KR20180064417A - 그람 음성균에 대해 활성인 라이신 폴리펩티드 - Google Patents

그람 음성균에 대해 활성인 라이신 폴리펩티드 Download PDF

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KR20180064417A
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레이먼드 슈흐
사이먼 호픈버그
마이클 비테킨트
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콘트라펙트 코포레이션
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Abstract

본 발명은 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)를 비롯한 그람 음성균에 기인하는 감염의 예방적 및 치료적 개선과 치료에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 그람 음성균 감염의 치료에 일반적으로 적절한 항생제의 효능을 증진시키기 위해 본 발명의 라이신 폴리펩티드를 혼입시키고 이용하는 조성물 및 방법을 추가로 제공한다.

Description

그람 음성균에 대해 활성인 라이신 폴리펩티드
본 발명은 일반적으로 그람 음성균에 기인하는 감염의 예방 및 치료에 관한 것이다. 더 구체적으로 말하자면, 본 발명은 그람 음성균의 성장을 방지 및/또는 억제시킬 수 있는 제제 및 조성물에 관한 것이다.
그람 음성 병원균들이 종전에 치료용으로 고려되었던 거의 모든 약물에 대한 내성이 진화하면서 상당한 위협이 되고 있다. 특히 염려되는 것은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 젠타마이신 (gentamicin), 세페핌 (cefepime), 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem)을 비롯한 항생제 등의, 다수의 항균제에 대한 내성을 나타낼 수 있는 그람 음성 병원균인 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)를 포함하는 건강 관리 관련 감염이다 (Lister et al. Clin Microbiol Rev. 4: 582-610 (2009)). 개별 약물에 대한 내성뿐만 아니라, 새로운 항생제의 부족과 함께 다중 내약성 균주의 출현 및 유병률 증가는 경고의 요인이다. 그람 음성 감염에 대한 새롭고 효율적인 치료법은 다중 내약성의 위협을 해결하기 위해 분명 필요하다. 하나의 매우 촉망되는 접근법은 세균 세포벽 (즉, 펩티도글리칸)의 주요 구조 성분을 분해시키기 위하여 라이신, 오토라이신 및 여러 박테리오신을 비롯한 세균 펩티도글리칸 가수 분해 효소, 즉 PGH를 사용하는 것에 기반하고 있다. PGH는 펩티도글리칸의 슈가 골격을 개열(開裂)시키는 글루코사미니다제 (glucosaminidases) 및 뮤라미다제 (muramidases; 즉, 리소자임), 줄기 펩티드 또는 교차 다리를 개열시키는 엔도펩티다제 (endopeptidases), 또는 슈가와 펩티드 부분을 연결하는 아미드 결합을 개열시키는 L-알라닌 아미다제 (L-alanine amidases)를 포함한다 (Bush K., Rec Sci Tech. (1):43-56 (2012); Reith J. et al. Appl Microbiol Biotechnol. (1):1-11 (2011)).
지난 14년 동안의 연구에 따르면, PGH는 재조합에 의하여 발현 및 정제될 수 있고, 감수성 세균에 외생적으로 첨가하여 세균을 신속히 분해할 수 있다. 이 "외부 용균 (lysis from without)" 현상은 여러 가지 그람 양성 병원균에 대하여 현재 개발중인 효율적인 항균 전략의 토대이다. 그러나, 그람 양성균에 비해, 그람 음성균 감염을 치료하기 위하여 라이신을 사용하는 것은 세균 세포벽 안에 추가적인 막층이 존재하기 때문에 제한되어 왔다. 외막 (outer membrane, OM)으로 알려져 있는 이 추가층은 상기 세포벽 내의 펩티도글리칸 기질에 대한 라이신의 접근을 방해한다. 그럼에도 불구하고, 최근에 그람 음성균 및 관련 박테리오파지의 여러 가지 PGH가 그람 음성균을 사멸시킬 수 있는 타고난 능력이 있다고 보고된 바 있다 (Lood et al., Antimicrob Agents Chemother, 4: 1983-91, (2015)). 살균성 그람 음성 라이신의 경우, 상기 작용은 음이온성 OM에 결합할 수 있고, 하위 펩티도글리칸 내로 효과 전이를 가능케 하는 천연 서열로 이루어진 양으로 하전된 (및 양친매성) N-말단 및 C-말단 알파 나선형 도메인에 좌우될 수 있다 (Lai et al. Microbiol Biotechnol, 90:529-539 (2011)). 최근에, 연구자들은 이 정보를 사용하여 그람 음성 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii)에 대한 항균 작용을 위하여 양이온 펩티드가 첨가된 조작된 라이신들인 “아틸라이신 (artilysin)"을 만들었다 (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014)). 이들 아틸라이신은 라이신과 관련이 없거나 라이신에서 유래되지 않은 외인성 유래의 양이온 펩티드에 융합된, 양으로 하전된 PGH (그람 양성균에 대하여 활성)로 구성된다 (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014); Briers et al. MBio . 4:e01379-14 (2014); United States Patent 8,846,865).
본 명세서에 있어 참조 문헌의 인용은, 이들 참조 문헌이 본 발명의 설명과 견련성이 있다거나 본 발명에 대한 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 것인 약학 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 라이신 폴리펩티드 또는 단편은 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 데 효율적인 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 호흡식 분말, 에어로졸 또는 스프레이 제형의 조성물이다.
일부 구현예에서, 상기 약학 조성물은 그람 음성균의 치료에 적절한 한 가지 이상의 항생제를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 서열 동일성이 80%이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열을 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 상기 코딩된 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시킨다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하며, 여기서 상기 코딩된 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키고, 상기 핵산은 이종 프로모터에 작동 가능하도록 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 cDNA 서열이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 서열 동일성이 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 상기 코딩된 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시킨다.
일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1 종의 그람 음성균의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 유효량이 함유된 조성물과 세균을 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 특성이 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 및 임의의 1 종 이상의 그람 음성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 음성균에 기인하는 세균 감염의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 세균 감염의 증상이 나타날 위험이 있거나 증상을 나타내는 것으로 진단된 대상에게 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 유효량이 함유된 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 특성이 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 및 임의의 1 종 이상의 그람 음성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 음성균에 의해 대상에서 발생한 국소 또는 전신 병원성 세균 감염의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상에게 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 유효량이 함유된 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 특성이 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세균 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 세균 감염의 증상이 나타날 위험이 있거나 증상을 나타내는 것으로 진단된 대상에게 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 단편의 유효량이 함유된 조성물의 제1 유효량과, 그람 음성균 감염의 치료에 적절한 항생제의 제2 유효량의 조합물을 병용 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 그람 음성균은 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 클레브시엘라 종 (Klebsiella spp.), 엔테로박터 종 (Enterobacter spp.), 대장균 (Escherichia coli), 시트로박터 프룬디 (Citrobacter freundii), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 및 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 85% 이상 또는 90% 이상 동일하다.
일부 구현예에서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 95% 이상 동일하다.
일부 구현예에서, 상기 그람 음성균 감염은 슈도모나스 애루지노사에 기인하는 감염이다.
일부 구현예에서, 상기 항생제는 세프타지딤 (ceftazidime), 세페핌 (cefepime), 세포페라존 (cefoperazone), 세프토비프롤 (ceftobiprole), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 아미노글리코시드 (amogogcoside), 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem), 도리페넴 (doripenem), 젠타마이신 (gentamicin), 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin), 피페라실린 (piperacillin), 티카르실린 (ticarcillin), 페니실린 (penicillin), 리팜피신 (rifampicin), 폴리믹신 B (polymyxin B) 및 콜리스틴 (colistin) 중 한 가지 이상으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그람 음성균 감염의 치료에 적절한 항생제 효능의 증진 방법을 제공하며, 상기 방법은 항생제를 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편과 함께 병용 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조합물의 투여는 항생제 또는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편을 개별적으로 투여하는 경우보다 그람 음성균의 성장을 억제하거나, 또는 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 데 더욱 효율적이다.
일부 구현예에서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 90% 이상 동일하다.
일부 구현예에서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 95% 이상 동일하다.
또 다른 구현예에서, 단리된 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시킨다.
도 1은 본 발명의 설명에서 보고된 라이신 폴리펩티드 GN37의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다. 도 1a (왼쪽)는 GN37의 아미노산 서열이다. 도 1a (오른쪽)는 GN37의 뉴클레오티드 서열이다. 도 1b는 GN37의 도식이며, GN37은 DD- 및 DL-카복시펩티다제 활성이 있는 PGH의 펩티다제 M15_4 계열의 구성원임을 나타낸다 (VanY 슈퍼패밀리의 구성원을 포함한다). 도 1c는 GN37을 그람 양성 부분 동족체 (스트렙토마이세스 (Streptomyces), GenBank sequence AGJ50592.1) 및 대장균 (GenBank WP_001117823.1 및 NP_543082.1 - 양쪽 모두 추정 엔돌리신 (endolysins)), 예르시니아 종 (GenBank CAJ28446.1-확인된 엔돌리신) 및 아시네토박터 바우마니 (GenBank WP_034684053.1, 추정 라이신) 등의 다른 그람 음성 병원균으로부터 추정되거나 확인된 엔돌리신과 비교한 다중 서열 정렬을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 설명에서 보고된 라이신 폴리펩티드 GN2, GN4, GN14 및 GN43의 아미노산 (굵은 활자) 및 뉴클레오티드 (기본 활자) 서열을 제공한다.
도 3은 다양한 GN 라이신 폴리펩티드의 존재하에서 대조군에 비해 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 의한 형광 신호의 유도 배수를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 형광 발광은 외막 투과성을 나타낸다.
도 4는 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대한 GN 라이신 폴리펩티드의 항균 작용을 나타내는 막대 그래프이다. 콜로니 형성 단위 (colony forming units, CFU)의 감소는 로그 눈금으로 표시된다.
도 5는 GN4, 즉 PGN4, FGN4-1, FGN4-2, FGN4-3 및 FGN4-4로부터 유래된 5 가지의 라이신 펩티드의 아미노산 서열을 제공한다.
도 6은 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대한 각 GN4-유래된 라이신 펩티드 (PGN4, FGN4-1, FGN4-2, FGN4-3 및 FGN4-4)의 항균 작용을 나타내는 막대 그래프이다. CFU 수치의 감소는 로그 눈금으로 표시된다.
도 7은 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대한 본 발명의 풀링된 GN 라이신 폴리펩티드 및 GN4-유래된 라이신 펩티드의 인간 혈청에서 항균 작용을 나타내는 막대 그래프이다. CFU 수치의 감소는 로그 눈금으로 표시된다.
[용어의 정의]
본 명세서에서 사용된 바와 같은 다음의 용어 및 그와 비슷한 용어는, 문맥상 달리 명시하지 않는 한 이하에 주어진 의미를 가진다.
"그람 음성균"은 일반적으로 그람 염색법에서 탈색되어 크리스털 바이올렛 색을 나타내는 세균을 의미하며, 즉 그들은 그람 염색 프로토콜에서 크리스털 바이올렛 염료를 보유하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "그람 음성균"이라는 용어는 다음의 세균 종에 한정되는 것은 아니지만, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 헤몰리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus ), 악티노바실루스 액티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 애로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila), 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 테타이오타오마이크론 (Bacteroides theataioatamicron), 박테로이데스 디스타소니스 (Bacteroides distasonis), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei), 버크홀데리아 말레이 (Burkholderia mallei), 프레보텔라 코르포리스 (Prevotella corporis), 프레보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia), 프레보텔라 엔도돈탈리스 (Prevotella endodontalis), 포르피로모나스 아사카롤리티카 (Porphyromonas asaccharolytica), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜리 (Campylobacter coli), 캄필로박터 피터스 (Campylobacter fetus), 시트로박터 프룬디 (Citrobacter freundii), 시트로박터 코세리 (Citrobacter koseri), 에드와시엘라 타다 (Edwarsiella tarda), 에이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 엔테로박터 클로아카 (Enterobacter cloacae), 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스 (Enterobacter agglomerans), 에쉐리히아 콜리 (Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 헤모필루스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 킨젤라 킨가에 (Kingella kingae), 클레브시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 리노스클레로마티스 (Klebsiella rhinoscleromatis), 클레브시엘라 오자에나에 (Klebsiella ozaenae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella penumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii), 나이세리아 고노르호애 (Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 파스퇴렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 프로테우스 펜네리 (Proteus penneri), 프로테우스 믹소파시엔스 (Proteus myxofaciens), 프로비덴시아 스투아르티 (Providencia stuartii), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri), 프로비덴시아 알카리파시엔스 (Providencia alcalifaciens), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피 (Salmonella paratyphi), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 보이디 (Shigella boydii), 시겔라 소네이 (Shigella sonnei), 시겔라 디센테리애 (Shigella dysenteriae), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 알지놀리티쿠스 (Vibrio alginolyticus), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 예르시니아 슈도튜베르큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 트라코마티스 (Chlamydophila trachomatis), 리케차 프로바체키 (Ricketsia prowazekii), 콕시엘라 부르네티 (Coxiella burnetii), 에를리히아 샤펜시스 (Ehrlichia chaffeensis) 또는 바르토넬라 헨셀라 (Bartonella hensenae)의 하나 이상 (즉, 하나 또는 조합)을 설명할 수 있다. 본 발명의 화합물은 병원성 세균의 성장을 방지 또는 억제하고, 한 가지 이상의 세균 감염을 치료하는 데 유용할 것이며, 특히 반드시 그람 음성균 및 특히 슈도모나스 애루지노사를 배타적으로 포함하는 것은 아니다.
"살균성"이라는 용어는 제제의 문맥상 통상적으로 세균의 초기 개체군 중 적어도 3-로그 (99.9%) 또는 그 이상의 감소 정도까지 세균의 사멸을 일으키거나 세균을 박멸시킬 수 있는 특성이 있는 것을 의미한다.
"정균성"이라는 용어는 통상적으로 세균 세포의 성장을 억제하는 것을 비롯하여, 세균의 성장을 억제함으로써 세균의 초기 개체군 중 2-로그 (99%) 이상 및 3-로그 이하로 감소시키는 특성이 있는 것을 의미한다.
“항균성”이라는 용어는 제제의 문맥상 일반적으로 정균성 제제 및 살균성 제제 모두를 포함하는 것으로 사용된다.
“내약성”이라는 용어는 병원균 및 더 구체적으로는 세균의 문맥상, 일반적으로 약물의 항균 작용에 내성이 있는 세균을 의미한다. 더 특별한 방법으로 사용되는 경우, 내약성은 특히 항생제 내성을 의미한다. 어떤 경우에는, 일반적으로 특정 항생제에 감수성인 세균이 상기 항생제에 대해 내성을 일으킴으로써 내약성 미생물 또는 균주가 될 수 있다. "다중 내약성" 병원균은 각각 단일 요법으로 사용되는, 적어도 두 가지 종류의 항균제에 대해 내성을 일으킨 병원균이다. 예를 들어, 슈도모나스 애루지노사의 특정 균주는 아미노글리코시드, 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론 및 카바페넴을 비롯한 거의 모든 항생제 또는 모든 항생제에 대해 내성인 것으로 밝혀졌다 (Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention). 통상의 기술자는 세균의 약물 또는 항생제에 대한 감수성 또는 내성을 측정하는 통상적인 실험 기술을 사용하여 세균이 내약성인지 여부를 쉽게 판단할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 생리학적 상용성인 임의의 및 모든 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 용해제, 코팅제, 방부제, 등장제 및 흡수 지연제, 계면 활성제, 추진제 등을 포함한다. 담체(들)은 의약상 일반적으로 사용되는 양으로는 치료 대상에 해가 되지 않는다는 의미에서 "수용 가능"해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 의도된 목적에서 벗어나게 하지 않은 채 조성물의 다른 성분과 상용성이다. 게다가, 약학적으로 허용 가능한 담체는 과도한 부작용 (예컨대, 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 본 명세서에서 제공된 바와 같이 대상에게 사용하기 적절하다. 부작용은 그들의 위험이 상기 성분에 의해 제공되는 이익보다 클 때 "과도한" 것이다. 약학상 허용되는 담체 또는 부형제의 비제한적인 예시로는 인산완충식염수, 물, 및 오일/물 에멀젼과 마이크로 에멀젼 등의 에멀젼과 같은 임의의 표준 약학 담체를 포함한다.
동결 건조된 라이신 폴리펩티드를 비롯한 고체 조성물의 경우, 요소 또는 메스나 등의 부형제가 안정성을 향상시키기 위해 포함될 수 있다. 다른 부형제는 벌킹제, 완충제, 장성 변형제, 계면 활성제, 방부제 및 보조 용매를 포함한다.
라이신 폴리펩티드를 비롯한 고체 경구 조성물의 경우, 적절한 약학상 허용되는 부형제는 전분, 슈가, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕괴제 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
액체 경구 조성물의 경우, 적절한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 글리콜, 오일, 알콜, 방향제, 방부제 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
크림, 겔, 거품, 연고 또는 스프레이를 비롯한 국소 고체 조성물의 경우, 적절한 부형제는 크림, 셀룰로오스염기 또는 유성 염기, 유화제, 경화제, 레올로지 변형제 또는 증점제, 계면 활성제, 연화제, 방부제, 보습제, 알칼리화제 또는 완충제 및 용제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
발포 기제의 제형에 적절한 부형제는 프로필렌 글리콜, 유화 왁스, 세틸 알콜 및 글리세릴 스테아레이트를 포함 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 잠재적 방부제에는 메틸파라벤과 프로필파라벤이 있다.
"유효량"이라는 용어는 적절한 빈도나 복용의 요법으로 적용 또는 투여될 때, 세균 성장을 예방 또는 억제, 치료되는 질환 (여기서는 박테리아 병원균의 성장 또는 감염)의 발병, 중증도, 지속 기간 또는 진행을 예방, 감소 또는 개선, 치료되는 질환의 진전을 예방, 치료되는 질환의 퇴행을 유발, 또는 항생제나 정균 요법과 같은 다른 치료 요법의 예방 효과 또는 치료 효과를 향상시키거나 개선하기에 충분한 양을 의미한다.
"병용 투여"라는 용어는 라이신 폴리펩티드와 항생제 또는 임의의 다른 항균제를 순차적인 방식으로 별도 투여하는 것뿐만 아니라 이들 제제를 단일 혼합물/조성물 또는 별도 투여, 하지만 그럼에도 불구하고 대상에게 실질적으로 동시에 투여되는, 예컨대 당일 또는 24 시간 동안 상이한 시간에 투여되는 등 실질적으로 동시적인 방식으로 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 라이신 폴리펩티드와 한 가지 이상의 추가적인 항균제와의 병용 투여는 수일, 수주 또는 수개월까지 지속되는 연속적 치료로서 제공될 수 있다. 또한, 사용에 따라, 병용 투여가 연속적이거나 동시적일 필요가 없다. 예를 들어, 세균성 궤양이나 감염된 당뇨병성 궤양 등의 치료용 국소 항균제로 사용한 경우, 상기 라이신은 첫 번째 항생제 사용 후 24 시간 이내에만 투여될 수 있으며 이후 라이신의 추가 투여 없이도 항생제 사용을 계속할 수 있다.
"대상"이라는 용어는 치료받는 대상을 의미하며, 그 중에서도 포유류, 식물, 하등 동물, 단세포 유기체 또는 세포 배양을 포함한다. 예를 들어, "대상"이라는 용어는 그람 음성균 감염에 취약하거나 감염에 걸린 원핵 생물 및 진핵 생물 등의 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 대상의 예시로는 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트 및 유전자 변형 비인간 동물 등의 포유류가 있다. 특정 구현예에서, 상기 대상은 인간, 예컨대 세균 감염이 전신적이든 특정 기관 또는 조직에 국한되어 있든지 관계 없이, 그람 음성균 감염을 앓고 있거나 감염될 위험이 있는 인간이다.
"폴리펩티드"라는 용어는 "단백질" 및 "펩티드"라는 용어와 상호 교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기로 만들어지고 약 30 개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 중합체를 의미한다. 상기 용어는 단리된 형태의 폴리펩티드뿐만 아니라, 활성 단편과 이들의 유도체 (아래에 정의됨)를 포함한다. "폴리펩티드"라는 용어는 또한 아래에 기술된 바와 같은 라이신 폴리펩티드를 포함하고, 라이신 기능을 유지하는 융합 단백질 또는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드 또는 조작되거나 합성하여 생산된 폴리펩티드일 수 있다. 특정 라이신 폴리펩티드는, 예컨대 효소적 또는 화학적 개열에 의해 천연 단백질로부터 유래 또는 제거될 수 있거나, 또는 통상적인 펩티드 합성 기술 (예컨대, 고체상 합성) 또는 분자 생물학 기술 (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에 개시된 바와 같음)을 사용하여 조제될 수 있거나, 또는 예컨대 GN4의 양친매성 도메인을 포함하는 GN4의 단편 및 동일하거나 적어도 하나의 공통 표적 세균에 대한 라이신 활성을 유지하는 이의 절단된 형태로 본 명세서에 예시로 도시된 바와 같이, 활성 단편을 생산하도록 전략적으로 절단되거나 분절화될 수 있다. 천연 라이신 폴리펩티드 변이체는 또한 (상기 전술한 바와 같이 천연 라이신 단백질의 활성 단편을 포함하는) 천연 라이신 폴리펩티드와 서열 동일성이 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 98% 이상이다.
"융합 폴리펩티드"라는 용어는 2 개 이상의 핵산 분절의 융합으로 생성된 발현 산물을 의미하며, 일반적으로 상이한 특성 또는 기능성을 가지는 2 개의 도메인 또는 분절이 있는 융합된 발현 산물을 생성한다. 더 구체적인 의미에서, “융합 폴리펩티드"라는 용어는 직접 또는 아미노산이나 펩티드 링커를 통해 공유 결합된, 2 개 이상의 이종 폴리펩티드나 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드도 의미한다. 융합 폴리펩티드를 형성하는 폴리펩티드는 전형적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결되지만, C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로 또는 N-말단에서 C-말단으로도 연결될 수 있다. "융합 폴리펩티드"라는 용어는 "융합 단백질"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 개방형 표현인 특정 구조를 “포함하는 폴리펩티드”는 융합 폴리펩티드와 같은 인용된 구조보다 큰 분자를 포함한다.
"이종"이라는 용어는 자연적으로 인접하지 않은 뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 문맥상, "이종"이라는 용어는 융합 펩티드 또는 폴리펩티드가 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 둘 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드, 예컨대 라이신 폴리펩티드나 그의 활성 단편과 양이온성 및/또는 다중양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드, 스시 (Sushi) 펩티드 (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)), 디펜신 펩티드 (Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), 소수성 펩티드 및/또는 강화된 라이신 작용이 있을 수 있는 항균성 펩티드의 조합이나 융합을 설명하는 데 사용될 수 있다. 이 정의에는 2 개 이상의 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편이 포함된다. 이들은 라이신 작용이 있는 융합 폴리펩티드를 만드는 데 사용될 수 있다.
"활성 단편"이라는 용어는 본 명세서에 개시된, 단리된 최초 폴리펩티드의 한 가지 이상의 기능 또는 생물학적 활성을 보유하는 전장 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 예컨대 도 2의 GN4 및 도 5의 그의 단편 (FGN4-1 및 FGN4-2)을 참조하라. 본 명세서에서 특히 관심 있는 생물학적 활성은 슈가 골격이나 펩티드 결합을 개열시킴으로써 그람 음성균의 외막을 관통하고 그람 음성균의 코팅을 가수 분해하는 라이신 작용의 활성이다.
"양친매성 펩티드"라는 용어는 친수성 및 소수성 작용기가 모두 있는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 2차 구조는 소수성 및 친수성 아미노산 잔기를 펩티드의 상이한 말단에 위치시킨다. 이들 펩티드는 종종 나선형 2차 구조를 취한다.
"양이온성 펩티드"라는 용어는 양으로 하전된 아미노산 잔기가 있는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 양이온성 펩티드는 pKa 값이 9.0 이상이다. 본 발명의 문맥상 "양이온성 펩티드"라는 용어는 다중양이온성 펩티드도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "다중양이온성 펩티드"라는 용어는 주로 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기로 구성되는 합성하여 생산된 펩티드를 의미한다. 양으로 하전되지 않은 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 음으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기일 수 있다.
"소수성 그룹"이라는 용어는 물 분자에 대한 친화도가 낮거나 전혀 없지만 오일 분자에 대한 친화도가 높은 아미노산 측사슬 등의 화학적 그룹을 의미한다. 소수성 물질은 물이나 수상에서 용해도가 낮거나 전혀 없으며 일반적으로 무극성이지만, 유상에서는 용해도가 높은 경향이 있다. 소수성 아미노산의 예시로는 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 발린 (Val), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 메티오닌 (Met) 및 트립토판 (Trp)이 있다.
본 발명의 문맥상 "증진 (augmenting)"이라는 용어는 항균 작용의 정도가 다른 경우보다 높다는 것을 의미한다. "증진”은 부가적 효과뿐만 아니라 상승 (초 부가적) 효과도 포함한다.
효과와 관련하여 "상승 (synergistic)" 또는 "초 부가적 (superadditive)"이라는 용어는 활성 물질이 각각 단독으로 투여되거나 적용됨으로써 발생하는 효과를 뛰어 넘는 두 활성 물질에 의해 유도된 유익한 효과를 의미한다. 활성 성분의 하나 또는 둘 모두는 임계치 이하의 수준, 즉 상기 활성 물질이 개별적으로 사용되는 경우 효과가 없거나 매우 제한된 효과가 발생하는 수준으로 사용될 수 있다.
“치료"라는 용어는 질환을 치유, 또는 병원균을 박멸, 또는 대상의 상태를 직접 또는 간접적으로 개선할 목적으로, 인간을 포함하는 대상이 의료 지원을 받는 임의의 과정, 작용, 적용, 요법 등을 의미한다. 치료는 또한 발병률 감소, 또는 증상 경감, 재발 제거, 재발 예방, 발병 예방, 증상 개선, 예후 개선 또는 이들의 조합을 의미한다. "치료"는 또한 대상에서 세균의 개체군, 성장률 또는 독성을 감소시킴으로써 대상의 세균 감염 또는 기관 또는 조직 또는 환경의 세균 오염을 조절하거나 감소시키는 것을 더 포함한다. 따라서 발병률을 감소시키는 "치료"는 대상이든 환경이든, 특정 환경에서 한 가지 이상의 그람 음성균의 성장을 억제하는 데 효율적이다. 반면에 이미 확립된 감염의 "치료"는 감염이나 오염의 원인이 되는 그람 음성균을 박멸하는 것을 포함하여 개체군을 감소시키거나 사멸시키는 것을 의미한다.
"예방"이라는 용어는 세균 감염과 같은 질환의 발병률, 재발, 전염, 발병 또는 확립의 예방을 포함한다. 본 발명이 감염의 완전한 예방 또는 확립의 예방에 한정되도록 의도된 것은 아니다. 일부 구현예에서, 발병이 지연되거나 이후에 걸리는 질병의 중증도가 감소하고, 이는 예방의 예시를 구성한다. 본 발명의 맥락에 따라, 걸린 질병은 그러한 병리와 관련된 증상이 아직 나타나지 않은 박테리아 병원균의 검출뿐만 아니라 박테리아 병원균의 성장의 검출과 같은 임상증상 또는 준임상증상을 모두 나타내는 질병을 포함한다.
펩티드 또는 폴리펩티드 (본 명세서에서 활성 단편을 포함한다)와 관련하여 "유도체"라는 용어는 예를 들어, 라이신 작용에 실질적으로 악영향을 미치지 않거나 라이신 작용을 없애지 않는 아미노산 이외의 하나 이상의 화학적 부분을 함유하도록 조작된 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 화학적 부분은 예컨대 아미노 말단 아미노산 잔기, 카복시 말단 아미노산 잔기, 또는 내부 아미노산 잔기를 통해 펩티드에 공유 결합될 수 있다. 이러한 조작은 반응성 부분에 보호기 또는 캡핑기 삽입, 항체 및/또는 형광 표지 등의 검출 가능한 표지 삽입, 글리코실화 삽입 또는 조작, 또는 PEG 등의 벌킹 그룹 삽입 (PEG화) 및 라이신 폴리펩티드의 작용에 실질적으로 악영향을 미치지 않거나 라이신 작용을 없애지 않는 다른 변화를 포함한다.
라이신 폴리펩티드에 삽입될 수 있는 통상적으로 사용되는 보호기는 t-Boc 및 Fmoc를 포함 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 mCherry 등의, 하지만 이에 한정되는 것은 아닌 통상적으로 사용되는 형광 표지 단백질은 라이신 폴리펩티드에 공유 결합 또는 비공유 결합되거나, 세포 단백질의 정상 기능을 방해하지 않으면서 라이신 폴리펩티드에 융합될 수 있는 소형 단백질이다. 전형적으로, 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 라이신 폴리뉴클레오티드 서열의 상류 또는 하류에 삽입된다. 이는 세포 기능 또는 결합된 라이신 폴리펩티드의 기능을 방해하지 않는 융합 단백질 (예컨대, 라이신 폴리펩티드::GFP)을 생성할 것이다.
단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 접합은 많은 약학 단백질의 순환 반감기를 연장시키는 방법으로 사용되어 왔다. 따라서, 라이신 폴리펩티드 유도체의 문맥상, "유도체"라는 용어는 하나 이상의 PEG 분자의 공유 결합에 의해 화학적으로 조작된 라이신 폴리펩티드를 포함한다. PEG화 라이신 폴리펩티드는 생물학적 활성과 치료학적 활성을 유지하면서 PEG화되지 않은 라이신 폴리펩티드에 비해 연장된 순환 반감기를 나타낼 것으로 예상된다.
라이신 폴리펩티드 서열에 관해 "아미노산 서열 동일성 퍼센트”라는 용어는 본 명세서에서, 필요한 경우 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 특정 라이신 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 등의 공중이 이용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 해당 분야의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 성취될 수 있다. 2 개 이상의 폴리펩티드 서열은 0 내지 100% 사이에서 동일하거나, 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 2 개의 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 80% 이상 (바람직하게는 약 85% 이상, 약 90% 이상 및 바람직하게는 약 95% 이상)이 동일할 때 "실질적으로 동일하다” 본 명세서에 기술된 바와 같이 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"라는 용어는 라이신 펩티드에도 마찬가지로 적용된다. 따라서, "실질적으로 동일한"이라는 용어는 본 명세서에 기술된 단리된 라이신 폴리펩티드 및 펩티드의 돌연변이, 절단, 융합 또는 달리 서열이 조작된 변이체, 및 그의 활성 단편뿐만 아니라, 기준 폴리펩티드와 비교했을 때 실질적으로 서열이 동일한 (예컨대, 상기 언급된 한 가지 이상의 방법에 의해 측정될 때, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한) 폴리펩티드도 포함할 것이다.
2 개의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 약 80% 이상 (바람직하게는 약 85% 이상, 약 90% 이상 및 바람직하게는 약 95% 이상)이 동일하거나, 또는 보존적 치환을 나타낼 때 “실질적으로 상동이다”. 본 발명의 라이신 폴리펩티드의 서열은 라이신 폴리펩티드의 하나 이상, 또는 여러 개, 또는 10% 까지, 또는 15% 까지, 또는 20% 까지의 아미노산이 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산으로 치환될 때 실질적으로 상동이며, 여기서 상기 생성된 라이신은 본 명세서에 개시된 라이신 폴리펩티드의 작용에 대한 프로파일, 항균 효과 및/또는 세균 특이성이 있다. 본 명세서에 기술된 "실질적으로 상동인"의 의미는 라이신 펩티드에도 마찬가지로 적용된다.
"호흡식 조성물"이라는 용어는 통상 호흡이나 보조 호흡 동안 또는 호흡과 함께 (예컨대, 기관내기관지, 폐 및/또는 비강 투여에 의해) 호흡기로 직접 전달하도록 제형화된 본 발명의 약학 조성물을 의미하며, 미립화, 분무화, 건조 분말 및/또는 에어로졸화 된 제제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"생물막"이라는 용어는 세균 자체 합성의 수화된 중합체 기질에서 표면에 부착하고 응집한 세균을 의미한다. 생물막은 세포가 표면에 서로 붙어있는 미생물의 응집체이다. 이러한 부착 세포는 종종 세포 외 고분자 물질 (EPS)의 자체 생산 기질 내에 삽입된다. 점액이라고도 불리는 새균막 EPS (단, 점액으로 설명되는 모든 것이 세균막인 것은 아님) 또는 플라크는, 일반적으로 세포 외 DNA, 단백질 및 다당류로 구성된 고분자 응집체이다.
특정 세균에 대해 사용하기에 적절한 항생제의 문맥상, "적절한"이라는 용어는 이후에 내성이 발생하더라도 그 세균에 대해 효율적인 것으로 밝혀진 항생제를 의미한다.
"항균 펩티드" (AMP) 라는 용어는 사실상 모든 유기체에서 발견될 수 있는, 넓은 범위의 짧은 (일반적으로 6 내지 50 개 길이의 아미노산 잔기) 양이온성, 유전자 코딩된 펩티드 항생제의 구성원을 의미한다. 상이한 AMP는 상이한 특성을 나타내며, 이 부류의 많은 펩티드는 항생제뿐만 아니라 세포 침투성 펩티드의 주형으로서도 집중적으로 연구되고 있다. 몇 가지 공통적인 특징 (예컨대, 양이온성, 양친매성 및 짧은 길이)을 공유하고 있음에도 불구하고, AMP 서열은 매우 다양하며, 관찰된 AMP 형태의 다양성을 수용하기 위해 적어도 네 가지의 구조 그룹 (알파-나선형, 베타-시트, 연장된 및 루프로 된)이 제안되었다. 마찬가지로, 항생제로서 몇 가지 작용 방식이 제안되었고, 이는 예컨대, 이들 펩티드의 다수의 주요 표적이 세포막인 반면, 다른 펩티드의 주요 표적은 세포질 침입 및 핵심 대사 기능의 파괴인 것으로 나타났다. AMP는 특정 표적 결합의 부재에도 불구하고, 예컨대 대부분의 AMP의 경우와 같이 막에 기공을 형성함으로써, 협동 작용을 나타내기에 충분히 농축될 수 있다. 그러나 이 현상은 인지질 이중층 모델에서만 관찰되었으며, 경우에 따라서는 이들 현상이 발생하기 위해 6 개의 인지질 분자 당 하나의 펩티드 분자가 있는 정도의 높은 막 내 AMP 농도가 필요하다. 이들 농도는 전체 막 포화 상태에 있지 않은 경우 포화 상태에 근접하다. AMP에 대한 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)는 전형적으로 낮은 마이크로 몰의 범위이기 때문에, 이들 임계치의 관련성 및 이들의 생체 내에서의 중요성과 관련하여 당연하게도 회의론이 발생하였다 (Melo et al., Nature Reviews Microbiology, 7, 245-250 (2009)).
디펜신 (defensins)은 척추 동물과 무척추 동물 모두에서 발견되는 작은, 양이온성, 시스테인 및 아르기닌이 풍부한 항균 펩티드의 큰 계열이다 (Wilmes, M. and Sahl, H., Int J Med Microbiol. ;304(1):93-9 (2014)). 디펜신은 시스테인의 간격 패턴에 따라 식물, 무척추 동물, 알파, 베타 및 세타 디펜신의 5 가지 그룹으로 나뉜다. 후자의 3 가지는 주로 포유류에서 발견된다. 알파 디펜 신은 호중구와 장 상피 세포에서 발견되는 단백질이다. 베타 디펜신은 가장 광범위하게 분포되어 있으며 백혈구와 많은 종류의 상피 세포에 의해 분비된다. 세타 디펜신은 레서스 원숭이의 백혈구 등에서 어느 정도까지만 드물게 발견되었다. 디펜신은 세균, 곰팡이 및 많은 외피 보유 세균 및 비 외피성 세균에 대해 활성이다. 그러나 세균의 효율적인 사멸에 필요한 농도는 대부분 높으며, 즉 마이크로 몰 범위이다. 다수의 펩티드의 작용은 생리학적 염 조건, 2가 양이온 및 혈청의 존재하에서 제한될 수 있다. 또한, 디펜신은 종종 본 발명의 생성물 및 방법에 바람직하지 않은 용혈 작용을 한다.
스시 펩티드는 보체 조절 단백질 (CCP) 모듈 또는 짧은 컨센서스 반복 (SCR)으로도 알려진 스시 도메인을 특징으로 한다. 스시 도메인은 짧은 연결 서열에 의해 산재된 스시 도메인의 탠덤 배열을 포함하는 다양한 보체 및 접착 단백질에서 발견된다. 스시 도메인은 분자 내 이황화 결합, 고도로 보존된 트립토판 및 보존된 글리신, 프롤린 및 소수성 잔기에 관여하는 4 개의 불변 시스테인 잔기를 교대로 함유한 약 60 잔기를 가로지르는 컨센서스 서열을 포함한다 (Kirkitadze, M. and Barlow, P., Immunol Rev., 180:146-61 (2001)). 스시 도메인은 단백질-단백질 및 단백질-리간드 상호 작용에 관여하는 것으로 알려져 있다. 스시 도메인을 함유하는 펩티드는 항균 작용이 있는 것으로 나타났다 (Ding, JL. and Ho, B. Drug Development Research, 62:317-335 (2004)).
카텔리시딘 (cathelicidins)은 양이온성 숙주-방어 펩티드 (CHDP) - 항균 치료법으로 제안된 펩티드 부류 - 및 감염에 대한 선천적인 숙주 방어의 중요한 성분으로 알려진 다기능 항균 펩티드이다. 살균 능력에 더하여, 이들 펩티드는 염증 및 면역을 조절할 수 있는 특성이 있다. 최근, 외인성 인간 카텔리시딘 LL-37의 전달이 급성 슈도모나스 애루지노사 폐 감염의 쥣과 모델에서 감염에 대한 보호적 전-염증 반응을 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 생체 내 카텔리시딘 매개의 세균 제거 효과의 향상을 입증했다 (Beaumont et al. PLoS One . 2;9(6):e99029 (2014)). 따라서, 카텔리시딘은 감염 및 펩티드 노출을 모두 필요로 하고 천연 카텔리시딘 생성에 독립적인 초기 호중구 반응의 향상과 함께, 직접적인 살균 작용이 없는 폐에서의 세균 제거를 효율적으로 촉진하였다. 게다가, 카텔리시딘이 결핍된 마우스는 손상되지 않은 초기 세포 염증 반응을 나타내지만, 감염에 대한 후기 호중구의 반응은 이들 동물에서는 발견되지 않았고, 슈도모나스 애루지노사를 유의하게 제거하지 못하였다. 이들 결과는 생체 내 폐 감염에서 카텔리시딘의 조절 특성의 중요성을 입증하였고, 감염성 환경에 특이적인 보호적 폐 호중구 반응의 유도에서 카텔리시딘의 핵심적인 역할을 강조하였다 (Beaumont, P.E. et al., PLoS One. 2014; 9(6): e99029. Published online 2014 Jun 2. doi:　 10.1371/journal.pone.0099029).
[구현예]
본 발명은 그람 음성균에 대한 새로운 항균제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 등의 그람 음성균에 대해 활성인 라이신 폴리펩티드 (그의 활성 단편을 포함한다)에 관한 것이다. 이러한 라이신 폴리펩티드의 예시로는 서열 번호 1 내지 서열 번호 10의 아미노산 서열을 가지는 것들이 있다. 상기 천연 서열은 종전에 서열화되었지만 부분적으로 밝혀진 파지 게놈으로부터 생물정보학 기술에 의해 동정되었다. 이와 같이 동정된 서열 중 일부는 추정 엔돌리신으로 주석이 달렸지만, 이전에 이들 서열을 가지는 폴리펩티드에 확연히 기여한 기능은 없었다. 게다가, 합성 또는 발현에 대한 추정 엔돌리신으로 주석이 달린 일부 서열은 라이신 작용이 전혀 없거나 표적 병원균에 대해 불활성인 것으로 밝혀졌다. 분리, 발현 및 시험에서 사실상 생물정보학적으로 동정된 서열 중 소수만이 그람 음성 라이신 기능을 가지고 있었다. 또한, 라이신의 활성 단편이 동정되고, 그람 음성 라이신 작용이 있는 서열 조작된 활성 펩티드 및 폴리펩티드가 제조되었다. 게다가, 본 발명의 설명에 따르면, 이러한 서열 조작된 펩티드는 라이신 작용을 유지하는 확인된 천연 그람 음성 라이신 폴리펩티드의 단편뿐만 아니라, 상기 천연 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편과 서열 동일성이 80% 이상 (예컨대, 85% 이상, 90% 이상 85% 이상 또는 98% 이상)인 그의 변이체를 포함하고, 실제로 동일하지 않은 부분은 천연 및 비천연 (합성) 아미노산 잔기 모두로의 치환을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 이들 폴리펩티드의 C-말단의 알파 나선형 도메인이 그람 음성 라이신 작용에 중요하다는 것을 입증하였고, 상기 작용을 정확히 밝히기 위한 연구를 수행하였지만, 본 명세서에 개시된 천연 라이신 또는 그의 단편과 80% 이상 (예컨대, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 99%) 동일한 서열을 가지는 임의의 펩티드는 슈도모나스 애루지노사를 비롯한 그람 음성 세균, 및 클레브시엘라 종, 엔테로박터 종, 에쉐리히아 콜리, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 예르시니아 페스티스 및 프란시셀라 툴라렌시스 등의 다른 것들에 대한 작용에 대해 신속하게 시험할 수 있다. 이러한 시험은 예컨대 실시예 2, 3, 4 또는 예측예 1에 제공된 교시를 따를 수 있다. 물론, 상기 시험 절차 및 프로토콜 그 자체는 이들 실시예에서의 시험 절차 및 프로토콜로 한정되는 것은 아니지만, 통상의 기술자에게 공지된 항세균제와 진짜 항균제의 효율을 평가하는 임의의 방법일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 그람 음성균에 의해 세균 감염이 발생한 대상의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의, 서열 번호 1 내지 서열 번호 10와 아미노산 서열 동일성이 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상인 라이신 폴리펩티드를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 세균은 아시네토박터 바우마니, 아시네토박터 헤몰리티쿠스, 악티노바실루스 액티노마이세템코미탄스, 애로모나스 하이드로필라, 박테로이데스 프라길리스, 박테로이데스 테타이오타오마이크론, 박테로이데스 디스타소니스, 박테로이데스 오바투스, 박테로이데스 불가투스, 보르데텔라 페르투시스, 브루셀라 멜리텐시스, 버크홀데리아 세파시아, 버크홀데리아 슈도말레이, 버크홀데리아 말레이 푸로박테리움, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 엔도돈탈리스, 포르피로모나스 아사카롤리티카, 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 피터스, 캄필로박터 콜리, 시트로박터 프룬디, 시트로박터 코세리, 에드와시엘라 타다, 에이케넬라 코로덴스, 엔테로박터 클로아카, 엔테로박터 애로게네스, 엔테로박터 아글로메란스, 에쉐리히아 콜리, 프란시셀라 툴라렌시스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 듀크레이, 헬리코박터 파일로리, 킨젤라 킨가에, 클레브시엘라 뉴모니애, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 리노스클레로마티스, 클레브시엘라 오자에나에, 레지오넬라 뉴모필라, 모락셀라 카타랄리스, 모르가넬라 모르가니, 나이세리아 고노르호애, 나이세리아 메닌지티디스, 파스퇴렐라 물토시다, 플레시오모나스 시겔로이데스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 프로테우스 펜네리, 프로테우스 믹소파시엔스, 프로비덴시아 스투아르티, 프로비덴시아 레트게리, 프로비덴시아 알카리파시엔스, 슈도모나스 애루지노사, 슈도모나스 플루오레센스, 살모넬라 타이피, 살모넬라 파라타이피, 세라티아 마르세센스, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 보이디, 시겔라 소네이, 시겔라 디센테리애, 스테노트로포모나스 말토필리아, 스트렙토바실루스 모닐리포르미스, 비브리오 콜레라, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 비브리오 불니피쿠스, 비브리오 알지놀리티쿠스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 슈도튜베르큘로시스, 클라미디아 뉴모니애, 클라미디아 트라코마티스, 리케차 프로바체키, 콕시엘라 부르네티, 에를리히아 샤펜시스 및 바르토넬라 헨셀라로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 한 구체적인 구현예에서, 상기 그람 음성균 감염은 아시네토박터 바우마니, 보르데텔라 페르투시스, 버크홀데리아 세파시아, 버크홀데리아 슈도말레이, 버크홀데리아 말레이, 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜리, 엔테로박터 클로아카, 엔테로박터 애로게네스, 에쉐리히아 콜리, 프란시셀라 툴라렌시스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 듀크레이, 헬리코박터 파일로리, 클레브시엘라 뉴모니애, 레지오넬라 뉴모필라, 모락셀라 카타랄리스, 모르가넬라 모르가니, 나이세리아 고노르호애, 나이세리아 메닌지티디스, 파스퇴렐라 물토시다, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 슈도모나스 애루지노사, 살모넬라 타이피, 세라티아 마르세센스, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 보이디, 시겔라 소네이, 시겔라 디센테리애, 스테노트로포모나스 말토필리아, 비브리오 콜레라 및 클라미디아 뉴모니애로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균에 의해 발생한다. 한 구체적인 구현예에서, 상기 그람 음성균 감염은 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 타이피, 시겔라 종, 에쉐리히아 콜리, 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 애루지노사, 클레브시엘라 뉴모니애, 나이세리아 고노르호애, 나이세리아 메닌지티디스, 세라티아 종, 프로테우스 미라빌리스, 모르가넬라 모르가니, 프로비덴시아 종, 에드와시엘라 종, 예르시니아 종, 헤모필루스 인플루엔자, 바르토넬라 퀸타나 (Bartonella Quintana), 브루셀라 종, 보르데텔라 페르투시스, 버크홀데리아 종, 모락셀라 종, 프란시셀라 툴라렌시스, 레지오넬라 뉴모필라, 콕시엘라 부르네티, 박테로이데스 종, 엔테로박터 종 및 클라미디아 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 세균에 의해 발생한다.
(i) 본 발명의 라이신 펩티드 및 폴리펩티드가 그람 음성균의 OM을 관통하여 기질에 도달 할 수 있고, 그러한 세균을 사멸시키고 세균 콜로니의 성장 속도를 실질적으로 감소시킬 수 있다는 사실과, (ii) 아틸라이신 등의 완충액 및 배지에서 OM을 침투하도록 조작된 다른 라이신 폴리펩티드의 유사한 관찰에 기초하여, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 한 가지 이상의 그람 음성균 감염의 치료에 유용할 것으로 예상된다. 게다가, 본 라이신 폴리펩티드가 양이온성 펩티드와 다른 항균 펩티드와의 융합 (존재한다면) 전에도 그람 음성 표적에 대한 활성을 보유한다는 사실은 인간 혈청에 의해 저해되는 것으로 보이는 아틸라이신보다 유리할 수 있다 (Deslouches, B. et al., Activity of the De Novo Engineered Antimicrobial Peptide WLBU2 against Pseudomonas aeruginosa in Human Serum and Whole Blood: Implications for Systemic Applications, Antimicrobial Agents & Chemotherapy, Aug. 2005, p. 3208-3216 Vol. 49, No 8; Brogden N. et al., Int J Antimicrob Agents. 2011 September; 38(3): 217-225. doi:10.1016/j.ijantimicag.2011.05.004; Svenson, J. et al., J. Med. Chem., 2007, 50 (14), pp 3334-3339).
한 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 특히 하부 호흡기 감염에만 국한되지는 않지만, 그 중에서도 호흡기 감염 (RTI)을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 성병을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 요로 감염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 만성 기관지염 (ACEB)의 급성 악화를 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 낭포성 섬유증 (CF) 환자의 호흡기 감염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 급성 중이염 또는 신생아 패혈증을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 급성 부비강염을 의미할 수 있다. 한 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 내약성 세균, 나아가 다중 내약성 세균에 기인하는 감염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 카테터 관련 패혈증을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 클라미디아를 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 지역 사회성 폐렴 (CAP) 또는 병원내 호흡기 감염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 복합성 피부 및 피부 구조 감염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 비복합성 피부 및 피부 구조 감염을 의미할 수 있다. 한 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"은 심내막염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 열성 호중구 감소증을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 임균성 자궁경관염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 임균성 요도염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 원내 감염 폐렴 (HAP)을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 골수염을 의미할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "감염" 및 "세균 감염"이라는 용어는 패혈증을 의미할 수 있다. 일반적인 그람 음성 병원균 및 관련 감염은 본 발명의 표 1에 열거되어 있다. 이들 구현예뿐만 아니라 표 1에 열거된 병원균 및 질병은 본 방법의 용도의 예시로서 제공되는 것이고, 이를 한정하려고 의도된 것은 아니다.
표 1. 의학적으로 관련된 그람 음성균 및 관련 질병.
그람 음성 병원균 1차 질병
살모넬라 티피무리움 위장 (GI) 감염 - 살모넬라증
시겔라 종 GI 감염 - 시겔라증
에쉐리히아 콜리 요로 감염 (UTIs)
아시네토박터 바우마니 상처 감염
슈도모나스 애루지노사 혈류 감염 및 폐렴
클레브시엘라 뉴모니애 폐렴, UTIs 및 혈류 감염
나이세리아 고노르호애 성병 (STD) - 임질 (gonorrhea)
나이세리아 메닌지티디스 수막염 (meningitis)
세라티아 종 카테터 오염, UTIs 및 폐렴
프로테우스 미라빌리스 UTIs
모르가넬라 종 UTIs
프로비덴시아 종 UTIs
에드와시엘라 종 UTIs
살모넬라 타이피 GI 감염 - 장티푸스 (typhoid fever)
예르시니아 페스티스 선페스트 및 폐페스트
예르시니아 엔테로콜리티카 GI 감염
예르시니아 슈도튜베르큘로시스 GI 감염
헤모필루스 인플루엔자 수막염
바르토넬라 퀸타나 참호열 (trench fever)
브루셀라 종 브루셀라증
보르데텔라 페르투시스 호흡기 - 백일해
버크홀데리아 종 호흡기
모락셀라 종 호흡기
프란시셀라 툴라렌시스 야토병 (tularemia)
레지오넬라 뉴모필라 호흡기 - 재향군인병 (legionnaires' disease)
콕시엘라 부르네티 Q열
박테로이데스 종 복부 감염
엔테로박터 종 UTIs 및 호흡기
클라미디아 종 STDs, 호흡기 및 안구
한 구현예에서, 본 발명은 대상에서 슈도모나스 애루지노사와, 인간 질병에서 가장 중요한 그람 음성균인 클레브시엘라 종, 엔테로박터 종, 에쉐리히아 콜리, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 예르시니아 페스티스 및 프란시셀라 툴라렌시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 적어도 1 종의 추가적 그람 음성균에 기인하는 그람 음성균 감염의 치료 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 대상에서 슈도모나스 애루지노사에 기인하는 그람 음성균 감염의 치료 방법을 제공한다. 슈도모나스 애루지노사 (P. aeruginosa)는 환경 어디에서나 발견되는 산화 효소에 양성이고, 그람 음성인 막대 모양의 유기체이다. 슈도모나스 애루지노사는 토양, 물, 식물 및 동물 조직을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 수많은 서식지에서 자랄 수 있다. 이는 기회주의적 유기체이며, 낭포성 섬유증, 암, 화상, 당뇨병성 궤양 또는 면역계 결핍이 있는 사람들과 같은 감수성 개체들에게 국소 또는 전신 질병을 유발할 수 있는 가장 문제인 원내 병원균 중 하나이다. 특히 병원 환경에서, 이는 일반적으로 사용되는 다수의 항생제에 내성을 가지게 되었다.
미국 질병 관리 예방 센터 (US Centers for Disease Control and Prevention) 및 국립 병원 감염 감시 시스템 (National Nosocomial Infection Surveillance System)의 데이터에 따르면, 슈도모나스 애루지노사는 병원내 폐렴의 두 번째로 흔한 원인이고, 요로 감염의 세 번째로 흔한 원인이며, 수술 부위 감염의 네 번째로 흔한 원인이면서 혈류에서 일곱 번째로 빈번하게 단리된 병원균이고, 모든 부위에서 다섯 번째로 흔한 분리주이다 (Solh and Alhajhusain, J Antimicrob Chemother. 64(2):229-38 (2009)). 또한, 슈도모나스 애루지노사는 입원 환자에서 폐렴을 일으키는 가장 흔한 다중 내약성 (MDR) 그람 음성 병원균이다 (Goossens et al., Clin Microbiol Infect. 980-3 (2003)).
슈도모나스 애루지노사에 기인하는 감염의 비제한적인 예시로는, A) 병원 감염: 1. 특히 낭포성 섬유증 환자 및 인공 호흡 환자에서의 호흡기 감염, 2. 균혈증 및 패혈증, 3. 상처 감염, 특히 화상 피해자의 감염, 4. 요로 감염, 5. 침습성 장치에 대한 수술후 감염, 6. 오염된 약물 용액의 정맥 내 투여에 의한 심내막염, 7. 후천성 면역 결핍증, 항암 치료, 스테로이드 치료, 혈액성 악성 종양, 장기 이식, 신장 대체 요법 및 중증 호중구 감소증 기타 증상을 앓고 있는 환자의 감염, B) 지역 사회성 감염: 1. 시역 사회성 호흡기 감염, 2. 수막염, 3. 오염된 물에 의해 발생한 외이도의 모낭염 및 외이염, 4. 노인 및 당뇨병 환자의 악성외이도염, 5. 어린이 종골의 골수염, 6. 주로 오염된 콘택트 렌즈와 관련된 안구 감염, 7. 손이 자주 물에 노출되는 사람들의 손발톱 감염 등의 피부 감염, 8. 위장관 감염 및 9. 근골격계 감염이 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및/또는 다른 그람 음성균으로 인한 감염에 걸릴 위험이 있는 환자를 치료하는 데 사용된다. 슈도모나스 애루지노사 또는 다른 그람 음성균 감염에 걸릴 위험이 있는 대상은 예컨대, 낭포성 섬유증 환자, 호중구 감소증 환자, 괴사성 장염 환자, 화상 피해자, 상처 감염 환자, 및 더 일반적으로 병원 환경 내의 환자, 특히 수술 환자와 중심 정맥 카테터 등의 카테터, 히크만 (Hickman) 장치 또는 심장 박동기와 이식형 제세동기 등의 전기생리학적 심장 장치를 비롯한 체내 삽입 의료 장치를 사용하여 치료받는 환자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 슈도모나스 애루지노사를 비롯한 그람 음성균에 감염될 위험이 있는 다른 환자 그룹에는 인공 관절 치환술 (예컨대, 인공 슬관절 치환술 또는 인공 고관절 치환술) 등의 보철물이 이식된 환자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 대상은 그람 음성균 호흡기 감염을 앓고 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상은 낭포성 섬유증을 앓고 있으며, 각각의 활성 성분은 호흡식 조성물, 경구 조성물 또는 구강 조성물의 형태로 독립적으로 투여된다. 더 구체적인 구현예에서, 상기 대상은 낭포성 섬유증과 관련된 그람 음성균 호흡기 감염을 앓고 있으며, 각각의 활성 성분은 호흡식 조성물의 형태로 병용 투여된다. 한 구현예에서, 상기 대상은 슈도모나스 애루지노사 또는 다른 그람 음성균에 감염된 상처를 앓고 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료 가능한 상처의 예시로는 감염된 화상 또는 감염될 위험이 있는 화상이 있다. 이러한 화상에는 열 (thermal or heat) 화상, 저온 화상, 화학 화상, 전기 화상 또는 방사선 화상이 있다.
또한, 슈도모나스 애루지노사 및 다른 그람 음성균은 빈번하게 병원 음식물, 싱크대, 수도꼭지, 대걸레 및 호흡 장치 등에 콜로니를 형성한다. 상기 감염은 비생체 매개물 (fomites)과 접촉하거나 오염된 음식과 물을 섭취함으로써 환자에서 환자로 전염된다 (Barbara Iglewski, Medical Microbiology, 4th edition, Chapter 27, Pseudomonas, 1996).
한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 다른 치료 요법과 함께 대상에서 그람 음성균 감염 (또는 특징지어지지 않은 감염)을 치료하는 데 사용된다. 이러한 선택적인 병용 요법은 항생제 또는 다른 살균제나 정균제, 및/또는 병원균 표면의 상이한 성분을 표적으로 하는 (예컨대, 외막의 상이한 성분을 표적으로 하는) 다른 라이신 등의 추가적인 치료제를 필요로 하는 환자에게 병용 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항생제 외에도, 살균제 및 정균제는 라이신, 소독제, 방부제 및 보존제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 중 임의의 것은 본 발명의 라이신 폴리펩티드와 임의로 조합하여 사용될 수 있다.
항균 소독제는 차아염소산염, 클로라민, 디클로로이소시아누레이트 및 트리클로로이소시아누레이트, 습식 염소, 이산화 염소, 과산화아세트산, 과황화칼륨, 과붕산나트륨, 과탄산나트륨 및 요소 과수화물, 요오드 포비돈, 요오드 팅크, 요오드화된 비이온성 계면 활성제, 에탄올, n-프로판올 및 이소프로판올 및 이들의 혼합물, 2-페녹시에탄올 및 1- 및 2-페녹시프로판올, 크레졸, 헥사클로로펜, 트리클로산, 트리클로로페놀, 트리브로모페놀, 펜타클로로페놀, 디브로몰 (Dibromol) 및 그의 염, 염화 벤즈알코늄, 브롬화 또는 염화 세틸 트리메틸암모늄, 염화 디데실디메틸암모늄, 염화 세틸피리디늄, 염화 벤제토늄, 클로로헥시딘, 글루코프로타민, 옥테니딘 디하이드로클로라이드, 오존 및 과망간산염 용액, 콜로이드 은, 질산 은, 염화 수은, 페닐수은 염, 구리, 황산구리, 염화 산화 구리, 인산, 질산, 황산, 아미도 황산, 톨루엔술폰산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화칼슘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 라이신 폴리펩티드와 방부제의 조합은 항생제의 조합보다 그람 음성균에 대해 더 많은 효능을 제공할 수 있다. 방부제는 Daquin 용액, 차아염소산 나트륨 또는 칼륨 용액, 벤젠설폰염화나트륨 용액, 요오드 포비돈 등의 특정 요오드제, 요소 과수화물 용액 및 pH 완충 과산화아세트산 용액 등의 과산화물, 방부제가 포함되거나 포함되지 않은 알콜, 소르브산, 벤조산, 젖산 및 살리실산 등의 약한 유기산, 헥사클로로펜, 트리클로산 및 디브로몰 등의 일부 페놀성 화합물, 및 벤즈알코늄, 클로로헥시딘, 메틸이소티아졸론, αα-테르피네올, 티몰, 클로록실레놀 옥테니딘 용액 등의 양이온성 활성 화합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 라이신은 표준 치료 항생제 또는 마지막 수단의 항생제와, 개별적으로 또는 해당 기술 분야의 범위 내에서 다양한 조합으로 병용 투여될 수 있다. 슈도모나스 애루지노사 작용에 대한 전통적인 항생제는 아미노글리코시드, 티카르실린, 유레이도페니실린, 세프타지딤, 세페핌, 아즈트레오남 (aztreonam), 카바페넴, 시프로플록사신, 레보플록사신 등을 포함한다 (표 2). 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 표 2에 열거된 다른 것들을 치료하는 데 사용되는 항생제와 병용 투여될 수 있다. 다른 그람 음성균, 예컨대 클레브시엘라 종, 엔테로박터 종, 에쉐리히아 콜리, 시트로박터 프룬디, 살모넬라 티피무리움, 예르시니아 페스티스 및 프란시셀라 툴라렌시스에 대한 항생제의 목록은 슈도모나스 애루지노사에 대해 상기 제공된 것과 유사할 것이며, 관련된 특정 세균 또는 마지막 수단의 항생제 (특정 균주가 표준 치료 항생제에 대해 내성인 경우)에 대한 표준 치료 항생제일 것이다.
병용 투여될 추가적인 선택적 치료제는 상기 언급된 항생제 및 티카르실린-클라부라네이트 조합물, 피페라실린-타조박탐 조합물, 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 시프로플록사신, 레보플록사신, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 젠타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 (폴리믹신 E) 등의 표 2에 열거된 항생제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상처의 치료의 경우, 병용 투여될 치료제는 프로필렌 글리콜 하이드로겔 (예컨대, SOLUGEL®(Johnson & Johnson)), 방부제, 항생제 및 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
표 2. 슈도모나스 애루지노사의 치료에 사용되는 항생제
분류 제제
페니실린 티카르실린-클라부라네이트
피페라실린-타조박탐
세팔로스포린 세프타지딤
세페핌
세포페라존
모노박탐 아즈트레오남
플루오로퀴놀론 시프로플록사신레보플록사신
카바페넴 이미페넴메로페넴
도리페넴
아미노글리코시드 젠타마이신토브라마이신
아미카신
폴리믹신 콜리스틴폴리믹신 B
폴리믹신 B 및 관련 콜리스틴 (폴리믹신 E) 등의 항생제 펩티드는 슈도모나스 애루지노사 세균 감염 치료용 항균제로서 사용되어 왔다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 폴리믹신 B 및/또는 콜리스틴과 함께 병용 투여된다.
본 발명의 라이신 폴리펩티드를 항생제와 조합하는 것은 효율적인 새로운 항균 요법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드와 한 가지 이상의 항생제의 병용 투여는, 상기 라이신 또는 상기 항생제 또는 양쪽 모두의 감소된 투여량 및 양으로 수행될 수 있고/있거나, 증진된 살균 작용 및 정균 작용, 감소된 항생제 내성의 위험, 감소된 해로운 신경학적 또는 신장 부작용 (콜리스틴 또는 폴리믹신 B의 사용과 관련된 부작용)으로 낮아진 치료 빈도 및/또는 짧아진 치료 기간으로 수행될 수 있다. 종전의 연구에 따르면 총 콜리스틴의 누적 투여량은 신장 손상과 관련이 있으며, 이는 상기 라이신 폴리펩티드와의 조합 요법으로 투여량을 감소시키거나 치료 기간을 단축하여 신독성의 발병률을 낮출 수 있음을 시사하였다 (Spapen et al. Ann Intensive Care. 1: 14 (2011)). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감소된 투여량"이라는 용어는 동일한 활성 성분을 가지는 단일 요법에 비해 조합에서 하나의 활성 성분의 투여량을 의미한다. “치료 기간”에 대해서도 마찬가지이다. 일부 구현예에서, 조합된 상기 라이신 또는 상기 항생제의 투여량은 개별적인 단일 요법에 비해 준최적 또는 심지어 임계치 이하일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 내약성 그람 음성균에 기인하는 감염 등의 세균 감염을 치료하는 데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 단독 또는 한 가지 이상의 항생제와 함께 다중 내약성 그람 음성균에 기인하는 감염 등의 세균 감염을 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 문맥상, 내약성 또는 다중 내약성 그람 음성균은 슈도모나스 애루지노사를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
실제로, 혼합된 그람 양성 종 및 그람 음성 종의 감염은 일반적으로 다균성이다 (Citron et al. J Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828 (2007))에 의해 일반적으로 다균성이다. 일부 구현예에서, 그람 음성균에 대해 활성인 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 그람 음성균에 대해 효율적인 항생제와 함께 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특정 대상의 감염에 따라 그람 양성균의 치료에 적절한 한 가지 이상의 항생제 및/또는 한 가지 이상의 다른 라이신과 조합하여 사용될 수도 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 그람 음성균의 세포벽을 파괴하거나 분해할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사의 세포벽을 파괴하거나 분해할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 한 가지 이상의 그람 음성균의 성장을 억제시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 조성물을, 그람 음성균의 성장이 억제되는 양 및 그러한 조건하에서 대상에게 투여하거나 특정 환경에 전달하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 및/또는 한 가지 이상의 다른 그람 음성균의 성장을 억제시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드를 다른 임상적으로 관련 있는 제제와 조합하여 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 외막을 본 발명의 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드에 접촉 (세균을 노출)시킴으로써 슈도모나스 애루지노사 및/또는 한 가지 이상의 다른 그람 음성균의 외막의 투과성을 증가시키는 방법을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 외막을 항생제, 살균제, 방부제 등 다른 임상적으로 관련 있는 제제와 함께 본 명세서에 개시된 라이신 폴리펩티드와 접촉시킴으로써 슈도모나스 애루지노사 및/또는 한 가지 이상의 다른 그람 음성균의 투과성을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 그람 음성균에 대한 한 가지 이상의 항생제의 항생 작용을, 본 명세서에 개시된 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드와 관심 있는 항생제를 함께 대상에게 투여함으로써 단독으로 사용되는 상기 항생제의 작용에 비해 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 조합은 세균에 대해 효율적이며, 폴리믹신 B의 신독성 및 신경독성 효과와 같은 바람직하지 않은 부작용을 감소시키면서 항생제에 대한 내성이 극복되도록, 및/또는 항생제가 저용량으로 사용되도록 허용한다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 그람 음성균의 외막의 추가적 투과성 제제와 조합하여 사용될 수 있으며, EDTA, TRID, 젖산, 락토페린, 폴리믹신, 시트르산 등의 금속 킬레이터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (Vaara M. Microbiol Rev. 56(3):395-441 (1992)).
한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 화학적으로 조작된다. 화학적 조작은 화학적 부분의 첨가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 부분의 제거를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 화학적 조작은 아미노 말단 또는 카복시 말단뿐만 아니라, 아미노산 측사슬을 비롯한 라이신 폴리펩티드의 어느 곳에서나 일어날 수 있다. 이러한 조작은 라이신 폴리펩티드의 하나 이상의 부위에 존재할 수 있다. 또한, 라이신 폴리펩티드의 하나 이상의 측사슬 또는 말단기는 통상의 기술자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다.
일부 구현예에서, 라이신 폴리펩티드는 지속 기간을 향상시키는 부분의 부착을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 지속 기간을 향상시키는 부분은 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG")은 향상된 지속 기간을 가지는 치료용 폴리펩티드를 수득하는 데 사용되어왔다 (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995); Mehvar, R., J. Pharm . Pharmaceut . Sci ., 3:125-136 (2000)). 상기 PEG 골격 [(CH2CH2―O―)n, n: 반복 모노머의 수]은 유연하고 양친매성이다. 라이신 폴리펩티드와 같은 다른 화학적 독립체에 부착될 때, PEG 중합체 사슬은 면역 반응 및 다른 제거 메커니즘으로부터 이러한 라이신 폴리펩티드를 보호할 수 있다. 결과적으로, PEG화는 약물 동력학적 최적화, 생체 이용률의 증가, 및 면역원성과 투여량 및/또는 투여 빈도의 감소를 통해 라이신 폴리펩티드의 효능 및 안전성을 개선시킬 수 있다. "PEG화 (pegylation)"는 PEG 분자와 다른 화합물, 예컨대 라이신 폴리펩티드와의 접합을 의미한다.
한 구현예에서, 본 발명은 병원 및 기타 건강 관련 또는 공중이 사용하는 건물 내의 의료 장치, 바닥, 계단, 벽 및 카운터 탑 등의 표면, 및 수술실, 응급실, 병원실, 진료소 및 욕실 등에 있는 장비의 표면의 그람 음성균 오염의 예방, 감소, 처리 또는 제거에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 조성물을 사용하여 보호될 수 있는 의료 장치의 예시로는 튜빙과, 비뇨관 카테터, 점액 추출 카테터, 석션 카테터, 배꼽 캐뉼라, 콘택트 렌즈, 자궁내 장치, 질내 및 장내 장치, 기관내 관, 기관지경, 치과 보철 및 치과 교정 장치, 외과 기구, 치과 기구, 튜빙, 흘수선, 섬유, 종이, 표지 조각 (예컨대, 종이 표지 조각 또는 플라스틱 표지 조각), 접착제 (예컨대, 하이드로겔 접착제, 핫멜트 접착제 또는 용제형 접착제), 붕대, 티슈 드레싱 또는 치유 장치 및 폐색 패치 등의 다른 의료 장치의 표면, 및 의료 분야에서 사용되는 임의의 다른 장치의 표면을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 장치들은 전극, 외부 보철, 고정 테이프, 압축 붕대 및 다양한 유형의 모니터를 포함할 수 있다. 의료 장치들은 또한 삽입 또는 이식 부위 근처의 피부와 같은 삽입 또는 이식 부위에 위치할 수 있고, 그람 음성균에 의한 콜로니 형성에 영향을 받기 쉬운 하나 이상의 표면을 가질 수 있는 임의의 장치를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 그람 음성균 오염에 대해 식품의 보존을 위해 사용되며, 이는 라이신 폴리펩티드를 비롯한 본 발명의 조성물을 상기 식품에 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 식제품의 예시로는 육제품 (염지육 및/또는 무염지육, 신선육 및/또는 조리육), 샐러드 및 기타 식물성 제품, 음료 및 유제품, 반가공 식품, 인스턴트 식품과 건조 식품 등의 간이 식품 등이 있다.
인간에 대해 세균이 제기하는 문제점 중 하나는 생물막의 형성이다. 생물막 형성은 미생물 세포가 서로 접착할 때 발생하고 표면의 세포외 고분자 물질 (EPS)의 기질에 박혀 있다. 생체 고분자 (예컨대, 다당류, 핵산 및 단백질) 및 영양소가 풍부한 보호 환경에서 미생물의 성장은 향상된 미생물 누화 및 증가된 독성을 허용한다. 생물막이 모든 지원 환경에서 발생할 수 있기 때문에, 생물막 형성을 방지하거나 제거할 수 있는 방법 또는 조성물이 필요하다. 슈도모나스 애루지노사는 다양한 생체 및 비생체 표면, 예컨대 CF 폐의 점액 플러그, 오염된 카테터, 콘택트 렌즈 등에서 생물막을 형성하는 것으로 밝혀졌다 (Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)). 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 세균의 생물막, 특히 슈도모나스 애루지노사의 기여에 의해 형성된 생물막의 예방, 조절, 파괴 및 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 라이신 폴리펩티드는 생체 내에서, 예를 들어 대상에서의 세균 감염을 치료하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내에서, 예를 들어 세포 배양의 세균성 오염 수준을 제거하거나 감소시키기 위해 배양 중인 세포 (예컨대, 세균)을 처리하는 데 사용될 수도 있다.
라이신 폴리펩티드의 생산 방법
한 구현예에서, 본 발명은 한 가지 이상의 그람 음성균, 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사의 성장을 억제하거나 사멸시키는 본 발명의 라이신 폴리펩티드의 생산 방법을 포함하며, 상기 방법은 적절한 조건하에서 상기 폴리펩티드를 발현하기 위해 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드를 코딩하는 라이신 폴리뉴클레오티드가 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
높은 수준으로 라이신 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 라이신 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로 그들을 적절한 발현 벡터의 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결시키고, 적절한 세포 숙주에 상기 발현 벡터를 형질 전환 시킴으로써 발현된다. 본 발명의 라이신 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 조절 서열에 이처럼 작동 가능하도록 하는 연결은, 폴리뉴클레오티드 (DNA) 서열의 정확한 판독 프레임 상류에 개시 코돈 ATG를 제공하는 것을 포함한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현 및/또는 숙주에서 폴리펩티드를 발현시키기에 적절한 임의의 시스템이나 벡터는 라이신 폴리펩티드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 상기 적절한 DNA/폴리뉴클레오티드 서열은 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual에 개시된 것과 같은 임의의 공지된 여러 가지 일반 기술을 통해 발현 시스템에 삽입될 수 있다. 또한, 편리한 단리 방법의 제공을 위해 라이신 폴리펩티드에 태그, 예컨대, c-myc, 비오틴, 폴리-His 등이 삽입될 수도 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 이용 가능하다.
매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합은 본 발명의 라이신 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하는 데 사용될 수 있다. 많은 적절한 벡터가 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 이들은 상업적으로 이용 가능하다. 적절한 벡터의 예시로는 문헌 Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)에 제공되어 있다. 이러한 벡터로는 무엇보다도, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터가 있으며, 예를 들어 세균성 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예컨대 바큘로바이러스, SV40 등의 파포바바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대 코스미드 및 파지미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소로부터 유래된 벡터가 있다. 또한, 상기 벡터는 본 발명의 라이신 폴리펩티드의 구성적 발현 또는 유도성 발현을 제공할 수 있다. 더 구체적으로, 적절한 벡터는 SV40의 유도체 및 공지된 세균 플라스미드, 예컨대 대장균 플라스미드 colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체, RP4, pBAD24 및 pBAD-TOPO를 비롯한 플라스미드, 파지 DNAS, 예컨대 파지 λ의 수많은 유도체, 예컨대 NM989, 및 기타 파지 DNA, 예컨대 M13 및 섬유질 단일 가닥 DNA, 2D 플라스미드 또는 그의 유도체를 비롯한 효모 플라스미드, 곤충 세포 또는 포유류 세포 등의 진핵 세포에서 유용한 벡터, 파지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열을 사용하도록 조작된 플라스미드를 비롯한 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 언급 된 벡터의 다수는 New England Biolabs, Addgene, Clontech, Life Technologies 등의 벤더로부터 상업적으로 이용 가능하며, 이들 중 다수가 적절한 숙주 세포를 제공한다.
또한, 벡터는 다양한 조절 요소 (프로모터, 리보솜 결합 부위, 터미네이터, 인핸서, 발현 수준 조절을 위한 다양한 시스-요소를 포함한다)를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 백터가 숙주 세포에 따라 만들어진다. 라이신 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위해, 다양한 발현 조절 서열 (폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 서열이 여기에 작동 가능하도록 연결됨) 중 어느 것도 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 유용한 조절 서열은 SV40, CMV, 우두, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 프로모터 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 λ의 주요 작동 영역 및 프로모터 영역, fd 피막 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소의 프로모터, 산 포스파타제 (예컨대, Pho5)의 프로모터, 효모 결합 인자의 프로모터, 세균에서의 발현을 위한 대장균 프로모터, 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 프로모터 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
매우 다양한 숙주 세포가 본 발명의 라이신 폴리펩티드를 발현하는 데 유용하다. 본 발명의 라이신 폴리펩티드의 발현에 적절한 숙주 세포의 비제한적 예시로는, 대장균 균주, 슈도모나스 균주, 바실루스 균주, 스트렙토마이세스 균주, 효모 등의 진균류, 및 CHO, Rl.l, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (예컨대, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 및 BMT10), 곤충 세포 (예컨대, Sf9)와 인간 세포 등의 동물세포, 및 조직 배양물의 식물 세포와 같은 공지의 진핵 숙주 및 원핵 숙주를 포함한다. 상기 발현 숙주는 임의의 공지된 발현 숙주 세포일 수 있지만, 바람직한 구현예에서 상기 발현 숙주는 대장균 균주 중 하나이다. 이들은 상업적으로 이용 가능한 Top10 (Thermo Fisher Scientific), DH5a (Thermo Fisher Scientific), XL1-Blue (Agilent Technologies), SCS110 (Stratagene), JM109 (Promega), LMG194 (ATCC) 및 BL21 (Thermo Fisher Scientific)과 같은 대장균 균주를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 대장균을 숙주 시스템으로 사용하는 데는, 즉 최적의 환경 조건에서 배가 배의 시간이 약 20 분인 빠른 성장 속도 (Sezonov et al., J. Bacteriol . 189 8746-8749 (2007)), 쉬운 고밀도 배양의 달성, 외인성 DNA로 쉽고 빠른 변형 등의 몇 가지 이점이 있다. 플라스미드 선택뿐만 아니라 균주 선택을 비롯한 대장균에서의 단백질 발현에 관한 세부 사항은 문헌 Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbiol ., 5: 172 (2014)에 기재되어 있다.
라이신 폴리펩티드 및 그의 벡터의 효율적인 발현은 (전사 수준 및 번역 수준 모두에서의) 최적의 발현 신호, 정확한 단백질 접힘 및 세포 성장 특성 등의 다양한 요인에 의존한다. 벡터의 제조 방법 및 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질 도입시키는 방법과 관련하여, 해당 분야에 공지된 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 모든 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주가 본 발명의 라이신 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하는 데 동등하게 기능하는 것은 아니지만, 통상의 기술자는 적절한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 원하는 발현을 달성하기 위한 과도한 실험 없이 선택할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명자들은 발현 수준과 발현된 폴리펩티드의 작용 간의 상관 관계를 발견하였으며, 특히 대장균 발현 시스템에서 중간 수준의 발현 (예컨대, 약 1 내지 10mg/리터 사이)으로 생성된 라이신 폴리펩티드는 대장균에서 더 높은 수준으로 발현 (예컨대, 약 20 내지 약 100mg/리터 사이)된 라이신 폴리펩티드보다 작용 수준이 더 높았고, 어떤 경우 후자는 완전 불활성인 폴리펩티드를 생성하였다.
본 발명의 라이신 폴리펩티드는 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피는 역시 라이신 폴리펩티드 정제에 사용될 수 있다.
또는, 본 발명의 라이신 폴리펩티드 생산에 사용되는 벡터 시스템은 무세포 발현 시스템일 수 있다. 다양한 무세포 발현 시스템이 상업적으로 이용 가능하며, Promega, LifeTechnologies, Clonetech 등으로부터 이용 가능한 것들이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 언급한 바와 같이, 단백질 생산 및 정제에 관한 한, 다양한 선택이 있다. 이하, 본 발명자들은 비제한적인 예시를 통해 본 발명의 라이신 폴리펩티드를 대장균에서 생산하는 데 사용될 수 있는 일반적인 프로토콜을 포함시켰다. 단백질 생산 및 정제에서 고려되어야 할 적절한 방법 및 전략의 예시로는 문헌 Structural Genomics Consortium, Nat Methods., 5(2): 135 -146 ( 2008)에서 더 제공된다.
예시적 프로토콜:
1. 라이신 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 전체 유전자 합성에 의해 생성된다.
2. DNA 단편을 (아라비노스로 유도할 수 있는) pBAD24 등의 바람직한 유도성 벡터에 결찰시키고, 대장균 세포 (예컨대, Invitrogen, Carlsbad, CA의 TOP10)로 형질 전환시킨다.
3. 형질 전환된 세균을 Lysogeny 브로스 (LB), 벡터 유도제 (예컨대, 0.2% 아라비노스) 및 선별 마커 (예컨대, 50 μg/ml 카르베니실린) 등의 브로스가 첨가된 한천 플레이트에 뿌리고 바람직하게는 37℃에서 밤새 배양한다.
4. 라이신 플라스미드를 함유하는 대장균 Top10 세포의 단일 밀폐 배양물을 선별 마커가 첨가된 브로스 (예컨대, 50 ㎍/ml 카르베니실린이 첨가된 LB)에서 바람직하게는 37℃에서 밤새 배양한다. 이어서 상기 배양물을 선별 마커가 첨가된 새 배지 (예컨대, 카르베니실린이 첨가된 LB)에서 예컨대 1:200으로 희석시키고, 예컨대 3 시간 동안 추가로 배양할 수 있다. 유도제 (예컨대, 0.2% L-아라비노스)의 첨가로 라이신 발현이 유도되고, 상기 세포를 바람직하게는 30℃에서 밤새 배양한다.
5. 세포 펠렛을 완충액 (예컨대, 20 mM Tris, pH 6.8)에서 재현탁시키고 균질화한다.
6. 단백질 가용화 및 정제 (한 가지 이상의 크로마토그래피 기술을 사용)는 1가 염의 적절한 이온 강도, 예컨대, 300 내지 500 mM NaCl에 상응하는 이온 강도를 함유하는 잘 완충된 용액에서 수행된다.
7. 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)가 바람직하게는 초기 정제 단계에서 사용된다. 추가적인 정제가 필요한 경우, 크기 배제 크로마토그래피 (겔 여과)가 추가 단계에서 사용될 수 있다. 필요한 경우, 이온 교환 크로마토그래피가 최종 단계에서 사용될 수 있다.
라이신 폴리펩티드의 동정
본 발명은 대수기 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대해 강력한 항균 작용이 있는 5 가지 라이신의 동정을 기반으로 한다 (실시예 1 및 2). 본 발명의 라이신 폴리펩티드를 동정하기 위해, 본 발명자들은 항균 스크린과 결합된 생물정보학 기반의 접근법을 사용하였다. 이와 같이 동정된 서열 중 일부는 이전에 추정 엔돌리신으로 주석이 달렸다. 그러나, 본 발명자들은 이들 중 상당 부분 (80 개 이상의 폴리펩티드를 스크리닝)이 라이신 작용을 하지 않거나 또는 표적 유기체인 슈도모나스 애루지노사에 대해 불활성이라는 것을 발견하였다. 활성인 것으로 동정된 5 가지의 라이신은 GN37 (서열 번호 1), GN2 (서열 번호 2), GN4 (서열 번호 3), GN14 (서열 번호 4) 및 GN43 (서열 번호 5)로 지정되었다. 처음에, 본 발명자들은 슈도모나스 애루지노사의 외막 (OM)을 투과성으로 만드는 정제된 라이신 (합성되고, 발현 벡터 pBAD26으로 클로닝된 후 정제됨)의 능력을 평가하였다 (실시예 1).
대부분의 그람 음성균은 소수성 화합물을 배제하고 1-N-페닐나프틸아민 (NPN), 크리스털 바이올렛 또는 8-아닐리노-1-나프탈렌설폰산 (ANS) 등의 소수성 제제의 흡수를 허용하지 않는다. 소수성 화합물에 대한 강한 내성은 외막 (OM)을 펩티도글리칸에 고정시키고 안정하게 유지시키는 관련 단백질이 함유된 OM의 존재에 기인한다. 이 소수성 성질로 인해, NPN은 소수성 조건에서 강하게 형광을 나타내고 수성 조건에서는 약하게 형광을 나타낸다 (J Sokatch, The biology of pseudomonas, December 2012, Elsevier). 따라서, NPN 형광 발광은 외막 투과성을 측정하는 데 사용될 수다.
본 발명의 설명에서, 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1의 OM을 투과성으로 만드는 많은 라이신 (GN1, GN2, GN4, GN8, GN14, GN20, GN22, GN26, GN27, GN28, GN30, GN37 및 GN43)의 능력은 상기 언급된 라이신의 존재하에서, 또는 부재하에서 NPN을 PAO1 세포와 함께 배양함으로써 시험되었다. 도 3에 나타난 바와 같이, GN37 (서열 번호 1), GN2 (서열 번호 2), GN4 (서열 번호 3), GN14 (서열 번호 4) 및 GN43 (서열 번호 5)의 존재 하에서의 NPN 배양은 라이신의 부재하에서 방출된 형광 (음성 대조군)에 비해 가장 높은 형광 발광을 유도하였다. 게다가, 5 가지 라이신 (GN2, GN4, GN14, GN37 및 GN43) 각각은, 확립된 투과성 제제인 EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세테이트)에 의한 것보다 훨씬 더 큰 OM 투과성을 유도하였다. 또한, 5 가지 라이신 각각은 슈도모나스 애루지노사, 폴리믹신 B (PMB)를 치료하는 데 사용되는 최후의 수단으로 알려진 항생제와 비슷하거나 더 나은 수준으로 OM을 투과성으로 만들었다. 본 발명의 활성 라이신은 일반적으로 GN14의 경우 15 개 아미노산 잔기와 GN43의 경우 33 개 아미노산 잔기 사이에서 크기가 다양한 C-말단 (N-말단이 있는 GN14 제외) 알파 나선형 양친매성 도메인을 가진다. 알파 나선형 양친매성 도메인의 서열을 포함하는 GN2, GN4, GN14, GN37 및 GN43의 공통적인 특징은 표 3에 있다. 2차 폴리펩티드 구조는 http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/ 의 Jpred4와 같은 다양한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 특히 양친매성 알파 나선은 Helical Wheel (http://kael.net/helical.htm)을 사용하여 검토되었다. GN37 (서열 번호 11), GN2 (서열 번호 12), GN4 (서열 번호 13), GN14 (서열 번호 14) 및 GN43 (서열 번호 15)의 핵산 서열 역시 제공되었다 (도 1a 및 도 2).
표 3. 라이신 폴리펩티드 각각의 일반적인 특징 및 이에 상응하는 C-말단 알파 나선형 양친매성 도메인의 서열 (굵게 밑줄친 부분은 알파 나선형 양친매성 도메인을 나타낸다).
GN2
Figure pct00001
가설 단백질 GOS_817346 [해양 메타게놈]
Figure pct00002
GenBank: EDG23390.1
Figure pct00003
147 개 아미노산, 16,700 Da, pI 6.16
Figure pct00004
그람 음성 파지 라이신의 범위와 50-75 % 동일

MKISLEGLSLIKKFEGCKLEAYKCSAGVWTIGYGHTAGVKEGDVCTQEEAEKLLRGDIFKFEEYVQDSVKVDLDQSQFDALVAWTFNLGPGNLRSSTMLKKLNNGEYESVPFEMRRWNKAGG KTLDGLIRRRQAESLLFESKEWH QV
GN4
Figure pct00005
추정 엔돌리신 [슈도모나스 파지 PAJU2]
Figure pct00006
NCBI 참조 서열: YP_002284361.1
Figure pct00007
144 개 아미노산, 16,199 Da, pI 9.58
Figure pct00008
슈도모나스 애루지노사 파지 리소자임 및 뮤라미다제의 범위와 90% 이상 동일

MRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLKLLNKGDYQGAADQFP RWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFL EPLS
GN14
Figure pct00009
추정 엔돌리신 [슈도모나스 파지 Lu11]
Figure pct00010
NCBI 참조 서열: YP_006382555.1
Figure pct00011
189 개 아미노산, 20,380 Da, pI 9.14
Figure pct00012
3 가지 슈도모나스 애루지노사 파지 라이신과만 97%이상 동일

MNNELPWVAEARKYIGLREDTSKTSHNPKLLAMLDRMGEFSNESRAWWHDDETPWCGLFVGYCLGV AGRYVVREWYRARAW EAPQLTKLDRPAYGALVTFTRSGGGHVGFIVGKDARGNLMVLGGNQSNAVSIAPFAVSRVTGYFWPSFWRNKTAVKSVPFEERYSLPLLKSNGELSTNEA
GN37
Figure pct00013
펩티다제 M15 [미카비브리오 애루지노사보루스]
Figure pct00014
NCBI 참조 서열: WP_014102102.1
Figure pct00015
126 개 아미노산, pI 9.69

MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEG LRSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRW DWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTF KDGPHFELDRSKYR
GN43
Figure pct00016
MULTISPECIES와 100% 동일: 펩티다제 M23 [슈도모나스]
Figure pct00017
NCBI 참조 서열: WP_003085274.1
Figure pct00018
439 개 아미노산, 48,311 da, pI 9.55

MKRTTLNLELESNTDRLLQEKDDLLPQSVTNSSDEGTPFAQVEGASDDNTAEQDSDKPGASVADADTKPVDPEWKTITVASGDTLSTVFTKAGLSTSAMHDMLTSSKDAKRFTHLKVGQEVKLKLDPKGELQALRVKQSELETIGLDKTDKGYSFKREKAQIDLHTAYAHGRITSSLFVAGRNAGLPYNLVTSLSNIFGYDIDFALDLREGDEFDVIYEQHKVNGKQVATGNILAARFVNRGKTYTAVRYTNKQGNTSYYRADGSSMRKAFIRTPVDFARISSRFSLGRRHPILNKIRAHKGVDYAAPIGTPIKATGDGKILEAGRKGGYGNAVVIQHGQRYRTIYGHMSRFAKGIRAGTSVKQGQIIGYVGMTGLATGPHLHYEFQINGRHVDPLSAKLPMADPL GGADRKRFMAQTQPMIARMDQEKKTLLALNKQR
GN2, GN4, GN14, GN37 및 GN43이 강력한 막 투과 활성을 나타내기 때문에, 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대한 5 가지 라이신 각각의 항균 작용이 평가되었다 (실시예 2). 양성 대조군으로 EDTA와 PMB를 사용하는 것 외에, 인간 리소자임과 노보비오신도 포함되었다. 인간 리소자임 (HuLYS)은 폐 감염의 병태생리학에 관여하는 다양한 조직, 세포 및 분비물에서 발견되는 자연 발생 항균 펩티드이다 (Callewaert et al. J. Biosci. 35:127-160 (2010)). 세균의 세포벽에서 펩티도글리칸을 분해함으로써, 그람 양성균 및 슈도모나스 애루지노사를 비롯한 그람 음성균 모두에 대해 효율적이라는 것이 밝혀졌다. 노보비오신 (알바마이신, 카타마이신, 스페로마이신)은 스트렙토마이세스 니베우스 (Streptomyces niveus)로부터 단리된 아미노쿠마린 항생제이다. 이는 그람 양성균에 대해 주로 활성이지만, 특정 그람 음성 균주들도 감수성이 있다 (Lindsey Grayson, Kucers' The Use of Antibiotics: A Clinical Review of Antibacterial, Antifungal and Antiviral Drugs, CRC Press 6th Edition, 2010).
도 4에 도시된 바와 같이, 5 가지 라이신 (GN2, GN4, GN14, GN37 및 GN43) 모두는 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대하여 HuLYS 또는 노보비오신 단독보다 더 큰 항균 작용을 나타냈지만, GN4, GN14 및 GN37은 EDTA 및 PMB와 동등한 항균 작용을 나타냈다.
GN37은 종전에 항-슈도모나스 PGH 작용의 공급원으로서 사용되지 않은 슈도모나스 애루지노사의 포식 세균인 미카비브리오 애루지노사보루스 (Micavibrio aeruginosavorus)로부터 유래되었다. 살아 있는 미카비브리오 애루지노사보루스의 용도는 MDR 슈도모나스 애루지노사를 조절하기 위한 생물학적 기반의 제제로서 제안되었다 (Dashiff et al. J Appl., 110(2):431-44 (2011)). 그러나, 본 발명자들의 지식에 의하면, 이 유기체를 개개의 항균 단백질, PGH, 박테리오신, 항생제 등의 공급원으로서 사용한다는 보고는 없었다. 본 발명자들은 슈도모나스 애루지노사의 표면에 부착하여 내부로부터 영양분을 추출하는 외생적 포식 세균이 외막 및 세포벽을 관통하기 위해 항-슈도모나스 PGH 작용을 코딩해야 한다고 판단하였다. 이에 기반하여, 미카비브리오 애루지노사보루스 균주 ARL-13의 게놈 서열을 PGH 유사 효소로 주석이 달린 유전자에 대해 조사하였다. 5 가지 가수 분해 효소를 동정하여 복제하고 항-슈도모나스 작용을 스크리닝하였다. 현재 GN37으로 지정된 유전자 자리는 한천 오버레이 플레이트에서 클리어링 존 (halo)을 생성한 유일한 ORF이다. 따라서, GN37의 고유한 공급원 및 실시예 3에 기술된 강력한 작용 때문에, GN37가 더 자세하게 조사되었다. 실시예 3에 도시된 바와 같이, GN37을 다양한 공지의 라이신 또는 추정 라이신과 비교하는 다중 서열 정렬은 GN37이 미트레신 (Mitrecin) A와 단지 67% 동일하다는 것을 밝혀냈다 (Farris and Steinberg, Lett Appl Microbiol., 58(5):493-502 (2014); 및 특허 공보 US20140094401 A1). GN37과 달리, 미트레신 A는 그람 양성균 유기체 (즉, 스트렙토마이세스)의 게놈에서 동정되었다. 게다가, 미트레신 A에 대해 기술된 활성은 (대략 동등한 농도에서) GN37의 활성에 비해 매우 약하다. GN37 처리 후 단지 1 시간 만에 (예르시니아 슈도튜베르큘로시스에 대한) 세균 생존력이 >3-log 감소된 것에 비해, 미트레신 A는 16 시간의 배양 동안 세균 생존력을 <1-log 만 감소시켰다.
본 명세서에 개시된 전장 라이신 외에, 본 발명은 본 발명의 라이신의 C-말단 알파 나선형 양친매성 도메인에 기반한 펩티드 유도체를 제공한다. 이 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 C-말단 (및/또는 N-말단)의 점진적 절단 (아미노산 결실)은 활성 라이신 펩티드 단편을 최소 길이의 활성 라이신 펩티드로 생성할 수 있다. 이러한 펩티드는 알파 나선을 파괴하지 않는 방식으로, 절단된 C-(또는 N-) 말단에 한 가지 이상의 아미노산 (자연 발생 라이신의 아미노산 이외의 것)을 첨가함으로써 추가적으로 조작될 수 있다. C- 및 N-말단 알파 나선형 양친매성 도메인은 모두 생물정보학적 접근법을 사용하여 동정될 수 있다. 알파 나선을 파괴하지 않는 아미노산의 예시로는, 알파 나선 영역을 연장하거나 막 삽입을 촉진시키는 소수성 잔기 또는 하전된 잔기가 있다. 아미노산 첨가가 라이신 폴리펩티드 GN4를 사용하여 추가적으로 설명된다 (실시예 4, 도 5). 펩티드 FGN4-1 (서열 번호 7)과 FGN4-2 (서열 번호 8)는 각각 조작된 GN4 (서열 번호 3), PGN4 (서열 번호 6), FGN4-3 (서열 번호 9) 및 PGN4-4 (서열 번호 10)의 펩티드 조각인 반면 (도 5), 생존력 분석 결과 PGN4와 FGN4-3은 시험된 다른 GN4 펩티드보다 더 큰 항균 작용을 나타냈다 (도 6). PGN4-4는 39 개 아미노산 폴리펩티드이며, 31 개 아미노산 폴리펩티드 FGN4-2 및 B 형 간염 캡시드 (SQSRESQC)로부터 동정된 8 잔기의 항균 펩티드를 포함한다. 따라서, 도 6에서 볼 수 있듯이, SQSRESQC 펩티드의 첨가는 FGN4-2의 활성을 증진시킨다. 천연 단편 FGN4-1과 C-말단 시스테인 (FGN4-4)이 첨가된 FGN4-4의 비교를 통해, C-말단에 시스테인을 첨가하면 FGN4-1의 활성이 향상된다는 것을 알 수 있다. 상기 시스테인은 다이머화 및 증진 작용을 촉진하는지 여부를 확인하기 위해 첨가되었다. 그 결과는 말단 시스테인이 작용을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 추가적인 조작으로는 11 개의 C-말단 잔기가 제거된 FGN4-2가 있다. 이들 잔기는 알파 나선형 구조 (2차 단백질 구조의 고려 사항에 기반)에 필요하지 않으며, 본 발명자들은 활성이 유지되는지 여부를 조사하였다. 11 개 모든 잔기의 제거는 활성을 감소시켰지만 활성은 회복될 수 있었고 실제로 이 단락의 앞부분에서 설명한 바와 같이 다른 조작으로 개선될 수있었다. 전술한 바에 비추어, 통상의 기술자는 이 도메인의 C-말단 또는 N-말단 또는 양쪽 모두로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 점진적으로 결실된 라이신 폴리펩티드를 생성함으로써, 및 이러한 폴리펩티드를 단독으로 또는 슈도모나스 애루지노사 및/또는 다른 그람 음성균에 대한 활성 (즉, 억제, 개체군 감소 또는 사멸시킬 수 있는 능력)을 위해 그람 음성균에 대해 활성인 한 가지 이상의 항생제와 조합하여 시험함으로써 손상되지 않은 C-말단 알파 나선형 양친매성 도메인이 있는 절단된 라이신을 용이하게 생성할 수 있다. 이러한 시험은 예컨대 실시예 2, 3, 4 또는 예측예 1에 제공된 교시를 따를 수 있다. 물론, 상기 시험 절차 및 프로토콜 그 자체는 이들 실시예에서의 시험 절차 및 프로토콜로 한정되는 것은 아니지만, 통상의 기술자에게 공지된 항세균제와 진짜 항균제의 효율을 평가하는 임의의 방법일 수 있다.
인간 혈청에서의 항균 작용 분석을 위해, GN 라이신 폴리펩티드 및 GN 펩티드를 폴리믹신 B의 서브 MIC 농도의 존재 및 부재하에 각각 풀링하였다 (실시예 5, 도 7). PMB는 슈도모나스 애루지노사에 대해 활성이 있는 강력한 항생제이며, 1 ㎍/ml의 농도에서, 인간 혈청에서 1 시간 처리 후 생존력이 <2-log10 감소하였다. 상기 GN4 펩티드 풀 (25 ㎍/㎖에서 각각의 펩티드를 함유, 도 7에 "펩티드 풀"로 표시됨)만이 생존력 감소를 초래하지 않았으며 라이신 폴리펩티드 풀 (25 ㎍/㎖의 농도로 각각의 GN 라이신을 함유)만이 단지 생존력의 2-log10 감소를 초래하였다 (도 7). 그러나 PMB와 조합한 경우, 펩티드 풀과 라이신 풀 모두 생존력이 ≥4-log10 감소했다 (도 7). 이들 발견은 본 발명의 PMB와 GN 라이신 폴리펩티드의 조합의 강력한 부가적 효과 또는 심지어 상승 효과를 나타낸다. 또한 개별 라이신 폴리펩티드가 풀 대신에 개별적으로 사용되는 경우, 슈도모나스 애루지노사 등의 그람 음성균의 생존력을 상당히 감소시킬 것으로 예상된다. 도 7에 관하여 관찰된 것은 펩티드 풀만이 도 6으로부터 예측된 것 만큼 활성이 없다는 것이다. 이는 많은 항균제의 생물학적 작용이 인간 혈청 존재하에서 감소된다는 사실에 기인한다 (Zhanel et al., Antimicrob Agents Chemother. 42(9): 2427-2430 (1998)). 그러나 라이신 풀이 일단 PMB와 병용 투여되면, 혈청의 존재에도 불구하고 라이신 풀의 항균 작용이 회복된다 (도 7). 따라서, 인간 혈청의 존재하에서 라이신 풀 항균 작용의 감소는, PMB의 존재하에서 더 이상 저해하지 않는 펩티드 풀 내 펩티드 간의 길항 작용 때문일 수 있다. 또는, 인간 혈청에 존재하는 한 가지 이상의 단백질이 라이신 풀에 대하여 PMB의 첨가시 저해되는 길항 효과가 있을 수 있다. 상기 두 가지 가능한 시나리오는 개별적인 라이신 폴리펩티드를 사용하여 분석을 반복하고, PMB의 존재 또는 부재하 혈청에서 분석을 수행하고, 라이신 풀을 사용하여 얻은 결과와 상기 결과를 비교함으로써 구별될 수 있다. 또한, 혈청 내 라이신 풀 작용의 저해는 라이신과 외막 사이의 정전기적 상호 작용을 방해하는 높은 염 농도 때문일 수 있다.
본 발명의 GN 라이신 폴리펩티드는 전통적인 항생제, 백신 및 항독소 처리와는 다른 세균 활성이 있으며, 그람 음성균에 기인하는 감염을 퇴치하는 데 유용하다. 실시예에 기술된 바와 같이, 다른 처리와 달리 라이신은 MIC 이하의 정균 효과로 사용될 때 신속한 살균 작용을 제공하고, 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus), 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니애 (S. pneumoniae), 바실루스 안트라시스 (B. anthracis) 및 바실루스 세레우스 (B. cereus)를 비롯한 그람 양성균에 대한 특정 라이신을 사용하여 이전에 수득한 결과를 미러링하였을 때 다양한 항생제 내성 세균에 대해 활성이며, 진화하는 내성과 관련이 없다 (Fischetti, V. Curr Opin Microbiol., 11(5): 393-400 (2008)). 본 발명의 설명에 기반하여, 임상 환경에서, 라이신은 내약성 및 다중 내약성 세균으로부터 발생하는 감염을 치료하기 위한 강력한 대체제이다. 그람 음성균에 대한 기존의 내성 메커니즘은 라이신의 PGH 작용에 대한 감수성에 영향을 주지 않아야 한다.
본 발명의 라이신 폴리펩티드는 그람 음성 감염의 치료용으로 개발중인 기존의 PGH와 다르다. 종전에 기술된 아틸라이신은 외인성 유래의 양이온성 펩티드에 융합된 양으로 하전된 PGH로 구성된다 (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014); Briers et al., MBio . 4:e01379-14 (2014); 미국 특허 제8,846,865호). 또한, 상기 아틸라이신은 엔돌리신에서 유래되지 않은 다중 양이온성 펩티드를 사용한다. 이와 대조적으로, 본 발명의 라이신 폴리펩티드의 다중 양이온성 영역은 슈도모나스 애루지노사의 OM과 자연적으로 상호 작용하고 이를 불안정화시키는 라이신으로부터 유래되며, 이 병원균에 대한 표적화 효율이 개선될 것으로 예상되는 것이 특징이다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 단리되고 재조합에 의하여 생성된 라이신 폴리펩티드에 첨가된 펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드가 확실히 고려되고 있음에도 불구하고, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 항균 양이온성 펩티드를 첨가함으로써 조작될 필요가 없다. 그러나, 양이온성 또는 다른 항균성 (항세균성) 펩티드가 없는 경우에도, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 정균 작용 및 살균 작용을 비롯한 실질적인 항-그람 음성 항균 작용을 한다. 전술한 바에도 불구하고, 본 발명은 또한 미국 특허 출원 US2015/0118731 및 국제 특허 출원 WO 2014/0120074, WO 2015/070912, WO 2015/071436, WO 2015/070911, WO.2015/071437, WO/2012/085259, WO 2014/001572 및 WO 2013/0344055에 기술된 것과 같은 항균 펩티드 (AMP, 디펜신, 스시 펩티드, 양이온성 펩티드, 다중 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드, 소수성 펩티드) 스트레치에 융합된 천연 그람 음성 항균 기능이 있는 라이신 폴리펩티드를 포함하는 융합 라이신 폴리펩티드를 고려한다. 추가적인 살균성 분절을 함유하는 융합 폴리펩티드, 즉 융합 전에 자체적으로 살균 작용을 하거나 모체 라이신 폴리펩티드의 살균 작용에 분명히 기여하는 분절을 함유하는 융합 폴리펩티드 역시 고려된다.
약학 조성물 및 제제
본 발명의 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 태블릿, 알약, 펠렛, 캡슐, 액체 함유 캡슐, 분말, 지효성 제제, 좌약, 탐폰용 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 로젠지, 트로키제, 캔디, 주사제, 껌, 연고, 도말, 서방성 패치, 액체 흡수 와이프 및 이들의 조합된 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 형태의 투여는 국소적이거나, 즉 약학적 조성물이 그의 작용이 요구되는 곳에 직접 (예컨대 상처에 직접) 적용되거나, 또는 전신적일 수 있다. 결과적으로 전신 투여는, 물질이 소화관을 통해 제공되는 것인 장 투여 또는 경구 투여일 수 있고, 물질이 주사 또는 호흡 등 소화관 이외의 다른 경로를 통해 제공되는 것인 비경구 투여일 수 있다. 따라서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 경구, 비경구, 호흡, 국소, 직장, 비강, 버컬 또는 이식된 저장소를 통해, 또는 임의의 다른 공지된 방법에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 또한 지효성 투여 제형의 방식으로 투여될 수도 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 고체 또는 액체 제제, 예컨대 태블릿, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액 및 분산액으로 제형화될 수 있다. 상기 화합물은 예컨대 락토스, 수크로스, 옥수수 전분, 젤라틴, 감자 전분, 알긴산 및/또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
태블릿 및 알약과 같은 고체 조성물을 제조하기 위해서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드 또는 그의 단편은 약학 부형제와 혼합되어 고체 예비 제제 조성물을 형성한다. 원하는 경우, 태블릿은 표준 기술에 의해 슈가로 코팅되거나 장용성 코팅될 수 있다. 상기 태블릿 또는 알약은 코팅되거나, 연장된 작용 기간의 이점이 있는 제형을 제공하기 위해 혼합될 수 있다. 예를 들어, 상기 태블릿 또는 알약은 내부 투약 성분 및 외부 투약 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자에 대한 외피 형태이다. 두 구성 성분은 장층에 의해 구별될 수 있으며, 장층은 위장에서의 분해에 저항하고 내부 구성 성분이 그대로 십이지장으로 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 역할을 한다. 다양한 물질이 이러한 장층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질에는 다수의 폴리머 산, 및 폴리머 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물이 있다.
본 발명의 국소 조성물은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 피부학적으로 또는 귀(耳)적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체는 피부학적으로 허용 가능한 담체의 경우, 바람직하게는 피부, 손발톱, 점막, 조직 및/또는 모발과 상용성이며, 이러한 요건을 충족시키는 임의의 통상적으로 사용되는 피부학적 담체가 포함될 수 있다. 귀적으로 허용 가능한 담체의 경우, 상기 담체는 귀의 모든 부분과 상용성인 것이 바람직하다. 이러한 담체는 통상의 기술자가 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여용 담체는 미네랄 오일, 액체 석유, 백색 석유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 및/또는 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 피부 연고를 제조함에 있어서, 본 발명의 활성 성분은 유성 탄화수소 베이스, 무수 흡수 베이스, 유중수적형 흡수 베이스, 수중유적형 물 제거 가능 베이스 및/또는 수용성 베이스로 제형화될 수 있다. 귀 조성물을 제조함에 있어서, 본 발명의 활성 성분은 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리사카라이드겔, 겔라이트 (Gelrite®), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 중합체 및 아크릴산의 중합체 또는 공중합체 등의 카복시-함유 중합체뿐만 아니라 다른 중합체 완화제와 같은 담체를 포함하는 수성 중합체 현탁액으로 제형화될 수 있다. 본 발명 내용에 따른 국소 조성물은 수성, 수성-알콜성 또는 유성 용액, 로션 또는 혈청 분산액, 수성, 무수 또는 유성 겔, 수상에서 지방층을 분산시킴으로써 수득된 에멀젼 (OAV 또는 수중유적형) 또는, 반대로, (W/O 또는 유중수적형), 마이크로에멀젼 또는 대신에 마이크로캡슐, 미립자 또는 이온성 및/또는 비이온성 유형의 지질 소포 분산액, 크림, 로션, 겔, 거품 (일반적으로 가압 캐니스터, 적합한 애플리케이터, 유화제 및 불활성 추진제를 필요로 한다), 에센스, 밀크, 현탁액 또는 패치를 비롯하여, 국소 적용에 적절한 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 국소 조성물은 또한 친수성 또는 친유성 겔화제, 소수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 산화방지제, 용매, 향료, 충전제, 자외선 차단제, 악취 흡수제 및 염료 등의 보조제를 함유할 수 있다. 추가적인 구현예에서, 상기 국소 항균 조성물은 경피 패치, 드레싱, 패드, 랩, 매트릭스 및 붕대 등 대상의 피부 또는 다른 조직과 부착되거나 달리 결합될 수 있는 장치와 함께 투여될 수 있고, 본 발명에 따른 한 가지 이상의 항균 라이신 폴리펩티드의 치료적 유효량을 전달할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 국소 조성물은 국소 화상을 치료하는 데 사용되는 한 가지 이상의 성분을 추가로 포함한다. 이러한 성분은 전형적으로 프로필렌 글리콜하이드로겔, 글리콜, 셀룰로오스 유도체 및 수용성 알루미늄 염의 조합물, 방부제, 항생제, 및 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 습윤제 (고체 또는 액체 왁스 에스테르 등), 흡수 촉진제 (친수성 점토 또는 전분 등), 점도 형성제 및 피부 보호제도 또한 첨가될 수 있다. 국소 제제는 구강 세정제와 같은 린스 형태일 수 있다. 예컨대, WO2004/004650을 참조하라.
본 발명의 화합물은 또한 적절한 양의 라이신 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 치료제를 주사함으로써 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 라이신 폴리펩티드는 그람 음성균에 의한 감염, 더 구체적으로는 슈도모나스 애루지노사에 기인하는 감염을 치료하기 위해 근육내, 경막내, 경피내, 피하 또는 정맥내 투여될 수 있다. 상기 담체는 증류수, 식염수, 알부민, 혈청 또는 이들의 임의의 조합물로 이루어질 수 있다. 또한, 비경구 주사제의 약학 조성물은 pH 완충 용액, 보조제 (예컨대, 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제), 리포솜 제제, 나노 입자, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼뿐만 아니라 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말 중 한 가지 이상에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 라이신 폴리펩티드의 수성 또는 비수성 용액을 포함할 수 있다.
비경구 주사의 투여 방식이 선택된 경우, 등장성 제제가 사용되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 등장성 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 일부의 경우, 인산 완충 식염수 등의 등장성 용액이 바람직하다. 안정제에는 젤라틴과 알부민이 포함될 수 있다. 혈관 수축 제제는 상기 제제에 첨가될 수 있다. 이러한 적용 유형에 따른 약학 제제는 무균이며 발열원이 없다.
희석제는 한 가지 이상의 다른 부형제, 예컨대 에탄올, 프로필렌 글리콜, 오일 또는 약학적으로 허용 가능한 유화제 또는 계면 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 호흡식 조성물이다. 본 발명의 호흡식 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 건조된, 호흡식 분말로 유리하게 제형화된다. 구체적인 구현예에서, 라이신 폴리펩티드 흡입 용액은 에어로졸 전달용 추진제와 함께 추가로 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다.
계면 활성제는 의약과 추진제 사이의 표면 장력 및 계면 장력을 낮추기 위해 본 발명의 호흡식 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 상기 의약, 추진제 및 부형제가 현탁액을 형성하는 경우, 계면 활성제는 필요할 수도 있고 필요하지 않을 수도 있다. 상기 의약, 추진제 및 부형제가 용액을 형성하는 경우, 계면 활성제는 특정 의약 및 부형제의 용해도에 따라 부분적으로 필요할 수도 있고 필요하지 않을 수도 있다. 상기 계면 활성제는 의약과 비반응성이고 의약, 부형제 및 추진제 사이의 표면 장력을 실질적으로 감소시키고/감소시키거나 밸브 윤활제로서 작용하는 임의의 적절한, 무독성 화합물일 수 있다.
적절한 계면 활성제의 예시로는, 올레산, 소르비탄 트리올레이트, 세틸 피리디늄 클로라이드, 콩 레시틴, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌(10) 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에틸렌 디아민 블록 공중합체, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체, 피마자유 에톡실레이트 및 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
적절한 추진제의 예시로는, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 및 이산화탄소가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
호흡식 조성물로 사용하기에 적절한 부형제의 예시로는, 락토스, 전분, 중간 사슬 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 중간 사슬 지방산, 짧은 사슬 또는 긴 사슬, 또는 이들의 임의의 조합의 트리글리세리드 에스테르, 과플루오로디메틸시클로부탄, 과플루오로시클로부탄, 폴리에틸렌 글리콜, 멘톨, 라우로글리콜, 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르, 중간 사슬 지방산의 폴리글리콜화 글리세리드, 알코올, 유칼립투스 오일, 짧은 사슬 지방산 및 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비강 적용을 포함한다. 비강 적용에는 예컨대, 비강 스프레이, 점비액, 비강 연고, 비강 세척제, 비강 주사제, 비강 패킹, 기관지 스프레이 및 흡입기를 포함하고, 또는 인후 로젠지, 구강 세정제 또는 가글을 사용함으로써, 또는 콧구멍이나 얼굴에 도포된 연고를 사용함으로써, 또는 이들과 유사한 적용 방법의 조합을 통해 간접적으로 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 한 가지 이상의 항균제 및/또는 한 가지 이상의 통상적인 항생제를 포함하는 보완제를 함유한다. 감염의 치료를 촉진시키거나 항균 효과를 증진시키기 위해, 본 발명의 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드를 함유하는 치료제는 상기 라이신 폴리펩티드의 살균 작용 역시 강화시킬 수 있는 한 가지 이상의 보완제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보완제는 그람 음성균을 처리하는 데 사용되는 한 가지 이상의 항생제일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 보완제는 슈도모나스 애루지노사에 기인하는 감염의 치료에 사용되는 항생제 또는 항균제이다.
대상에 대한 투여량 및 투여 빈도
본 발명의 조성물은 단위 투여 제형으로 주어질 수 있으며, 해당 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 단일 투여 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 숙주, 상기 수용자가 감염성 세균에 노출된 기간, 상기 대상의 크기 및 무게 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 가져오는 각 화합물의 양일 것이다. 일반적으로 100% 중에서, 총량은 활성 성분의 약 1% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 5% 내지 약70 %, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30 %의 범위일 것이다
투여되는 투여량은 치료되는 감염의 활성, 치료받는 환자의 연령, 건강 및 일반적인 신체 상태, 특정 라이신 폴리펩티드의 작용, 본 발명 내용에 따른 라이신 폴리펩티드가 쌍을 이루는 항생제의 성질 및 활성 및 이러한 쌍의 조합된 효과를 포함하는 다수의 요인에 좌우된다. 일반적으로, 본 라이신 폴리펩티드의 투여될 유효량은 14 일까지의 기간 동안 매일 1 내지 4회 투여되는 1-50 mg/kg의 범위에 속할 것으로 예상된다. 항생제도 사용되는 경우, 상기 항생제는 표준 투여 요법으로 또는 저용량으로 투여될 것이다. 그러나 이러한 모든 투여량과 요법은 (상기 라이신 폴리펩티드이든 그와 함께 투여되는 임의의 항생제이든 관계 없이) 최적화의 대상이 된다. 최적 투여량은 해당 분야의 기술 범위 내에서 시험관 내 및 생체 내 예비 효능 실험을 수행함으로써 결정될 수 있지만, 본 발명의 설명을 고려한다.
일부 구현예에서, 활성 라이신 폴리펩티드 단위에 노출되는 시간은 ml 당 활성 라이신 폴리펩티드 단위의 원하는 농도에 영향을 미칠 수 있다. "장기" 또는 "저속" 방출 담체 (예컨대, 특정 비강 스프레이 또는 로젠지 등)로 분류되는 담체는 ml 당 저농도의 라이신 폴리펩티드 단위를 보유하거나 제공할 수 있는 반면, "단기" 또는 "고속" 방출 담체 (예컨대, 가글 등)로 분류되는 담체는 짧은 기간 동안 ml 당 고농도의 라이신 폴리펩티드 단위를 보유하거나 제공할 수 있다. 더 높은 단위/ml 투여량 또는 더 낮은 단위/ml 투여량이 필요할 수 있는 상황도 존재한다.
본 발명의 임의의 라이신 폴리펩티드의 경우, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 분석에서, 또는 동물 모델, 일반적으로 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 추정될 수 있다. 상기 동물 모델은 바람직한 투여의 농도 범위 및 투여 경로를 얻기 위해서도 사용될 수 있다. 입수된 정보는 유효량뿐만 아니라, 인간에서의 투여 경로를 결정하는 데에도 사용될 수 있다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 성분을 제공하거나 원하는 효과를 유지하기 위해 추가로 조정될 수 있다. 고려될 수 있는 추가적인 요소에는 질병 상태의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별, 식이 요법, 원하는 치료 기간, 투여 방법, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합, 반응 민감도, 치료에 대한 내성/반응 및 치료 의사의 판단이 있다.
치료 요법은 일일 투여 (예컨대, 매일 1회, 2회, 3회 등), 격일 투여 (예컨대, 격일 1회, 2회, 3회 등), 주 2회 투여, 주 1회 투여, 격주 1회 투여, 월 1회 투여 등을 수반할 수 있다. 한 구현예에서, 치료는 지속주입법으로 투여될 수 있다. 단위 투여량은 여러 번 투여될 수 있다. 또한 임상 증상을 모니터링함으로써 나타난 바에 따라 투여 간격 역시 불규칙할 수 있다. 대신에, 상기 단위 투여량은 지효성 제제로 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량과 투여 빈도는 환자에 따라 다를 수 있다. 통상의 기술자는 이러한 가이드라인이 국소 투여, 예컨대 비강내, 호흡, 직장 등을 통한 투여, 또는 전신 투여, 예컨대 구강, 직장 (관장 등을 통해), i.m. (근육내), i.p. (복막내), i.v. (정맥내), s.c. (피하), 경요도 등을 통한 투여를 위해 조정될 것이라는 사실을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1
그람 음성 라이신의 동정
그람 음성균을 사멸시키는데 사용될 수 있는 추정 PGH 후보는 생물정보학 검색 프로토콜을 사용하여 동정되었다. 먼저, 본 발명자들은 "아미다제", "리소자임", "글루코사미니다제", "엔도펩티다제", "펩티도글리칸 가수 분해 효소", “용해성 트랜스글리코실라제”, “엔돌리신”, “라이신” 및 “세포벽 가수 분해 효소”를 비롯한 박테리오파지 라이신 검색 용어로 스크리닝된 주석이 달린 게놈 서열로부터 수득한 슈도모나스 애루지노사 PGH의 선발 후보자 명단을 생성하였다. 이 방법으로 동정된 PGH는 BLASTP 분석에 의해 GenBank (슈도모나스 애루지노사 그룹; Taxid: 136841)의 모든 슈도모나스 애루지노사 게놈 서열 및 미카비브리오 애루지노사보루스 균주 ARL-13의 게놈 서열을 검색하여 더 큰 추정 PGH의 그룹을 생성하기 위하여 사용되었다. 46 개 PGH로 구성된 이 그룹의 하위 집합은 이후 추가적인 연구를 위해 선택되었다 - 여기에 포함시키는 기준은 서열 보존과 관련하여 다양했으며, 다양한 추정 촉매/세포벽 결합 작용이 있는 매우 보전된 효소 및 저조하게 보존된 효소 모두를 포함하였다. 46 개의 PGH는 합성되고, 세균 발현 벡터 pBAD24에 클로닝되고 (Guzman et al., J Bacteriol . (14):4121-30 (1995)), 대장균 균주 Top10 (Life Technologies)으로 형질 전환되었다. 활성을 평가하기 위하여, 플레이트 기반 분석법을 사용하여 모든 대장균 클론 (벡터 대조군 포함)의 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대한 용균 작용을 스크리닝하였다. 이어서, 전술한 방식으로 액체 LB 배양물에서 가용성 단백질의 유도와 관련하여 양성 클론을 추가로 분석하였다 (Schuch et al., Nature, 418 (6900):884-9, (2002)). 용해성 및 활성 라이신의 경우, 유도된 배양물의 미가공 대장균 추출물을 소수성 형광 프로브 1-N-페닐나프틸아민 (NPN)을 사용하여 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1의 투과성을 유도하는 능력에 대해 조사하였다. 상기 NPN 분석은 세균 외막을 파괴하는 화합물을 스크리닝하는 표준 방법이다 (Helander and Mattila-Sandholm, J Appl Microbiol., 88(2):213-9. (2000)). 이 스크리닝 접근법은 슈도모나스 애루지노사 균주 및 다른 그람 음성균 (미카비브리오 애루지노사보루스 등)의 게놈뿐만 아니라 해양 메타지노믹스를 사용하여 동정된 게놈에서 5 가지의 후보 PGH (N- 및 C-말단 알파 나선형 도메인 포함)를 궁극적으로 생성하였다. 이후 페넴 항생제에 내성인 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 대한 생성된 단백질의 항균 작용을 시험하였다 (Okamoto et al. Antimicrob Agents Chemother. 45(7):1964-71 (2001)).
정제된 라이신의 활성을 평가하기 위하여, 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1에 의한 소수성 형광 프로브 1-N-페닐나프틸아민 (NPN)의 섭취를 조사하였다. 그람 음성균의 외막은 라이신과 NPN을 비롯한 소수성 화합물에 대한 투과성 장벽으로 작용하기 때문에, GN의 투과 활성은 소수성 화합물이 내부 표적에 도달할 수 있는 능력에 의해 평가될 수 있고, 평가되었다. 따라서, NPN은 일반적으로 외막에 의해 차단되지만, 그것은 외막 지질 이중층으로 분할할 때 눈에 띄는 형광 강도를 나타낸다.
슈도모나스 애루지노사 PAO1은 미국 균주 은행 (American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 수득하였다. 세균을 37℃및 250rpm의 항온 진탕기에서 LB 배지 (Sigma-Aldrich)에서 105 CFU/ml의 초기 농도로 배양하였다. 슈도모나스 애루지노사 배양물은 10 μg/ml의 농도로 각 후보 라이신 (GNs)이 첨가되어 대수기 (A550 ~ 0.3)의 초기까지 성장하였다. NPN의 섭취를 측정하기 위하여, 10 μM NPN을 PBS 중의 GN1, GN2, GN4, GN8, GN14, GN20, GN22, GN26, GN27, GN28, GN30, GN37 및 GN43을 함유하는 대수기 성장 세포에 첨가하고, 형광분광광도계로 1 시간에 420 nm에서 형광 발광을 모니터링하였다 (도 3). 항생제 폴리믹신 B (5 μg/ml) 및 EDTA (1 mM)가 양성 대조군으로 사용된 한편, NPN으로 처리되었지만 라이신이 첨가되지 않은 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 강한 형광 신호가 슈도모나스 애루지노사 세포가 NPN (회색 바)의 존재하에서 GN2 (서열 번호 2), GN4 (서열 번호 3), GN14 (서열 번호 4), GN37 (서열 번호 1) 또는 GN43 (서열 번호 5)로 처리되었을 때 관찰되었다. 각 라이신의 일반적인 특징은 표 4에 나와있다.
총체적으로, 이들 결과는 그람 양성균의 OM을 투과시키는 능력을 나타내는 GN 라이신 그룹을 동정하여, 이종 펩티드 분절의 첨가에 의지할 필요 없이 그람 음성균에 대해 활성인 라이신을 동정하는 첫 단계를 확립하였다.
표 4. G2, GN4, GN14, GN37 및 GN43의 일반적인 특징
Figure pct00019
실시예 2
GN 라이신은 그람 음성균에 대하여 강한 항균 작용을 나타낸다
정제된 라이신의 항균 작용을 평가하기 위하여, 개별 GN 라이신과의 배양 후 살아 있는 슈도모나스 애루지노사 균주 PAO1의 생존력을 평가하였다. 간략하게, 106 PAO1 세포를 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) 완충액의 존재하에서 1 시간 동안 (37℃교반 없이) 25 μg/ml의 농도로 표시된 GN 라이신으로 처리하였다. 대조군으로 폴리믹신 B (PMB, 25 μg/ml), 노보비오신 (Nov, 5 μg/ml), EDTA (1 mM) 및 인간 리소자임 (HuLYZ, 25 μg/ml)을 사용하였다. 검출 임계값은 2.0 Log10 CFU/ml 이었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 각 GN 라이신은 HuLYZ 또는 노보비오신보다 더 큰 항균 작용을 나타냈지만, GN4 (서열 번호 3), GN14 (서열 번호 4) 및 GN37 (서열 번호 1)은 각각 EDTA 및 PMB에 비해 강하거나 동등한 항균 작용을 나타냈다.
본 실험은 GN이 그람 음성균에 대한 통상적인 항생제, 인간 리소자임 또는 킬레이트화제 EDTA 중 어느 것보다도 동등하거나 더 큰 항균 작용을 나타낼 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3
GN37은 매우 효율적인 그람 음성 항균제이다
GN37 라이신은 미카비브리오 애루지노사보루스의 381-bp MICA_542 좌위에 의해 코딩되는 126 개 아미노산 폴리펩티드이다 (도 1a). 미카비브리오 애루지노사보루스는 슈도모나스 애루지노사의 포식자이며, 종전에는 항-슈도모나스 PGH 작용의 공급원으로 이용되지 않았다. 상기 GN37 라이신은 예상되는 pI가 9.69인 양으로 높게 하전된 단백질이다. 또한, GN37은 DD- 및 DL-카복시펩티다제 활성이 있는 PGH의 펩티다제_M15_4 계열의 구성원이다 (VanY 슈퍼패밀리의 구성원을 포함한다) (도 1b). BLASTP 분석에 기반하여, GN37 (서열 번호 1)은 50 가지 이상의 상이한 그람 음성균 종 및 1 가지 그람 양성균 종의 단백질과 ≤67% 동일하다. GN37과 그람 양성 동족체 (스트렙토마이세스 유래, GenBank 서열 AGJ50592.1) 및 대장균 (WP_001117823.1 및 NP_543082.1), 예르시니아 종 (CAJ28446.1) 및 아니세토박터 바우마니 (WP_034684053.1)를 비롯한 그람 음성 병원균의 단백질을 비교한 다중 서열 정렬도 도 1c에 나와있다. 중요하게도, 공용 데이터베이스에는 GN37과 >67% 동일한 서열은 존재하지 않는다.
실시예 4
GN4의 펩티드 유도체는 강력한 항균 작용을 나타낸다
전장 라이신 이외에도, GN4의 5 가지 펩티드 유도체 (알파- 기반 나선형 C-말단 단편에 상응한다)도 생성되어 조사되었다 (도 5). 제1 펩티드 (FGN4-1, (서열 번호 7))는 42 개 아미노산 C-말단 알파 나선형 도메인에 상응한다. 이는 상기 영역이 GN4의 C-말단 알파 나선형 양친매성 도메인을 생성하기에 충분하다는 단백질 2차 구조 예측을 고려하여 도달되었다 (또는 C-말단의 맨 끝의 점진적인 절단 및 매번 작용에 대한 효과를 시험함으로써 도달될 수 있다). 추가적인 조작에 대한 근거는 본 명세서의 다른 부분에서 설명하였다.
단일 C-말단 시스테인은 FGN4-4 (서열 번호 10)를 생성시키기 위해 FGN4-1 (서열 번호 7)에 첨가되었다. 3 가지 첨가 펩티드의 경우, FGN4-1의 11 개 C-말단 잔기가 제거되거나 (FGN4-2, (서열 번호 8)), 제거되어 단일 리신 (K) 잔기 (FGN4-3, (서열 번호 9)) 또는 B 형 간염 캡시드 (PGN4, (서열 번호 6))로부터 동정된 8 잔기의 항균 펩티드로 대체되었다. 상기 B 형 간염 펩티드는 SQSRESQC이고 면역 에피토프 데이터베이스 (Immune Epitope Database)의 에피토프 ID 번호 96916을 가진다. 상기 GN4-유래 펩티드 각각의 항균 작용은 살해능 분석으로 조사되었으며 (도 6), 105 PAO1 세포를 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) 완충액의 존재하에서 1 시간 동안 (37℃교반 없이) 10 μg/ml의 농도로 표시된 펩티드 유도체로 처리하였다. 검출 임계값은 2.0 Log10 CFU/ml 이었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 시험된 펩티드 각각은 일부 항균 작용을 나타냈고 (음성 대조군으로 사용된 완충액에 비해), 반면 FGN4-1 및 FGN4-4는 세포 생존력이 ≥4 log 감소된 우수한 작용을 나타냈다.
실시예 5
GN 라이신 및 GN 펩티드는 강력한 항균성을 보인다
GN 라이신 및 GN 펩티드의 항균성은 인간 혈성에서 다음으로 평가되었다. 슈도모나스 애루지노사 세포를 인간 혈성에서 37℃에서 1 시간 동안, 교반 없이 배양하였고, PAO1의 대수기에 대한 상기 작용을 조사하였다. GN 라이신 및 GN 펩티드 (25 μg/ml)는 폴리믹신 B (PMB) (1 μg/ml)의 서브 MIC 농도의 존재 및 부재하에서 각각 풀링되었다. 검출 임계값은 2.0 log10 CFU/ml 이었다. 도 7에 나타난 바와 같이, GN 라이신 풀만이 폴리믹신 B에 의해 나타난 항균성과 유사한 항균성을 나타냈다. 또한, PMB와 조합된 경우, 펩티드 풀과 라이신 풀 모두 생존력의 ≥4-log10 감소를 초래하였다.
총체적으로, 이들 발견은 PMB와 라이신 폴리펩티드 (GNs) 또는 인간 혈청 내의 라이신 펩티드 사이에 강한 부가적 또는 상승 작용을 나타낸다. 선행 연구가 결합된 라이신 혼합물의 개별 성분의 강한 항균 작용을 입증했기 때문에, 라이신 풀 이외에도, 개별 라이신 성분 역시 항생제와 강한 부가적 또는 상승 작용을 나타낼 것으로 예상된다 (Loeffler et al. Antimicrob Agents Chemother. Jan; 47(1): 375-377 (2003)).
예측예 1
단리된 GN 라이신의 시험
이 실시예에서, 본 명세서에 기술된 GN 라이신 폴리펩티드 및 펩티드 유도체가 슈도모나스 애루지노사 이외에도 그람 음성균 균주의 성장을 억제하거나 사멸시킬 수 있는지를 개별적으로 검증하는 것이 목적이다. 그렇게 하기 위하여, 본 발명의 단리된 폴리펩티드 (본 명세서에 기술된 바와 같이 발현되고 통상적인 기술에 의해 정제될 수 있음)의 클레브시엘라 뉴모니애 NCTC 9633 (ATCC 13883), 엔테로박터 애로게네스 NCTC 10006 (ATCC 13048), 시트로박터 프룬디 NCT 9750 (ATCC 8090), 살모넬라 티피무리움 CDC 6516-60 (ATCC 14028), 예르시니아 페스티스 (ATCC BAA-1511D-5), 프란시셀라 툴라렌시스 (ATCC 6223) 및 에쉐리히아 콜리 DSM 1103 (ATCC 25822) 등 다양한 그람 음성 균주에 대한 항균 작용을 시험할 것이다. 이 실험의 추가적인 실험에서, 상기 균주는 다중 내약성 슈도모나스 애루지노사 Br667 균주와 같은 한 가지 이상의 표준 치료 항생제에 대한 내성이 있도록 선택될 수 있다.
간략하게, GN 라이신 폴리펩티드 및 GN4 펩티드를 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) 완충액의 존재하에서 1 시간 동안 (37℃, 교반없이) 5-15 μg/ml의 농도로 시험할 것이다. 검출 임계값은 2.0 Log10 CFU/ml일 것이다. 라이신 폴리펩티드 또는 그의 단편 각각의 작용은 단독으로, 또는 폴리믹신 B 등의 그람 음성균에 대해 활성인 항생제나 젠타마이신 등의 그람 음성균에 대해 활성인 다른 항생제와 조합하여 시험될 것이다. 라이신 폴리펩티드가 항생제에 대한 내성을 극복하는 능력을 시험하는 이 실험에서, 상기 선택된 항생제는 특정 세균이 내성을 가지는 항생제일 것이다. 평판계수법에 의한 CFU/mL의 측정을 위해 접종물의 100 μL 분량을 상이한 시점 (0, 1, 4 및 8 시간)에 배양 배지에서 제거할 것이다.
그람 음성균의 외막 구조의 보존, 및 본 발명의 GN4와 그의 전술한 유도체 및 기타 라이신 및 슈도모나스 애루지노사에 대한 실시예의 유효성에 기반하여, 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 그람 음성균의 추가적인 (슈도모나스 애루지노사 외) 균주에 대한 항균 작용을 나타낼 것으로 예상된다.
예측예 2
GN 라이신/라이신 펩티드와 추가적인 항생제 사이의 상승 효과 및 부가적 효과의 시험
실시예 5에 기술된 실험 설계와 유사하게, 본 명세서에 개시된 라이신 폴리펩티드는 추가적인 (PMB 외) 항생제와 조합하여 사용되는 경우의 상승 효과 또는 부가적 효과에 대해 시험될 것이다. GN 라이신 및 GN 펩티드의 항균성의 상승 또는 부가적 효과는 인간 혈청에서 평가될 것이다. 슈도모나스 애루지노사를 인간 혈청에서 37℃에서 1 시간 동안, 교반 없이 배양하고, PAO1의 대수기에 대한 상기 작용을 조사할 것이다. GN 라이신 및 GN 펩티드 (10-25 μg/ml)는 노보비오신, 아미노글리코시드, 카바페넴, 세프타지딤 (3 세대), 세페핌 (4 세대), 세프토비프롤 (5 세대), 플루오로퀴놀론, 피페라실린, 티카르실린, 콜리스틴, 리파마이신 (리팜피신, 리파부틴, 리파펜틴 등) 및 페니실린과 같은 항생제의 서브 MIC 농도의 존재 및 부재하에서 각각 배양될 것이다. 세균의 생존력은 평판계수법에 의해 CFU/mL 단위로 측정될 것이다.
예측예 3
폐렴의 생체 내 모델을 사용한 다중 내약성 슈도모나스 애루지노사 치료용 라이신 폴리펩티드의 시험
성체 C57 블랙 마우스는 병원균이 없는 특정 조건하, 케이지 속의 통제된 환경에서 관리될 것이다. 이들은 산소 공급 챔버에서 세보레인 (Abbot Laboratories)을 흡입하여 잠시 마취되고 머리를 들어 올린 바로 누운 자세로 놓일 것이다. 위관 바늘을 사용하여 MDR 슈도모나스 애루지노사 균주 Ka02 세균 접종물 (링거 젖산 용액 50 μl에서의 106 cfu)을 각 동물의 왼쪽 폐에 천천히 주입할 것이다.
동물들은 3 개의 실험 처리군으로 무작위하게 분리될 것이다. 3 개의 실험군은 다음으로 구성될 것이다. 1) 식염수 처리군 (n=5), 여기서 식염수는 감염 1 시간 후 i.v. 투여된 뒤 감염 5 시간 후 추가로 i.p. 투여될 것이다. 2) 라이신 폴리펩티드 GN4 군 (n=5), 여기서 GN4는 감염 1 시간 후 20 mg/kg의 투여량으로 i.v. 투여된 뒤 감염 5 시간 후 추가로 15 mg/kg의 투여량으로 i.p. 투여될 것이다. 3) 양성 대조군-이미페넴 처리군 (n=5), 여기서 “Tienam” (Merck, Sharpe and Dohme) (활성 성분, 이미페넴, 카바페넴 항생제)이 감염 1 시간 후 25 mg/kg의 투여량으로 i.p. 투여된 뒤 감염 5 시간, 24 시간, 29 시간, 48 시간 및 53 시간 후의 시점에 추가로 25 mg/kg이 i.p. 투여될 것이다.
생존은 3 가지 실험군 모두에 대해 감염 후 9일 째까지 12 시간마다 모니터링될 것이다. 상기 동일한 실험 설계가 본 명세서에 개시된 추가적인 라이신 폴리펩티드의 생체 내 항균 작용을 시험하는 데 사용될 것이다.
예측예 4
호중구 감소증 마우스 모델의 슈도모나스 애루지노사 유도 패혈증에 대한 라이신 폴리펩티드의 보호 가능성 시험
슈도모나스 애루지노사로 인한 침습성 감염에 대한 라이신 폴리펩티드의 보호 효능은 종전에 기술된 호중구 감소증 마우스 모델에서 측정될 것이다 (Pier et al. Infect. Immun. 57:174-179 (1989); Schreiber et al. J. Immunol. 146:188-193 (1991)). 성체 BALB/c ByJ 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.)는 병원균 및 슈도모나스가 없는 환경에서 관리될 것이다. 1, 3 및 5일 째에 각 마우스에 복강내 시클로포스파미드 (CytoxanR ′, Bristol-Myers Squibb, Princeton, N.J.) 3mg을 투여함으로써 호중구 감소증이 확립될 것이다. 5일 째에, 상기 시클로포스파미드는 0 시간 때에 투여될 것이고, 2 시간 후, 라이신 (20 mg/kg) 또는 PBS 대조군이 ip 투여될 것이며, 이어서 2 시간 후 살아 있는 슈도모나스 애루지노사 06ad PA의 103 cfu가 투여될 것이다. 그 후 마우스는 매일 모니터링될 것이고 사망률은 결과로서 측정될 것이다. 또한, 동물을 치료하기 위한 최적의 라이신 농도를 결정하기 위해, 라이신 폴리펩티드의 첨가 농도가 시험될 것이다.
상기 동일한 실험 설계가 본 명세서에 개시된 추가적인 라이신 폴리펩티드의 생체 내 보호적 항균 작용을 시험하는 데 사용될 것이다.
예측예 5
인간 대상에서의 전신 감염 치료
다중 내약성 슈도모나스 애루지노사로 인한 전신 호흡기 감염으로 진단된 환자는 본 명세서에 개시된 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드와 함께 정맥내 주사되거나 에어로졸화된 폴리믹신 B로 치료될 것이다.
정맥내 주사되는 폴리믹신 B의 권장 투여량은 1.5 내지 2.5 mg/kg/일 (1 mg = 10,000 IU)이다 (Sobieszczyk ME et al., J Antimicrob Chemother., 54(2):566-9 (2004)). 폴리믹신 B의 IV 정맥 주사는 15일 동안 60-90 분에 걸쳐 수행될 것이다. 본 발명의 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드를 비롯한 약학 조성물은 예정된 농도로 매일 정맥내 투여될 것이다. 또는, 에어로졸화된 폴리믹신 B 요법이 본 발명의 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드를 비롯한 약학 조성물과 함께 2.5 mg/kg/일로 매일 (14일 동안) 투여될 것이다. 개별 환자의 임상 상태에 따라, 치료 기간 및/또는 치료 농도가 달라질 수 있다. 또한, 정맥내 주사되거나 에어로졸화된 폴리믹신 B는 하루 동안 여러 번 투여될 수 있다. 정맥내 주사되는 폴리믹신과 에어로졸화된 폴리믹신의 사용에 관한 상세한 정보는 예컨대, 문헌 Falagas et al.. Clin Med Res. 4(2): 138-146 (2006))에 의해 제공된다.
치료의 마지막에, 환자들은 미생물학적 클리어런스뿐만 아니라 안전성에 대해 평가될 것이다. 전신 호흡기 감염을 앓고 있는 환자의 치료는 감염 관련 증상의 경감 및/또는 환자의 원인균 개체군의 감소 또는 박멸을 유도할 것으로 예상된다.
예측예 6
인간 대상에서의 당뇨병성 궤양의 국소 치료
당뇨병성 족부 궤양 감염은 당뇨병의 심각한 합병증 중 하나이며, 당뇨병 환자 사이의 주요 입원 원인 중 하나이다. 중요하게도, 슈도모나스 애루지노사는 빈번하게 당뇨병 성 발 궤양에서 심각한 조직 손상을 일으킨다 (Sivanmaliappan and Sevanan, Int J Microbiol. article ID: 605195 (2011). 본 발명의 라이신 폴리펩티드가 당뇨병성 족부 궤양 감염의 치료에 효능이 있다는 것을 입증하기 위하여, 임상 연구가 수행될 것이다.
먼저, 슈도모나스 애루지노사의 존재에 대해 개별 환자의 상처 배양 시료가 시험될 것이다. 다음으로, 본 발명의 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드 (예컨대, 풀에서)에 대한 슈도모나스 애루지노사의 감수성이 임상검사표준연구소 (CLSI) 기준에 따른 디스크 확산 방법 등을 사용하여 확인될 것이다 (van der Heijden et al. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 6:8 (2007)). 또는, 상기 환자는 라이신 기준에 대한 미생물 감수성을 충족시키기 위해 사전 선택될 수 있다. 동시에, 사용될 적절한 항생제, 예컨대 폴리믹신 B에 대한 개별 균주의 감수성이 시험관 내에서 측정될 것이다 (또는 상기 환자는 특정 항생제에 대한 미생물 감수성의 기준을 충족시키기 위해 사전 선택될 것이다). 감수성 균주, 예컨대 슈도모나스 애루지노사 ATCC 27853 (폴리믹신에 감수성)은 품질 관리 (QC)로서 사용될 수 있다. 또한, 라이신 폴리펩티드 및 항생제용으로 선택되는, 예컨대 폴리믹신 B (상처 환경에 의한 라이신 저해 가능성을 배제하기 위함 - 실시예 5 및 도 7 및 상기 그의 논의 참조) 를 포함하는 병용 요법에 대한 상처 배양 시료에 존재하는 슈도모나스 애루지노사의 감수성 연구가 수행될 것이다.
시험관 내 감수성 연구에 이어서, 본 발명자들은 당뇨병성 궤양 감염의 치료에서 본 발명의 라이신 폴리펩티드의 생체 내 효능을 시험할 것이다. 라이신은 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있거나, 국소 제제로서 상처에 직접 적용될 수 있다. 또한, 라이신 폴리펩티드는 당뇨병성 궤양의 치료에 사용되는 항생제와 조합하여 시험될 것이며, 여기서 상기 항생제는 특정 항생제의 표준 투여량에 따라 전신 (경구 또는 비경구) 또는 국소 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리믹신 B가 라이신 폴리펩티드와 조합하여 사용되는 경우, 정맥내 주사하는 폴리믹신 B의 권장 투여량은 1.5 내지 2.5 mg/kg/일 이다.
당뇨병성 족부 궤양 감염은 일반적으로 혼합된 그람 양성 및 그람 음성 종을 가지는 다균성이기 때문에 (Citron et al. J Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828 (2007)), 본 발명의 라이신 폴리펩티드는 주어진 환자의 족부 궤양 감염에 존재하는 그람 양성균의 치료에 적합한 한 가지 이상의 항생제 및/또는 한 가지 이상의 다른 라이신과 조합하여 사용될 수 있다. 라이신 치료 이후 세균 개체군의 로그 감소 또는 박멸 또는 임의의 기타 임상적이나 실험적으로 향상된 척도 측면에서 높은 반응율이 뒤따를 것으로 예상된다. 본 발명 내용에 따른 라이신 및 항생제의 조합에 대한 반응은 라이신 및 항생제가 상승 작용함에 따라 더 높아질 것으로 예상된다. 실제로 유효성을 포기하지 않으면서 라이신 또는 항생제 중 하나 또는 둘 모두의 투여량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다.
예측예 7
인간 대상에서의 화상의 국소 치료
화상 상처 감염은 치유를 지연시키고, 흉터 형성을 촉진시키며, 균혈증, 패혈증 또는 장기 부전을 초래할 수 있기 때문에 심각한 우려가 제기된다. 슈도모나스 애루지노사는 화상 감염의 가장 흔한 원인이다 (Church et al. Clinical Microbiology Reviews, 19 (2), 403 - 434 (2006)). 본 발명의 라이신 폴리펩티드가 슈도모나스 애루지노사에 대해 활성인 것으로 밝혀졌기 때문에, 이들은 단일 요법 또는 한 가지 이상의 항생제 없이 유리하게 조합하여 이러한 감염의 치료에 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 라이신 폴리펩티드를 포함하는 크림, 겔 및/또는 거품 형태의 국소 조성물은 1, 2 및 3도 화상을 비롯한 다양한 정도의 화상을 앓고 있는 환자의 다친 피부 영역에 적용될 것이다. 항생제 또는 추가적인 활성제 (다른 표적 유기체에 대해 활성인 라이신 및 선택적으로 이들 표적 유기체에 대응하는 항생제)가 있거나 없는 라이신 폴리펩티드를 함유하는 국소 조성물은 상이한 시간 간격으로 감염된 화상 영역에 직접 적용될 것이다.
라이신 폴리펩티드의 국소 적용은 환자 증상의 경감이나 제거뿐만 아니라, 원인 세균 개체군의 감소나 박멸 역시 초래할 것으로 예상된다.
상기 실시예들은 본 명세서에 기술된 방법 및 특징의 예시이며, 한정하려는 것으로 의도된 것은 아니다. 또한, 이들은 본 발명에 대한 일반적인 적용에 대한 설명을 포함하고, 이러한 설명은 설명이 나타난 특정 실시예에 국한되지 않고 본 명세서에 기술된 실험 결과의 보다 광범위한 의미의 결론 서술 및 표현을 구성한다.
모든 인용된 참조 문헌의 내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에서 완전히 표기된 것처럼 전체로서 참조 문헌으로 포함된다.
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20 25 30 Lys Val Val Lys Arg Ala Ile Glu Ile Ser Pro Val Asp Phe Thr Val 35 40 45 Thr Glu Gly Leu Arg Thr Leu Glu Arg Gln Lys Glu Leu Phe Ala Lys 50 55 60 Gly Ala Ser Lys Thr Met Arg Ser Arg His Leu Thr Gly His Ala Val 65 70 75 80 Asp Ile Ser Pro Leu Val Asp Gly Lys Val Ser Trp Asp Trp Lys Tyr 85 90 95 Tyr Tyr Pro Met Ala Asp Ala Met Lys Gln Ala Ala Lys Glu Leu Asn 100 105 110 Ile Pro Val Glu Trp Gly Gly Asp Trp Lys Thr Phe Lys Asp Gly Pro 115 120 125 His Phe Gln Leu Pro Tyr Gly Val Tyr Lys 130 135

Claims (24)

  1. 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 (P. aeruginosa) 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 것인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 단편은 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 데 효율적인 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 용액, 현탁액, 에멀젼, 호흡식 분말, 에어로졸 또는 스프레이의 제형인 것인 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 그람 음성균의 치료에 적절한 한 가지 이상의 항생제를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  5. 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 서열 동일성이 80%이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열을 포함하며, 여기서 상기 코딩된 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 것인 벡터.
  6. 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 상기 코딩된 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키고, 상기 핵산은 이종 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 것인 재조합 발현 벡터.
  7. 제5항 또는 제6항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 핵산 서열은 cDNA 서열인 것인 재조합 벡터.
  9. 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 서열 동일성이 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 코딩된 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제3항에 있어서, cDNA인 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 적어도 1 종의 그람 음성균의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 방법으로서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 유효량이 함유된 조성물과 세균을 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 특성이 있는 것인 방법.
  12. 슈도모나스 애루지노사 및 임의의 1 종 이상의 그람 음성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 음성균에 기인하는 세균 감염의 치료 방법으로서, 세균 감염의 증상이 나타날 위험이 있거나 증상을 나타내는 것으로 진단된 대상에게 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 유효량이 함유된 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 라이신 폴리펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 특성이 있는 것인 방법.
  13. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 적어도 1 종의 그람 음성균은 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa ), 클레브시엘라 종 (Klebsiella spp .), 엔테로박터 종 (Enterobacter spp .), 대장균 (Escherichia coli ), 시트로박터 프룬디 (Citrobacter freundii ), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium ), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis ) 및 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 85% 이상 또는 90% 이상 동일한 것인 방법.
  15. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 95% 이상 동일한 것인 방법.
  16. 제18항에 있어서, 상기 그람 음성균 감염은 슈도모나스 애루지노사에 기인하는 감염인 것인 방법.
  17. 슈도모나스 애루지노사 및 임의의 1 종 이상의 그람 음성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 음성균에 의해 대상에서 발생한 국소 또는 전신 병원성 세균 감염의 치료 방법으로서, 대상에게 서열 번호 1 내지 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편의 유효량이 함유된 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 펩티드는 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 특성이 있는 것인 방법.
  18. 세균 감염의 예방 또는 치료 방법으로서, 세균 감염의 증상이 나타날 위험이 있거나 증상을 나타내는 것으로 진단된 대상에게 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 단편의 유효량이 함유된 조성물의 제1 유효량과, 그람 음성균 감염의 치료에 적절한 항생제의 제2 유효량의 조합물을 병용 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항생제는 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코시드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 젠타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 중 한 가지 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 그람 음성균 감염의 치료에 적절한 항생제 효능의 증진 방법으로서, 항생제를 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 한 가지 이상의 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편과 함께 병용 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조합물의 투여는 항생제 또는 라이신 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편을 개별적으로 투여하는 경우보다 그람 음성균의 성장을 억제하거나, 또는 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 데 더욱 효율적인 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 90% 이상 동일한 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 95% 이상 동일한 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 항생제는 세프타지딤, 세페핌, 세포페라존, 세프토비프롤, 시프로플록사신, 레보플록사신, 아미노글리코시드, 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴, 젠타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 피페라실린, 티카르실린, 페니실린, 리팜피신, 폴리믹신 B 및 콜리스틴 중 한 가지 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 서열 번호 1 내지 서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열에 대하여 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 슈도모나스 애루지노사 및 경우에 따라 적어도 하나의 다른 그람 음성균 종의 성장을 억제하거나, 개체군을 감소시키거나, 또는 사멸시키는 것인 단리된 라이신 폴리펩티드 또는 라이신 작용이 있는 그의 단편.
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