KR102228999B1

KR102228999B1 - 폴리펩타이드 변이체 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제

Info

Publication number: KR102228999B1
Application number: KR1020200108498A
Authority: KR
Inventors: 명희준; 김민수; 홍혜원; 편지원; 장재연
Original assignee: 주식회사 라이센텍; 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2021-03-18

Abstract

신규한 폴리펩타이드 변이체 및 이의 항생제로서의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 박테리오파지로부터 유래하는 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제에 관한 것이다.

Description

폴리펩타이드 변이체 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제{Polypeptide Variants and Antibiotics against Gram-Negative Bacteria Comprising the Same}

본 명세서에서 신규한 폴리펩타이드 및 이의 항생제로서의 용도가 제공된다. 보다 구체적으로, 박테리오파지로부터 유래하는 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제가 제공된다.

박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 자신의 숙주 박테리아에 감염(infection)한 후 세균 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 박테리오파지의 단백질인 엔도라이신을 이용하여 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖는다. 따라서, 박테리오파지의 엔도라이신 활성을 가지는 물질은 항생제 후보물질로서 유용하게 적용될 수 있다.

근래 항생제 내성세균이 급속히 증가하고 있고, 어떤 항생제로도 치료가 되지 않는 다제내성세균도 늘어나고 있다. 특히, 그람음성균 중 하나인 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)는 전 세계적으로 새로운 치료수단의 개발이 시급한 ESKAPE(Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter species) bacteria 중 하나이다. 따라서 기존의 항생제와는 차별화되는 치료수단의 개발이 요구된다.

일 예는 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 박테리오파지로부터 유래한 것 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 엔도라이신 활성을 갖는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 발현 벡터로 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위한 것일 수 있다.

다른 예는,

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,

상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항생제를 제공한다.

상기 항생제는 그람음성균에 대하여 항생 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 항생제 (제1 항생제)는 다른 항생제 (제2 항생제)와 병용됨으로써, 자체의 항생 효과에 의한 상승 효과 및 낮은 농도의 제2 항생제로도 우수한 항생 효과를 발휘할 수 있도록 하는 이점을 갖는다. 이로 인하여, 높은 농도의 항생제 사용에 의한 독성 (예컨대, 신장 독성, 간 독성 등) 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한, 다른 기전의 항생제 병용을 통한 항생제 내성균의 출현을 억제할 수 있다.

이에, 일 예는,

(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 및

(2) 항생제 (예컨대, 폴리믹신 B(polymyxin B) 및/또는 콜리스틴 (Colistin) 등의 polymyxin 계열 항생제 등)

를 포함하는 항생제를 제공한다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항생제의 약학적 유효량을 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

다른 예는 상기 항생제를 소독이 필요한 대상에 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다.

다른 예는 상기 항생제를 세척이 필요한 대상에 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다.

세균을 숙주로 증식하여 천연의 항생제로 사용될 수 있는 박테리오파지가 세균에 침투하여 내부에서 증식을 마치면 완성된 파지입자들이 세균 외부로 방출되며, 이 때, 세균의 세포벽을 공격하여 분해하여 외부로 방출될 통로를 만들어 주는 효소가 엔도라이신이다. 모든 박테리오파지는 유전체(genome) 내에 이러한 엔도라이신 유전자를 가지고, 증식 시에 발현된 엔도라이신 단백질을 이용한다. 세균을 숙주로 증식하는 박테리오파지와 세포벽을 분해하는 특성을 가지는 박테리오파지 유래의 엔도라이신은 천연의 항생제로 이용될 수 있다. 본 명세서에서는 신규한 폴리펩타이드가 기존 엔도라이신보다 뛰어난 항생 효과를 입증하여, 엔도라이신 활성을 가지는 폴리펩타이드, 및 이의 항생제 및/또는 이와 관련된 용도를 제공한다.

그람 양성세균의 경우에는 가장 외벽에 세포벽이 위치하므로, 외부에서 엔도라이신을 첨가하면 세포벽이 바로 공격당하여 분해된다. 반면에, 그람 음성세균의 경우에는 가장 외부에 외세포막이 존재하고, 그 내부에 세포벽이 위치하므로, 외부에서 엔도라이신을 첨가하더라도 먼저 외세포막을 통과하여야 세포벽을 만나게 된다. 따라서, 기본적으로 엔도라이신은 그람 음성세균에는 효과가 없다고 알려져 왔다. 본 명세서에서 제공되는 엔도라이신 활성을 가지는 폴리펩타이드는 그람음성균을 사멸시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:

일 예는 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 박테리오파지로부터 유래한 엔도라이신과 비교하여 우수한 엔도라이신 활성 및/또는 항생 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 분자량이 약 28 kDa (28 kDa±2)인 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 재조합적 또는 합성적(예컨대, 화학적 합성)으로 제조된 것일 수 있다.

엔도라이신은 박테리오파지가 암호화하는 펩티도글리칸 가수분해효소를 의미한다. 엔도라이신은 박테리오파지 증식의 용해 회로에서 후기 유전자 발현 동안 합성되고 박테리아성 펩티도글리칸의 분해를 통해 감염된 세포로부터 자손 비리온의 방출을 매개한다. 효소적 활성의 측면에서, 엔도라이신은 통상적으로 글루코사미니다아제 (Glucosaminidase), 무라미다아제 (muramidase) (lysozyme의 일종), 트랜스글리코실라아제 (transglycosylase), 아미다아제 (amidase), 엔도펩티다아제 (endopeptidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.

일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 본래의 기능은, 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) (아미노산 서열의 경우), 또는 엔도라이신 효소 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있고, 상기 목적하는 기능은 슈도모나스 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 활성을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 다르게 기재되지 않는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 폴리펩타이드로서 엔도라이신 활성을 갖는 폴리펩타이드는,

(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드, 및/또는

(2) 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고, 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) 및/또는 그람음성균에 대한 항생 활성을 갖는 (유지하는) 폴리펩타이드

를 의미하는 것일 수 있다.

또한, 본 명세서에서, 다르게 기재되지 않는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는,

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) 및/또는 슈도모나스 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사에 대한 항생 활성을 갖는 (유지하는) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(c) 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드

를 의미할 수 있고,

서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는

(d) 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는

(e) 서열번호 2의 핵산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고, 엔도라이신 효소 기능 (예컨대, 펩티도글리칸 가수분해 활성) 및/또는 그람음성균에 대한 항생 활성을 갖는 (유지하는) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

를 의미하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "상동성(identity)"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입(형질전환 또는 형질감염)하여 얻어진 것일 수 있다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 적절한 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 엔도라이신 제조 방법을 제공한다. 상기 폴리펩타이드를 적절한 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 엔도라이신의 제조 방법은, 상기 발현시키는 단계 이후에, 발현된 엔도라이신을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 숙주세포로의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 상기 폴리펩타이드을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드가 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전법, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 구조체를 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.

본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는　pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드는 천연 유래의 것이 아닐 수 있으며, 재조합적 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 재조합적으로 생산되는 경우, 정제를 위하여 통상의 시그날 펩타이드, 절단부위, tag 등이 결합된 형태일 수 있다. 따라서, 비제한적인 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드는 단백질의 재조합적 생산 과정에 통상적으로 사용 가능한 시그날 펩타이드, 절단부위, tag (예컨대, His tag, GST (glutathione-s-transferase) tag, MBP (maltose binding protein) tag 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 형태이거나, 이들이 제거된 정제된 형태일 수 있다.

다른 예는,

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,

상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

상기 항생제는 그람음성균에 대하여 항생효과를 갖는 것일 수 있다. 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 클렙시엘라 속 세균, 살모넬라 속 세균, 캠필로박터 속 세균, 크로노박터 속 세균 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 또는 8종)일 수 있다. 일 예에서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 클렙시엘라 속 세균, 살모넬라 속 세균 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 6종)일 수 있다. 예를 들어, 상기 슈도모나스 속 세균은 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 일 수 있고, 상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)일 수 있고, 상기 에스케리챠 속 세균은 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)일 수 있고, 상기 엔테로박터 속 세균은 엔테로박터 에어로지너스(Enterobacter aerogenes)일 수 있고, 상기 클렙시엘라 속 세균은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)일 수 있고, 상기 살모넬라 속 세균은 살모넬라 엔테리티디스(Selmonella enteritidis)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 항생제는 앞서 설명한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (이하, 제1 항생제)에 더하여, 다른 항생제 (제2 항생제)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 제2 항생제는 통상적으로 사용되는 항생제, 예를 들어 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는 항생제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제2 항생제는 폴리믹신 (polymyxin) 계열 항생제일 수 있으며, 예컨대, 폴리믹신 B(polymyxin B), 콜리스틴 (Colistin), 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이와 같이, 항생제 (제1 항생제)를 다른 항생제 (제2 항생제)와 함께 병용함으로써, 제1 항생제 자체의 항생 효과에 의한 상승 효과 및 낮은 농도의 제2 항생제로도 우수한 항생 효과를 발휘할 수 있도록 하는 이점을 갖는다. 이로 인하여, 높은 농도의 항생제 사용에 의한 독성 (예컨대, 신장 독성, 간 독성 등) 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한, 다른 기전의 항생제 병용을 통한 항생제 내성균의 출현을 억제할 수 있다.

이에, 일 예는,

(2) 항생제 (예컨대, 폴리믹신 B(polymyxin B), 콜리스틴 (Colistin), 또는 이의 조합 등의 polymyxin 계열 항생제 등)

를 포함하는 항생제를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 항생제 (예컨대, 폴리믹신 B(polymyxin B), 콜리스틴 (Colistin), 또는 이의 조합 등의 polymyxin 계열 항생제 등)와 함께 사용(병용)함으로써, MIC (Minimum Inhibitory Concentration; 예컨대, CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)의 표준 시험법을 따라 측정) 값이, 상기 항생제의 단독사용시와 비교하여, 3/4배 이하 (75% 이하), 2/3배 이하 (약 67% 이하), 1/2배 이하 (50% 이하), 1/3배 이하 (약 33% 이하), 4/1 이하 (25% 이하), 1/5 이하 (20% 이하), 1/7 이하 (약 14% 이하), 또는 1/10 이하 (10% 이하)로 감소할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "항생제"는 그람음성균에 대하여 성장 저해능 및/또는 사멸능을 갖는 모든 형태의 제제를 포괄하는 것으로, 특별한 언급이 없는 한, 항균제, 방부제, 살균제 등과 호환적으로 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항생제의 약학적 유효량을 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 예방 또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병 의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 그람음성균은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 그람음성균에 의하여 유발되는 질병은 그람음성균의 감염이 원인이 되는 모든 질병들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 피부감염, 욕창, 폐렴, 균혈증, 패혈증, 심내막염, 수막염, 외이도염, 중이염, 각막염, 골수염, 장염, 복막염, 낭포성섬유증 등과 같은 슈도모나스 속 세균에 의하여 유발되는 질병; 피부감염, 폐렴, 균혈증, 패혈증 등과 같은 아시네토박터 속 세균에 의하여 유발되는 질병; 장염, 크론병, 궤양성 대장염, 세균성이질, 요로감염증, 피부감염, 균혈증, 패혈증 등과 같은 에스케리챠 속 세균에 의하여 유발되는 질병 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 바로서, 약학적 유효량은 소망하는 효과를 얻을 수 있는 유효성분의 함유량 또는 투여량을 의미한다. 상기 약학 조성물 내의 유효 성분의 함유량 또는 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 유효성분이 폴리펩타이드인 경우, 1회 투여량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 50 mg/kg, 0.01 내지 20 mg/kg, 0.01 내지 10mg/kg, 0.01 내지 5mg/kg, 0.1 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 20 mg/kg, 0.1 내지 10mg/kg, 0.1 내지 5mg/kg, 1 내지 100 mg/kg, 1 내지 50 mg/kg, 1 내지 20 mg/kg, 1 내지 10mg/kg, 또는 1 내지 5mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 약학 조성물 내 유효 성분의 함량은, 전체 약학 조성물 중량 기준으로, 0.01중량% 내지 99.9중량%, 0.01중량% 내지 90중량%, 0.01중량% 내지 80중량%, 0.01중량% 내지 70중량%, 0.01중량% 내지 60중량%, 0.01중량% 내지 50중량%, 0.01중량% 내지 40중량%, 0.01중량% 내지 30중량%, 1중량% 내지 99.9중량%, 1중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 80중량%, 1중량% 내지 70중량%, 1중량% 내지 60중량%, 1중량% 내지 50중량%, 1중량% 내지 40중량%, 1중량% 내지 30중량%, 5중량% 내지 99.9중량%, 5중량% 내지 90중량%, 5중량% 내지 80중량%, 5중량% 내지 70중량%, 5중량% 내지 60중량%, 5중량% 내지 50중량%, 5중량% 내지 40중량%, 5중량% 내지 30중량%, 10중량% 내지 99.9중량%, 10중량% 내지 90중량%, 10중량% 내지 80중량%, 10중량% 내지 70중량%, 10중량% 내지 60중량%, 10중량% 내지 50중량%, 10중량% 내지 40중량%, 또는 10중량% 내지 30중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 약학 조성물은, 상기 유효 성분 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 단백질, 핵산, 또는 세포를 포함하는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 생물체를 자극하지 않고 유효성분의 생물학적 활성 및/또는 특성을 저해하지 않는 담체를 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 등의 가축류, 닭, 오리, 거위, 꿩, 메추리, 칠면조 등의 가금류　등을 포함하는 포유류에서 선택된 1종 이상, 또는 이들로부터 유래하는 세포, 조직, 또는 이들의 배양물일 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구적 투여에 의하여 투여되거나, 세포, 조직, 또는 체액에 접촉시킴으로써 투여되는 것일 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여인 경우에는 피하 주입, 근육 주입, 정맥내 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 비내 투여시, 상기 약학 조성물을 희석하여 분무기나 분무 시스템을 통해 비강으로 흡수 되도록 하는 비강 분무를 통하여 투여될 수 있으며, 상기 비강 분무를 위한 비강 분무제 또는 호흡기용 제형으로는 에어로졸제 등을 들 수 있다.

또한 상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 주사제, 현탁액, 시럽제, 유화액 형태, 도포제, 패치, 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제, 에어로졸제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공한다.

상기 사료는　상기 항생제를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합하거나, 사료 제조 시 직접 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 사료 내　항생제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예컨대, 건조된 분말형태일 수 있다. 상기 항생제는 전체 사료 중량의 0.005 내지 10 중량%, 0.05 내지 10 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.005 내지 5 중량%, 0.05 내지 5 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.005 내지 2 중량%, 0.05 내지 2 중량%, 또는 0.1 내지 2 중량%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사료는 상기 항생제　외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 항생제가 첨가될 수 있는 사료는 시판되는 사료, 또는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류, 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다. 상기 항생제를 음용수에 혼합하여 공급함으로써, 음용수 내의 그람음성균의 숫자를 감소시킬 수 있다. 상기 그람음성균은 앞서 설명한 바와 같다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 다른 예는 상기 항생제를 소독이 필요한 대상에 적용하는 단계를 포함하는, 소독 방법을 제공한다. 상기 소독제는 병원균 감염을 막기 위한 제제를 총칭하는 것으로, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 항생제를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다. 다른 예는 상기 항생제를 세척이 필요한 대상에 적용하는 단계를 포함하는, 세척 방법을 제공한다. 상기 항생제가 그람음성균에 대하여 항생 효과를 가지므로, 그람음성균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 개체의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척(세정)하는 용도로 적용될 수 있다. 상기 그람음성균은 앞서 설명한 바와 같다.

본 명세서에서 제공되는 신규한 엔도라이신은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 및 에스케리챠 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사, 아시네토박터 바우마니 및 에스케리챠 콜라이에 대하여 우수한 성장 억제능 및 사멸능을 나타내어, 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균 및 에스케리챠 속 세균, 예컨대, 슈도모나스 에루기노사, 아시네토박터 바우마니 및 에스케리챠 콜라이에 대한 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 일 실시예에 따른 엔도라이신(LNT102) (서열번호 1)과 엔도라이신(LNT101) (서열번호 3)의 아미노산 서열을 비교하여 보여준다.
도 2는 엔도라이신(LNT102) 발현을 위한 발현벡터 pBT7-LNT102의 개열지도이다.
도 3는 엔도라이신(LNT102)의 정제과정 중 얻어진 반응물의 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 4는 엔도라이신(LNT102) 및 엔도라이신(LNT101)의 다양한 그람음성균에 대한 사멸능을 보여주는 그래프이다.
도 5a 및 5b는 엔도라이신(LNT102)의 농도 및 처리 시간에 따른 그람음성균 사멸능을 보여주는 그래프이다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1: 엔도라이신 활성을 갖는 신규한 폴리펩타이드의 발굴

엔도라이신 LNT101 (서열번호 3)은 PG_binding_1 domain(10-65 amino acid)과 transglycosylase SLT domain(95-179 amino acid)으로 구성되어 있다.

엔도라이신 LNT101 PG_binding_1 domain의 아미노산 서열을 BLASTp 분석으로 유사 아미노산 서열을 가진 유전자인 Thermoanaerobacterium phage THSA-485A의 glycoside hydrolase family 25 (accession no. YP_006546280.1), Serratia phage phiMAM1의 peptidoglycan binding protein (accession no. YP_007349105.1), Serratia phage 2050H1 peptidoglycan binding protein (accession no. ASZ78903.1), Serratia phage vB_SmaA_3M의 putative peptidoglycan binding protein (accession no. AYP28388.1), Enwinia phage vB_EamM-Bue1의 putative peptidoglycan binding protein (accession no. AVO22912.1), Pseudomonas phage Noxifer의 putative peptidoglycan binding protein (accession no. YP_009609055.1), Salmonella phage Mutine의 endolysin (accession no. AUG88272.1) 및 Salmonella phage bering의 peptidoglycan binding protein (accession no. QIQ61961.1)의 아미노산 서열을 비교하여 LNT101 엔도라이신과 다른 아미노산 부위를 비교 단백질의 우점 아미노산 서열로 11개 아미노산을 치환하였다.

LNT101 엔도라이신 transglycosylase SLT domain의 아미노산 서열을 BLASTp 분석으로 유사 아미노산 서열을 가진 유전자인 Pseudomonas phage Noxifer의 tail fiber protein (accession no. YP_009609112.1), Pseudomonas phage SL2의 hypothetical protein SL2_199 (accession no. YP_009619739.1), Pseudomonas phage KTN4의 putative endolysin (accession no. ANM44938.1), Pseudomonas phage phiKZ의 PHIKZ144 (accession no. NP_803710.1), Pseudomonas phage Psa21의 tail fiber protein (accession no. QBJ02724.1) 및 Pseudomonas phage vB_PaeM_PS119XW의 hypothetical protein (accession no. QEM41943.1)의 아미노산 서열을 비교하여 LNT101 엔도라이신과 다른 아미노산 부위를 비교 단백질의 우점 아미노산 서열로 4개의 아미노산을 치환하였다.

15개의 치환된 아미노산 서열 부분은 LNT101 유전자 서열 부분에서 codon usage를 고려하여 변경하였고(서열번호 2), 이를 LNT102 (서열번호 1)로 명명하였다. LNT101과 LNT102의 서열 비교는 도 1에 나타내었다. LNT102는 유전자 합성 및 C-terminal 6 X histidine tag이 부착된 pBT7-C-His vector(바이오니아)에 cloning 하였다. 이와 같이 준비된 LNT102의 발현벡터 pBT7-LNT102를 도 2에 모식적으로 나타내었다.

상기 기재된 LNT102 및 LNT101의 서열을 아래의 표 1에 정리하였다:

	아미노산 서열 (N→C) 또는 핵산 서열 (5'→3')	서열번호
Endolysin LNT102	MGTVLKRGDRGSAVEDLQMKLNVAGYNLSADGIFGGDTEKAVRDVQAGAGLVVDGKVGPKTLYAIAKSATVPAKWEAIPFPTANKSRSAAMPTLNAVGAMTGVDSRLLATFASIESAFDYTVKAKTSSATGWFQFLDATWDDMIKAYGSKYGIPKDPTRALRKDPRANALMGAEFIKGNAAVLRPVINREPSDTDLYLAHFLGAGGAKKFLSADQKTLGEVLFPKPAKANPSIFSNKGVPRTLAEIYKLFEDKVSKHRA	1
Endolysin LNT102 coding gene	ATGGGTACTGTACTCAAACGTGGCGACCGCGGCTCTGCTGTGGAAGATCTACAAATGAAACTTAACGTCGCAGGATACAACCTGAGCGCTGACGGAATCTTCGGTGGAGATACAGAGAAAGCTGTTCGTGATGTGCAAGCTGGCGCGGGCTTGGTGGTTGACGGAAAAGTTGGACCTAAAACTCTATATGCGATTGCCAAATCCGCTACTGTTCCTGCTAAATGGGAAGCTATCCCTTTCCCAACAGCTAATAAATCTCGGTCGGCTGCAATGCCCACTCTGAATGCGGTTGGAGCAATGACTGGTGTGGATTCTCGGTTACTCGCTACATTCGCTTCCATTGAGTCTGCTTTTGATTACACTGTCAAAGCAAAAACATCTTCGGCTACTGGTTGGTTCCAGTTCCTTGATGCTACATGGGATGACATGATCAAAGCATATGGTTCCAAATACGGGATACCTAAAGATCCCACTAGGGCACTCCGTAAAGACCCACGTGCAAATGCATTAATGGGTGCAGAATTCATTAAAGGAAATGCAGCTGTATTACGTCCAGTAATCAATCGCGAACCGAGTGATACAGACTTGTATTTGGCACATTTCCTTGGTGCTGGCGGCGCTAAGAAATTCCTATCCGCAGATCAGAAAACTCTCGGTGAAGTTCTATTCCCGAAACCTGCTAAAGCAAACCCGTCGATCTTTAGCAATAAAGGTGTACCACGTACCCTTGCAGAGATCTACAAGCTGTTCGAAGATAAAGTTTCGAAACATCGGGCA	2
Endolysin LNT101	MGTVLKRGDRGSAVEDLQMKLRVAGYAVSADGIFGGDTEKAVRDFQASKALVVDGKVGPATLAELAKSATVPAKWEAIPFPTANKSRSAAMPTLNAVGAMTGTDSRLLATFASIESAFDYTVKASTSSATGWFQFLDATWDDMIKAHGSKYGIPKDPTRALRKDPRANALMGAEFLKGNAAVLRPVINREPSDTDLYLAHFLGAGGAKKFLSADQKTLGEVLFPKPAKANPSIFSNKGVPRTLAEIYKLFEDKVSKHRA	3

실시예 2: LNT-102 엔도라이신의 정제

상기 준비된 pBT7-LNT102 plasmid를 대장균 BL21-Star(DE3) strain (Invitrogen)에 transformation 한 후, LB broth (1% Tryptone, 0.5%(w/v) Yeast extract, 0.5%(w/v) NaCl)에서 OD₆₀₀=0.5까지 배양하였다. 이후 1 mM IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid)를 첨가한 후 37℃에서 4 시간 동안 진탕배양하였다. Cell harvest 후, lysis buffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)로 재현탁하고, 1 mM PMSF 및 1 mg/ml lysozyme을 넣고 얼음에서 30 분간 정치하였다. Sonication으로 세포를 용해하고, 13,000 rpm에서 40분 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이를 Ni-NTA 아가로오스 레진 (Qiagen)이 packing된 column에 통과시켰다. 이후 wash buffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole)로 wash 후, elution buffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole)로 elution하여, LNT102 단백질 (6xHis tag 포함)을 정제하였다.

15% SDS-PAGE로 LNT102 단백질의 순도를 확인하고 Bradford assay로 LNT102단백질의 농도를 측정하였다. 상기 정제과정 중에 얻어진 각각의 반응물을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. SDS-PAGE를 통해 확인한 상기 정제한 LNT102 단백질의 분자량은 약 28kDa이었다.

실시예 3: 엔도라이신 LNT102의 그람음성균에 대한 사멸능 조사

본 실시예에서는 다양한 그람음성균을 대상으로 실시예 2에서 정제된 엔도라이신 LNT102의 박테리아 사멸능 및 타겟 박테리아 스펙트럼을 확인하였다.

In vitro 시험

이를 위하여, 2 μM 농도의 엔도라이신 LNT101과 LNT102, 및 슈도모나스 에루기노사(PAO1; ATCC 15692), 아시네토박터 바우마니(ATCC 17978), 에스케리챠 콜라이(ATCC 8739), 클렙시엘라 뉴모니아(ATCC 13883), 엔테로박터 에어로지너스(CCARM 16006), 및 살모넬라 엔테리티디스(ATCC 13076) 각각 1 X 10⁶CFU를 reaction buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5)에 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 넣고, 37℃에서 2 시간 동안 정치하였다. 2시간 후, 각 그람음성균의 콜로니 수를 확인하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다 (도 4에서 PA90은 엔도라이신 LNT101을, mtPA90은 엔도라이신 LNT102를 각각 나타냄). 도 4에 나타난 바와 같이, 엔도라이신 LNT101과 LNT102는 모두 시험된 모든 그람음성균에 대해 대조군 대비 우수한 사멸능을 가짐을 확인되었고, 특히 LNT102는, LNT101과 비교하여, 동일 용량에서 보다 우수한 그람음성균 사멸능을 나타내었다.

0.1, 0.5, 2.5 μM 농도의 엔도라이신 LNT102 및 슈도모나스 에루기노사, 아시네토박터 바우마니, 및 에스케리챠 콜라이 각각 1 X 10⁶CFU를 reaction buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5)에 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 넣고, 37℃에서 2 시간 동안 정치하였다. 30 분, 1 시간, 및 2 시간 후, 각 그람음성균의 콜로니 수를 확인하여, 그 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다. 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, 엔도라이신 LNT102는 시험된 모든 처리 용량 및 시간에서 그람음성균에 대하여 사멸능을 가짐을 확인하였고, 이러한 그람음성균 사멸능은 처리 시간 및 용량 의존적인 것으로 나타났다.

실시예 4: 엔도라이신 LTN102 및 항생제 병용시의 그람음성균 사멸능 상승 효과

세균의 세포막에 작용하는 기전을 갖는 polymyxin 계열 항생제와 실시예 2에서 정제된 엔도라이신 LNT102의 병용 처리에 의한 상승효과를 확인하였다. 구체적으로, Polymyxin B를 96 well microplate A 행에 4 μg/ml 처리 후, B - G 행으로 1/2씩 serial dilution 하였다. H 행에는 polymyxin을 처리하지 않았다. Colistin을 96 well microplate A 행에 8 μg/ml 처리 후, B - G 행으로 1/2씩 serial dilution 하였다. H 행에는 polymyxin을 처리하지 않았다. 그 후, LNT102 엔도라이신 1 μM을 추가로 처리한 병용 처리군, 및 동량의 PBS 처리군을 만들었다. 모든 well에 슈도모나스 에루기노사, 및 에스케리챠 콜라이를 각각 1 x 10⁵ CFU/ml, total 100 ㎕의 양으로 처리하였다. 이후 18 시간, 37℃에서 배양하였다. MIC (Minimum Inhibitory Concentration)는 균이 자라지 않은 well의 최소 polymyxin 계열 항생제의 농도값을 의미하며, MIC 시험은 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)의 표준 시험법을 따라 broth microdilution technique으로 수행하였다 (Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. 11th ed. Document M07. Wayne, PA: CLSI; 2018).

다양한 농도의 polymyxin 계열 항생제 (polymyxin B, Colistin)와 LNT102 엔도라이신의 병용 처리에 의한 polymyxin 계열 항생제의 MIC 변화를 측정하여, 하기의 표 2에 나타내었다.

	Polymyxin B + PBS	Polymyxin B + LNT102	Colistin + PBS	Colistin + LNT102
P. aeruginosa (ATCC 27853)	0.5 μg/ml	< 0.06 μg/ml	2 μg/ml	0.5 μg/ml
A. baumannii (ATCC 19606)	0.5 μg/ml	0.03 μg/ml	2 μg/ml	0.25 μg/ml
E. coli(ATCC 8739)	0.5 μg/ml	0.06 μg/ml	2 μg/ml	1 μg/ml

표 1에 나타난 바와 같이, LNT102 엔도라이신 병용 시, polymyxin 계열 항생제인 polymyxin B 및 Colistin의 MIC가 최대 1/16배로 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 기존의 항생제, 예컨대 polymyxin 계열 항생제와 LNT102 엔도라이신을 병용처리시 현저히 상승된 항생효과를 얻을 수 있음을 보여준다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> LyseNTech Hankuk University Of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation Foundation <120> Polypeptide Variants and Antibiotics against Gram-Negative Bacteria Comprising the Same <130> DPP20203256KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Endolysin LNT102 <400> 1 Met Gly Thr Val Leu Lys Arg Gly Asp Arg Gly Ser Ala Val Glu Asp 1 5 10 15 Leu Gln Met Lys Leu Asn Val Ala Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Asp Gly 20 25 30 Ile Phe Gly Gly Asp Thr Glu Lys Ala Val Arg Asp Val Gln Ala Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Val Val Asp Gly Lys Val Gly Pro Lys Thr Leu Tyr Ala 50 55 60 Ile Ala Lys Ser Ala Thr Val Pro Ala Lys Trp Glu Ala Ile Pro Phe 65 70 75 80 Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ser Ala Ala Met Pro Thr Leu Asn Ala 85 90 95 Val Gly Ala Met Thr Gly Val Asp Ser Arg Leu Leu Ala Thr Phe Ala 100 105 110 Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Thr Val Lys Ala Lys Thr Ser Ser 115 120 125 Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Asp Ala Thr Trp Asp Asp Met Ile 130 135 140 Lys Ala Tyr Gly Ser Lys Tyr Gly Ile Pro Lys Asp Pro Thr Arg Ala 145 150 155 160 Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ala Asn Ala Leu Met Gly Ala Glu Phe Ile 165 170 175 Lys Gly Asn Ala Ala Val Leu Arg Pro Val Ile Asn Arg Glu Pro Ser 180 185 190 Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Leu Gly Ala Gly Gly Ala Lys 195 200 205 Lys Phe Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr Leu Gly Glu Val Leu Phe Pro 210 215 220 Lys Pro Ala Lys Ala Asn Pro Ser Ile Phe Ser Asn Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Arg Thr Leu Ala Glu Ile Tyr Lys Leu Phe Glu Asp Lys Val Ser Lys 245 250 255 His Arg Ala <210> 2 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endolysin LNT102 coding gene <400> 2 atgggtactg tactcaaacg tggcgaccgc ggctctgctg tggaagatct acaaatgaaa 60 cttaacgtcg caggatacaa cctgagcgct gacggaatct tcggtggaga tacagagaaa 120 gctgttcgtg atgtgcaagc tggcgcgggc ttggtggttg acggaaaagt tggacctaaa 180 actctatatg cgattgccaa atccgctact gttcctgcta aatgggaagc tatccctttc 240 ccaacagcta ataaatctcg gtcggctgca atgcccactc tgaatgcggt tggagcaatg 300 actggtgtgg attctcggtt actcgctaca ttcgcttcca ttgagtctgc ttttgattac 360 actgtcaaag caaaaacatc ttcggctact ggttggttcc agttccttga tgctacatgg 420 gatgacatga tcaaagcata tggttccaaa tacgggatac ctaaagatcc cactagggca 480 ctccgtaaag acccacgtgc aaatgcatta atgggtgcag aattcattaa aggaaatgca 540 gctgtattac gtccagtaat caatcgcgaa ccgagtgata cagacttgta tttggcacat 600 ttccttggtg ctggcggcgc taagaaattc ctatccgcag atcagaaaac tctcggtgaa 660 gttctattcc cgaaacctgc taaagcaaac ccgtcgatct ttagcaataa aggtgtacca 720 cgtacccttg cagagatcta caagctgttc gaagataaag tttcgaaaca tcgggca 777 <210> 3 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Endolysin LNT101 <400> 3 Met Gly Thr Val Leu Lys Arg Gly Asp Arg Gly Ser Ala Val Glu Asp 1 5 10 15 Leu Gln Met Lys Leu Arg Val Ala Gly Tyr Ala Val Ser Ala Asp Gly 20 25 30 Ile Phe Gly Gly Asp Thr Glu Lys Ala Val Arg Asp Phe Gln Ala Ser 35 40 45 Lys Ala Leu Val Val Asp Gly Lys Val Gly Pro Ala Thr Leu Ala Glu 50 55 60 Leu Ala Lys Ser Ala Thr Val Pro Ala Lys Trp Glu Ala Ile Pro Phe 65 70 75 80 Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ser Ala Ala Met Pro Thr Leu Asn Ala 85 90 95 Val Gly Ala Met Thr Gly Thr Asp Ser Arg Leu Leu Ala Thr Phe Ala 100 105 110 Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Thr Val Lys Ala Ser Thr Ser Ser 115 120 125 Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Asp Ala Thr Trp Asp Asp Met Ile 130 135 140 Lys Ala His Gly Ser Lys Tyr Gly Ile Pro Lys Asp Pro Thr Arg Ala 145 150 155 160 Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ala Asn Ala Leu Met Gly Ala Glu Phe Leu 165 170 175 Lys Gly Asn Ala Ala Val Leu Arg Pro Val Ile Asn Arg Glu Pro Ser 180 185 190 Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Leu Gly Ala Gly Gly Ala Lys 195 200 205 Lys Phe Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr Leu Gly Glu Val Leu Phe Pro 210 215 220 Lys Pro Ala Lys Ala Asn Pro Ser Ile Phe Ser Asn Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Arg Thr Leu Ala Glu Ile Tyr Lys Leu Phe Glu Asp Lys Val Ser Lys 245 250 255 His Arg Ala

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 엔도라이신 활성을 갖는, 폴리펩타이드.
제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제3항에 있어서, 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
제3항 또는 제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제3항 또는 제4항의 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.
제1항의 폴리펩타이드를 포함하고, 그람음성균에 대하여 항생 활성을 갖는, 항생제.
삭제
제7항에 있어서, 폴리믹신 계열 항생제를 추가로 포함하는, 항생제.
제9항에 있어서, 상기 폴리믹신 계열 항생제는 폴리믹신 B, 콜리스틴, 또는 이들의 조합인, 항생제.
삭제
제7항에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 클렙시엘라 속 세균, 및 살모넬라 속 세균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 항생제.
제12항에 있어서, 상기 슈도모나스 속 세균은 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)이고, 상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)이고, 상기 에스케리챠 속 세균은 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)이고, 상기 엔테로박터 속 세균은 엔테로박터 에어로지너스(Enterobacter aerogenes)이고, 상기 클렙시엘라 속 세균은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)이고, 상기 살모넬라 속 세균은 살모넬라 엔테리티디스(Selmonella enteritidis)인, 항생제.
제7항의 항생제를 포함하는, 그람음성균의 감염 또는 그람음성균에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제14항에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균, 아시네토박터 속 세균, 에스케리챠 속 세균, 엔테로박터 속 세균, 클렙시엘라 속 세균, 및 살모넬라 속 세균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 슈도모나스 속 세균은 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)이고, 상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)이고, 상기 에스케리챠 속 세균은 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)이고, 상기 엔테로박터 속 세균은 엔테로박터 에어로지너스(Enterobacter aerogenes)이고, 상기 클렙시엘라 속 세균은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)이고, 상기 살모넬라 속 세균은 살모넬라 엔테리티디스(Selmonella enteritidis)인, 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 세균이고, 슈도모나스 속 세균에 의하여 유발되는 질병은 피부감염, 욕창, 폐렴, 균혈증, 패혈증, 심내막염, 수막염, 외이도염, 중이염, 각막염, 골수염, 장염, 복막염, 또는 낭포성섬유증인, 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 그람음성균은 아시네토박터 속 세균이고, 아시네토박터 속 세균에 의하여 유발되는 질병은 피부감염, 폐렴, 균혈증, 또는 패혈증인, 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 그람음성균은 에스케리챠 속 세균이고, 에스케리챠 속 세균에 의하여 유발되는 질병은 장염, 크론병, 궤양성 대장염, 세균성이질, 요로감염증, 피부감염, 균혈증, 또는 패혈증인, 약학 조성물.
제7항의 항생제를 포함하는, 사료 첨가제.
제7항의 항생제를 포함하는, 소독제.
제7항의 항생제를 포함하는, 세척제.