro His Val Glu Pro Gly 35 40 45 Lys Thr Ile Thr Pro Gly Gln Gly Leu Leu Leu Leu Asn Arg Asp Met 50 55 60 Ala Lys Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Val Ala His His Ser Leu Thr 65 70 75 80 Gln Ser Gln Phe Asp Ala Val Cys Asp Leu Val Tyr Asn Ala Gly Ala 85 90 95 Gly Val Ile Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ala Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Asp Val Ala Thr Leu Arg Ala Lys Leu Ala Leu Phe Ile Asn Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Pro Leu Leu Gly Leu Arg Arg Arg Thr Ala Gly Arg Leu Ala 130 135 140 Leu Phe Asp Gly Lys Pro Trp Gln Glu Ala Glu Ala Ile Gly Arg Ala 145 150 155 160 Val Lys Gly Leu Glu His His His His His His 165 170 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Cecropin A <400> 8 Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Thr Gln Ile Ala Lys 35 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Met+Cecropin A <400> 9 Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile 1 5 10 15 Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln 20 25 30 Ala Thr Gln Ile Ala Lys 35 <210> 10 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Met+Cecropin A+GGGGS3 linker+mtEC340 <400> 10 Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile 1 5 10 15 Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln 20 25 30 Ala Thr Gln Ile Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Arg Asn Ile Ser Asn Asn Gly Ile Lys 50 55 60 Phe Thr Ala Ala Phe Glu Gly Phe Arg Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Thr 65 70 75 80 Pro Asn Glu Lys Tyr Leu Thr Ile Gly Tyr Gly Ser Tyr Gly Pro His 85 90 95 Val Glu Pro Gly Lys Thr Ile Thr Pro Gly Gln Gly Leu Leu Leu Leu 100 105 110 Asn Arg Asp Met Ala Lys Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Val Ala His 115 120 125 His Ser Leu Thr Gln Ser Gln Phe Asp Ala Val Cys Asp Leu Val Tyr 130 135 140 Asn Ala Gly Ala Gly Val Ile Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ala 145 150 155 160 Leu Arg Ser Gly Asp Val Ala Thr Leu Arg Ala Lys Leu Ala Leu Phe 165 170 175 Ile Asn Gln Asn Gly Lys Pro Leu Leu Gly Leu Arg Arg Arg Thr Ala 180 185 190 Gly Arg Leu Ala Leu Phe Asp Gly Lys Pro Trp Gln Glu Ala Glu Ala 195 200 205 Ile Gly Arg Ala Val Lys Gly 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Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩타이드.
서열번호 2의 아미노산 서열의 39번째 아미노산이 세린으로,
서열번호 2의 아미노산 서열의 43번째 아미노산이 히스티딘으로,
서열번호 2의 아미노산 서열의 45번째 아미노산이 글루탐산으로,
서열번호 2의 아미노산 서열의 73번째 아미노산이 발린으로,
서열번호 2의 아미노산 서열의 81번째 아미노산이 세린으로,
서열번호 2의 아미노산 서열의 101번째 아미노산이 알라닌으로, 및
서열번호 2의 아미노산 서열의 113번째 아미노산이 발린으로 치환된 변이가 도입된, 폴리펩타이드.
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제2항에 있어서,
서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩타이드.
제2항 또는 제5항에 있어서, 세크로핀 A (Cecropin A)를 추가로 포함하는 것인, 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 세크로핀 A는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 세크로핀 A 및 상기 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 순서대로 연결된 것인, 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 세크로핀 A 및 상기 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의하여 연결된 것인, 폴리펩타이드.
제6항에 있어서,
서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩타이드.
제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 것인, 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 것인, 폴리펩타이드.
제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 및 세크로핀 A를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제13항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합 벡터.
제13항의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.
제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 및 세크로핀 A를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 박테리오파지.
제16항에 있어서, 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것인, 박테리오파지.
제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 및 세크로핀 A를 포함하는 융합 폴리펩타이드,
상기 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항생제.
제18항에 있어서, 폴리믹신 계열 항생제를 추가로 포함하는, 항생제.
제19항에 있어서, 상기 폴리믹신 계열 항생제는 폴리믹신 B, 콜리스틴, 또는 이들의 조합인, 항생제.
제18항에 있어서, 그람 음성균에 대하여 항생 활성을 갖는, 항생제.
제21항에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 및 클렙시엘라 속 세균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 항생제.
제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 및 세크로핀 A를 포함하는 융합 폴리펩타이드,
상기 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는,
그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 및 클렙시엘라 속 세균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균이고,
슈도모나스 속 세균에 의하여 유발되는 질병은 피부감염, 욕창, 폐렴, 균혈증, 패혈증, 심내막염, 수막염, 외이도염, 중이염, 각막염, 골수염, 장염, 또는 복막염인, 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 그람음성균은 아시네토박터 속 세균이고,
아시네토박터 속 세균에 의하여 유발되는 질병은 피부감염, 폐렴, 균혈증, 또는 패혈증인, 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 그람음성균은 에스케리챠 속 세균이고,
에스케리챠 속 세균에 의하여 유발되는 질병은 장염, 크론병, 궤양성 대장염, 세균성이질, 요로감염증, 피부감염, 균혈증, 또는 패혈증인, 약학 조성물.
제18항의 항생제를 포함하는, 사료 첨가제.
제18항의 항생제를 포함하는, 소독제.
제18항의 항생제를 포함하는, 세척제.