CN108348574A - 具有对抗革兰氏阴性菌的活性的溶素多肽 - Google Patents

Abstract

本公开提供了可用于预防性和治疗性改善和治疗由革兰氏阴性菌(包括铜绿假单胞菌)所引起的感染的方法和组合物。本公开还提供了引入并利用本公开的溶素多肽以增强通常适用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的功效的组合物和方法。

Description

具有对抗革兰氏阴性菌的活性的溶素多肽

声明或相关申请

本专利申请要求于2015年9月17日提交的美国临时专利申请62/220,212和于2015年10月28日提交的美国临时专利申请62/247,619的优先权；这些临时申请的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开一般涉及预防和治疗由革兰氏阴性菌引起的感染。更具体地，本公开涉及能够预防和/或抑制革兰氏阴性菌生长的试剂和组合物。

背景技术

革兰氏阴性病原体通过进化出对先前考虑用于治疗的几乎所有药物的抗性而产生显著威胁。特别令人关注的是涉及革兰氏阴性病原体铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的医疗保健相关感染，其可以产生对许多抗微生物剂如抗生素(包括但不限于环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南)的抗性(Lister等，ClinMicrobiol Rev.4：582-610(2009))。除了对个体药物的抗性外，多重耐药菌株的出现和增加的流行结合新抗生素的缺乏也是警报的原因。显然需要用于革兰氏阴性感染的新颖且有效的治疗以解决来自多重耐药性的威胁。一种非常有前途的方法是基于使用细菌肽聚糖水解酶或PGH，包括溶素、自溶素和一些细菌素，以降解细菌细胞壁的主要结构组分(即肽聚糖)。PGH包括切割肽聚糖的糖骨架的氨基葡萄糖苷酶和胞壁质酶(即溶菌酶)、切割干肽(stem-peptide)或交叉桥(cross-bridge)的内肽酶、或切割连接糖和肽部分的酰胺键的L-丙氨酸酰胺酶(Bush K.，Rec Sci Tech.(1)：43-56(2012)；Reith J.等Appl MicrobiolBiotechnol.(1)：1-11(2011))。

过去14年的工作表明，PGH可被重组表达、纯化并外源地添加到敏感细菌中用于快速细菌溶解。这种“自外溶菌(lysis from without)”现象是目前正在开发的用于多种革兰氏阳性菌病原体的有效抗菌策略的基础。然而，与革兰氏阳性菌相比，由于在细菌细胞壁内存在额外的膜层，使用溶素治疗革兰氏阴性菌感染受到限制。这个被称为外膜(OM)的额外的层阻碍溶素接近它们在细胞壁中的肽聚糖底物。尽管如此，近来已经报道了来自革兰氏阴性菌和相关噬菌体的多种PGH，其具有杀灭革兰氏阴性菌的某种先天能力(Lood等，Antimicrob Agents Chemother，4：1983-91，(2015))。对于杀菌性革兰氏阴性溶素，活性可能依赖于天然序列中带正电荷(且两亲性)的N-和C-端α螺旋结构域，其能够与阴离子性OM结合并影响易位到下面的肽聚糖中(Lai等Microbiol Biotechnol，90：529-539(2011))。最近，研究人员利用这些知识创造了“artilysin”，其是工程化溶素，具有添加的阳离子肽，用于对抗革兰氏阴性铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的抗菌活性(Briers等，Antimicrob Agents Chemother.58(7)：3774-84(2014))。这些artilysin由融合到与溶素无关或并非源自溶素的外源衍生的阳离子肽的带正电荷的PGH(具有对抗革兰氏阳性菌的活性)组成(Briers等，Antimicrob Agents Chemother.58(7)：3774-84(2014)；Briers等，MBio.4：e01379-14(2014)；美国专利8,846,865)。

本文中参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献是相关的或者它们构成了本公开的现有技术。

发明内容

在一个方面中，本公开提供了药物组合物，其包含有效量的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段，所述分离的溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、或减少其种群、或将其杀灭；和药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，溶素多肽或片段以有效抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的量存在。

在一些实施方式中，药物组合物为溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气雾剂或喷雾剂。

在一些实施方式中，药物组合物还包含适用于治疗革兰氏阴性菌的一种或多种抗生素。

在另一个方面中，本公开提供了包含分离的多核苷酸或所述多核苷酸的互补序列的载体，所述分离的多核苷酸包含编码溶素多肽或其具有溶素活性的片段的核酸分子，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中编码的溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭。

在另一个方面中，本公开提供了包含编码溶素多肽或其具有溶素活性的片段的核酸的重组表达载体，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列，其中编码的溶素多肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的特性，所述核酸可操作地连接至异源启动子。

在一些实施方式中，核酸序列是cDNA序列。

在又一个方面中，本公开提供了包含编码溶素多肽或其具有溶素活性的片段的核酸分子的分离的多核苷酸，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中编码的溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭。

在一些实施方式中，多核苷酸是cDNA

在另一个方面中，本公开提供了抑制至少一种革兰氏阴性菌物种的生长、或减少其种群、或将其杀灭的方法，所述方法包括使所述细菌与含有有效量的溶素多肽或其活性片段的组合物接触，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的特性。

在一个相关的方面中，本公开提供了治疗由选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种的革兰氏阴性菌所引起的细菌感染的方法，其包括向诊断患有细菌感染、具有其风险或表现出其症状的受试者施用含有有效量的溶素多肽或其活性片段的组合物，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的特性。

在另一个方面中，本公开提供了在受试者中治疗由革兰氏阴性菌所引起的局部或全身性致病细菌感染的方法，所述革兰氏阴性菌选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种，所述方法包括向受试者施用含有有效量的溶素多肽的组合物，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:15的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌的生长、减少其种群或将其杀灭的特性。

在又一个方面中，本公开提供了预防或治疗细菌感染的方法，其包括向诊断患有细菌感染、具有其风险或表现出其症状的受试者共同施用第一有效量的含有有效量的溶素多肽或其片段的组合物和第二有效量的适用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的组合，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，革兰氏阴性菌选自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和土拉弗朗西斯菌(Franciscella tulerensis)。

在一些实施方式中，溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少85％、或至少90％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

在一些实施方式中，溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少95％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

在一些实施方式中，革兰氏阴性菌感染是由铜绿假单胞菌所引起的感染。

在一些实施方式中，抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。

在另一个方面中，本公开提供了用于增强适用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的功效的方法，其包括共同施用所述抗生素与一种或多种溶素多肽或其活性片段的组合，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中施用所述组合相比个别施用所述抗生素或所述溶素多肽或其活性片段在抑制所述革兰氏阴性菌生长、或减少其种群或将其杀灭方面更为有效。

在一些实施方式中，溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少90％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

在一些实施方式中，溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少95％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

在另一个方面中，分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、或减少其种群、或将其杀灭。

附图说明

图1提供了本公开中报道的溶素多肽GN37的核苷酸和氨基酸序列。图1A(左)是GN37的氨基酸序列。图1A(右)是GN37的核苷酸序列。图1B是GN37的示意图，表明GN37是具有DD-和DL-羧肽酶活性的PGH的肽酶M15_4家族的成员(包括VanY超家族的成员)。图1C显示了将GN37与革兰氏阳性部分同源物(链霉菌，GenBank序列AGJ50592.1)以及来自其它革兰氏阴性病原体(包括大肠杆菌(GenBank WP_001117823.1和NP_543082.1，均是推定的内溶素)、耶尔森氏菌(GenBank CAJ28446.1，经确认的内溶素)和鲍氏不动杆菌(GenBank WP_034684053.1，推定的溶素))的推定的或经确认的内溶素进行比较的多序列比对。

图2提供了本公开中报道的溶素多肽GN2、GN4、GN14和GN43的氨基酸(粗体)和核苷酸(正常字体)序列。

图3是描绘在存在各种GN溶素多肽的情况下，铜绿假单胞菌菌株PAO1的荧光信号相对于对照的倍数诱导的柱状图，其中荧光指示外膜透化。

图4是显示GN溶素多肽对抗铜绿假单胞菌菌株PAO1的抗菌活性的柱状图。菌落形成单位(CFU)的减少以对数刻度呈现。

图5提供了源自GN4的五种溶素肽(PGN4、FGN4-1、FGN4-2、FGN4-3和FGN4-4)的氨基酸序列。

图6是显示每种GN4衍生溶素肽(PGN4、FGN4-1、FGN4-2、FGN4-3和FGN4-4)对抗铜绿假单胞菌菌株PAO1的抗菌活性的柱状图。CFU计数的减少沿着对数刻度呈现。

图7是显示本公开的汇集的GN溶素多肽和GN4衍生溶素肽在人血清中对抗铜绿假单胞菌菌株PAO1的抗菌活性的柱状图。CFU计数的减少沿着对数刻度呈现。

具体实施方式

定义

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则以下术语及其同根词应具有下文归属于它们的含义。

“革兰氏阴性菌”通常指产生在革兰氏染色中脱色的结晶紫染色的细菌，即它们在革兰氏染色方案中不保留结晶紫染料。如本文所用，术语“革兰氏阴性菌”可以非限制性地描述以下细菌物种中的一种或多种(即一种或组合)：鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)，溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticu)，伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，Bacteroides theataioatamicron，吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)，卵圆拟杆菌(Bacteroides ovatus)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)，类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)，鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)，人体普雷沃氏菌(Prevotella corporis)，中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)，牙髓普雷沃氏菌(Prevotella endodontalis)，非解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)，胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)，迟缓爱德华氏菌(Edwarsiella tarda)，侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)，阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，成团肠杆菌(Enterobacteragglomeran)，大肠杆菌(Escherichia coli)，土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，金氏金氏菌(Kingella kingae)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)，鼻硬结克雷伯菌(Klebsiella rhinoscleromatis)，臭鼻克雷伯菌(Klebsiella ozaenae)，嗜肺军团菌(Legionella penumophila)，卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，摩氏摩根菌(Morganella morganii)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidi)，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，彭氏变形杆菌(Proteus penneri)，粘液变形杆菌(Proteusmyxofaciens)，斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)，雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)，产碱普罗登斯菌(Providencia alcalifaciens)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)，索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)，沙眼衣原体(Chlamydophila trachomatis)，普氏立克次氏体(Ricketsia prowazekii)，贝纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)，查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)或汉氏巴尔通体(Bartonella hensenae)。本公开的化合物将可用于预防或抑制病原性细菌生长，并可用于治疗一种或多种细菌感染，特别但不一定唯一地涉及革兰氏阴性菌，特别是铜绿假单胞菌。

在试剂的上下文中的术语“杀菌”通常意指具有引起细菌死亡或能够杀灭细菌至细菌初始种群中至少3-log(99.9％)或更多的减少的程度的特性。

术语“抑菌”通常意味着具有抑制细菌生长，包括抑制生长的细菌细胞，从而导致细菌初始群体中2-log(99％)或更多且至多正好低于3-log减少的特性。

在试剂的上下文中的术语“抗菌的”通常用于包括抑菌剂和杀菌剂两者。

在病原体且更具体地细菌的上下文中的术语“耐药性”通常是指对药物的抗微生物活性具有抗性的细菌。当以更特定的方式使用时，耐药性特别是指抗生素抗性。在某些情况下，通常对特定抗生素易感的细菌可以发展成对该抗生素具有抗性，从而变成耐药性微生物或菌株。“多重耐药性”病原体是对各自用作单药治疗的至少两类抗微生物药物发展出抗性的病原体。例如，已发现铜绿假单胞菌的某些菌株对几乎全部或全部抗生素具有抗性，所述抗生素包括氨基糖苷类、头孢菌素类、氟喹诺酮类和碳青霉烯类(美国抗生素抗性威胁(Antibiotic Resistant Threats in the United States)，2013，美国卫生与服务部，疾病控制和预防中心)。本领域技术人员可以使用确定细菌对药物或抗生素的易感性或抗性的常规实验室技术容易地确定细菌是否是耐药性的。

术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗剂和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂等。载体必须是在通常用于药物中的量下不对待治疗的受试者有害的意义上是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其他成分相容，而不使组合物不适合于其预期目的。此外，药学上可接受的载体适用于本文所提供的受试者，而没有过度的不良副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)。当其风险超过组合物所提供的利益时，副作用是“不适当的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、和诸如油/水乳剂和微乳剂的乳剂。

对于包含冻干溶素多肽的固体组合物，可以包含赋形剂如尿素或美司钠以改善稳定性。其他赋形剂包括膨胀剂(bulking agent)、缓冲剂、张度(tonicity)调节剂、表面活性剂、防腐剂和助溶剂。

对于包含溶素多肽的固体口服组合物，合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。

对于液体口服组合物，合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、乙二醇类、油、醇类、调味剂、防腐剂等。

对于局部固体组合物如霜剂、凝胶剂、泡沫剂、软膏剂或喷雾剂，合适的赋形剂包括但不限于霜剂、纤维素或油性基底、乳化剂、硬化剂、流变改性剂或增稠剂、表面活性剂、润肤剂、防腐剂、湿润剂、碱化或缓冲剂、和溶剂。

用于配制泡沫基底的合适赋形剂包括但不限于丙二醇、乳化蜡、鲸蜡醇和硬脂酸甘油酯。潜在的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

术语“有效量”是指当以合适的频率或给药方案应用或施用时足以预防或抑制细菌生长或预防被治疗的病症(这里是细菌病原体生长或感染)、减少或改善其发作、严重性、持续时间或进展、阻止被治疗的病症的发展、导致被治疗的病症的消退、或者增强或改善另外的治疗(例如抗生素或抑菌治疗)的预防或治疗效果的量。

术语“共同施用”旨在包括以连续的方式分开施用溶素多肽和抗生素或任何其他抗菌剂，以及以基本上同时的方式施用这些试剂，例如在单一混合物/组合物中或以单独给予的剂量，但仍基本上同时施用于受试者，例如在同一天或24小时中的不同时间。溶素多肽与一种或多种另外的抗菌剂的这样的共同施用可作为持续至多数天、数周或数月的持续治疗而提供。另外，取决于用途，共同施用不需要是连续的或同时的(co-extensive)。例如，如果用途是作为局部抗菌剂以治疗例如细菌性溃疡或感染的糖尿病性溃疡，则可以仅在第一次抗生素使用的24小时内开始施用溶素，然后抗生素使用可以继续进行而不再进一步施用溶素。

术语“受试者”是指待治疗的受试者，并且尤其包括哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物或细胞培养物。例如，术语“受试者”旨在包括易感或患有革兰氏阴性菌感染的生物体，例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方式中，受试者是人，例如患有革兰氏阴性菌感染、处于患有其的风险、或易感于其的人，无论这样的感染是全身性的还是局限于特定的器官或组织。

术语“多肽”与术语“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且是指由氨基酸残基构成且具有至少约30个氨基酸残基的聚合物。该术语不但包括分离形式的多肽，还包括其活性片段和衍生物(定义如下)。术语“多肽”还包括包含如下所述的溶素多肽并保持溶素功能的融合蛋白或融合多肽。多肽可以是天然存在的多肽或者工程化或合成产生的多肽。特定的溶素多肽可以例如通过酶促或化学切割从天然蛋白衍生或移出，或者可以使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(例如Sambrook,J.等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)中公开的那些)制备，或可被策略性截短或分段，产生活性片段，如例如本文中用包含GN4的两亲性结构域的GN4的片段及其进一步的截短形式说明的，其维持对抗相同的或至少一种共同的靶细菌的溶素活性。天然溶素多肽的变体还包括与天然溶素多肽(其如上所述包括天然溶素蛋白的活性片段)具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性。

术语“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段融合产生的表达产物，导致融合表达产物通常具有两个具有不同特性或功能的结构域或区段。更具体而言，术语“融合多肽”还指包含直接或经由氨基酸或肽接头共价连接的两个或更多个异源多肽或肽的多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常被连接C端至N端，尽管它们也可以被连接C端至C端、N端至N端或N端至C端。术语“融合多肽”可与术语“融合蛋白”互换地使用。因此，开放式表述“包含”某种结构的“多肽”包括比所记载的结构如融合多肽更大的分子。

术语“异源性的”是指非天然连续的核苷酸、肽或多肽序列。例如，在本公开的上下文中，术语“异源性的”可以用于描述两种或更多种肽和/或多肽的组合或融合，其中该融合肽或多肽通常未见于自然中，例如溶素多肽或其活性片段和阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide)(Ding等，Cell Mol Life Sci.，65(7-8)：1202-19(2008))、防卫素肽(Ganz，T.Nature Reviews Immunology 3，710-720(2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽，其可具有增强的溶素活性。该定义中包括两个或更多个溶素多肽或其活性片段。这些可用于制备具有溶素活性的融合多肽。

术语“活性片段”是指本文公开的全长多肽的一部分，其保留分离的原始多肽的一种或多种功能或生物学活性。参见例如图2中的GN4以及其在图5中的片段(FGN4-1和FGN4-2)。本文特别感兴趣的生物学活性是具有钻透外膜并水解革兰氏阴性菌的包衣的活性的溶素的生物学活性，无论是通过切割糖骨架还是肽键。

术语“两亲性肽”是指具有亲水性和疏水性官能团两者的肽。优选地，二级结构在肽的不同端处放置疏水性和亲水性氨基酸残基。这些肽通常采用螺旋二级结构。

术语“阳离子肽”是指具有带正电荷的氨基酸残基的肽。优选地，阳离子肽具有9.0或更高的pKa值。在本公开的上下文中，术语“阳离子肽”还包括聚阳离子肽。

如本文所用的术语“聚阳离子肽”是指由主要由带正电荷的氨基酸残基(特别是赖氨酸和/或精氨酸残基)组成的合成产生的肽。不带正电荷的氨基酸残基可以是带中性电荷的氨基酸残基和/或带负电荷的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基。

术语“疏水基团”是指对水分子具有低亲和力或不具有亲和力，但对油分子具有更高亲和力的化学基团，例如氨基酸侧链。疏水物质倾向于在水或水相中具有低溶解性或不具有溶解性，并且通常是非极性的，但倾向于在油相中具有更高的溶解性。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。

在本公开的上下文中的术语“增强”意味着抗微生物活性的程度比它否则将是的程度更高。“增强”包括加和以及协同(超加和)效应。

与效果有关的术语“协同”或“超加和”意指由两种活性物质带来的有益效果，其超过了单独施用或应用每种物质所产生的效果。一种活性成分或活性成分两者可以在亚阈值水平(即，如果活性物质单独使用时不产生或产生非常有限的效果的水平)下使用。

术语“治疗”是指任何过程、作用、应用、治疗等，其中使受试者(包括人)经受医疗救助，目的是直接或间接地治愈病症、或根除病原体、或改善受试者的状况。治疗还指降低发病率、或减轻症状、消除复发、防止复发、预防发生、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”还包括减少受试者中细菌的种群、生长速率或毒力，从而控制或减少受试者中的细菌感染或者器官或组织或环境的细菌污染。因此，降低发病率的“治疗”有效抑制至少一种革兰氏阴性菌在特定环境(无论它是受试者还是环境)中的生长。另一方面，已经确定的感染的“治疗”是指减少导致感染或污染的革兰氏阴性菌的群体或将其杀灭，包括甚至将其根除。

术语“预防”包括预防病症例如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或确立。无意于将本公开限制为感染的确立的完全预防或预防。在一些实施方式中，发作被延迟，或者随后感染的疾病的严重程度被降低，并且这样的构成了预防的实例。在本公开的上下文中，感染的疾病包括表现出临床或亚临床症状的那些两者，例如当与这样的病理学相关的症状尚未显现时细菌病原体的检测以及细菌病原体的生长的检测。

肽或多肽(其如本文所述包括活性片段)的上下文中的术语“衍生物”旨在包括例如经修饰以含有除氨基酸以外的基本上不会不利地影响或破坏溶素活性的一个或多个化学部分的多肽。化学部分可以与肽共价连接，例如通过氨基端氨基酸残基、羧基端氨基酸残基，或在内部氨基酸残基处。这样的修饰包括在反应性部分上添加保护或封端基团、添加可检测标记如抗体和/或荧光标记、添加或改变糖基化、或添加膨胀基团(bulking group)如PEG(聚乙二醇化)和基本上不会不利地影响或破坏溶素多肽的活性的其他变化。

可以添加到溶素多肽中的常用保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。

常用的荧光标记蛋白例如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry，是可以共价或非共价结合至溶素多肽或与溶素多肽融合而不干扰细胞蛋白的正常功能的紧凑蛋白。通常，编码荧光蛋白的多核苷酸插入溶素多核苷酸序列的上游或下游。这将产生不干扰与其连接的溶素多肽的细胞功能或功能的融合蛋白(例如，溶素多肽::GFP)。

聚乙二醇(PEG)与蛋白质的缀合已被用作延长许多药物蛋白质的循环半衰期的方法。因此，在溶素多肽衍生物的上下文中，术语“衍生物”包括通过共价连接一个或多个PEG分子而化学修饰的溶素多肽。预期聚乙二醇化溶素多肽与未聚乙二醇化溶素多肽相比将显示延长的循环半衰期，同时保持生物学和治疗活性。

关于溶素多肽序列的术语“氨基酸序列同一性百分比”在本文中定义为在比对序列和(如果必要的话)引入缺口以获得最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与特定溶素多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的软件如BLAST或Megalign(DNASTAR)软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100％同一性的任何一处，或其间的任何整数值。在本公开的上下文中，当至少80％的氨基酸残基(优选至少约85％、至少约90％、并且优选至少约95％)相同时，两个多肽是“基本上相同的”。如本文所述的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”也适用于溶素肽。因此，术语“基本上相同的”将涵盖本文所述的分离的溶素多肽和肽的突变、截短、融合或在其他方面的序列修饰的变体及其活性片段，以及相比于参比多肽具有基本上的序列同一性(例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性，如通过例如上文提到的一种或多种方法所测量的)的多肽。

当至少约80％的氨基酸残基(优选至少约85％、至少约90％、并且优选至少约95％)相同时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”，或代表保守置换。本公开的溶素多肽的序列在溶素多肽的一个或多个、或若干个、或至多10％，或至多15％或至多20％的氨基酸被相似或保守的氨基酸替代物置换时，是基本上同源的，并且其中所得溶素具有本文公开的溶素多肽的活性、抗菌效果和/或细菌特异性的性质。本文所述的“基本上同源的”的含义也适用于溶素肽。

术语“可吸入组合物”是指被配制用于在常规或辅助呼吸期间或与常规或辅助呼吸相结合而直接递送至呼吸道(例如通过气管内支气管、肺、和/或鼻腔施用)的本公开的药物组合物，包括但不限于雾化、喷洒、干粉和/或气雾化制剂。

术语“生物膜”是指附着于表面并在其自身合成的水合聚合物基质中聚集的细菌。生物膜是其中细胞在表面上彼此粘附的微生物的聚集体。这些粘附细胞通常嵌入胞外聚合物质(EPS)的自产基质中。生物膜EPS，其也被称为粘液(尽管不是所有被描述为粘液的东西都是生物膜)或菌斑，是通常由细胞外DNA、蛋白质和多糖组成的聚合物聚集体。

在适用于对抗某些细菌的抗生素的上下文中，术语“适合”是指即使抗性随后发展，但也被发现对那些细菌有效的抗生素。

术语“抗微生物肽”(AMP)是指可在几乎每种生物体中发现的范围广泛的短的(通常长度为6至50个氨基酸残基)、阳离子性的、基因编码的肽抗生素的成员。不同的AMP显示出不同的特性，并且该类中的许多肽不仅作为抗生素，而且作为用于细胞穿透肽的模板而被深入研究。尽管共享一些共同的特征(例如阳离子性、两亲性和短尺寸)，AMP序列的变化很大，并且已经提出了至少四种结构组(α螺旋、β折叠、延伸和成环)以适应所观察到的AMP构象的多样性。同样，已经提出了多种作为抗生素的作用模式，并且显示出例如这些肽中的许多的主要靶标是细胞膜，而对于其他肽，主要靶标则是细胞质侵入和核心代谢功能的破坏。尽管缺乏特异性靶标结合，但是AMP可以变得足够集中以展现合作活性；例如，通过在膜中形成孔，如大多数AMP的情况那样。然而，这种现象仅在模型磷脂双层中观察到，并且在一些情况下，高至每六个磷脂分子一个肽分子的膜中AMP浓度是这些事件发生所需要的。这些浓度接近(如果不是处于)全膜饱和。由于AMP的最小抑制浓度(MIC)通常在低微摩尔范围内，已经可理解地产生关于这些阈值与其体内重要性的相关性的怀疑(Melo等，NatureReviews Microbiology，7，245-250(2009)))。

防卫素是在脊椎动物和无脊椎动物两者中发现的小的、阳离子性的、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽的大家族(Wilmes,M.和Sahl,H.，Int J Med Microbiol.；304(1)：93-9(2014))。根据半胱氨酸的间隔模式将防卫素分成五组：植物、无脊椎动物、α-、β-和θ-防卫素。后三者主要在哺乳动物中发现。α-防卫素是在嗜中性粒细胞和肠上皮细胞中发现的蛋白质。β-防卫素是分布最为广泛的，并且由许多类型的白细胞和上皮细胞分泌，θ-防卫素迄今为止在例如恒河猴的白细胞中被罕见地发现。防卫素对细菌、真菌和许多包膜和非包膜病毒具有活性。然而，有效杀灭细菌所需的浓度大多是高的，即，在微摩尔范围内。在存在生理盐条件、二价阳离子和血清的情况下，许多肽的活性可能受到限制。此外，防卫素通常具有溶血活性，这对于本公开的产品和方法而言是不期望的。

寿司(Sushi)肽的特征在于存在寿司结构域，也称为补体控制蛋白(CCP)模块或短一致重复(SCR)。寿司结构域发现于各种补体和粘附蛋白中，其含有散布有短连接序列的串联排列的寿司结构域。寿司结构域含有跨越约60个残基的一致序列，其进而含有参与分子内二硫键的4个不变的半胱氨酸残基，高度保守的色氨酸，和保守的甘氨酸、脯氨酸和疏水残基(Kirkitadze,M.和Barlow,P.，Immunol Rev.，180：146-61(2001))。已知寿司结构域参与蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用。已经显示含有寿司结构域的肽具有抗微生物活性(Ding,JL.和Ho,B.Development Research，62：317-335(2004))。

Cathelicidin是多功能抗微生物肽，也称为阳离子宿主防御肽(CHDP)(被提议作为抗微生物治疗剂的一类肽)，并且是对抗感染的先天宿主防御的重要组分。除了杀微生物潜力之外，这些肽还具有有着调节炎症和免疫的能力的性质。最近，发现外源人cathelicidin LL-37的递送在急性铜绿假单胞菌肺感染的小鼠模型中增强了对感染的保护性促炎应答，证实了cathelicidin介导的体内细菌清除的(Beaumont等PLoS One 2；9(6)：e99029(2014))。因此，在不存在直接杀微生物活性的情况下，cathelidicin有效地促进从肺清除细菌，需要感染和肽暴露两者并且独立于天然cathelicidin生产的早期嗜中性粒细胞应答增强。此外，尽管cathelicidin缺陷型小鼠具有完整的早期细胞炎症应答，但后期嗜中性粒细胞对感染的应答在这些动物中不存在，铜绿假单胞菌的清除显著受损。这些发现证明了cathelicidins在体内肺部感染中的调节特性的重要性，并强调了特定于传染性环境，cathelicidin在诱导保护性肺嗜中性粒细胞应答方面的关键作用。Beaumont,P.E.等，PLoS One.2014；9(6)：e99029，在线发布于2014年6月2日，doi：10.1371/ journal.pone.0099029。

实施方式

本公开涉及对抗革兰氏阴性菌的新型抗菌剂。具体而言，本公开涉及具有对抗革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌的活性的溶素多肽(包括其活性片段)。这样的溶素多肽的实例为具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10组内的氨基酸序列的那些。天然序列通过来自先前测序但部分阐明的噬菌体基因组的生物信息学技术识别。尽管如此识别的一些序列已被注释为推定的内溶素，但先前没有功能被确定地归因于具有这些序列的多肽。而且，被注释为推定的内溶素的多个序列在合成或表达时原来是完全缺乏溶素活性或对靶病原体无活性。在分离、表达和测试中，实际上仅有少数生物信息学识别的序列具有革兰氏阴性溶素功能。另外，识别了溶素的活性片段，并制备了具有革兰氏阴性溶素活性的序列修饰的活性肽和多肽。而且，根据本公开，这样的序列修饰的肽包括保持溶素活性的经证实的天然革兰氏阴性溶素多肽的片段，以及与天然溶素多肽或其活性片段具有80％或更多(例如至少85％、至少90％、至少85％或至少98％)的序列同一性的它们的变体，并且事实上非相同部分可能包括天然和非天然(合成)氨基酸残基两者的置换。本发明人已经确定这些多肽的C-端的α螺旋结构域对于革兰氏阴性溶素活性是重要的，并且已经进行了研究以查明活性，但是可以快速测试其序列与本文公开的天然溶素或其片段具有80％或更多(例如85％、90％、95％或98％或99％)的同一性的任何肽对抗革兰氏阴性菌的活性，所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌和其他如克雷伯氏杆菌、肠杆菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌。这样的测试可以遵循例如在实施例2、3、4或预示例1中提供的教导。当然，测试程序和方案本身不限于这些实施例中的那些，而可以是本领域技术人员已知的用于评估抗菌剂和实际上抗微生物剂的有效性的任何方法。

在一个实施方式中，本公开提供了用于治疗由革兰氏阴性菌引起的受试者中的细菌感染的方法，其包括向受试者施用有效量的与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％氨基酸序列同一性的溶素多肽。细菌可以选自鲍曼不动杆菌，溶血不动杆菌，伴放线放线杆菌，嗜水气单胞菌，脆弱拟杆菌，Bacteroidestheataioatamicron,吉氏拟杆菌，卵圆拟杆菌，普通拟杆菌，百日咳博德特氏菌，羊布鲁氏菌，洋葱伯克霍尔德菌，类鼻疽伯克霍尔德菌，鼻疽伯克霍尔德菌，梭杆菌，人体普雷沃氏菌，中间普雷沃氏菌，牙髓普雷沃氏菌，非解糖卟啉单胞菌，空肠弯曲杆菌，胎儿弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，克氏柠檬酸杆菌，迟缓爱德华氏菌，侵蚀艾肯菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌，成团肠杆菌，大肠杆菌，土拉弗朗西斯菌，流感嗜血杆菌，杜克雷嗜血杆菌，幽门螺杆菌，金氏金氏菌，肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯菌，鼻硬结克雷伯菌，臭鼻克雷伯菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，摩氏摩根菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，多杀巴斯德氏菌，类志贺邻单胞菌，奇异变形杆菌，普通变形杆菌，彭氏变形杆菌，粘液变形杆菌，斯氏普罗威登斯菌，雷氏普罗威登斯菌，产碱普罗登斯菌，铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌，伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，索氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，嗜麦芽窄食单胞菌，念珠状链杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，肺炎嗜衣原体，沙眼衣原体，普氏立克次氏体，贝纳特氏立克次体，查菲埃立克体或汉氏巴尔通体。例如，在一个具体的实施方式中，革兰氏阴性菌感染是由选自以下的细菌所引起的感染：鲍曼不动杆菌，百日咳博德特氏菌，洋葱伯克霍尔德菌，类鼻疽伯克霍尔德菌，鼻疽伯克霍尔德菌，空肠弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌，大肠杆菌，土拉弗朗西斯菌，流感嗜血杆菌，杜克雷嗜血杆菌，幽门螺杆菌，肺炎克雷伯菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，摩氏摩根菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，多杀巴斯德氏菌，奇异变形杆菌，普通变形杆菌，铜绿假单胞菌，伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，索氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，嗜麦芽窄食单胞菌，霍乱弧菌和肺炎嗜衣原体。在一个具体的实施方式中，革兰氏阴性菌感染是由选自以下的一种或多种细菌所引起的感染：鼠伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，志贺氏菌，大肠杆菌，鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，沙雷氏菌，奇异变形杆菌，摩氏摩根菌，普罗威登斯菌，爱德华氏菌，耶尔森氏菌，流感嗜血杆菌，五日热巴尔通体，布鲁氏菌，百日咳博代氏杆菌，伯克霍尔德氏菌，莫拉菌，土拉弗朗西斯菌，嗜肺军团菌，贝纳特氏立克次体，拟杆菌，肠杆菌和衣原体。

基于(i)本公开的溶素肽和多肽能钻透革兰氏阴性菌的OM并到达它们的底物、杀灭这样的细菌并且显著降低细菌菌落的生长速率的事实，和(ii)与诸如artilysin的经工程化而在缓冲液和培养基中穿透OM的其他溶素多肽类似的观察结果，预期本公开的溶素多肽将可用于治疗一种或多种革兰氏阴性菌感染。而且，本发明的溶素多肽甚至在与阳离子性和其他抗微生物肽融合(若有的话)之前也具有对抗革兰氏阴性靶标的活性的事实可以相对于artilysin有优势，因为后者似乎被人血清抑制。Deslouches,B.等，Activity ofthe De Novo Engineered Antimicrobial Peptide WLBU2 against Pseudomonasaeruginosa in Human Serum and Whole Blood:Implications for SystemicApplications，Antimicrobial Agents&Chemotherapy，2005年8月，p.3208–3216 Vol.49，No 8；Brogden N.等，Int J Antimicrob Agents.2011年9月；38(3)：217-225。doi:10.1016/j.ijantimicag.2011.05.004；Svenson,J.等，J.Med.Chem.，2007，50(14)，pp3334–3339。

在一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”尤其可以指呼吸道感染(RTI)，特别但不唯一地是下呼吸道感染。在另一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指性传播疾病。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指泌尿道感染。在另一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指慢性支气管炎的急性加重(ACEB)。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指具有囊性纤维化(CF)的患者的呼吸道感染。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指急性中耳炎或新生儿败血症。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指急性鼻窦炎。在一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指由耐药细菌甚至多重耐药细菌引起的感染。在另一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指与导管相关的败血症。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指衣原体。在另一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指社区获得性肺炎(CAP)或医院呼吸道感染。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指并发的皮肤和皮肤结构感染。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指非并发的皮肤和皮肤结构感染。在一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指心内膜炎。在另一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指发热性嗜中性粒细胞减少症。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指淋球菌性宫颈炎。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指淋球菌性尿道炎。在另一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指医院获得性肺炎(HAP)。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指骨髓炎。在又一个实施方式中，术语“感染”和“细菌感染”可以指败血症。本公开的表1中列出了常见的革兰氏阴性病原体和相关的感染。这些实施方式以及表1中列出的病原体和疾病意在作为本发明方法的使用的实例，而无意于进行限制。

表1.医学上相关的革兰氏阴性菌和相关疾病

在一个实施方式中，本公开提供了用于治疗由铜绿假单胞菌和任选地由至少一种另外的革兰氏阴性细菌物种引起的受试者中的革兰氏阴性菌感染的方法，所述革兰氏阴性菌是例如选自克雷伯氏杆菌、肠杆菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌的那些，其是人类疾病中最显著的革兰氏阴性菌。

在一个实施方式中，本公开提供了用于治疗由铜绿假单胞菌引起的受试者中的革兰氏阴性菌感染的方法。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是氧化酶阳性的、革兰氏阴性的、杆状的有机体，在环境中无处不在。铜绿假单胞菌可以在许多栖息地中生长，包括但不限于土壤、水以及植物和动物组织上。它是条件致病菌(opportunistic organism)，并且是能够在诸如具有囊性纤维化、癌症、烧伤、糖尿病性溃疡或免疫系统缺陷的人的易感个体中引发局部或全身性疾病的最成问题的医院病原体之一。特别是在医院环境中，它已经变得抵抗许多常用的抗生素。

根据来自美国疾病控制和预防中心以及国家医院感染监测系统的数据，铜绿假单胞菌是医院肺炎的第二最常见原因、泌尿道感染的第三最常见原因、手术部位感染的第四最常见原因、从血流中第七最频繁分离的病原体、以及总体上从所有部位第五最常见的分离物(Solh和Alhajhusain，J Antimicrob Chemother.64(2)：229-38(2009))。而且，铜绿假单胞菌是住院患者中最常见的导致肺炎的多重耐药(MDR)革兰氏阴性病原体(Goossens等，Clin Microbiol Infect.980-3(2003))。

由铜绿假单胞菌引起的感染的非限制性实例包括：A)医院感染：1.呼吸道感染，特别是在囊性纤维化患者和机械通气患者中；2.菌血症和败血症；3.伤口感染，尤其是烧伤受害者的伤口感染；4.泌尿道感染；5.侵入性设备(devises)上的手术后感染；6.静脉内施用受污染的药物溶液引起的心内膜炎；7.具有有着严重中性粒细胞减少的获得性免疫缺陷综合征、癌症化疗、类固醇治疗、血液恶性肿瘤、器官移植、肾脏替换疗法和其他病症的患者中的感染。B)社区获得性感染：1.社区获得性呼吸道感染；2.脑膜炎；3.由受污染的水引起的毛囊炎和耳道感染；4.老年人和糖尿病患者中的恶性外耳炎；5.儿童跟骨的骨髓炎；6.通常与被污染的隐形眼镜相关的眼部感染；7.皮肤感染，例如手经常暴露于水的人中的指甲感染；8.胃肠道感染；和9.肌肉骨骼系统感染。

在一些实施方式中，本公开的溶素多肽用于治疗处于获得由铜绿假单胞菌和/或另外的革兰氏阴性菌引起的感染的风险中的受试者。处于获得铜绿假单胞菌或其他革兰氏阴性菌感染风险中的受试者包括但不限于例如囊性纤维化患者、嗜中性白血球减少症患者、坏死性小肠结肠炎患者、烧伤患者，伤口感染患者以及更通常地在医院环境中的患者，特别是被使用诸如导管(例如中心静脉导管)、希克曼装置或电生理学心脏装置(例如起搏器和可植入除颤器)的可植入医疗器械治疗的手术患者和患者。处于感染包括铜绿假单胞菌的革兰氏阴性菌的风险中的其他患者组包括但不限于具有植入假体的患者，例如全关节置换(例如全膝或髋关节置换)。

在一个实施方式中，受试者患有革兰氏阴性菌呼吸感染。在另一个实施方式中，受试者患有囊性纤维化并且每种活性成分独立地在可吸入组合物、口服组合物或口含组合物中被施用。在更具体的实施方式中，受试者患有与囊性纤维化相关的革兰氏阴性菌呼吸感染，并且每种活性成分在可吸入组合物中被共同施用。在一个实施方式中，受试者患有已被铜绿假单胞菌或另外的革兰氏阴性菌感染的伤口。可以通过本公开的方法治疗的伤口的实例是受感染的烧伤或处于变为受感染的风险中的烧伤。这样的烧伤包括热(热)烧伤、低温烧伤、化学烧伤、电烧伤或辐射烧伤。

另外，铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性菌经常在医院食物、水槽、水龙头、拖把和呼吸设备中定殖。感染通过接触污染物或通过摄入受污染的食物和水而从患者传播给患者(Barbara Iglewski，Medical Microbiology，第4版，第27章，Pseudomonas，1996)。

在一个实施方式中，本公开的溶素多肽与其他疗法组合用于治疗受试者中的革兰氏阴性菌感染(或尚未表征的感染)。这样的任选的组合疗法可以包括向有需要的患者共同施用另外的治疗剂，例如抗生素或其他杀菌剂或抑菌剂、和/或靶向病原体表面的不同组分(例如，靶向外膜的不同组分)的另外的溶素。除抗生素外，杀菌剂和抑菌剂包括但不限于溶素、消毒剂、防腐剂(antiseptics)和防腐剂(preservatives)。这些中的任一种可以任选地与本公开的溶素多肽组合使用。

抗微生物消毒剂包括但不限于次氯酸盐、氯胺、二氯异氰尿酸盐和三氯异氰尿酸盐、湿氯气、二氧化氯、过乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和尿素过氧化氢合物、聚维酮碘、碘酊、碘化非离子表面活性剂、乙醇、正丙醇和异丙醇及其混合物；2-苯氧乙醇和1-和2-苯氧丙醇、甲酚、六氯酚、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、二溴酚及其盐、苯扎氯铵、鲸蜡基三甲基溴化铵或鲸蜡基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、氯化鲸蜡基吡啶、氯化苄乙氧铵、洗必泰、glucoprotamine、奥替尼啶二盐酸盐、臭氧和高锰酸盐溶液、胶体银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、铜、硫酸铜、铜氧化物-氯化物、磷酸、硝酸、硫酸、氨基磺酸、甲苯磺酸、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙。

本公开的溶素多肽与防腐剂的组合可以提供比抗生素组合更强的对抗革兰氏阴性菌的效力。防腐剂包括但不限于Daquin溶液、次氯酸钠或次氯酸钾溶液、苯磺酰氯酰胺钠溶液、某些碘制剂如聚维酮碘、过氧化物如脲过氧化氢溶液和pH缓冲过乙酸溶液、有或没有防腐剂添加剂的醇、弱有机酸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸、一些酚类化合物如六氯酚、三氯生和二溴酚，以及阳离子活性化合物如苄烷铵、洗必泰、甲基异噻唑酮、α-萜品醇、百里酚、氯二甲苯酚奥替尼啶溶液。

如在本领域的技术之内，本公开的溶素可以与标准护理抗生素或与最后手段的抗生素单独或以各种组合共同施用。用于对抗铜绿假单胞菌活性的传统抗生素包括氨基糖苷类、替卡西林、脲基青霉素、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、碳青霉烯类、环丙沙星、左氧氟沙星等(表2)。本公开的溶素多肽可与用于治疗铜绿假单胞菌的抗生素和表2中列出的其它共同施用。用于其它革兰氏阴性菌如克雷伯氏杆菌、肠杆菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌的抗生素的列表将与上文提供的用于铜绿假单胞菌的类似，并且将是用于涉及的特定细菌的标准护理抗生素或甚至是最后手段的抗生素(如果该特定菌株抵抗标准护理抗生素)。

待共同施用的另外的任选的治疗剂包括但不限于上述抗生素以及表2中列出的那些，例如替卡西林-克拉维酸组合、哌拉西林-他唑巴坦组合、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、环丙沙星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、多粘菌素B和粘菌素(多粘菌素E)。为了治疗伤口，待共同施用的治疗剂包括但不限于丙二醇水凝胶(例如(Johnson&Johnson))；防腐剂；抗生素；和皮质类固醇。

表2.用于治疗铜绿假单胞菌的抗生素

已经使用抗生素肽例如多粘菌素B和相关的粘菌素(多粘菌素E)作为用于治疗铜绿假单胞菌细菌感染的抗菌剂。因此，在一个实施方式中，本公开的溶素多肽将与多粘菌素B和/或粘菌素共同施用。

组合本公开的溶素多肽与抗生素提供了有效的新的抗微生物方案。在一个实施方式中，本公开的溶素多肽与一种或多种抗生素的共同施用可以在溶素或抗生素中的任一或两者的降低的剂量和量、和/或降低的频率和/或治疗持续时间下进行，具有增强的杀菌和抑菌活性、降低的抗生素抗性风险，并具有降低的有害的神经或肾脏副作用(例如与粘菌素或多粘菌素B使用有关的那些)的风险。先前的研究已经显示总累积粘菌素剂量与肾损伤相关，这表明使用与溶素多肽的组合治疗的剂量减少或治疗持续时间缩短可减少肾毒性的发生率(Spapen等Ann Intensive Care.1：14(2011))。如本文所用，术语“减少的剂量”是指与用相同活性成分的单药治疗相比的组合中的一种活性成分的剂量。“治疗持续时间”同上。在一些实施方式中，组合中溶素或抗生素的剂量相比于各自的单药治疗可以是次优的或甚至亚阈值的。

在一些实施方式中，本公开的溶素多肽用于治疗细菌感染，例如由耐药性革兰氏阴性菌引起的感染。在进一步的实施方式中，本公开的溶素多肽单独或与一种或多种抗生素一起用于治疗细菌感染，例如由多药耐药性革兰氏阴性菌引起的感染。在本公开的上下文中，耐药性或多药耐药性革兰氏阴性菌包括但不限于铜绿假单胞菌。

在实践中，感染通常是多微生物的，具有混合的革兰氏阳性和革兰氏阴性物种(Citron等，J Clin Microbiol.45(9)：2819-2828(2007))。在一些实施方式中，本公开的具有对抗革兰氏阴性菌的活性的溶素多肽不但可与有效对抗革兰氏阴性菌的抗生素一起使用，而且还可与适用于治疗革兰氏阳性菌的一种或多种抗生素和/或一种或多种其他溶素组合使用，取决于给定受试者的感染。

在一个实施方式中，本公开的溶素多肽能够破坏或降解革兰氏阴性菌的细胞壁。在一个优选的实施方式中，本公开的溶素多肽能够破坏或降解铜绿假单胞菌的细胞壁。

在一些实施方式中，本公开提供了抑制一种或多种革兰氏阴性菌的生长的方法，其包括在使得革兰氏阴性菌的生长受到抑制的量和条件下向受试者施用或向特定环境递送本文公开的一种或多种溶素多肽或其药学上可接受的组合物。

在另一个实施方式中，本公开提供了抑制铜绿假单胞菌和/或一种或多种其他革兰氏阴性菌的生长的方法，其包括向受试者施用与其它临床相关试剂组合的本文公开的一种或多种溶素多肽。

在一些实施方式中，本公开提供了通过使铜绿假单胞菌和/或一种或多种其他革兰氏阴性菌的外膜与本公开的一种或多种溶素多肽接触(将细菌暴露于其)而增加所述外膜的渗透性的方法。

在进一步的实施方式中，本公开提供了通过使铜绿假单胞菌和/或一种或多种其他革兰氏阴性菌的外膜与和其它临床相关试剂如抗生素、杀菌剂、防腐剂等组合的本文公开的溶素多肽接触而增加所述外膜的渗透性的方法。

在一些实施方式中，本公开提供了通过向受试者施用本文公开的一种或多种溶素多肽连同感兴趣的抗生素，与单独使用的一种或多种抗生素的活性相比，增强所述抗生素对抗革兰氏阴性菌的抗生素活性的方法。该组合有效对抗细菌并允许克服对该抗生素的抵抗性和/或以较低剂量使用该抗生素，减少不期望的副作用，例如多粘菌素B的肾毒性和神经毒性作用。

本公开的化合物可单独使用或与革兰氏阴性菌的外膜的另外的透化剂组合使用，包括但不限于例如金属螯合剂，例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸(VaaraM.Microbiol Rev.56(3)：395-441(1992))。

在一个实施方式中，本公开的溶素多肽是化学修饰的。化学修饰包括但不限于添加化学部分、创建新键和去除化学部分。化学修饰可发生在溶素多肽的任何位置，包括氨基酸侧链以及氨基或羧基端。这样的修饰可以存在于溶素多肽中的多于一个位点。此外，溶素多肽的一个或多个侧基、或端基，可以由本领域普通技术人员已知的保护基所保护。

在一些实施方式中，溶素多肽含有持续时间增强性部分的连接。在一个实施方式中，持续时间增强性部分是聚乙二醇。聚乙二醇(“PEG”)已被用于获得持续时间增强的治疗性多肽(Zalipsky,S.，Bioconjugate Chemistry，6：150-165(1995)；Mehvar,R.，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3：125-136(2000))。PEG骨架[(CH₂CH₂—O—)_n，n：重复单体的数量]是柔性的和两亲性的。当连接到另外的化学实体如溶素多肽时，PEG聚合物链可以保护这样的溶素多肽免受免疫应答和其他清除机制的影响。因此，聚乙二醇化可以通过优化药代动力学、增加生物利用度以及降低免疫原性和给药量和/或频率而导致溶素多肽功效和安全性改善。“聚乙二醇化”是指PEG分子与另外的化合物例如溶素多肽的缀合。

在一个实施方式中，本公开涉及预防、减少、治疗或除去医疗器械，表面如医院和其他健康相关或公共使用建筑中的地板、楼梯、墙壁和工作台面，和手术室、急诊室、病房、诊所和浴室等中的设备的表面的革兰氏阴性菌污染。可使用本文所述组合物保护的医疗器械的实例包括但不限于管道和其他表面医疗器械，例如导尿管、粘液提取导管、抽吸导管、脐带插管、隐形眼镜、子宫内装置、阴道内和肠内装置、气管内管、支气管镜、牙齿假体和牙齿矫正装置、手术器械、牙科器械、管道、牙科用水线、织物、纸张、指示条(例如纸指示条或塑料指示条)、粘合剂(例如水凝胶粘合剂、熔融粘合剂或溶剂基粘合剂)、绷带、组织敷料或愈合装置和闭塞贴片，以及医疗领域中使用的任何其它表面装置。装置可以包括各种类型的电极、外部假体、固定带、压迫绷带和监视器。医疗设备还可以包括可以放置在插入或植入部位处的任何装置，所述部位例如插入或植入部位附近的皮肤，并且其可以包括易感于革兰氏阴性菌定殖的至少一个表面。

在一个实施方式中，本公开的溶素多肽用于保护食物免于革兰氏阴性菌污染，其包括向食物中添加包含溶素多肽的本公开的组合物。这样的食物产品的实例是肉制品(熏制的和/或未熏制的、新鲜的和/或烹饪的)、沙拉和其他蔬菜制品、饮料和乳制品、半加工食品、方便食品例如即食餐和干制食品等。

细菌对人类构成的问题之一是生物膜的形成。当微生物细胞彼此粘附并嵌入表面上的细胞外聚合物质(EPS)基质中时，生物膜形成发生。微生物在富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白质)和营养素的这样的受保护环境中的生长允许增强的微生物串扰(cross-talk)和增加的毒力。由于生物膜可以在任何支持环境中出现，因此需要能够预防或去除生物膜形成的方法或组合物。已显示铜绿假单胞菌在各种活体和非生命体表面上形成生物膜，所述表面例如CF肺的粘液栓、污染的导管、隐形眼镜等(Sharma等，Biologicals，42(1)：1-7(2014))。因此，在一个实施方式中，本公开的溶素多肽可以用于预防、控制、破坏和治疗细菌生物膜，特别是由铜绿假单胞菌形成或导致的细菌生物膜。

本公开的溶素多肽可以体内使用，例如用于治疗受试者中的细菌感染，以及体外使用，例如用于处理培养物中的细胞(例如细菌)以消除或降低细胞培养物的细菌污染水平。

生产溶素多肽的方法

在一个实施方式中，本公开包括生产杀灭或抑制一种或多种革兰氏阴性菌，优选铜绿假单胞菌的生长的本公开的溶素多肽的方法，所述方法包括在合适的条件下培养包含编码一种或多种溶素多肽的溶素多核苷酸的宿主细胞以表达所述多肽。

为了获得高水平的溶素多肽表达，溶素多核苷酸序列典型地通过在合适的表达载体中将它们可操作地连接至表达控制序列并使用该表达载体转化合适的细胞宿主而表达。编码本公开的溶素多肽的多核苷酸序列与表达控制序列的这样的可操作连接包括在多核苷酸(DNA)序列上游的正确阅读框中提供起始密码子ATG。通常，适用于在宿主中保持、增殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体可用于表达溶素多肽。合适的DNA/多核苷酸序列可以通过各种众所周知且常规的技术中的任何一种插入表达系统中，例如在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual中提出的那些技术。另外，还可以将标签加入溶素多肽中以提供便利的分离方法，例如c-myc、生物素、聚-His等。用于这样的表达系统的试剂盒可商购获得。

种类繁多的宿主/表达载体组合可用于表达编码本公开的溶素多肽的多核苷酸序列。大量的合适载体对于本领域技术人员是已知的，并且是可商购的。在Sambrook等编辑的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory(2001)中提供了合适的载体的实例。这样的载体包括，尤其是，染色体、游离体和病毒衍生的载体，例如，衍生自以下的载体：细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒(papova virus)如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件如粘粒和噬菌粒的载体。此外，所述载体可以提供本公开的溶素多肽的组成型或诱导型表达。更具体地，合适的载体包括但不限于SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9和它们的衍生物，质粒如RP4、pBAD24和pBAD-TOPO；噬菌体DNAS，例如噬菌体λ的许多衍生物，例如NM989和其它噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2D质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，例如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如已经修饰为使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。上述载体中的许多可从供应商如NewEngland Biolabs、Addgene、Clontech、Life Technologies等商购获得，其中许多也提供合适的宿主细胞。

另外，载体可以包含各种调控元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、用于控制表达水平的各种顺式元件)，其中载体根据宿主细胞而构建。种类繁多的表达控制序列(控制与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的序列)中的任何一种可用于这些载体中以表达编码溶素多肽的多核苷酸序列。有用的控制序列包括但不限于：SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统的早期或晚期启动子、噬菌体λ的主要操作子和启动子区域、fd包衣蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母交配因子的启动子、用于在细菌中表达的大肠杆菌启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他启动子序列，及其各种组合。

种类繁多的宿主细胞可用于表达本公开的溶素多肽。适用于表达本公开的溶素多肽的宿主细胞的非限制性实例包括众所周知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌菌株、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、真菌如酵母菌，和动物细胞如CHO、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养物中的人细胞和植物细胞。虽然表达宿主可以是任何已知的表达宿主细胞，但在一个优选的实施方式中，表达宿主是大肠杆菌菌株之一。这些包括但不限于商业可购的大肠杆菌菌株如Top10(Thermo Fisher Scientific)、DH5α(Thermo Fisher Scientific)、XL1-Blue(AgilentTechnologie)、SCS110(Stratagene)、JM109(Promega)、LMG194(ATCC)和BL21(ThermoFisher Scientific)。使用大肠杆菌作为宿主系统具有多种优点，包括：快速生长动力学，其中在最佳环境条件下，其倍增时间为约20分钟(Sezonov等，J.Bacteriol.189 8746-8749 (2007))，容易实现高密度培养，使用外源DNA容易且快速转化等。关于大肠杆菌中蛋白质表达的详细信息，包括质粒选择以及菌株选择，由Rosano,G.和Ceccarelli,E.，FrontMicrobiol.，5：172(2014)所详细讨论。

溶素多肽及其载体的有效表达取决于多种因素，例如最佳表达信号(均处于转录和翻译水平)、正确的蛋白质折叠和细胞生长特征。关于构建载体的方法和将构建的重组载体转导入宿主细胞的方法，可以使用本领域已知的常规方法。尽管理解并非所有载体、表达控制序列和宿主将同样良好地表达编码本公开的溶素肽的多核苷酸序列，但在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员将能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主，而无需过多实验以完成期望的表达。在一些实施方式中，本发明人已经发现表达水平与经表达的多肽的活性之间的相关性；特别在大肠杆菌表达系统中，中等水平的表达(例如约1和10mg/升之间)已经产生具有与在大肠杆菌中以更高水平表达(例如在约20和约100mg/升之间)的那些相比更高水平的活性的溶素多肽，后者有时产生完全失活的多肽。

通过众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱，可以从重组细胞培养物中回收和纯化本公开的溶素多肽。高效液相色谱也可用于溶素多肽纯化。

或者，用于产生本公开的溶素多肽的载体系统可以是无细胞表达系统。各种无细胞表达系统是可商购的，包括但不限于可从Promega、LifeTechnologies、Clonetech等获得的那些。

如上所述，当涉及蛋白质生产和纯化时，存在一系列选择。以下，发明人列入作为非限制性实例的可用于在大肠杆菌中生产本公开的溶素多肽的一般方案。StructuralGenomics Consortium，Nat Methods.，5(2)：135-146(2008)中进一步提供了在蛋白质生产和纯化中考虑的合适方法和策略的实例。

示例性方案：

1.通过全基因合成生产编码溶素多肽的DNA。

2.接下来将DNA片段连接到优选诱导型载体如pBAD24(可用阿拉伯糖诱导)中并转化到大肠杆菌细胞(例如来自Invitrogen，Carlsbad，CA的TOP10)中。

3.将转化的细菌涂布在补充有肉汤如Lysogeny肉汤(LB)、载体诱导剂(例如0.2％阿拉伯糖)和可选择标记物(例如50μg/ml羧苄青霉素)的琼脂平板上并且优选在37℃下孵育过夜。

4.在补充有可选择标记物的肉汤(例如补充有50μg/ml羧苄青霉素的LB)中生长含有溶素质粒的大肠杆菌Top10细胞的单一紧密培养物(single close culture)，优选在37℃下过夜。然后可以将培养物在补充有可选择标记物的新鲜培养基(例如补充有羧苄青霉素的LB)中稀释例如1：200，并再孵育例如3小时。通过加入诱导剂(例如0.2％L-阿拉伯糖)诱导溶素表达，并优选在30℃下孵育细胞过夜。

5.将细胞沉淀重悬于缓冲液(例如20mM Tris，pH 6.8)中并均化。

6.在含有合适离子强度的单价盐(例如等于300-500mM的NaCl的离子强度)的充分缓冲溶液中进行蛋白质增溶和纯化(使用一种或多种色谱技术)。

7.优选将固定金属亲和色谱(IMAC)用作初始纯化步骤。如果需要额外的纯化，可将尺寸排阻色谱(凝胶过滤)用于进一步的步骤。如果有必要，也可将离子交换色谱用作最后的步骤。

溶素多肽的识别

本公开是基于识别具有对抗指数期铜绿假单胞菌菌株PAO1的有效抗菌活性的五种溶素(实施例1和2)。为了识别本公开的溶素多肽，本发明人使用了与抗菌筛选结合的基于生物信息学的方法。在如此识别的序列中，一些先前被注释为推定的内溶素。然而，本发明人发现其中绝大多数(他们筛选了超过80个多肽)没有任何溶素活性，或不具有对抗靶生物体铜绿假单胞菌的活性。将识别为具有活性的5种溶素命名为GN37(SEQ ID NO:1)、GN2(SEQ ID NO:2)、GN4(SEQ ID NO:3)、GN14(SEQ ID NO:4)和GN43(SEQ ID NO:NO：5)。首先，发明人评估了纯化的溶素(将其合成、克隆到表达载体pBAD26中、然后纯化)透化铜绿假单胞菌的外膜(OM)的能力(实施例1)。

大多数革兰氏阴性菌排斥疏水性化合物，并且不允许摄取疏水性试剂如1-N-苯基萘胺(NPN)、结晶紫或8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)。对疏水性化合物的强抗性是由于外膜(OM)的存在，其含有将OM锚定到肽聚糖并保持其稳定的相关蛋白质。由于其疏水特性，NPN在疏水性条件下强烈地发出荧光，并在水性条件下微弱地发出荧光(J Sokatch，The biologyof pseudomonas，2012年12月，Elsevier)。因此，NPN荧光可以用作外膜渗透性的量度。

在本公开中，许多溶素(GN1、GN2、GN4、GN8、GN14、GN20、GN22、GN26、GN27、GN28、GN30、GN37和GN43)透化铜绿假单胞菌菌株PAO1的OM的能力是在存在或不存在上述溶素的情况下，通过将NPN与PAO1细胞一起孵育而测试。如图3中所示，与不存在溶素(阴性对照)时发出的荧光相比，在GN37(SEQ ID NO:1)、GN2(SEQ ID NO:2)、GN4(SEQ ID NO:3)、GN14(SEQID NO:4)和GN43(SEQ ID NO:5)的存在下孵育NPN产生最高诱导的荧光。而且，与由已确定的透化剂EDTA(乙二胺四乙酸盐)引起的OM渗透性相比，五种溶素(GN2、GN4、GN14、GN37和GN43)中的每一种均引起显著更强的OM渗透性。而且，五种溶素中的每一种均使OM透化，其类似于或优于用于治疗铜绿假单胞菌的最后手段的已知抗生素多粘菌素B(PMB)。本公开的活性溶素一般具有大小在对于GN14为15个氨基酸残基和对于GN43为33个氨基酸残基之间变化的C端(除了GN14以外，其具有N端)α-螺旋两亲性结构域。包含α-螺旋两亲性结构域的序列的GN2、GN4、GN14、GN37和GN43的共同特征包括在表3中。可以使用各种软件程序如http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/的Jpred4确定二级多肽结构。特别是使用Helical Wheel(http://kael.net/helical.htm)检查两亲性α螺旋。还提供了GN37(SEQ IDNO 11)、GN2(SEQ ID NO 12)、GN4(SEQ ID NO 13)、GN14(SEQ ID NO 14)和GN43(SEQ ID NO15)的核酸序列(图1A和图2)。

表3.每种溶素多肽的一般特征和相应的C端α-螺旋两亲性结构域的序列(粗体和下划线区域代表α-螺旋两亲性结构域)。

由于GN2、GN4、GN14、GN37和GN43表现出有效的膜透化活性，评估了五种溶素中的每一种对抗铜绿假单胞菌菌株PAO1的抗菌活性(实施例2)。除了使用EDTA和PMB作为阳性对照外，还包括人溶菌酶和新生霉素。人溶菌酶(HuLYS)是在涉及肺部感染的病理生理学中的各种组织、细胞和分泌物中发现的天然存在的抗微生物肽(Callewaert等，J.Biosci.35：127-160(2010))。已经显示其通过降解细菌细胞壁中的肽聚糖而对革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体(包括铜绿假单胞菌)两者都有效。新生霉素(阿巴霉素，Cathamycin，Spheromycin)是从雪白链霉菌(Streptomyces niveus)分离的氨基香豆素抗生素。它主要具有对抗革兰氏阳性菌的活性，但某些革兰氏阴性菌株也是易感性的(Lindsey Grayson，Kucers的The Use of Antibiotics:A Clinical Review of Antibacterial,Antifungaland Antiviral Drugs，CRC Press第6版，2010)。

如图4中所示，与单独的HuLYS或新生霉素相比，所有五种溶素(GN2、GN4、GN14、GN37和GN43)对铜绿假单胞菌菌株PAO1均表现出更高的抗菌活性，同时GN4、GN14和GN37显示与EDTA和PMB相等的抗菌活性。

GN37源自Micavibrio aeruginosavorus，它是以前未被用作抗假单胞菌PGH活性来源的铜绿假单胞菌的捕食者。已有建议使用活的Micavibrio aeruginosavorus作为生物基试剂以控制MDR铜绿假单胞菌(Dashiff等J Appl.，110(2)：431-44(2011))。但是据发明人所知，还没有关于使用该生物体作为个体抗微生物蛋白质、PGH、细菌素、抗生素等的来源的报道。本发明人推断，附着于铜绿假单胞菌表面并由其内提取营养物的表生捕食性细菌必须编码抗假单胞菌PGH活性以刺穿外膜和细胞壁。基于此，针对注释为PGH样酶的基因，扫描Micavibrio aeruginosavorus菌株ARL-13的基因组序列。对五种水解酶进行了识别、克隆和筛选抗假单胞菌活性。现在命名为GN37的基因座是唯一在琼脂覆层板上产生清除区(光环)的ORF。因此，由于实施例3中描述的GN37的独特来源和有效活性，对GN37进行了进一步的详细检查。如实施例3中所示，将GN37与各种已知或推定的溶素进行比较的多序列比对显示GN37与Mitrecin A(Farris和Steinberg，Lett Appl Microbiol.，58(5)：493-502(2014)；和专利公开US20140094401A1)仅有67％相同。与GN37不同，在革兰氏阳性生物体(即链霉菌)的基因组中识别出Mitrecin A。此外，对Mitrecin A描述的活性与GN37相比非常弱(在大致相等的浓度下)。与在GN37处理仅1小时后>3-log的降低相比，Mitrecin A在16小时的孵育内仅获得<1-log的细菌存活力降低(对抗假结核耶尔森氏菌)。

除了本文公开的全长溶素之外，本公开还提供了基于本公开的溶素的C端α-螺旋两亲性结构域的肽衍生物。包含该结构域的多肽的C端(和/或N端)的渐进截短(氨基酸缺失)可以产生活性溶素肽片段直至最小长度的活性溶素肽。可以通过以不破坏α螺旋的方式将一个或多个氨基酸(不同于天然存在的溶素的那些)添加到截短的C(或N)端而进一步修饰这样的肽。可以使用生物信息学方法识别C和N端α-螺旋两亲性结构域两者。α螺旋非破坏性氨基酸的实例是疏水性或带电残基，其延伸α螺旋区或促进膜插入。使用溶素多肽GN4进一步说明氨基酸添加(实施例4，图5)。尽管肽FGN4-1(SEQ ID NO:7)和FGN4-2(SEQ ID NO:8)是GN4(SEQ ID NO:3)的肽片段，PGN4(SEQ ID NO:6)、FGN4-3(SEQ ID NO:9)和FGN4-4(SEQ ID NO:10)各自含有修饰(图5)，存活性测定表明PGN4和FGN4-3比其他测试的GN4肽显示出更高的抗菌活性(图6)。PGN4-4是39个氨基酸的多肽，其包含31个氨基酸的多肽FGN4-2和从乙型肝炎衣壳识别的8个残基的抗菌肽(SQSRESQC)。因此，如图6中所示，添加SQSRESQC肽增强了FGN4-2的活性。天然片段FGN4-1和具有添加的C端半胱氨酸(FGN4-4)的FGN4-4的比较表明向C端添加半胱氨酸增强了FGN4-1的活性。添加半胱氨酸以查看它是否会促进二聚化和增强活性。结果表明，端半胱氨酸增强了活性。另外的修饰包括其中去除11个C端残基的FGN4-2。这些残基不是α螺旋结构需要的(基于二级蛋白质结构考虑)，并且发明人探索以查看是否将维持活性。去除所有11个残基确实降低了活性，但活性可以恢复，并且事实上通过其他修饰(如本段前面所述的那些修饰)得以改善。鉴于上述情况，本领域普通技术人员可通过产生逐渐缺少来自C端α-螺旋两亲性结构域的C端或来自N端或二者的一个或多个氨基酸残基的溶素多肽，并且单独或与具有对抗革兰氏阴性菌的活性的一种或多种抗生素组合测试这样的多肽对抗铜绿假单胞菌和/或另外的革兰氏阴性菌的活性(即抑制、减少种群或杀灭的能力)而容易地生产其C端α-螺旋两亲性结构域完整的截短的溶素。这样的测试可以遵循例如在实施例2、3、4或预示例1中所提供的教导。当然，测试程序和方案本身并不限于这些实施例中的那些，而可以是本领域技术人员已知的用于评估抗菌剂和实际上抗微生物剂的有效性的任何方法。

为了分析人血清中的抗菌活性，将GN溶素多肽和GN肽各自在亚MIC浓度的多粘菌素B的存在和不存在下汇集(实施例5，图7)。PMB是具有对抗铜绿假单胞菌的活性的有效抗生素，浓度为1mcg/ml时，在人血清中处理1小时后导致生存力降低<2-log10。单独的GN4肽池(含有25mcg/ml的每种肽，在图7中标记为“肽池”)不导致生存力降低，而单独的溶素多肽池(含有25mcg/ml浓度的每种GN溶素)仅导致生存力降低＜2-log10(图7)。然而，当与PMB结合时，肽池和溶素池均导致生存力降低≥4-log10(图7)。这些发现表明PMB和本公开的GN溶素多肽的组合的强力的加和或甚至协同效应。预期个体溶素多肽如果单独使用而不是在池中使用，也将导致革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌的生存力显著降低。关于图7的观察是单独的肽池不具有像从图6所预测的那样的活性。这很可能是由于许多抗菌剂的生物活性在人血清的存在下减小的事实(Zhanel等，Antimicrob Agents Chemother.42(9)：2427-2430(1998))。然而，一旦溶素池与PMB共同施用，则尽管存在血清，但溶素池的抗菌活性仍得以恢复(图7)。因此，在人血清的存在下溶素池抗微生物活性的降低可能是由于肽池中的肽之间的拮抗活性在PMB的存在下不再是抑制性的。或者，存在于人血清中的一种或多种蛋白质可能对溶素池具有拮抗作用，其中该作用在添加PMB后被抑制。这两种可能的情况可以通过使用个体溶素多肽进行重复测定，在存在或不存在PMB的情况下在血清中进行测定，以及将结果与使用溶素池获得的结果进行比较而区分。此外，血清中溶素池活性的抑制可能是由于破坏溶素和外膜之间的静电相互作用的高盐浓度。

本公开的GN溶素多肽具有不同于传统抗生素、疫苗和抗毒素治疗剂的细菌活性，并且可用于与革兰氏阴性菌引起的感染斗争。如实施例中所述，与其他治疗剂不同，溶素提供快速杀菌作用，并且当以亚MIC量使用时提供抑菌作用，并且具有对抗一系列抗生素抗性细菌的活性，这反映了先前使用对抗革兰氏阳性菌(包括金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、炭疽芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌)且未与进化抗性相关联的特定溶素获得的结果(Fischetti,V.Curr Opin Microbiol.，11(5)：393-400(2008))。基于本公开，在临床环境中，溶素是用于治疗由耐药和耐多药细菌引起的感染的有效替代物。革兰氏阴性菌的现有抵抗机制不应影响对溶素的PGH活性的敏感性。

本公开的溶素多肽与正在开发的用于治疗革兰氏阴性感染的现有PGH不同。先前描述的artilysin由与外源衍生的阳离子肽融合的带正电的PGH组成(Briers等，Antimicrob Agents Chemother.58(7)：3774-84(2014)；Briers等，MBio.4：e01379-14(2014)；美国专利8,846,865)。而且，artilysin使用不是源自内溶素的聚阳离子肽。相比之下，本公开的溶素多肽的聚阳离子区来源于天然地与铜绿假单胞菌的OM相互作用并且使其不稳定的溶素，预期该特征导致对抗该病原体的改善的靶向效率。

本公开的溶素多肽不需要通过添加抗微生物阳离子肽而修饰，尽管含有添加到如本文所述分离和重组产生的溶素多肽的这样的肽的融合多肽当然也被设想。然而，即使在不存在添加的阳离子或其他抗微生物(抗菌)肽的情况下，本公开的溶素多肽也具有实质性的抗革兰氏阴性抗菌活性，包括抑菌和杀菌活性两者。尽管有上述内容，本公开还设想了融合溶素多肽，其包含与抗微生物肽(AMP、防卫素、寿司肽、阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、疏水性肽)段(例如美国专利申请US2015/0118731_和国际专利申请WO2014/0120074、WO2015/070912；WO2015/071436；WO2015/070911；WO2015/071437；WO/2012/085259；WO2014/001572和WO2013/0344055中所述的那些)融合的具有天然革兰氏阴性抗菌功能的溶素多肽。还设想了含有另外的杀菌节段(即在融合之前本身具有杀菌活性或对母体溶素多肽的杀菌活性有积极贡献的节段)的融合多肽。

药物组合物和制备物

本公开的组合物可以采取以下形式：溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、小丸、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、粉剂、缓释制剂、栓剂、棉塞应用乳剂、气雾剂、喷雾剂、混悬剂、糖锭、锭剂、糖果、注射剂、口香糖、软膏剂、涂片、定时贴片、液体吸收擦拭物及其组合。

本公开的组合物或其药学上可接受的形式的施用可以是局部的，即药物组合物在期望其作用的地方直接施用(例如直接施用于伤口)或全身的。进而，全身施用可以是肠内或口服(即通过消化道给予物质)、肠胃外(即通过消化道以外的其他途径给予物质，例如通过注射或吸入)。因此，本公开的溶素多肽可以口服、肠胃外、通过吸入、局部、直肠、鼻腔、口腔或经由植入的储库或通过任何其他已知方法施用于受试者。本公开的溶素多肽还可以通过缓释剂型施用。

对于口服施用，本公开的溶素多肽可以配制成固体或液体制备物，例如片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂、混悬剂和分散剂。化合物可以用赋形剂如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、明胶、马铃薯淀粉、海藻酸和/或硬脂酸镁进行配制。

为了制备固体组合物如片剂和丸剂，将本公开的溶素多肽或其片段与药物赋形剂混合以形成固体预制剂组合物。如果期望，片剂可以通过标准技术被糖包衣或肠溶包衣。片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式组成以提供提供延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分，后者是前者上的包膜的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，其用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。

本公开的局部组合物可以进一步包含药学上或生理学上可接受的载体，例如皮肤病学或耳可接受的载体。在皮肤病学可接受的载体的情况下，这样的载体优选与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可以包括满足这些要求的常规使用的任何皮肤病学载体。在耳可接受的载体的情况下，载体优选与耳朵的所有部分相容。本领域普通技术人员可以容易地选择这样的载体。用于局部施用本公开化合物的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯和/或聚氧丙烯化合物、乳化蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。在配制皮肤软膏剂时，本公开的活性组分可以配制在油质烃基质、无水吸收基质、油包水吸收基质、水包油水可移除基质和/或水溶性基质中。在配制耳用组合物时，本公开的活性组分可以配制在包括诸如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、纤维素聚合物如羟丙基甲基纤维素和含羧基聚合物如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其他聚合缓和剂的载体的水性聚合悬浮液中。根据本公开的局部组合物可以是适合于局部应用的任何形式，包括水性、水性-醇性、或油性溶液、洗剂或精华素(serum)分散体，水性、无水或油性凝胶，通过将脂肪相分散在水相(OAV或水包油)或相反(W/O或油包水)获得的乳液、微乳液或者微囊、微粒或者离子型和/或非离子型的脂囊泡分散体，霜剂，洗剂，凝胶剂，泡沫剂(其通常需要加压罐、合适的涂抹器、乳化剂和惰性推进剂)，香精，奶类产品，混悬剂或贴剂。本公开的局部组合物还可以含有助剂，例如亲水或亲脂胶凝剂、亲水或亲脂活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香味剂、填料、防晒剂、气味吸收剂和染料。在另一方面，局部抗菌组合物可以与能够粘附或以其他方式与受试者的皮肤或其他组织相关联的装置例如经皮贴片、敷料、垫、包裹物、基质和绷带结合施用，能够递送治疗有效量的根据本公开的一种或多种抗菌溶素多肽。

在一个实施方式中，本公开的局部组合物另外包含用于治疗局部烧伤的一种或多种组分。这样的组分通常包括但不限于丙二醇水凝胶；二醇、纤维素衍生物和水溶性铝盐的组合；防腐剂；抗生素；和皮质类固醇。还可加入湿润剂(如固体或液体蜡酯)、吸收促进剂(如亲水性粘土、或淀粉)、粘性增加剂和皮肤保护剂。局部制剂可以是漂洗剂如漱口水的形式。参见例如WO2004/004650。

本公开的化合物还可以通过注射包含适量的溶素多肽和载体的治疗剂而施用。例如，可通过肌内、鞘内、真皮下、皮下或静脉内施用溶菌素多肽以治疗由革兰氏阴性菌引起的感染，更具体地由铜绿假单胞菌引起的感染。载体可以包含蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合。另外，肠胃外注射的药物组合物除了包含以下的一种或多种外，还可以包含溶素多肽的药学上可接受的水性或非水性溶液：pH缓冲溶液、助剂(例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在使用前不久重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。

在肠胃外注射是所选择的施用模式的情况下，优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂可以包括明胶和白蛋白。可以将血管收缩剂加入到制剂中。根据这种应用类型的药物制备物是无菌和无热原提供的。

稀释剂可进一步包含一种或多种其他赋形剂，例如乙醇、丙二醇、油或药学上可接受的乳化剂或表面活性剂。

在另一个实施方式中，本公开的组合物是可吸入组合物。本公开的可吸入组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施方式中，本公开的溶素多肽有利地配制成干燥的可吸入粉末。在具体的实施方式中，溶素多肽吸入溶液可以进一步与用于气雾递送的推进剂一起配制。在某些实施方式中，溶液可以被雾化。

可将表面活性剂加入到本公开的可吸入药物组合物中以降低药物和推进剂之间的表面和界面张力。在药物、推进剂和赋形剂要形成悬浮液的情况下，可以需要或不需要表面活性剂。在药物、推进剂和赋形剂要形成溶液的情况下，表面活性剂可以是或不是必要的，部分取决于特定药物和赋形剂的溶解度。表面活性剂可以是任何合适的无毒化合物，其与药物无反应性并且实质性降低药物、赋形剂和推进剂之间的表面张力和/或充当阀润滑剂。

合适的表面活性剂的实例包括但不限于：油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯；氯化鲸蜡基吡啶；大豆卵磷脂；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚氧乙烯(10)硬脂基醚；聚氧乙烯(2)油基醚；聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；蓖麻油乙氧基化物；及其组合。

合适的推进剂的实例包括但不限于：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和二氧化碳。

用于可吸入组合物中的合适的赋形剂的实例包括但不限于：乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯；中链、短链或长链脂肪酸的甘油三酯酯，或其任何组合；全氟二甲基环丁烷；全氟环丁烷；聚乙二醇；薄荷醇；丙二醇单月桂酸甘油酯(lauroglycol)；二甘醇单乙基醚；中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯；醇；桉树油；短链脂肪酸；及其组合。

在一些实施方式中，本公开的组合物包括鼻应用。鼻应用包括例如鼻用喷雾剂、滴鼻剂、鼻用软膏剂、洗鼻液、鼻用注射液、鼻用填充物、支气管喷雾剂和吸入器、或间接通过使用咽喉锭剂、漱口水或漱口剂、或通过使用涂敷至鼻孔或面部的软膏，或这些和类似应用方法的任何组合。

在另一个实施方式中，本公开的药物组合物含有补充剂，包括一种或多种抗微生物剂和/或一种或多种常规抗生素。为了加速感染治疗或增强抗菌作用，含有本公开的一种或多种溶素多肽的治疗剂可以进一步包含也可以加强溶素多肽的杀菌活性的至少一种补充剂。补充剂可以是用于治疗革兰氏阴性菌的一种或多种抗生素。在优选的实施方式中，补充剂是用于治疗由铜绿假单胞菌所引起的感染的抗生素或抗微生物剂。

施用于受试者的剂量和频率

本公开的组合物可以以单位剂型存在，并且可以通过本领域众所周知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据待治疗的宿主、受体暴露于感染性细菌的持续时间、受试者的大小和体重、以及特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的每种化合物的量。通常，在100％中，总量将在约1％至约99％的活性成分的范围内，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。

施用的剂量取决于许多因素，包括被治疗的感染的活性、待治疗的受试者的年龄、健康和一般身体状况、特定溶素多肽的活性、根据本公开的溶素多肽与其配对的抗生素的特性和活性(若有的话)、以及这样的配对的组合效果。通常，预期待施用的本发明溶素多肽的有效量落入每天施用1-4次、至多14天时间段的1-50mg/kg范围内。如果还使用抗生素，则将以标准给药方案或以较低量施用抗生素。然而，所有这样的剂量和方案(不论是溶素多肽还是与其联合施用的任何抗生素)都进行优化。可以通过进行体外和体内试验性功效实验确定最佳剂量，如在本领域的技能之内，但将本公开纳入考虑。

在一些实施方式中，暴露于活性溶素多肽单位的时间可影响每毫升的活性溶素多肽单位的期望浓度。被分类为“长”或“慢”释放载体(例如某些鼻用喷雾剂或锭剂)的载体可以具有或提供每毫升的更低浓度的溶素多肽单位，但经历更长时间段，而“短”或“快”释放载体(例如漱口液)可以具有或提供每毫升的高浓度的溶素多肽单位，但经历更短时间段。存在情况，其中具有高得多的单位/毫升剂量或低得多的单位/毫升剂量可以是必要的。

对于本公开的任何溶素多肽，可以在细胞培养测定中或在动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中初始地估计治疗有效剂量。动物模型也可用于获得期望的浓度范围和施用途径。所获得的信息然后可用于确定有效剂量以及在人中的施用途径。可以进一步调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望效果。可以纳入考虑的另外的因素包括疾病状态的严重程度，患者的年龄、体重和性别；饮食、期望的治疗持续时间、施用方法、施用时间和频率、药物组合、反应灵敏度、和对治疗的耐受性/响应以及治疗医师的判断。

治疗方案可以使得有必要每日(例如，每天一次、两次、三次等)，每隔一天(例如每隔一天一次、两次、三次等)、每半周、每周、每两周一次、一个月一次等施用。在一个实施方式中，可以作为连续输注给予治疗剂。单位剂量可以在多个时机施用。如通过监测临床症状所示，间隔也可以是不规则的。或者，可以作为缓释制剂施用单位剂量，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率可以根据患者变化。本领域技术人员将理解，这样的指导方针将根据局部施用，例如鼻内、吸入、直肠等，或全身施用，例如口服、直肠(例如通过灌肠)、i.m.(肌内)、i.p.(腹膜内)、i.v.(静脉内)、s.c.(皮下)，经尿道等而调整。

实施例

实施例1

革兰氏阴性溶素的识别

使用生物信息学搜索方案识别可用于杀灭革兰氏阴性菌的推定的PGH候选物。首先，发明人生成了从注释的基因组序列获得的铜绿假单胞菌PGH的简短列表，其是用针对噬菌体溶素的搜索术语(包括“酰胺酶”、“溶菌酶”、“氨基葡萄糖苷酶”、“内肽酶”、“肽聚糖水解酶”、“裂解转糖基酶”、“内溶素”、“溶素”和“细胞壁水解酶”)筛选。然后将以这种方式识别的PGH用于通过BLASTP分析检索GenBank中所有的铜绿假单胞菌基因组序列(铜绿假单胞菌组；Taxid：136841)和Micavibrio aeruginosavorus菌株ARL-13的基因组序列以产生更大的组的推定的PGH。然后选择由46个PGH组成的该组的子集用于进一步研究-此处的纳入标准在序列保守性方面是多样性的，并且包括具有一系列推定的催化/细胞壁结合活性的高和低保守性酶两者。合成该46种PGH，将其克隆到细菌表达载体pBAD24(Guzman等，JBacteriol.(14)：4121-30(1995))中，并转化到大肠杆菌菌株Top10(Life Technologies)中。为了评估活性，使用基于平板的测定法筛选所有大肠杆菌克隆(包括载体对照)对铜绿假单胞菌菌株PAO1的裂解活性。然后按照描述的方式(Schuch等，Nature，418(6900)：884-9，(2002))，就液体LB培养物中可溶性蛋白的诱导进一步分析阳性克隆。对于可溶性和活性溶素，然后使用疏水性荧光探针1-N-苯基萘胺(NPN)检测诱导的培养物的粗制大肠杆菌提取物诱导铜绿假单胞菌菌株PAO1的透化的能力。NPN测定是筛选破坏细菌外膜的化合物的标准方法(Helander和Mattila-Sandholm，J Appl Microbiol.，88(2)：213-9(2000))。该筛选方法最终在铜绿假单胞菌菌株和其他革兰氏阴性生物体(包括Micavibrioaeruginosavorus)的基因组中得到了5种候选PGH(具有N和C端的α螺旋结构域)，以及使用海洋宏基因组学识别的那些。然后测试所得蛋白质对抗铜绿假单胞菌菌株PAO1的抗菌活性，其抵抗青霉烯抗生素(Okamoto等，Antimicrob Agents Chemother.45(7)：1964-71(2001))。

为了评估纯化的溶素的活性，检测了铜绿假单胞菌菌株PAO1对疏水性荧光探针1-N-苯基萘胺(NPN)的摄取。由于革兰氏阴性菌的外膜用作对疏水性化合物(包括溶素和NPN)的渗透屏障，GN的透化活性可以通过并且是通过疏水性化合物到达内部靶标的能力评估。因此，尽管NPN通常被外膜排斥，但当其分配到外膜脂质双层中时，其显示出突出的荧光强度。

铜绿假单胞菌PAO1从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。在37℃和250r.p.m的摇床培养箱中，在LB培养基(Sigma-Aldrich)中以10⁵CFU/ml的初始浓度培养细菌。铜绿假单胞菌培养物生长至指数期的开始(A550～0.3)，将每种候选溶素(GN)以10mcg/ml的浓度加入其中。为了测量NPN的摄取，将10μM NPN添加到PBS中含有GN1、GN2、GN4、GN8、GN14、GN20、GN22、GN26、GN27、GN28、GN30、GN37和GN43的指数生长细胞中，并采用荧光分光光度计在1小时时在420nm下监测荧光(图3)。使用抗生素多粘菌素B(5mcg/ml)和EDTA(1mM)作为阳性对照，而用NPN处理但不加入溶素的细胞用作阴性对照。

如图3中所示，当在NPN的存在下用GN2(SEQ ID NO:2)、GN4(SEQ ID NO:3)、GN14(SEQ ID NO:4)、GN37(SEQ ID NO:1)或GN43(SEQ ID NO:5)处理铜绿假单胞菌细胞时，观察到强荧光信号(灰色条)。表4中显示了每种溶素的一般特征。

总体地，这些结果识别了一组显示出透化革兰氏阴性菌的OM的能力的GN溶素，建立了识别对抗革兰氏阴性菌具有活性的溶素的第一步，而不需要借助添加异源肽段。

Leason Ellis Ref.11003/005100-WO0

表4.G2、GN4、GN14、GN37和GN43的一般特征

{11003/005100-WO0/01568855.1}53

实施例2

GN溶素表现出对抗革兰氏阴性菌的强抗菌活性

为了评估纯化的溶素的抗菌活性，评估了在与个体GN溶素一起孵育后，活的铜绿假单胞菌菌株PAO1的生存力。简而言之，在20mM Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液的存在下，用25mcg/ml浓度的指示GN溶素处理10⁶个PAO1细胞1小时(在37℃下，无搅拌)。使用多粘菌素B(PMB，25mcg/ml)、新生霉素(Nov，5mcg/ml)、EDTA(1mM)和人溶菌酶(HuLYZ，25mcg/ml)作为对照。检测阈值为2.0Log10CFU/ml。

如图4所示，每种GN溶素表现出比HuLYZ或新生霉素更高的抗菌活性，而GN4(SEQID NO:3)、GN14(SEQ ID NO:4)和GN37(SEQ ID NO:1)中的每种在分别与EDTA和PMB相比时显示出更强或相等的抗菌活性。

该实验证明GN可以展现出与常规抗生素、人溶菌酶或螯合剂EDTA中的任一种相等或更高的对抗革兰氏阴性菌的抗菌活性。

实施例3

GN37是高效革兰氏阴性抗菌剂

GN37溶素是由Micavibrio aeruginosavorus的381-bp MICA_542基因座编码的126个氨基酸的多肽(图1A)。M.aeruginosavorus是铜绿假单胞菌的捕食者，并且以前没有被用作抗假单胞菌PGH活性的来源。GN37溶素是高度带正电荷的蛋白质，预测的pI为9.69。此外，GN37是具有DD-和DL-羧肽酶活性的PGH的肽酶_M15_4家族的成员(包括VanY超家族的成员)(图1B)。基于BLASTP分析，GN37(SEQ ID NO:1)与来自>50种不同革兰氏阴性物种和1种革兰氏阳性菌物种的蛋白质具有≤67％的同一性。图1C中显示了将GN37与革兰氏阳性同源物(来自链霉菌，GenBank序列AGJ50592.1)和来自革兰氏阴性病原体(包括大肠杆菌(WP_001117823.1和NP_543082.1)、耶尔森氏菌(CAJ28446.1)和鲍氏不动杆菌(WP_034684053.1))的蛋白质进行比较的多序列比对。重要的是，公共数据库中没有序列与GN37具有>67％的同一性。

实施例4

GN4的肽衍生物展现出强大的抗菌活性

除了全长溶素之外，还产生并检测了GN4的五种肽衍生物(对应于基于α螺旋的C端片段)(图5)。第一种肽(FGN4-1，(SEQ ID NO:7))对应于42个氨基酸的C端α-螺旋结构域。这是将该区域足以产生GN4的C端α螺旋两亲性结构域的蛋白质二级结构预测考虑在内而得到(或者它可以通过C端的最末端的渐进截短以及测试每次对活性的影响而得到)。在说明书的其他地方已经描述了另外的修饰的基本原理。

将单个C端半胱氨酸添加至FGN4-1(SEQ ID NO:7)以产生FGN4-4(SEQ ID NO:10)。对于另外3个肽，去除FGN4-1的11个C端残基(FGN4-2，(SEQ ID NO:8))，或者将其去除并用单个赖氨酸(K)残基(FGN4-3，(SEQ ID NO:9))或从乙型肝炎衣壳识别的8残基抗菌肽置换(PGN4，(SEQ ID NO:6))。该乙型肝炎肽是SQSRESQC，并具有来自免疫表位数据库(ImmuneEpitope Database)的表位ID号96916。在杀灭试验中检查每种GN4-衍生肽的抗菌活性(图6)，其中在20mM Tris-HCl(pH7.2)缓冲液的存在下，用10mcg/ml浓度的指定肽衍生物处理10⁵个PAO1细胞1小时(在37℃下，不搅拌)。检测阈值为2.0log10CFU/ml。如图6中所示，每种所测试的肽显示出一些抗菌活性(与用作阴性对照的缓冲液相比)，而FGN4-1和FGN4-4表现出优异的活性，细胞活力降低≥4log。

实施例5

GN溶素和GN肽显示出稳健的抗菌特性

接下来在人血清中评估GN溶素和GN肽的抗菌特性。在37℃下在人血清中无搅拌孵育铜绿假单胞菌细胞1小时，并检测对抗指数期的PAO1的活性。在亚MIC浓度的多粘菌素B(PMB)(1mcg/ml)的存在和不存在下将GN溶素和GN肽(25mcg/ml)各自汇集。检测阈值为2.0log10CFU/ml。如图7中所示，单独的GN溶素池显示与多粘菌素B表现出的抗菌特性相似的抗菌特性。此外，当与PMB结合时，肽池和溶素池两者导致生存力降低≥4-log10。

总体地，这些发现表明人血清中PMB与溶素多肽(GN)或溶素肽之间的强力的加和或协同活性。因为以前的研究已经证明了组合的溶素混合物的个体组分的强抗微生物活性，预期除了溶素池外，个体溶素组分也将与抗生素表现出强力的加和或协同活性(Loeffler等Antimicrob Agents Chemother.1月；47(1)：375-377(2003))。

预示例1

分离的GN溶素的测试

在本实施例中，目的是验证本文所述的GN溶素多肽和GN4的肽衍生物单独地能够抑制除铜绿假单胞菌之外的革兰氏阴性菌菌株的生长或将其杀灭。为此，将测试本公开的分离的多肽(其可以如本文所述表达并通过常规技术纯化)对各种革兰氏阴性菌株如肺炎克雷伯氏菌NCTC 9633(ATCC 13883)、产气肠杆菌NCTC 10006(ATCC 13048)、弗氏柠檬酸杆菌NCT 9750(ATCC 8090)、鼠伤寒沙门氏菌CDC 6516-60(ATCC 14028)、鼠疫耶尔森氏菌(ATCC BAA-1511D-5)、土拉弗朗西斯菌(ATCC 6223)和大肠杆菌DSM1103(ATCC 25822)的抗微生物活性，以上菌株全部可商购。在本实验的另外的组中，可以选择菌株以抵抗一种或多种标准护理抗生素，例如多重耐药性铜绿假单胞菌Br667菌株。

简而言之，将在20mM Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液的存在下，在5-15mcg/ml的浓度下测试GN溶素多肽和GN4肽1小时(37℃下，无搅拌)。检测阈值将为2.0Log10CFU/ml。将单独、或与具有对抗革兰氏阴性菌的活性的抗生素如多粘菌素B或另外的具有对抗革兰氏阴性菌的活性的抗生素如庆大霉素联合，测试每种溶素多肽或其片段的活性。在其中测试溶素多肽克服对抗生素的抗性的能力的本实验的组中，选定的抗生素将是特定细菌对其具有抗性的抗生素。在不同时间点(0、1、4和8小时)自培养基中取出100μL等分的接种物用于通过平板计数技术测定CFU/mL。

基于革兰氏阴性菌的外膜结构的保守性，以及本公开和实施例的GN4及其前述衍生物和其他溶素对抗铜绿假单胞菌的有效性，预期本公开的溶素多肽将展现出对抗革兰氏阴性菌的另外的(除铜绿假单胞菌以外)菌株的抗菌活性。

预示例2

测试GN溶素/溶素肽和另外的抗生素之间的协同作用和加和作用

类似于实施例5中描述的实验设计，将测试本文公开的溶素多肽当与另外的(不同于PMB)抗生素组合使用时的协同或加和作用。GN溶素和GN肽的协同或加和抗菌特性将在人血清中评估。铜绿假单胞菌将在37℃下在人血清中无搅拌孵育1小时，并且将检查对抗指数期的PAO1的活性。将在存在和不存在亚MIC浓度的抗生素如新生霉素、氨基糖苷、碳青霉烯、头孢他啶(第3代)、头孢吡肟(第4代)、头孢吡普(第5代)、氟喹诺酮、哌拉西林、替卡西林、粘菌素、利福霉素(如利福平、利福布丁、利福喷丁等)和青霉素的情况下，各自孵育GN溶素和GN肽(10-25mcg/ml)。细菌存活力将通过平板计数技术以CFU/mL为单位确定。

预示例3

使用体内肺炎模型测试溶素多肽对于多药耐药性铜绿假单胞菌的治疗

将成年C57黑色小鼠维持在无特定病原体条件下的笼中的受控环境中。它们将在充氧室中用吸入的sevorane(Abbot Laboratories)短暂麻醉，并被抬高头呈仰卧位放置。使用灌胃针将MDR铜绿假单胞菌菌株Ka02细菌接种物(50μl乳酸林格溶液中的10⁶cfu)慢慢滴入每只动物的左肺中。

动物将被随机分入3个实验处理组。这三组将由以下组成：1)盐水处理组(n＝5)，其中盐水将在感染后1小时静脉内施用，然后在感染后5小时时进一步腹膜内施用；2)溶素多肽GN4组(n＝5)，其中GN4将在感染后1小时以20mg/kg的剂量静脉内施用，然后在感染后5小时时进一步以15mg/kg的剂量腹膜内施用；和3)阳性对照-亚胺培南治疗组(n＝5)，其中“泰能(Tienam)”(Merck,Sharpe and Dohme)(活性成分亚胺培南(碳青霉烯抗生素))将在感染后1小时以25mg/kg的剂量腹膜内施用，然后在感染后5小时、24小时、29小时、48小时和53小时的时间点进一步以25mg/kg腹膜内施用。

对于所有三组，将每12小时监测存活直到感染后第9天。将使用相同的实验设计测试本文公开的另外的溶素多肽的体内抗微生物活性。

预示例4

在中性粒细胞减少症的小鼠模型中测试溶素多肽对抗铜绿假单胞菌诱导的败血症的保护潜能

将在先前描述的中性粒细胞减少症小鼠的模型中(Pier等，Infect.Immun.57：174-179(1989)；Schreiber等，J.Immunol.146：188-193(1991))测量溶素多肽对抗铜绿假单胞菌的侵袭性感染的保护功效。成年BALB/c ByJ小鼠(Jackson Laboratories，BarHarbor,Me.)将保持在无病原体、无假单胞菌环境中。通过在第1、3和5天对每只小鼠腹膜内施用3mg环磷酰胺(Cytoxan^R′，Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)建立中性粒细胞减少症。在第5天，将在第0小时施用环磷酰胺，在2小时后将腹膜内施用溶素(20mg/kg)或PBS对照，然后在两小时后施用10³cfu的活铜绿假单胞菌06ad PA。之后将每天监测小鼠，并将死亡率作为结果进行测量。此外，为了确定动物治疗的最佳溶素浓度，将测试溶素多肽的另外的浓度。

将使用相同的实验设计测试本文公开的另外的溶素多肽的体内防护性抗微生物活性。

预示例5

人类受试者中全身性感染的治疗

将采用静脉内或气雾化多粘菌素B与本文公开的一种或多种溶素多肽的组合治疗诊断患有由多药耐药性铜绿假单胞菌所导致的全身性呼吸感染的患者。

静脉内多粘菌素B的推荐剂量为1.5至2.5mg/kg/天(1mg＝10,000IU)(Sobieszczyk ME等，J Antimicrob Chemother，54(2)：566-9(2004))。多粘菌素B的静脉输注将施用60-90分钟，15天。包含一种或多种本公开的溶素多肽的药物组合物将以预定浓度每日静脉内施用。或者，气雾化多粘菌素B治疗将以2.5mg/kg/天与包含一种或多种本公开的溶素多肽的药物组合物组合，每天施用(14天)。根据个体患者的临床状况，治疗方案的持续时间和/或浓度可以有所不同。此外，静脉内或气雾化多粘菌素B可以在一天内多次施用。关于使用静脉内和雾化多粘菌素的详细信息由例如Falagas等，Clin Med Res.4(2)：138-146(2006)提供。

在治疗结束时，将评估患者的微生物清除以及安全性。预期患有全身性呼吸感染的患者的治疗将导致与感染相关的症状的减轻和/或患者中致病细菌种群的减少或根除。

预示例6

人类受试者中糖尿病性溃疡的局部治疗

糖尿病足部溃疡感染是糖尿病的严重并发症之一，也是糖尿病患者中住院治疗的主要原因之一。重要的是，铜绿假单胞菌经常在糖尿病足部溃疡中导致严重的组织损伤(Sivanmaliappan和Sevanan，Int J Microbiol.文章ID：605195(2011))。为了显示本公开的溶素多肽在治疗糖尿病足溃疡感染方面的功效，将进行临床研究。

首先，将测试个体患者的伤口培养标本中铜绿假单胞菌的存在。之后，将使用例如根据临床和实验室标准研究所(CLSI)标准的盘扩散法(van der Heijden等，Ann ClinMicrobiol Antimicrob.6：8(2007))确认铜绿假单胞菌对本公开的一种或多种溶素多肽(例如在池中)的易感性。或者，将预选择患者以满足微生物对溶素的易感性的标准。平行地，将在体外测定个体菌株对待使用的合适抗生素(例如多粘菌素B)的易感性(或者将预选择患者以满足微生物对特定抗生素的易感性的标准)。可使用易感性菌株例如铜绿假单胞菌ATCC 27853(对多粘菌素易感)作为质量控制(QC)。此外，将进行伤口培养标本中存在的铜绿假单胞菌对包含溶素多肽和所选择的抗生素如多粘菌素B两者的组合疗法的易感性(以排除由于伤口环境导致的溶素抑制的可能性-参见以上实施例5和图7及其讨论)。

在体外易感性研究之后，发明人将测试本公开的溶素多肽在治疗糖尿病性溃疡感染方面的体内功效。溶素可以通过注射施用，例如静脉内或皮下注射，或者可以作为局部制剂直接施用于伤口。此外，将测试溶素多肽与用于治疗糖尿病的抗生素的组合，其中抗生素可根据特定抗生素的标准剂量按照指示全身(口服或肠胃外)或局部施用。例如，如果多粘菌素B与溶素多肽联合使用，则静脉内多粘菌素B的推荐剂量为1.5至2.5mg/kg/天。

由于糖尿病足溃疡感染通常是多微生物的，具有混合的革兰氏阳性和革兰氏阴性物种(Citron等，J Clin Microbiol.45(9)：2819-2828(2007))，本公开的溶素多肽可以与适用于治疗给定患者的足溃疡感染中存在的革兰氏阳性菌的超过一种抗生素和/或一种或多种其他溶素组合使用。预期高响应率将跟随溶素治疗，例如在细菌种群的对数减少或根除或任何其他临床或实验室测量结果的改善方面。预期对根据本公开的溶素和抗生素的组合的响应甚至更高，因为溶素和抗生素协同作用。事实上，减少溶素或抗生素中的一种或两者的施用量而不牺牲有效性是可能的。

预示例7

人类受试者中烧伤的局部治疗

烧伤伤口感染引起重大担忧，因为它们延迟愈合、促进瘢痕形成并可导致菌血症、败血症或器官衰竭。铜绿假单胞菌是最常见的烧伤感染源(Church等，ClinicalMicrobiology Reviews，19(2)，403-434(2006))。因为本公开的溶素多肽已显示对铜绿假单胞菌具有活性，预期它们可作为单药治疗或有利地与一种或多种抗生素组合而用于治疗这样的感染。

包含本公开的溶素多肽的霜剂、凝胶剂和/或泡沫剂形式的局部组合物将施用在患有各种程度烧伤(包括I、II和III度烧伤)的患者的患病皮肤区域上。含有溶素多肽的、有或没有抗生素或另外的活性剂(对不同靶标生物具有活性的溶素和任选地处理这些靶标生物的抗生素)的局部组合物将在不同的时间间隔内直接施用于感染的烧伤区域。

预期局部施用溶素多肽导致患者的症状的减少或消除，以及致病细菌种群的减少或根除。

前述实施例是对本文描述的方法和特征的说明，并非旨在进行限制。此外，它们包含对本公开的普遍适用性的陈述，并且这样的陈述不限于它们出现在其中的特定的实施例，而是构成对本文描述的实验结果的更广义含义的结论、描述和表达。

所有引用的参考文献的内容通过引用整体并入，如同为了所有目的在本文中完全转录一样。

SEQ ID NO 1：

GN37

多肽序列

MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGLRSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRWDWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFELDRSKYR

SEQ ID NO 2：

GN2

多肽序列

MKISLEGLSLIKKFEGCKLEAYKCSAGVWTIGYGHTAGVKEGDVCTQEEAEKLLRGDIFKFEEYVQDSVKVDLDQSQFDALVAWTFNLGPGNLRSSTMLKKLNNGEYESVPFEMRRWNKAGGKTLDGLIRRRQAESLLFESKEWHQV

SEQ ID NO 3

GN4

多肽序列

MRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLKLLNKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS

SEQ ID NO 4

GN14

多肽序列

MNNELPWVAEARKYIGLREDTSKTSHNPKLLAMLDRMGEFSNESRAWWHDDETPWCGLFVGYCLGVAGRYVVREWYRARAWEAPQLTKLDRPAYGALVTFTRSGGGHVGFIVGKDARGNLMVLGGNQSNAVSIAPFAVSRVTGYFWPSFWRNKTAVKSVPFEERYSLPLLKSNGELSTNEA

SEQ ID NO 5

GN43

多肽序列

MKRTTLNLELESNTDRLLQEKDDLLPQSVTNSSDEGTPFAQVEGASDDNTAEQDSDKPGASVADADTKPVDPEWKTITVASGDTLSTVFTKAGLSTSAMHDMLTSSKDAKRFTHLKVGQEVKLKLDPKGELQALRVKQSELETIGLDKTDKGYSFKREKAQIDLHTAYAHGRITSSLFVAGRNAGLPYNLVTSLSNIFGYDIDFALDLREGDEFDVIYEQHKVNGKQVATGNILAARFVNRGKTYTAVRYTNKQGNTSYYRADGSSMRKAFIRTPVDFARISSRFSLGRRHPILNKIRAHKGVDYAAPIGTPIKATGDGKILEAGRKGGYGNAVVIQHGQRYRTIYGHMSRFAKGIRAGTSVKQGQIIGYVGMTGLATGPHLHYEFQINGRHVDPLSAKLPMADPLGGADRKRFMAQTQPMIARMDQEKKTLLALNKQR

SEQ ID NO 6

PGN4

多肽序列

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRASQSRESQC

SEQ ID NO 7

FGN4-1

多肽序列

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS

SEQ ID NO 8

FGN4-2

多肽序列

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRA

SEQ ID NO 9

FGN4-3

多肽序列

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRK

SEQ ID NO 10

FGN4-4

多肽序列

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLSC

SEQ ID NO 11

GN37

多核苷酸序列

ATGACATACACCCTGAGCAAAAGAAGCCTGGATAACCTAAAAGGCGTTCATCCCGATCTGGTTGCCGTTGTCCATCGCGCCATCCAGCTTACACCGGTTGATTTCGCGGTGATCGAAGGCCTGCGCTCCGTATCCCGCCAAAAGGAACTGGTGGCCGCCGGCGCCAGCAAGACCATGAACAGCCGACACCTGACAGGCCATGCGGTTGATCTAGCCGCTTACGTCAATGGCATCCGCTGGGACTGGCCCCTGTATGACGCCATCGCCGTGGCTGTGAAAGCCGCAGCAAAGGAATTGGGTGTGGCCATCGTGTGGGGCGGTGACTGGACCACGTTTAAGGATGGCCCGCACTTTGAACTGGATCGGAGCAAATACAGATGA

SEQ ID NO 12

GN2

多核苷酸序列

ATGAAAATTAGTTTAGAGGGATTATCTCTCATCAAAAAATTTGAGGGTTGTAAACTAGAAGCATACAAATGTTCTGCAGGAGTGTGGACTATAGGTTATGGTCATACTGCAGGTGTAAAAGAAGGTGATGTTTGCACACAAGAGGAAGCTGAAAAATTATTAAGAGGAGATATCTTTAAATTTGAAGAGTATGTGCAAGATAGTGTAAAGGTTGATTTAGACCAAAGTCAATTTGACGCATTAGTTGCATGGACATTTAATTTAGGCCCAGGTAATTTAAGAAGTTCAACCATGTTGAAAAAATTAAATAATGGAGAGTATGAATCTGTTCCTTTCGAAATGAGAAGGTGGAATAAAGCAGGTGGTAAAACCTTAGATGGTTTAATCAGAAGACGCCAAGCAGAATCATTATTATTTGAAAGTAAAGAGTGGCATCAAGTATAA

SEQ ID NO 13

GN4

多核苷酸序列

ATGCGTACATCCCAACGAGGCATCGACCTCATCAAATCCTTCGAGGGCCTGCGCCTGTCCGCTTACCAGGACTCGGTGGGTGTCTGGACCATAGGTTACGGCACCACTCGGGGCGTCACCCGCTACATGACGATCACCGTCGAGCAGGCCGAGCGGATGCTGTCGAACGACATTCAGCGCTTCGAGCCAGAGCTAGACAGGCTGGCGAAGGTGCCACTGAACCAGAACCAGTGGGATGCCCTGATGAGCTTCGTGTACAACCTGGGCGCGGCCAATCTGGCGTCGTCCACGCTGCTCAAGCTGCTGAACAAGGGTGACTACCAGGGAGCAGCGGACCAGTTCCCGCGCTGGGTGAATGCGGGCGGTAAGCGCTTGGATGGTCTGGTTAAGCGTCGAGCAGCCGAGCGTGCGCTGTTCCTGGAGCCACTATCGTGA

SEQ ID NO 14

GN14

多核苷酸序列

ATGAATAACGAACTTCCTTGGGTAGCCGAAGCCCGAAAGTATATCGGCCTTCGCGAAGACACTTCGAAGACTTCGCATAACCCGAAACTTCTTGCCATGCTTGACCGCATGGGCGAATTTTCCAACGAATCCCGCGCTTGGTGGCACGACGACGAAACGCCTTGGTGCGGACTGTTCGTCGGCTATTGCTTGGGCGTTGCCGGGCGCTACGTCGTCCGCGAATGGTACAGGGCGCGGGCATGGGAAGCCCCGCAGCTTACGAAGCTTGACCGGCCCGCATACGGCGCGCTTGTGACCTTCACGCGAAGCGGCGGCGGCCACGTCGGTTTTATTGTGGGCAAGGATGCGCGCGGAAATCTTATGGTTCTTGGCGGTAATCAGTCGAACGCCGTAAGTATCGCACCGTTCGCAGTATCCCGCGTAACCGGCTATTTCTGGCCGTCGTTCTGGCGAAACAAGACCGCAGTTAAAAGCGTTCCGTTTGAAGAACGTTATTCGCTGCCGCTGTTGAAGTCGAACGGCGAACTTTCGACGAATGAAGCGTAA

SEQ ID NO 15

GN43

多核苷酸序列

ATGAATAACGAACTTCCTTGGGTAGCCGAAGCCCGAAAGTATATCGGCCTTCGCGAAGACACTTCGAAGACTTCGCATAACCCGAAACTTCTTGCCATGCTTGACCGCATGGGCGAATTTTCCAACGAATCCCGCGCTTGGTGGCACGACGACGAAACGCCTTGGTGCGGACTGTTCGTCGGCTATTGCTTGGGCGTTGCCGGGCGCTACGTCGTCCGCGAATGGTACAGGGCGCGGGCATGGGAAGCCCCGCAGCTTACGAAGCTTGACCGGCCCGCATACGGCGCGCTTGTGACCTTCACGCGAAGCGGCGGCGGCCACGTCGGTTTTATTGTGGGCAAGGATGCGCGCGGAAATCTTATGGTTCTTGGCGGTAATCAGTCGAACGCCGTAAGTATCGCACCGTTCGCAGTATCCCGCGTAACCGGCTATTTCTGGCCGTCGTTCTGGCGAAACAAGACCGCAGTTAAAAGCGTTCCGTTTGAAGAACGTTATTCGCTGCCGCTGTTGAAGTCGAACGGCGAACTTTCGACGAATGAAGCGTAA

Claims (24)

1.一种药物组合物，其包含有效量的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段，所述分离的溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、或减少其种群、或将其杀灭；和药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述溶素多肽或片段以有效抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的量存在。

3.权利要求2所述的药物组合物，其为溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气雾剂或喷雾剂。

4.权利要求2所述的药物组合物，其还包含适用于治疗革兰氏阴性菌的一种或多种抗生素。

5.一种包含分离的多核苷酸或所述多核苷酸的互补序列的载体，所述分离的多核苷酸包含编码溶素多肽或其具有溶素活性的片段的核酸分子，所述溶素多肽包含与选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中编码的溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭。

6.一种包含编码溶素多肽或其具有溶素活性的片段的核酸的重组表达载体，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列，其中编码的溶素多肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的特性，所述核酸可操作地连接至异源启动子。

7.包含权利要求5或6所述的载体的宿主细胞。

8.权利要求5或6所述的重组载体，其中所述核酸序列是cDNA序列。

9.一种包含编码溶素多肽或其具有溶素活性的片段的核酸分子的分离的多核苷酸，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中编码的溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭。

10.权利要求3所述的多核苷酸，其为cDNA。

11.一种抑制至少一种革兰氏阴性菌物种的生长、或减少其种群、或将其杀灭的方法，所述方法包括使所述细菌与含有有效量的溶素多肽或其活性片段的组合物接触，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的特性。

12.一种治疗由选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种的革兰氏阴性菌所引起的细菌感染的方法，其包括向诊断患有细菌感染、具有其风险或表现出其症状的受试者施用含有有效量的溶素多肽或其活性片段的组合物，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、减少其种群或将其杀灭的特性。

13.权利要求17或18所述的方法，其中至少一种革兰氏阴性菌物种选自铜绿假单胞菌、克雷伯氏杆菌、肠杆菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌。

14.权利要求17或18所述的方法，其中所述溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少85％、或至少90％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

15.权利要求17或18所述的方法，其中所述溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的序列具有至少95％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

16.权利要求18所述的方法，其中所述革兰氏阴性菌感染是由铜绿假单胞菌所引起的感染。

17.一种在受试者中治疗由革兰氏阴性菌所引起的局部或全身性致病细菌感染的方法，所述革兰氏阴性菌选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种，所述方法包括向受试者施用含有有效量的溶素多肽的组合物，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:15的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或肽具有抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌的生长、减少其种群或将其杀灭的特性。

18.一种预防或治疗细菌感染的方法，其包括向诊断患有细菌感染、具有其风险或表现出其症状的受试者共同施用第一有效量的含有有效量的溶素多肽或其片段的组合物和第二有效量的适用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的组合，所述溶素多肽包含与选自SEQID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列。

19.权利要求18所述的方法，其中所述抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。

20.一种用于增强适用于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的功效的方法，其包括共同施用所述抗生素与一种或多种溶素多肽或其活性片段的组合，所述溶素多肽包含与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中施用所述组合相比个别施用所述抗生素或所述溶素多肽或其活性片段在抑制所述革兰氏阴性菌生长、或减少其种群或将其杀灭方面更为有效。

21.权利要求20所述的方法，其中所述溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:10的序列具有至少90％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

22.权利要求20所述的方法，其中所述溶素多肽氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:10的序列具有至少95％同一性，或是其具有溶素活性的片段。

23.权利要求20所述的方法，其中所述抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。

24.一种分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段，所述溶素多肽包含与选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:10的多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述溶素多肽抑制铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的生长、或减少其种群、或将其杀灭。