JP2023526388A - 新規なポリペプチド、融合ポリペプチド、およびこれを含むグラム陰性菌に対する抗生物質 - Google Patents

新規なポリペプチド、融合ポリペプチド、およびこれを含むグラム陰性菌に対する抗生物質 Download PDF

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Abstract

新規なポリペプチド、および前記ポリペプチドを含む融合ポリペプチドおよびこれらの抗生物質としての用途が提供される。より具体的には、バクテリオファージに由来する新規なポリペプチド、セクロピンＡを含む新規な融合ポリペプチド、および前記ポリペプチドおよび／または融合ポリペプチドを含むグラム陰性菌に対する抗生物質が提供される。

Description

本発明は、新規なポリペプチド、前記ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、およびその抗生物質としての用途が提供される。より具体的には、バクテリオファージに由来する新規なポリペプチド、前記ポリペプチドとセクロピンＡとを含む融合ポリペプチド、および前記ポリペプチドおよび／または融合タンパク質を含むグラム陰性菌に対する抗生物質が提供される。
バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染し、感染された細菌の増殖を抑制し、阻害する細菌特異的ウイルスを意味する。バクテリオファージは宿主自身のバクテリアに感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）した後に細菌細胞内で増殖し、増殖後に子孫バクテリオファージが細菌の外に出てくるときにバクテリオファージのタンパク質であるエンドリシンを用いて宿主である細菌の細胞壁を破壊する方式で細菌を死滅させる能力を有する。したがって、バクテリオファージのエンドリシン活性を有する物質は抗生物質候補として有用に適用される。
近来、抗生物質の耐性菌が急速に増加しており、どんな抗生物質でも治療できない多剤耐性菌が増加している。特に、グラム陰性菌の中の１つであるシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、全世界的に新たな治療方法の開発が急務となっているＥＳＫＡＰＥ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ 種）細菌の中の１種であり、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は多様な感染症に関与する細菌である。したがって、既存の抗生物質とは差別化された治療方法の開発が求められる。
発明が解決しようとする課題
本発明の一実施形態は、新規なポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。前記ポリペプチドは、バクテリオファージに由来またはその変異体であり得る。前記ポリペプチドはエンドリシン活性を有し得る。
他の実施形態は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号７の核酸配列を含み得る。
他の実施形態は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは発現ベクターとして用いられる。
他の実施形態は、前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記ポリヌクレオチドの発現のためのものであり得る。
他の実施形態は、前記配列番号１のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２）、またはこれらの組み合わせを含むバクテリオファージを提供する。前記バクテリオファージのゲノムは配列番号５の核酸配列を含み得る。
他の実施形態は、新規な融合ポリペプチドを提供する。前記融合ポリペプチドは、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）およびエンドリシンを含み得る。前記セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）は、例えば、配列番号８のアミノ酸配列であり得る。前記エンドリシンは、バクテリオファージに由来またはその変異体であり、例えば、配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列であり得る。前記融合ポリペプチドにおいて、前記セクロピンＡ（例えば、配列番号８）およびエンドリシン（例えば、配列番号１または配列番号６）は順序に関係なくリンカーにより連結されるか、またはリンカーなしに直接連結され得る。一実施形態において、前記融合ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列であり得る。
他の実施形態は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１４の核酸配列を含み得る。
他の実施形態は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは発現ベクターとして用いられる。
他の実施形態は、前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、前記ポリヌクレオチドの発現のためのものであり得る。
他の実施形態は、
（１）配列番号１および配列番号６の中から選択される１つ以上のポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１３）、またはこれらの組み合わせ、
（３）前記（１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）前記（２）の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（５）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む組換えベクター、
（６）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）配列番号１のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含むバクテリオファージからなる群より選択される１種以上を含む、抗生物質を提供する。
前記抗生物質は、グラム陰性菌に対して抗生物効果を有し得る。
本発明に係る抗生物質（第１抗生物質）は、他の抗生物質（第２抗生物質）と併用することによって、自体の抗生物効果による相乗効果および第２抗生物質を低濃度としても優れた抗生物効果を発揮することができるという利点を有する。したがって、高濃度の抗生物質の使用による毒性（例えば、腎臓毒性、肝毒性など）などの副作用を減らすことができる。また、他の機作の抗生物質併用による薬剤耐性菌の出現を抑制することができる。
そこで、一実施形態は、
（ａ）（１）配列番号１および配列番号６の中から選択される１つ以上のポリペプチド、（２）前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１３）、またはこれらの組み合わせ、（３）前記（１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）前記（２）の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（５）前記（３）のポリヌクレオチド、（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む組換えベクター、（６）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む組換え細胞、および（７）配列番号１のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含むバクテリオファージからなる群より選択される１種以上；および
（ｂ）抗生物質（例えば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）および／またはコリスチン（Ｃｏｌｉｓｔｉｎ）などのポリミキシン系抗生物質など）を含む併用抗生物質を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含むシュードモナス属細菌の感染またはシュードモナス属細菌によって引き起こされる疾病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質の薬学的有効量をシュードモナス属細菌の感染またはシュードモナス属細菌によって引き起こされる疾病の予防および／または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、シュードモナス属細菌の感染またはシュードモナス属細菌によって引き起こされる疾病の予防または治療方法を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む飼料添加剤を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む消毒剤を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を、消毒を必要とする対象に適用する工程を含む、消毒方法を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む洗浄剤を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を、洗浄を必要とする対象に適用する工程を含む、洗浄方法を提供する。
課題を解決するための手段
細菌を宿主として増殖する、天然の抗生物質に用いられるバクテリオファージが細菌に侵入して内部で増殖が完了すると、完成したファージ粒子が細菌外に放出される。このとき、細菌の細胞壁を攻撃し分解して外部に放出される通路を作る酵素がエンドリシンである。すべてのバクテリオファージはゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）中にこのようなエンドリシン遺伝子を有し、増殖時に発現したエンドリシンタンパク質を用いる。細菌を宿主として増殖するバクテリオファージと細胞壁を分解する特性を有するバクテリオファージ由来のエンドリシンは天然の抗生物質に用いられる。
グラム陽性菌の場合、最も外壁に細胞壁が位置するので、外部からエンドリシンを添加すると、細胞壁が直ちに攻撃されて分解される。これに対して、グラム陰性菌の場合、最も外部に外細胞膜が存在し、その内部に細胞壁が位置するので、外部からエンドリシンを添加しても、まず、外細胞膜を通過しなければ細胞壁に接しない。したがって、基本的にエンドリシンはグラム陰性菌には効果がないことが知られている。本明細書で提供されるエンドリシン活性を有するポリペプチドは、グラム陰性菌を死滅させる効果を有することを特徴とする。
一方、前記セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）は、細菌膜を溶解する作用を有する抗菌活性を有するペプチドである。
本明細書において、新規なポリペプチドまたは新規なポリペプチドにセクロピンＡを融合させた融合ポリペプチドは既存のエンドリシンよりも優れた抗生物効果が証明され、エンドリシン活性を有するポリペプチド、およびその抗生物質および／またはこれに関連する用途を提供する。
以下、本発明をより詳しく説明する。
用語の定義
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と混用）またはポリペプチド（「タンパク質」と混用）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必ず含むことを意味し、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加わる「実質的に同等な配列」を含む（または前記変異を排除しない）ものとして解釈される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなるまたは表現される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必ず含むか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列からなるか、これを必ず含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味する。本明細書において、前記本来の機能は、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）、セクロピンＡ活性（例えば、細胞膜溶解活性）、および／または抗生作用であるか（アミノ酸配列の場合）、またはエンドリシン酵素機能、セクロピンＡ活性、および／または抗生作用を有するタンパク質をコードする機能（核酸配列の場合）であり、前記目的とする機能は、グラム陰性菌、例えばシュードモナス属細菌、例えばシュードモナス・エルギノーサに対する抗生物活性を意味する。
本明細書において、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、与えられた核酸配列またはアミノ酸配列に一致する程度を意味し、百分率（％）で示される。核酸配列に対する同一性の場合、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（参考資料：Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈμｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参考資料：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参考資料：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
本明細書で提供されるタンパク質またはポリペプチドは、天然から分離および／または精製されるか、組換えまたは化学的に合成され得る。本明細書で提供されるタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列がＮ－末端から最初のアミノ酸残基としてメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）またはＭｅｔ－Ａｌａ－Ｓｅｒ（ＭＡＳ）配列を含む場合、前記タンパク質またはポリペプチドが組換えによって生産されたものであり、前記Ｎ－末端から最初のアミノ酸位置のメチオニンは開始コドンによってコードされたものであり得る。したがって、本明細書で提供されるタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列がＮ－末端に組換え生産によるメチオニンを含む場合、前記タンパク質またはポリペプチドが他の方法（例えば、化学的合成または天然から分離）で得られる場合には前記組換え生産によるＮ－末端から１番目のメチオニンを除いた２番目のアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列またはＭＡＳ配列の次のアミノ酸残基（例えば、４番目のアミノ酸残基）から始まるアミノ酸配列を含むと解釈することができる。
新規なポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド
一実施形態は、新規なポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。前記ポリペプチドは、バクテリオファージに由来するものであり得る。前記ポリペプチドは、バクテリオファージに由来するエンドリシン活性を有する。前記ポリペプチドは、分子量が約２８ｋＤａ（２８ｋＤａ±２）であり得る。
他の実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。前記ポリペプチドは、バクテリオファージに由来するエンドリシン変異体であり、バクテリオファージに由来するエンドリシンに比べて、優れたエンドリシン活性および／または抗生物活性を有する。前記ポリペプチドは、分子量が約２８ｋＤａ（２８ｋＤａ±２）であり得る。前記ポリペプチドは、組換えまたは合成（例えば、化学合成）で製造され得る。
他の実施形態は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号７の核酸配列を含み得る。
エンドリシンは、バクテリオファージがコードするペプチドグリカン加水分解酵素を意味する。エンドリシンは、バクテリオファージの増殖の溶解サイクルで後期遺伝子発現中に合成され、バクテリア性ペプチドグリカンの分解によって感染した細胞から子孫ビリオンの放出を媒介する。酵素的活性の側面から、エンドリシンは、通常、グルコサミニダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）、ムラミダーゼ（ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ）（リゾチームの一種）、トランスグリコシラーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、アミダーゼ（ａｍｉｄａｓｅ）、エンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）などからなる群より選択される１つ以上の活性を有し得る。
本明細書において、特に記載がない限り、「配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列を含む」または「配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列からなる」ポリペプチドとしてエンドリシン活性を有するポリペプチドは、
（１）配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必ず含むポリペプチド、および／または
（２）配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列）からなるか、またはこれを必ず含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナス・エルギノーサに対する抗生物活性を有する（維持する）ポリペプチドを意味する。
また、本明細書において、特に記載がない限り、「配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列を含む」または「配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列からなる」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必ず含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または
（ｂ）配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列）からなるか、またはこれを必ず含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナス・エルギノーサに対する抗生物活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または
（ｃ）「配列番号２または配列番号７の核酸配列を含む」または「配列番号２または配列番号７の核酸配列からなる」ポリヌクレオチドを意味し、
「配列番号２または配列番号７の核酸配列を含む」または「配列番号２または配列番号７の核酸配列からなる」ポリヌクレオチドは、
（ｄ）配列番号２または配列番号７の核酸配列からなるか、またはこれを必ず含むポリヌクレオチド、または
（ｅ）配列番号２または配列番号７の核酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有する核酸配列（例えば、配列番号２の核酸配列と９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有する核酸配列または配列番号７の核酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有する核酸配列）からなるか、またはこれを必ず含み、エンドリシン酵素機能（例えば、ペプチドグリカン加水分解活性）および／またはグラム陰性菌に対する抗生物活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
融合ポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド
他の実施形態は、新規な融合ポリペプチドを提供する。前記融合ポリペプチドは、セクロピンＡおよびエンドリシンを含み得る。
前記セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）は、蝶（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ）に由来するものであり、例えば、配列番号８のアミノ酸配列であり得る。前記エンドリシンは、バクテリオファージに由来またはその変異体であり、例えば、配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列であり得る。
前記融合ポリペプチドにおいて、前記セクロピンＡ（例えば、配列番号８）およびエンドリシン（例えば、配列番号１または配列番号６）は順序に関係なく連結される。つまり、前記融合ポリペプチドにおいて、前記セクロピンＡとエンドリシンは、Ｎ－末端から、セクロピンＡおよびエンドリシンの順またはエンドリシンおよびセクロピンＡの順に連結され、例えば、セクロピンＡおよびエンドリシンの順に連結される。
また、前記セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）（例えば、配列番号８）およびエンドリシン（例えば、配列番号１または配列番号６）は、ペプチドリンカーによって連結されるか、またはリンカーなしに直接連結される。
一実施形態において、前記融合ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列であり得る。
前記融合ポリペプチドは、エンドリシンまたはセクロピンＡに比べて、グラム陰性菌に対して優れた抗生物活性および／または優れた細胞外膜透過（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）活性を有する。前記融合ポリペプチドは、分子量が約３４ｋＤａ（例えば、３４ｋＤａ±３）であり得る。前記融合ポリペプチドまたはエンドリシンおよびセクロピンＡは、組換えまたは合成（例えば、化学合成）で製造される。
他の実施形態は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１４の核酸配列を含み得る。
本明細書で提供される新規なポリペプチド（例えば、配列番号１または配列番号６）はエンドリシン活性を有する。エンドリシンは、バクテリオファージがコードするペプチドグリカン加水分解酵素を意味する。エンドリシンは、バクテリオファージの増殖の溶解サイクルで後期遺伝子発現中に合成され、バクテリア性ペプチドグリカンの分解によって感染した細胞から子孫ビリオンの放出を媒介する。酵素的活性の側面から、エンドリシンは、通常、グルコサミニダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）、ムラミダーゼ（ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ）（リゾチームの一種）、トランスグリコシラーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、アミダーゼ（ａｍｉｄａｓｅ）、エンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）などからなる群より選択される１つ以上の活性を有する。
本明細書において、特に記載がない限り、前記融合ポリペプチドは、
（１）配列番号８または配列番号８のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、またはこれを必ず含み、セクロピンＡ活性を有する（維持する）ポリペプチド；および
（２）配列番号１、配列番号６、またはこれらのアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列）からなるか、またはこれを必ず含み、エンドリシン活性を有する（維持する）ポリペプチドを順序と関係なく（例えば、Ｎ－末端から順に）含み得る。
一実施形態において、前記融合ポリペプチドは、
配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列を必ず含むポリペプチド、および／または
配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、またはこれを必ず含み、グラム陰性菌に対する抗生物活性を有する（維持する）ポリペプチドを意味する。
また、本明細書において、特に記載がない限り、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列からなるか、またはこれを必ず含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または
（ｂ）配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、またはこれを必ず含み、グラム陰性菌に対する抗生物活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または
（ｃ）配列番号１１または配列番号１４の核酸配列を含むポリヌクレオチドを意味し、
配列番号１１または配列番号１４の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、
（ｄ）配列番号１１または配列番号１４の核酸配列からなるか、またはこれを必ず含むポリヌクレオチド、および／または
（ｅ）配列番号１１または配列番号１４の核酸配列と９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の同一性を有する核酸配列からなるか、またはこれを必ず含み、グラム陰性菌に対する抗生物活性を有する（維持する）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
本明細書で提供される融合ポリペプチドにおいて、セクロピンＡとエンドリシンは、ペプチドリンカーによって連結されるか、またはペプチドリンカーなしに直接連結される。前記ペプチドリンカーは１～１００個、２～５０個、１～３０個、２～２０個、または２～１０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであり、その含まれているアミノ酸の種類は限定されない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択される１種以上のアミノ酸残基をそれぞれ１つ以上含み得る。ペプチドリンカーに好適なアミノ酸配列は当業界において知られている。一方、前記リンカーは、前記融合タンパク質の構造および／または機能に影響を与えない範囲内で、その長さを多様に決定することができる。例えば、前記ペプチドリンカーはＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択される１種以上を総１～１００個、２～５０個、１～３０個、２～２０個、または２～１０個を含んでなる。一実施形態において、前記ペプチドリンカーは、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２）、（Ｇ）４～１０（例えば、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧなど）、（ＧＧＧＧＳ）１～５（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１など）、（ＥＡＡＡＫ）１－５（例えば、（ＥＡＡＡＫ）３、（ＥＡＡＡＫ）５など）、（ＥＡＡＡＫ）４（ＧＧＧＧＳ）１などで表されるが、これらに限定されるものではない。
組換えベクター、および組換え細胞
他の実施形態は、上述したポリペプチド（配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド）または上述した融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０または配列番号１３）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、発現ベクターとして使用することができる。
他の実施形態は、前記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを好適な宿主細胞で発現させる工程を含む、前記ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチドの製造方法を提供する。前記ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチドを好適な宿主細胞で発現させる工程は、前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む組換え細胞を培養することによって行うことができる。前記エンドリシンの製造方法は、前記発現工程後に発現したエンドリシンを分離および／または精製する工程をさらに含み得る。
前記ポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行うことができる。本明細書において、用語「形質転換」は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するかまたは染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含み得る。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、その導入される形態に限定されない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自己発現に必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位および／または翻訳終結シグナルなどの発現調節因子を含み得る。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドはそれ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列に作動可能に連結される。前記用語「作動可能に連結された」とは、前記ポリヌクレオチドの転写の調節（例えば、転写開始）を行うことができるように発現調節因子（例えば、プロモーター）とポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当技術分野で知られている遺伝子組換え技術を利用して行うことができる。
前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入する方法であればいかなる方法でも行うことができ、宿主細胞に応じて当技術分野で知られている形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法としては、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、用語「ベクター」は、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように好適な調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ構造体を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または翻訳の終結を調節する配列を含み得る。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主細胞のゲノムに関係なく発現するか、または宿主細胞のゲノム自体に組み込まれる。
本発明に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常用いられるすべてのベクターの中から選択することができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
前記ベクターは、前記染色体内の挿入の可否を確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含み得る。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入の可否を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与する遺伝子の中から選択して用いられる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本明細書で提供されるポリペプチドは天然由来のものではなく、組換えまたは化学的に合成されたものであり得る。前記ポリペプチドが組換え生産される場合、精製のために通常のシグナルペプチド、切断部位、タグなどが結合した形態であり得る。したがって、非制限的な一例として、本明細書で提供されるポリペプチドは、タンパク質の組換え生産過程で通常使用可能なシグナルペプチド、切断部位、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ（グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグなど）などからなる群より選択される１つ以上をさらに含む形態であるか、またはこれらが除去された精製された形態であり得る。
抗生物質
他の実施形態は、
（１）配列番号１および配列番号６の中から選択される１つ以上のポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０）、またはこれらの組み合わせ、
（３）前記（１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）前記（２）の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（５）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む組換えベクター、
（６）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）配列番号１のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含むバクテリオファージからなる群より選択される１種以上を含む、抗生物質を提供する。
前記抗生物質は、グラム陰性菌に対して抗生物効果を有する。前記グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌などからなる群より選択される１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、または５種）であり得る。例えば、前記シュードモナス属細菌はシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり、前記アシネトバクター属細菌はアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）であり、前記エシェリヒア属細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、前記エンテロバクター属細菌はエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）であり、前記クレブシエラ属細菌はクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり得るが、これらに限定されるものではない。
本明細書で提供される抗生物質は、上述したポリペプチド（配列番号１または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド）または前記融合ポリペプチド、前記ポリペプチドまたは前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１種以上（以下、第１抗生物質）に加えて、他の抗生物質（第２抗生物質）をさらに含み得る。
前記第２抗生物質は、通常使用される抗生物質、例えば、グラム陰性菌に対して抗生物活性を有する抗生物質の中から選択される１種以上であり得る。一実施形態において、前記第２抗生物質はポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）系抗生物質であって、例えば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）、コリスチン（Ｃｏｌｉｓｔｉｎ）、またはその組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。
このように、抗生物質（第１抗生物質）を他の抗生物質（第２抗生物質）と一緒に併用することによって、第１抗生物質自体の抗生物効果による相乗効果および低濃度の第２抗生物質としても優れた抗生物効果を発揮することができる利点を有する。したがって、高濃度の抗生物質の使用による毒性（例えば、腎臓毒性、肝毒性など）などの副作用を減らすことができる。また、他の機作の抗生物質併用による薬剤耐性菌の出現を抑制することができる。
そこで、一実施形態は、
（ａ）（１）配列番号１および配列番号６の中から選択される１つ以上のポリペプチド、（２）前記ポリペプチドおよびセクロピンＡを含む融合ポリペプチド（例えば、配列番号１０）、またはこれらの組み合わせ、（３）前記（１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）前記（２）の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（５）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む組換えベクター、（６）前記（３）のポリヌクレオチド、前記（４）のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む組換え細胞、および（７）配列番号１のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含むバクテリオファージからなる群より選択される１種以上；および
（ｂ）抗生物質（例えば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）、コリスチン（Ｃｏｌｉｓｔｉｎ）、またはその組み合わせなどのｐｏｌｙｍｙｘｉｎ系抗生物質など）を含む併用抗生物質を提供する。
本明細書において、用語「抗生物質」は、グラム陰性菌に対して成長阻害能および／または殺菌能を有するすべての形態の製剤を包括することで、特段の言及がない限り、抗菌剤、防腐剤および殺菌剤などと互換可能に使用することができる。
薬学組成物
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含むグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって引き起こされる疾病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質の薬学的有効量をグラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって引き起こされる疾病の予防および／または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって引き起こされる疾病の予防または治療方法を提供する。前記予防または治療方法は、前記投与する工程前に、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって引き起こされる疾病の予防または治療を必要とする対象を確認する工程をさらに含み得る。前記グラム陰性菌は上述した通りである。
前記グラム陰性菌によって引き起こされる疾病は、グラム陰性菌の感染が原因となる全ての疾病の中から選択され、例えば、皮膚感染症、床ずれ、肺炎、菌血症、敗血症、心内膜炎、髄膜炎、外耳道炎、中耳炎、角膜炎、骨髄炎、腸炎、腹膜炎、嚢胞性線維症などのシュードモナス属細菌によって引き起こされる疾病；皮膚感染症、肺炎、菌血症、敗血症などのアシネトバクター属細菌によって引き起こされる疾病；腸炎、クローン病、潰瘍性大膓炎、細菌性赤痢、尿路感染症、皮膚感染症、菌血症、敗血症などのエシェリヒア属細菌によって引き起こされる疾病などからなる群より選択されるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用される薬学的有効量は、所望の効果が得られる有効成分の含有量または投与量を意味する。前記薬学組成物中の有効成分の含有量または投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって多様に処方可能である。例えば、前記有効成分がポリペプチドの場合、１回投与量は０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５ｍｇ／ｋｇ、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、または１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これらに限定されるものではない。
他の実施形態において、薬学組成物中の有効成分の含有量は、全体薬学組成物の重量を基準として、０．０１重量％～９９．９重量％、０．０１重量％～９０重量％、０．０１重量％～８０重量％、０．０１重量％～７０重量％、０．０１重量％～６０重量％、０．０１重量％～５０重量％、０．０１重量％～４０重量％、０．０１重量％～３０重量％、１重量％～９９．９重量％、１重量％～９０重量％、１重量％～８０重量％、１重量％～７０重量％、１重量％～６０重量％、１重量％～５０重量％、１重量％～４０重量％、１重量％～３０重量％、５重量％～９９．９重量％、５重量％～９０重量％、５重量％～８０重量％、５重量％～７０重量％、５重量％～６０重量％、５重量％～５０重量％、５重量％～４０重量％、５重量％～３０重量％、１０重量％～９９．９重量％、１０重量％～９０重量％、１０重量％～８０重量％、１０重量％～７０重量％、１０重量％～６０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４０重量％、または１０重量％～３０重量％であり得るが、これらに限定されるものではない。
また、前記薬学組成物は、前記有効成分以外に、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。前記薬学的に許容可能な担体はタンパク質、核酸、または細胞を含む薬物の製剤化に通常用いられるものであって、生物体を刺激せず、有効成分の生物学的活性および／または特性を阻害しない担体を意味する。一例として、前記担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどからなる群より選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。前記薬学組成物はまた、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択される１種以上をさらに含み得る。
前記薬学組成物の投与対象は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類、イヌ、ネコ、豚、牛、馬、羊、ヤギなどの家畜類、鶏、鴨、ガチョウ、キジ、ウズラ、七面鳥などの家禽類などを含む哺乳類から選択される１種以上、またはこれらに由来する細胞、組織、またはこれらの培養物であり得る。
前記薬学組成物は、経口投与または非経口投与によって投与するか、または細胞、組織、または体液に接触させることによって投与することができる。具体的には、非経口投与の場合には、皮下注入、筋肉注入、静脈内注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与可能である。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤型化されなければならない。鼻腔内投与の場合、前記薬学組成物を希釈してスプレーまたはスプレーシステムによって鼻腔に吸収されるように鼻腔噴霧によって投与することができ、前記鼻腔噴霧のための鼻腔噴霧剤または呼吸器用剤型としてはエアゾール剤などが挙げられる。
また、前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、注射剤、懸濁液、シロップ剤、乳化液形態、軟膏剤、貼付剤、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、またはエアゾール剤などの形態で剤型化することができ、剤型化のために分散剤または安定化剤をさらに含み得る。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む飼料添加剤を提供する。
他の実施形態は、前記飼料添加用組成物を含む飼料を提供する。
前記飼料は、前記抗生物質または併用抗生物質を飼料添加剤の形態で別に製造して飼料に混合するか、または飼料製造時に直接添加して製造することができる。
前記飼料中の抗生物質または併用抗生物質は液体または乾燥形態であり、例えば、乾燥粉末形態であり得る。前記抗生物質は、全体飼料重量の０．００５～１０重量％、０．０５～１０重量％、０．１～１０重量％、０．００５～５重量％、０．０５～５重量％、０．１～５重量％、０．００５～２重量％、０．０５～２重量％、または０．１～２重量％で含まれるが、これらに限定されるものではない。また、前記飼料は、前記抗生物質または併用抗生物質以外に、飼料の保存性を高めることができる通常の添加剤をさらに含み得る。
本明細書において、前記抗生物質または併用抗生物質を添加可能な飼料は、市販の飼料、または穀物、根果実、食品加工副産物、藻類、食物繊維、医薬品副産物、油脂類、デンプン類、瓢箪、穀物副産物、タンパク質、無機物、ミネラル、単細胞タンパク質、動物プランクトン、食べ残しなどからなる群より選択されるが、これらに限定されるものではない。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む食品添加物または飲用水添加物を提供する。前記抗生物質または併用抗生物質を飲用水に混合して供給することによって、飲用水中のグラム陰性菌数を減らすことができる。前記グラム陰性菌は上述した通りである。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む消毒剤を提供する。他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を消毒が必要な対象に適用する工程を含む、消毒方法を提供する。前記消毒剤は、病原体による感染を防止するための製剤の総称であり、一般の生活消毒剤、食品や調理場や設備の消毒剤、養鶏場や畜舎などの建物、築堤、陰樹、寝藁、卵座、運搬車両、食器などの各種の生育用品の消毒などに用いられる。
他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を有効性分として含む洗浄剤を提供する。他の実施形態は、前記抗生物質または併用抗生物質を洗浄が必要な対象に適用する工程を含む、洗浄方法を提供する。前記抗生物質はグラム陰性菌に対して抗生物効果を有するので、グラム陰性菌に露出するか、または露出する可能性かある個体の皮膚表面または身体各部などの洗浄用途に適用することができる。前記グラム陰性菌は上述した通りである。
発明の効果
本発明に係る新規なポリペプチド、前記ポリペプチドの変異体、または新規な融合ポリペプチドは、多様なグラム陰性菌に対して優れた細胞外膜透過能および殺菌能を示し、グラム陰性菌に対する抗生物質として有用に用いられる。
シュードモナス・エルギノーサに感染するバクテリオファージＰＢＰＡ９０のエンドリシン（ＬＮＴ１０１）遺伝子を発現する発現ベクターの切断地図である。 バクテリオファージＰＢＰＡ９０由来のエンドリシン（ＬＮＴ１０１）の精製過程を示す図である。 バクテリオファージＰＢＰＡ９０由来のエンドリシン（ＬＮＴ１０１）の試験管内のシュードモナス・エルギノーサに対する抗生物効果を示すグラフである。 バクテリオファージＰＢＰＡ９０由来のエンドリシン（ＬＮＴ１０１）の生体内のシュードモナス・エルギノーサに対する抗生物効果を示すグラフである。 一実施形態によるエンドリシン（ＬＮＴ１０２）（配列番号６）とエンドリシン（ＬＮＴ１０１）（配列番号１）のアミノ酸配列とを比較して示す図である。 エンドリシン（ＬＮＴ１０２）の発現のための発現ベクターｐＢＴ７－ＬＮＴ１０２の切断地図である。 エンドリシン（ＬＮＴ１０２）の精製過程で得られた反応物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる結果を示す図である。 エンドリシン（ＬＮＴ１０２）およびエンドリシン（ＬＮＴ１０１）の多様なグラム陰性菌に対する殺菌能を示すグラフである。 エンドリシン（ＬＮＴ１０２）の濃度および処理時間に応じたグラム陰性菌殺菌能を示すグラフである。 エンドリシン（ＬＮＴ１０２）の濃度および処理時間に応じたグラム陰性菌殺菌能を示すグラフである。 一実施形態による融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の模式図である。 一実施形態による融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の精製過程で得られた反応物のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる結果を示すイメージである。 エンドリシン（ＬＮＴ１０１）、エンドリシン変異体（ＬＮＴ１０２）、および融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の多様なグラム陰性菌に対する外膜透過活性を示すグラフである。 エンドリシン（ＬＮＴ１０１）、エンドリシン変異体（ＬＮＴ１０２）、および融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の多様なグラム陰性菌に対する殺菌能を示すグラフである。 融合ポリペプチドＬＮＴ１０３およびＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１の多様なグラム陰性菌に対する殺菌能を示すグラフである。 一実施形態による融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）とセクロピンＡのグラム陰性菌殺菌能を比較して示すグラフである。 一実施形態による融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の濃度および処理時間に応じたグラム陰性菌殺菌能を示すグラフである。 一実施形態による融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の細胞毒性および溶血試験（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ）の評価結果を示すグラフである。 一実施形態による融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３）の細胞毒性および溶血試験（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ）の評価結果を示すグラフである。 アシネトバクター・バウマニ全身感染マウスモデルにおいて融合ポリペプチドＬＮＴ１０３処理時の生存率をコリスチン処理時と比較して示すグラフである。
本発明に係る新規なエンドリシンおよび／またはこれを発現するバクテリオファージはシュードモナス属細菌、例えば、シュードモナス・エルギノーサに対して優れた成長抑制能および殺菌能を示すので、シュードモナス属細菌、例えば、シュードモナス・エルギノーサに対する抗生物質として有用に用いられる。
実施例１：ＬＮＴ１０１エンドリシンの製造および抗生物活性試験
１．１．シュードモナス・エルギノーサを死滅可能なバクテリオファージの分離
１．１．１．菌株の培養条件
シュードモナスエルギノーサ（ＰＲ０１９５７）を宿主として用い、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で３７℃の条件で振盪培養した。
１．１．２．バクテリオファージの分離
シュードモナス・エルギノーサに感染するバクテリオファージを選別するために、大韓民国京畿道果川市の果川下水処理場でサンプルを採取した。前記で採取したサンプルとシュードモナス・エルギノーサを３７℃で３時間振盪培養した後、５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を回収した。次いで、上澄液を０．４５μｍフィルターでろ過した後、二重寒天層プラークアッセイ（ｄｏｕｂｌｅ ａｇａｒ ｌａｙｅｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行った。
前記アッセイを簡単に説明すると、トップアガー５ｍｌに前記宿主バクテリアのシュードモナス・エルギノーサとバクテリオファージの培養液を０．１ Ｍ．Ｏ．Ｉ．にて混合して寒天プレートに注ぎ、３７℃で２４時間培養してプラークを得た。前記工程を繰り返すことによって精製された純粋バクテリオファージを確保することができ、該バクテリオファージをバクテリオファージＰＢＰＡ９０と命名した。
１．２：バクテリオファージＰＢＰＡ９０のゲノム分離および分析
前記実施例１．１で確保したバクテリオファージＰＢＰＡ９０のゲノムに対する配列分析を行った。２００ｍｌのＬＢ培地にシュードモナス・エルギノーサをＯＤ６００＝０．５まで培養した後、そこにろ過したバクテリオファージ１０９ｐｆｕ／ｍｌまたは０．１ Ｍ．Ｏ．Ｉ．にて感染させて溶菌した。その後、そこに塩化ナトリウムを最終濃度１Ｍとなるように追加した後、４℃で１時間放置した。次いで、１１、０００×ｇで１０分間遠心分離した後、沈殿物にＰＥＧ（ポリエチレングリコール８０００）を１０％（ｗ／ｖ）となるように入れ、４℃で１時間置いた。次いで、１１、０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄液を除去し、沈殿物をＳＭ緩衝液［１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４（七水和物）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５］に懸濁した。そこにクロロホルムを１：１の比率で入れてボルテックスした後、３、０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄液を得た。
ポリカーボネート試験管に４０％（ｗ／ｖ）グリセロール３ｍｌを入れ、続いて５％（ｗ／ｖ）グリセロール４ｍｌが混じらないように入れた。そこに準備した上澄液を入れ、４℃で１１、０００×ｇで１時間遠心分離した。次いで、上澄液を除去した後、沈殿物をＳＭ緩衝液で再懸濁してバクテリオファージゲノムＤＮＡを得た。バクテリオファージゲノムＤＮＡは、ファージＤＮＡ単離キット（ｐｈａｇｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｎｏｒｇｅｎ ｂｉｏｔｅｋ ｃｏｒｐ．）をメーカーのマニュアルに従って使用し、分離した。このように分離されたゲノム試料を用いてゲノムに対する塩基配列を分析した（Ｌ．Ａ．Ｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ）。
最終的に分析したバクテリオファージＰＢＰＡ９０ゲノムは、核酸配列全体の長さが３０４、０５２ｂｐであり、ＧＣ含有量は４４％だった。前記バクテリオファージＰＢＰＡ９０ゲノムの全長核酸配列を配列番号５に示す。前記ゲノム核酸配列情報に基づいてＷｅｂ上のＢＬＡＳＴを用いて公知のバクテリオファージゲノム配列との類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を調べた。ＢＬＡＳＴ調査の結果、バクテリオファージＰＢＰＡ９０のゲノム配列は、シュードモナスのバクテリオファージＫＴＮ４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＵ５２１３５６．１）と低い配列類似性を有することが確認された（ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒａｇｅ：４％、ｉｄｅｎｔｉｔｙ：９７．３４％）。このような事実に基づいて、バクテリオファージＰＢＰＡ９０は、従来知られていなかった新たなバクテリオファージであることを確認した。
１．３：ＬＮＴ１０１エンドリシンのクローニングおよび精製
上記で分析したバクテリオファージＰＢＰＡ９０のゲノム配列（配列番号５）に対するＯＲＦ ｓｅａｒｃｈによって１８０、０２９－１８０、８０６位の７８０ｂｐ（配列番号２）のＯＲＦがエンドリシン遺伝子であると推定され、前記バクテリオファージＰＢＰＡ９０由来のエンドリシン、およびこれをコードする遺伝子をそれぞれＬＮＴ１０１エンドリシンおよびＬＮＴ１０１遺伝子と命名した。
プライマー（Ｆ：５’－ａａｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｔａｃｔｇｔａｃｔｃａａａｃｇｔｇｇｃ－３’（配列番号３）、Ｒ：５’－ａａｃｔｃｇａｇｔｇｃｃｃｇａｔｇｔｔｔｃｇａａａｃｔｔｔａｔｃｔｔｃ－３’（配列番号４）を用いてバクテリオファージＰＢＰＡ９０のゲノムに対してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ＬＮＴ１０１遺伝子（配列番号５の１８０、０２９～１８０、８０６位の７８０ｂｐ長さの核酸配列）を得た。前記ＬＮＴ１０１遺伝子によってコードされるＬＮＴ１０１エンドリシンのアミノ酸配列を配列番号１（２５９ａａ）に示す。前記ＰＣＲは、以下の条件で行った：工程１：９４℃、５分；工程２：９４℃、３０秒；工程３：５２℃、４５秒；工程４：７２℃、１分；工程５：工程２～４を３０回繰り返し；工程６：７２℃、１０分。上記で得られたＰＣＲ産物をＮ－末端６×Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ－２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングして、ＬＮＴ１０１エンドリシン発現のための発現ベクター（ｐＥＴ－ＬＮＴ１０１プラスミド）を準備した。上記で準備した発現ベクターｐＥＴ－ＬＮＴ１０１を図１に模式的に示す。
上記で準備したｐＥＴ－ＬＮＴ１０１プラスミドを大腸菌ＢＬ２１－ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換後、ＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）でＯＤ６００＝０．５まで培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加した後、３７℃で４時間振盪培養した。細胞を回収後、溶菌バッファーバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で再懸濁し、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍｇ／ｍｌ リゾチームを入れ、氷中で３０分間静置した。超音波処理で細胞を溶解し、１３、０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して上澄液を得た。これをＮｉ－ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）がパックされたカラムを通過させた。その後、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）で溶出して、ＬＮＴ１０１タンパク質（６×Ｈｉｓタグを含む）を精製した。
１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥでＬＮＴ１０１タンパク質の純度を確認し、ブラドフォード試験でＬＮＴ１０１タンパク質の濃度を測定した。精製過程で得られたそれぞれの反応物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した結果を図２に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した、上記で精製したＬＮＴ１０１タンパク質の分子量は約２８ｋＤａであった。前記ＬＮＴ１０１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
１．４．バクテリオファージＰＢＰＡ９０およびその由来エンドリシンＬＮＴ１０１の標的バクテリアスペクトルの調査
本実施例においては、前記実施例１．１および１．２で選別したバクテリオファージＰＢＰＡ９０および実施例１．３で分離精製されたエンドリシンＬＮＴ１０１の標的細菌スペクトルを調べるために、シュードモナス・エルギノーサＡＴＣＣ１３３８８、ＡＴＣＣ９０２７、ＡＴＣＣ１０１４５、ＡＴＣＣ１５６９２、ＡＴＣＣ１５５２２、ＡＴＣＣ２５６１９、ＡＴＣＣ２７８５３、ＣＣＡＲＭ２１３４、ＣＣＡＲＭ２２００、ＣＣＡＲＭ２０２９、ＣＣＡＲＭ２１４４、ＣＣＡＲＭ２２９８、ＣＣＡＲＭ２３２６、ＰＲ０１９５７、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９、エンテロバクター・クロアカＣＣＡＲＭ０２５２、クレブシエラ・ニューモニエＫＣＴＣ２２６１、クレブシエラ・アエロゲネスＣＣＡＲＭ１６００６、カンピロバクター・ジェジュニＫＣＴＣ５３２７、クロノバクター・サカザキＫＣＴＣ２９４９、サルモネラ・チフィリウムＡＴＣＣ１４０２８、サルモネラ・エンテリティディスＡＴＣＣ１３０７６などのグラム陰性菌に対する抗菌活性を試験した。
バクテリオファージＰＢＰＡ９０とエンドリシンＬＮＴ１０１の標的細菌スペクトルはスポット試験で確認した。スポット試験は、４ｍｌのトップアガー（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．７％アガー）に滅菌した細菌を１×１０１１ＣＦＵ／２００μｌを入れてＬＢプレートに注いだ。トップアガーが固まった後、バクテリオファージＰＢＰＡ９０ １０μｌ（１×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）またはＬＮＴ１０１ １０μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）をスポットし、３７℃、１８時間インキュベートした。
前記インキュベーションの結果として形成される生育阻止円（ｈａｌｏ ｚｏｎｅ）の発生の有無を確認し、その結果を下記表１に示す。
Figure 2023526388000002
上記表１に示すように、エンドリシンＬＮＴ１０１は試験されたすべてのグラム陰性菌、つまり、シュードモナス・エルギノーサ、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、カムピロバクター、クロノバクター、およびサルモネラ菌株で生育阻止円を形成した。この結果は、エンドリシンＬＮＴ１０１が上述のような様々なグラム陰性菌のペプチドグリカンに対する分解能を有し、広い標的細菌スペクトルを有することを示している。
１．５．エンドリシンＬＮＴ１０１のシュードモナス・エルギノーサに対する殺菌能の調査
本実施例においては、前記実施例１．４でバクテリオファージＰＢＰＡ９０とエンドリシンＬＮＴ１０１が抗菌活性を有することが確認されたシュードモナス・エルギノーサ（ＡＴＣＣ １３３８８）を対象としてエンドリシンＬＮＴ１０１の細菌殺菌能を試験した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
このために、０．１、０．５、１．０μＭ濃度のエンドリシンＬＮＴ１０１とシュードモナス・エルギノーサ（ＡＴＣＣ １３３８８）１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で１時間静置した。３０分、１時間および２時間後、シュードモナス・エルギノーサのコロニー数を確認して、その結果を図３に示す。図３に示すように、エンドリシンＬＮＴ１０１は、試験されたすべての処理用量および時間でシュードモナス・エルギノーサに対する殺菌能を有することが確認され、このようなシュードモナス・エルギノーサ殺菌能は処理時間および用量に依存することが示された。
また、ＬＮＴ１０１エンドリシンは多様なグラム陰性菌に対して抗菌能を有することをＣＦＵ減少試験で確認し、その結果を下表２に示す。
Figure 2023526388000003
上記表２に示すように、薬剤耐性菌を含むシュードモナス・エルギノーサ８種、アシネトバクター・バウマニ３種、エンテロバクター・クロアカ１種、クレブシエラ・アエロゲネス１種の試験されたすべてのグラム陰性菌において用量依存的に細菌死滅効果を有することを確認した。
Ｉｎ ｖｉｖｏ試験
エンドリシンＬＮＴ１０１のシュードモナス・エルギノーサ殺菌能をｉｎ ｖｉｖｏにおいても確認した。前記ｉｎ ｖｉｖｏ有効性評価のための動物モデルとしてＧａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａを使用した。前記Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａモデルは、健常群（非感染群）、シュードモナス・エルギノーサ感染群（薬物非投与群）、感染モデルにＬＮＴ１０１を投与した２つのＬＮＴ１０１投与群、シュードモナス・エルギノーサ感染モデルにコリスチンを投与したコリスチン投与群、シュードモナス・エルギノーサ感染モデルにＬＮＴ１０１とコリスチンを併用投与した併用投与群に分けて実験を行い、各群当たり１０匹のＧａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａを使用した。
シュードモナス・エルギノーサ感染モデルは、シュードモナス・エルギノーサＰＡＯ１をＬＤ８０濃度である５０ＣＦＵ／幼虫を感染させて準備し、ＬＮＴ１０１は０．６μｇ／幼虫（３ｍｇ／Ｋｇ）、６μｇ／幼虫（３０ｍｇ／Ｋｇ）をそれぞれ投与した。コリスチンは０．５μｇ／幼虫（２．５ｍｇ／Ｋｇ）を投与し、併用投与の場合、コリスチン０．５μｇ／幼虫（２．５ｍｇ／Ｋｇ）とＬＮＴ１０１ ６μｇ／幼虫（３０ｍｇ／Ｋｇ）を投与した。７２時間観察の結果、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａの生存率を図４に示す。図４に示すように、感染群は１００％死亡したが、ＬＮＴ１０１およびコリスチン投与群では生存率が増加することを確認した。特に、ＬＮＴ１０１ ６μｇ／幼虫（３０ｍｇ／Ｋｇ）投与群では３０％の生存率を確認した。
１．６．エンドリシンＬＴＮ１０１とポリミキシン抗生物質とのシュードモナス・エルギノーサ殺菌能の相乗効果
細菌の細胞膜に作用する機作を有するポリミキシン系抗生物質とエンドリシンＬＮＴ１０１の併用処理による相乗效果を確認した。具体的には、マイクロプレートにポリミキシンＢ（３２μｇ／ｍｌ～０．０３μｇ／ｍｌ）とコリスチン（１２８μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ）を１／２ずつウェル当たり稀釈した後、ＬＮＴ１０１エンドリシンを１μＭ併用処理群および同量のＰＢＳ処理群を作った。全てのウェルにｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １×１０５ＣＦＵ／ｍｌを合計１００μｌで処理した。その後、１８時間、３７℃で培養した。ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）は、菌が増殖しないウェルの最小ポリミキシン系抗生物質の濃度値を意味し、ＭＩＣ試験は、微量液体希釈法で行った。
様々な濃度のポリミキシン系抗生物質（ポリミキシンＢ、コリスチン）とＬＮＴ１０１エンドリシンの併用処理によるポリミキシン系抗生物質のＭＩＣ変化を確認して、下表３に示す。
Figure 2023526388000004
上記表３に示すように、ＬＮＴ１０１エンドリシンの併用時、ポリミキシン系抗生物質であるポリミキシンＢおよびコリスチンのＭＩＣが５０％減少することを確認した。
実施例２．ＬＮＴ１０２エンドリシンの作製および抗生物質活性試験
２．１．エンドリシン活性を有する新規なポリペプチドの発見
実施例１．３で分離精製されたエンドリシンＬＮＴ１０１（配列番号１）は、ＰＧ_結合_１ドメイン（１０～６５アミノ酸残基）とトランスグリコシラーゼＳＬＴドメイン（９５～１７９アミノ酸残基）から構成されている。
エンドリシンＬＮＴ１０１のＰＧ_結合_１ドメインのアミノ酸配列をＢＬＡＳＴｐ分析によって、類似アミノ酸配列を有する下記遺伝子のアミノ酸配列と比較して、ＬＮＴ１０１エンドリシンおよび他のアミノ酸部位の１１個のアミノ酸を比較タンパク質のドミナントなアミノ酸配列で置換した：サーモアナエロバクター属ファージＴＨＳＡ－４８５Ａのグリコシルヒドラーゼファミリー２５（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ_００６５４６２８０．１）、セラチア属ファージｐｈｉＭＡＭ１のペプチドグリカン都合タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ_００７３４９１０５．１）、セラチア属ファージ２０５０Ｈ１のペプチドグリカン結合タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＳＺ７８９０３．１）、セラチア属ファージｖＢ_ＳｍａＡ_３Ｍの推定ペプチドグリカン結合タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＹＰ２８３８８．１）、エルウィニア属（Ｅｎｗｉｎｉａ）ファージｖＢ_ＥａｍＭ－Ｂｕｅ１の推定ペプチドグリカン結合タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＶＯ２２９１２．１）、シュードモナス属ファージＮｏｘｉｆｅｒの推定ペプチドグリカン結合タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ_００９６０９０５５．１）、サルモネラ属ファージＭｕｔｉｎｅのエンドリシン（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＵＧ８８２７２．１）およびサルモネラ属ファージｂｅｒｉｎｇのペプチドグリカン結合タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＱＩＱ６１９６１．１。
ＬＮＴ１０１エンドリシン・トランスグリコシラーゼＳＬＴドメインのアミノ酸配列をＢＬＡＳＴｐ分析によって、類似アミノ酸配列を有する下記遺伝子のアミノ酸配列と比較して、ＬＮＴ１０１エンドリシンおよび他のアミノ酸部位の４個のアミノ酸を比較タンパク質のドミナントなアミノ酸配列で置換した：シュードモナス属ファージＮｏｘｉｆｅｒのテールファイバータンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ_００９６０９１１２．１）、シュードモナス属ファージＳＬ２の仮想タンパク質ＳＬ２_１９９（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ_００９６１９７３９．１）、シュードモナス属ファージＫＴＮ４の推定エンドリシン（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＮＭ４４９３８．１）、シュードモナス属ファージｐｈｉＫＺのＰＨＩＫＺ１４４（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ_８０３７１０．１）、シュードモナス属ファージＰｓａ２１のテールファイバータンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＱＢＪ０２７２４．１）およびシュードモナス属ファージｖＢ_ＰａｅＭ_ＰＳ１１９ＸＷのｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＱＥＭ４１９４３．１）。
ＬＮＴ１０１遺伝子配列部分において、コドン使用率を考慮して１５個の置換されたアミノ酸配列部分を変更し（配列番号７）、これをＬＮＴ１０２（配列番号６）と命名した。ＬＮＴ１０１とＬＮＴ１０２の配列比較は図５に示す。ＬＮＴ１０２は遺伝子合成およびＣ－末端６×ヒスチジンタグ付きｐＢＴ７－Ｃ－Ｈｉｓベクター（バイオニア）にクローニングした。このように準備されたＬＮＴ１０２の発現ベクターｐＢＴ７－ＬＮＴ１０２を図６に模式的に示す。
前記ＬＮＴ１０２およびＬＮＴ１０１の配列を下表４に整理した。
Figure 2023526388000005
２．２．ＬＮＴ１０２エンドリシンの精製
前記準備されたｐＢＴ７－ＬＮＴ１０２プラスミドを大腸菌ＢＬ２１－Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した後、ＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）でＯＤ６００＝０．５まで培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加した後、３７℃で４時間振盪培養した。細胞を回収後、溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で再懸濁し、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍｇ／ｍｌ リゾチームを入れ、氷中で３０分間静置した。超音波処理で細胞を溶解し、１３、０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して上澄液を得た。これをＮｉ－ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）がパックされたカラムを通過させた。その後、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）で溶出して、ＬＮＴ１０２タンパク質（６×Ｈｉｓタグを含む）を精製した。
１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥでＬＮＴ１０２タンパク質の純度を確認し、ブラドフォード試験でＬＮＴ１０２タンパク質の濃度を測定した。前記精製過程で得られたそれぞれの反応物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した結果を図７に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した前記精製したＬＮＴ１０２タンパク質の分子量は約２８ｋＤａであった。
２．３．エンドリシンＬＮＴ１０２のグラム陰性菌に対する殺菌能の調査
本実施例においては多様なグラム陰性菌を対象として実施例２．２で精製されたエンドリシンＬＮＴ１０２の殺細菌能および標的細菌スペクトルを確認した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
そのために、２μＭ濃度のエンドリシンＬＮＴ１０１とＬＮＴ１０２、およびシュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）、アシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ１７９７８）、大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ １３８８３）、エンテロバクター・アエロゲネス（ＣＣＡＲＭ １６００６）、およびサルモネラ・エンテリティディス（ＡＴＣＣ １３０７６）を、それぞれ１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で２時間静置した。２時間後、各グラム陰性菌のコロニー数を確認して、その結果を図８に示す（図８において、ＰＡ９０はエンドリシンＬＮＴ１０１を、ｍｔＰＡ９０はエンドリシンＬＮＴ１０２をそれぞれ示す。）。図８に示すように、エンドリシンＬＮＴ１０１とＬＮＴ１０２はいずれも試験されたすべてのグラム陰性菌に対して、対照群に比べて優れた殺菌能を有することが確認され、特に、ＬＮＴ１０２は、ＬＮＴ１０１に比べて同じ用量でより優れたグラム陰性菌殺菌能を示した。
０．１、０．５、２．５μＭ濃度のエンドリシンＬＮＴ１０２およびシュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマニ、および大腸菌を、それぞれ１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で２時間静置した。３０分、１時間、および２時間後、各グラム陰性菌のコロニー数を確認して、その結果を図９および１０に示す。図９および図１０に示すように、エンドリシンＬＮＴ１０２は試験されたすべての処理用量および時間においてグラム陰性菌に対して殺菌能を有することが確認され、このようなグラム陰性菌殺菌能は処理時間および用量に依存することが示された。
２．４．エンドリシンＬＴＮ１０２および抗生物質併用時のグラム陰性菌殺菌能の相乗効果
細菌の細胞膜に作用する機作を有するポリミキシン系抗生物質と実施例２．２で精製したエンドリシンＬＮＴ１０２との併用処理による相乗效果を確認した。具体的には、９６ウェルのマイクロプレートのＡ列を４μｇ／ｍｌのポリミキシンＢで処理後、Ｂ～Ｇ列に１／２ずつ段階希釈した。Ｈ列はポリミキシンで処理しなかった。を９６ウェルのマイクロプレートのＡ列を８μｇ／ｍｌのコリスチンで処理後、Ｂ～Ｇ列に１／２ずつ段階希釈した。Ｈ列はポリミキシンで処理しなかった。その後、ＬＮＴ１０２エンドリシン１μＭでさらに処理した併用処理群、および同量のＰＢＳ処理群を作った。全てのウェルをシュードモナス・エルギノーサおよび大腸菌のそれぞれ１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、合計１００μｌの量で処理した。その後、１８時間、３７℃で培養した。ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）は、菌が増殖しないウェルの最小ポリミキシン系抗生物質の濃度値を意味し、ＭＩＣ試験は、ＣＬＳＩ（臨床・検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））の標準試験法によって微量液体希釈法で行った（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ．１１ｔｈ ｅｄ．Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ０７．Ｗａｙｎｅ，ＰＡ：ＣＬＳＩ；２０１８）。
様々な濃度のポリミキシン系抗生物質（ポリミキシンＢ、コリスチン）とＬＮＴ１０２エンドリシンの併用処理によるポリミキシン系抗生物質のＭＩＣ変化を測定して、下表５に示す。
Figure 2023526388000006
上記表５に示すように、ＬＮＴ１０２エンドリシン併用時、ポリミキシン系抗生物質であるポリミキシンＢおよびコリスチンのＭＩＣが最大１／１６倍に減少することを確認した。このような結果は、既存の抗生物質、例えば、ポリミキシン系抗生物質とＬＮＴ１０２エンドリシンとの併用処理時、顕著に上乗した抗生物効果が得られることを示す。
実施例３：融合ポリペプチドの製造
３．１．ポリペプチド（ＬＮＴ１０１およびＬＮＴ１０２エンドリシン）の準備
エンドリシンＬＮＴ１０１（配列番号１）は、ＰＧ_結合_１ドメイン（１０～６５アミノ酸残基）とトランスグリコシラーゼＳＬＴドメイン（９５～１７９アミノ酸残基）から構成されている。前記エンドリシンＬＮＴ１０１（配列番号１）の１５個のアミノ酸変異に加えて、配列番号６のエンドリシンＬＮＴ１０１変異体（以下、エンドリシンＬＮＴ１０２と命名）を準備した。
前記エンドリシンＬＮＴ１０２のコード遺伝子（配列番号７）をｐＢＴ７プラスミドに挿入してエンドリシンＬＮＴ１０２発現のためのｐＢＴ７－ＬＮＴ１０２ プラスミドを準備した。前記準備されたｐＢＴ７－ＬＮＴ１０２ プラスミドを大腸菌ＢＬ２１－Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した後、ＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）でＯＤ６００＝０．５まで培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加した後、３７℃で４時間振盪培養した。細胞の回収後、溶解 バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で再懸濁し、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍｇ／ｍｌ リゾチームを入れ、氷中で３０分間静置した。超音波処理で細胞を溶解し、１３、０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して上澄液を得た。これをＮｉ－ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）がパックされたカラムを通過させた。その後、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）で溶出して、ＬＮＴ１０２タンパク質（６×Ｈｉｓタグを含む）を精製した。
１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥでＬＮＴ１０２タンパク質の純度を確認し、ブラドフォード試験でＬＮＴ１０２タンパク質の濃度を測定した。前記精製過程で得られたそれぞれの反応物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した結果、前記精製したＬＮＴ１０２タンパク質の分子量は約３１ｋＤａであった。
３．２．融合ポリペプチドの製造
前記準備されたＬＮＴ１０２タンパク質にセクロピンＡが融合された融合ポリペプチドを準備した。具体的には、Ｎ－末端から順に［セクロピンＡ（配列番号８）］－［リンカー（ＧＳＧＳＧＳ）（配列番号１２）］－［エンドリシン（ＬＮＴ１０２と命名）（配列番号６）］を含む融合ポリペプチド（ＬＮＴ１０３と命名）（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）をｐＥＴ ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）プラスミドに挿入してＬＮＴ１０３発現のためのプラスミドｐＥＴ－ＬＮＴ１０３を準備した。前記準備されたｐＥＴ－ＬＮＴ１０３ プラスミドを大腸菌ＢＬ２１－Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した後、ＬＢ液体培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）にＯＤ６００＝０．５まで培養した。
その後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドｅ）添加後、２５℃で６時間振盪培養した。細胞の回収後、溶解 バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で再懸濁し、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）および１ｍｇ／ｍｌ リゾチームを入れ、氷上で３０分間静置した。超音波処理で細胞を溶解し、１３、０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して上澄液を得た。上記で得られた上澄液をＮｉ－ＮＴＡ アガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）がパックされたカラムを通過させた。その後、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）で溶出した。１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製／確認およびブラドフォード試験で濃度を測定した。
上記で得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図１２に示す。図１２から分かるように、精製された融合ポリペプチドＬＮＴ１０３（配列番号１０）の分子量が３４ＫＤａであることを確認した。
また、上記方法と同様の方法で、エンドリシンＬＮＴ１０１（配列番号１）にセクロピンＡが融合された融合ポリペプチド（ＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１；配列番号１３）を作製した。前記作製されたＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１に対して上述した方法でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１の分子量が３４ｋＤａであることを確認した。
一方、試験の便宜のために、前記精製された融合ポリペプチドＬＮＴ１０３（配列番号１０）およびＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１（配列番号１３）の１番目のアミノ酸ＭをＭＡＳ（Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｓｅｒ）に置換し、Ｃ末端に余分な配列としてとＨｉｓタグを追加した形態（配列番号１５または配列番号１６）で作製して、下記試験で配列番号１５は融合ポリペプチドＬＮＴ１０３、配列番号１６はＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１としてそれぞれ用いた。
本実施例に記載されたポリペプチドおよびそのコード遺伝子のアミノ酸配列および核酸配列を下表６に整理した：
Figure 2023526388000007
Figure 2023526388000008
３．３．融合ポリペプチドＬＮＴ１０３の外膜透過（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）活性評価
前記実施例３．２で準備した融合ポリペプチドのグラム陰性菌の外膜透過（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）活性評価のためにＮＰＮ取り込みアッセイを行った。代表的なグラム陰性菌として、シュードモナス・エルギノーサとアシネトバクター・バウマニを使って試験した。
シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）またはアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）をＯＤ６００＝０．３まで培養して１、０００ｇで１０分間遠心分離後、１／２容量程度の５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．２）で再懸濁した。マイクロプレートに４０μＭ ＮＰＮ（１－Ｎ－フェニルナフチルアミン）溶液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の４０μＭ ＮＰＮ、ｐＨ７．２）５０μｌ、試験物質（ＬＮＴ１０１、ＬＮＴ１０２またはＬＮＴ１０３）５０μｌ、および菌株懸濁液１００μｌ（合計２００μｌ）を入れ、３７℃で１時間反応した。その後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ）で励起波長３５０ｎｍ、発光波長（ｅｎｕｓｓｉｏｎ）４２０ｎｍの条件で蛍光測定した。陽性対照群としてセクロピンＡ（セクロピンＡ；配列番号８）、ＥＤＴＡ、またはポリミキシン Ｂを使用し、陰性対照群としては１０μＭ ＮＰＮ溶液を使用した。すべての実験は３セットで行った。
上記で得られた結果を図１３に示す。グラム陰性菌（シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）およびアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）に対するＬＮＴ１０１、ＬＮＴ１０２およびＬＮＴ１０３の外膜透過活性を比較するために、同じ濃度である２μＭの濃度を処理し、セクロピンＡとポリミキシンＢは２μＭ、ＥＤＴＡは１ｍＭで処理した。上記で得られた結果を陰性対照群に対する倍数値（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｖｅｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として図１３のＡとＢに示す。図１３のＡとＢに示すように、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３は、同じ濃度でポリペプチドＬＮＴ１０１およびＬＮＴ１０２よりグラム陰性菌の細胞外膜透過活性が高いことを確認し、陽性対照群であるセクロピンＡ、ＥＤＴＡ、ポリミキシンＢよりも高いことを確認した。
一方、ＬＮＴ１０３の濃度に応じたグラム陰性菌（シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）およびアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）に対する細胞外膜透過活性差を確認するために、ＬＮＴ１０３を０．２９μＭ、０．８８μＭ、または（２．６５μＭ）の量で処理し、セクロピンＡとポリミキシンＢは２μＭ、ＥＤＴＡは１ｍＭを処理した。上記で得られた結果を陰性対照群に対する倍数値（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｖｅｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として図１３のＣとＤに示す。図１３のＣとＤに示すように、ＬＮＴ１０３は、ＬＮＴ１０１、ＬＮＴ１０２、セクロピンＡおよびポリミキシンＢに比べてグラム陰性菌に対する細胞外膜透過活性に優れ、濃度依存的にグラム陰性菌に対する細胞外膜透過活性が増加することを確認した。
３．４．融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のグラム陰性菌に対する殺菌能の調査
実施例３．２で準備した融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のグラム陰性菌に対する殺菌能を確認するために、多様なグラム陰性菌に対してＣＦＵ減少評価を行った。前記ＣＦＵ減少評価を行うために、実施例３で準備したＬＮＴ１０１、ＬＮＴ１０２、およびＬＮＴ１０３をそれぞれ２μＭと、シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）、アシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６、ＡＴＣＣ １７９７８）、大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２２０８）、およびエンテロバクター・アエロゲネス（ＣＣＡＲＭ １６００６）を、それぞれ１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で２時間静置した。その後、各グラム陰性菌のコロニー数を確認して各ポリペプチドの抗生物効果を比較評価した。対照群としてＰＢＳ処理群（ＰＢＳを融合ポリペプチドと同じ体積で処理）を使った。
上記で得られた結果を図１４に示す。図４に示すように、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３は、ＬＮＴ１０１およびＬＮＴ１０２に比べて１．５～５．５ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌのＣＦＵ減少効果を示すことが確認された。特に、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６、ＡＴＣＣ １７９７８）、大腸菌（ＡＴＣＣ ８７３９）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２２０８）に対するＣＦＵ係数結果（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）は、０で処理されたすべての菌を死滅させた。
また、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３、およびＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１を２μＭの濃度に使用して同様の試験を行い、その結果を図１５に示す。比較のために、ＬＮＴ１０２またはＰＢＳを処理した群に対して同様の試験を行った。図１５に示すように、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３、およびＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１で処理した群は、全てＬＮＴ１０２またはＰＢＳで処理した群より抗生物活性に優れ、特に、ＬＮＴ１０３、およびＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１をそれぞれ２μＭの量で処理した場合、試験されたすべての細菌に対するＣｏｕｎｔｉｎｇ結果（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）が０で表され、すべての菌を死滅させることが確認された。
一方、セクロピンＡにエンドリシン（ＬＮＴ１０２またはＬＮＴ１０１）以外のタンパク質が融合された場合と抗菌活性を比較するために、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３、およびセクロピンＡ－ＥＧＦＰ融合タンパク質（ＬＮＴ１０３をＬＮＴ１０２に置換してエンドリシン活性を有さないＥＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ０２５７２．１）が融合されたタンパク質）のグラム陰性菌殺菌能を評価した。このために、前記タンパク質をそれぞれ０．２μＭまたは２μＭの量で処理してＣＦＵ減少試験を行った。上記で得られた結果を図１６に示す。図１６に示すように、セクロピンＡ－ＥＧＦＰ融合タンパク質は抗菌活性がない反面、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３は優れた抗菌活性を有することが確認された。特に、ＬＮＴ１０３２μＭ処理時には、試験されたすべてのグラム陰性菌に対するＣＦＵを計数した結果（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）は、０で処理されたすべての菌を死滅させたことを確認することができる。
また、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３の濃度および／または処理時間に応じたグラム陰性菌に対する殺菌能を試験した。具体的には、０．１、０．３、０．９、または２．７μＭ濃度の融合ポリペプチドＬＮＴ１０３およびシュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）またはアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で２時間静置した後、コロニー数を確認して、その結果を図１７のＡに示す。
また、２μＭ濃度の融合ポリペプチドＬＮＴ１０３とシュードモナス・エルギノーサ（ＰＡＯ１；ＡＴＣＣ １５６９２）１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で０分、２０分、４０分および６０分後、コロニー数を確認して、その結果を図１７のＢに示す。
また、１μＭ濃度の融合ポリペプチドＬＮＴ１０３とアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）１×１０６ＣＦＵを反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５）に最終容量が２００μｌとなるように入れ、３７℃で０分、１分、３分、５分および１０分後、コロニー数を確認して、その結果を図１７のＣに示す。
図１７のＡ、ＢおよびＣに示すように、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３は、濃度および時間依存的にグラム陰性菌に対して殺菌能を有することを確認した（図１７のＡ、Ｂ、およびＣにおいて棒グラフが表示されない部分はｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ値が０であって、処理されたすべての菌を死滅させることを意味する。）。
また、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）およびＭＢＣ（最小殺細菌濃度）を測定した。前記ＭＩＣおよびＭＢＣは、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の標準試験法によって微量液体希釈法で行うものの、当該試験法でＭＨ液体培地（カゼイン酸加水分解物 １７．５ｇ／Ｌ、ウシエキス ３．０ｇ／Ｌ、デンプン １．５ｇ／Ｌ．ｐＨ７．３）の代わりに、ＣＡＡ培地（Ｃａｓアミノ酸 ５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ）を用いて行った（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ．１１ｔｈ ｅｄ．Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｍ０７．Ｗａｙｎｅ，ＰＡ：ＣＬＳＩ；２０１８）。具体的には、９６ウェルのマイクロプレートの列を６４μｇ／ｍｌの濃度のＬＮＴ１０３で処理し、Ｂ～Ｇ列を１／２ずつ段階希釈された濃度のＬＮＴ１０３で処理した。Ｈ列はＬＮＴ１０３で処理しなかった。その後、全てのウェルを当該細菌株（標準株またはＱＣ，ＣＣＡＲＭおよび臨床分離菌株；表２～表４参照）を５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、合計１００μｌの量で処理した。その後、１８時間、３７℃で培養した。ＭＩＣは菌が増殖しない最低濃度と判断し、ＭＢＣは各ウェルのコロニー数を確認してコロニーが確認されない最低濃度と判断した。上記で得られた結果を下表７～表９に示す。
Figure 2023526388000009
Figure 2023526388000010
Figure 2023526388000011
３．５．融合ポリペプチドＬＮＴ１０３とポリミキシン抗生物質の併用によるグラム陰性菌殺菌能の相乗效果
細菌の細胞膜に作用する機作を有するポリミキシン系抗生物質と融合ポリペプチドＬＮＴ１０３の併用処理によるグラム陰性菌殺菌能の相乗效果を確認した。具体的には、コリスチン（ポリミキシンＥ）を９６ウェルのマイクロプレートの１列を１６μｌ／ｍｌで処理し、２～１１列を１／２ずつ段階希釈された濃度で処理した。Ａ列を１６μｇ／ｍｌのＬＮＴ１０３で処理し、Ｂ～Ｇ列は１／２ずつに段階希釈された濃度で処理した。その後、全てのウェルをアシネトバクター・バウマニ（ＡＴＣＣ １９６０６）を５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、合計１００μｌの量で処理した。その後、３７℃で１８時間培養し、ＦＩＣ（分割阻害濃度）インデックス値を次の数式で算出した。
ＦＩＣインデックス＝ＦＩＣＡ＋ＦＩＣＢ＝（ＣＡ／ＭＩＣＡ）＋（ＣＢ／ＭＩＣＢ）
（ＣＡおよびＣＢは、併用処理された物質（ポリミキシンＥおよびＬＮＴ１０３）のそれぞれの濃度であり、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢは、単独薬物のＭＩＣである。
ＦＩＣ ｖａｌｕｅ：ｓｙｎｅｒｇｙ ｅｆｆｅｃｔ＜０．５；ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ＞４；ａｄｄｉｔｉｖｅ ０．５－４）
試験結果、ＦＩＣインデックス値は０．３７５で表され、２つの物質間の相乗効果があることを確認した。
３．６．融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性評価
融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性は、Ｈｕｈ－７細胞株を用いた細胞毒性試験（ＷＳＴ試験）およびヒツジ血液（ＭＢ細胞）を用いた溶血試験で評価した。
細胞毒性試験進行過程は次の通りである。Ｈｕｈ－７細胞培養液を準備して９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０９細胞／ウェルの量で分注し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。そして、陰性対照としてＰＢＳ、陽性対照として１％（ｗ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理し、実験群として０．２５、０．５、または１ｍｇ／ｍｌの濃度の融合ポリペプチドＬＮＴ１０３で処理した後、ＣＯ２インキュベーターで２４時間および４８時間静置した。その後、Ｄ－Ｐｌｕｓ（商標）ＣＣＫ 細胞生存率アッセイキット（Ｄｏｎｇｉｎ ＬＳ）を用いて細胞生存率を測定して、その結果を図１８に示す。図１８に示すように、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度の融合ポリペプチドＬＮＴ１０３で２４時間処理したとき、陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、それぞれ９３％、９０％、７８％の細胞生存率を示し、４８時間処理したとき、陰性対照と比較して、それぞれ１０８％、１０５％、８６％の細胞生存率を示した。つまり、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３の処理時、対照群（ＰＢＳ）に対して約８０％以上の細胞生存率を示すことが確認され、細胞毒性が比較的低いことを確認することができる。その結果として、ＬＮＴ１０３のＩＣ５０は＞１ｍｇ／ｍｌであることが確認された。
溶血試験進行過程は次の通りである。３ｍｌヒツジ血液と１４ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）を混合した後、１０００ｇ、４℃で５分間遠心分離して上澄液を除去した。その後、除去した容量ほどＰＢＳを再び満たし、上記の洗浄工程を合計４回行った。洗浄によって溶解されたヘモグロビンを除去し、最後の遠心分離後、沈んだＲＢＣ（赤血球）４００μｌを９．６ｍｌのＰＢＳに溶解して４％（ｖ／ｖ）血液溶液を作製した。９６ウェルのマイクロプレートに５０μｌの試料と５０μｌのｌ４％（ｖ／ｖ）血液溶液を混合した後、３７℃で１時間反応させた。実験群は、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３を１２８μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌまで２倍の希釈範囲で処理し（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）、陽性対照群は０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、陰性対照群はＰＢＳを処理した。１時間反応後、マイクロプレートを１０００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上澄液５０μｌを取って新たなマイクロプレートに移して５７０ｎｍで吸光度を測定した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ）。上記で得られた結果を図１９に示す。図１９に示すように、融合ポリペプチドＬＮＴ１０３は、試験されたすべての濃度でｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙを示さないことを確認した。その結果として、ＬＮＴ１０３のＭＨＣ（最小溶血濃度）は＞１２８μｇ／ｍｌであることが確認された。
３．７．融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のｉｎ ｖｉｖｏ有効性評価
融合ポリペプチドＬＮＴ１０３のｉｎ ｖｉｖｏ有効性評価のために、アシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ １９６０６全身感染マウスモデルで生存率を確認した。
動物実験の進行過程は以下の通りである。マウスは、４週齢の雄のＩＣＲマウスを購入し、１週間の馴化期間を経た後、５～６週齢で重量２０～２１ｇであるときに使用した。アシネトバクター・バウマニ菌と１０％のムチンとを１：１で混合し、０．５ｍｌの２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（５％のムチン）の菌液をマウスの腹腔内に接種した。感染１時間および４時間後、皮下注射によりＬＮＴ１０３ ２０ｍｐｋ、ＬＮＴ１０３ １００ｍｐｋおよび比較群としてコリスチン ２０ｍｐｋをそれぞれ投与した。その後、９６時間生存率を確認してその結果を図２０に示す。図２０で確認されるように、全身感染マウスモデルにＬＮＴ１０３を投与した群は、非投与群（対照）および比較群（コリスチン投与群）に比べて高い生存率を示し、ＬＮＴ１０３は濃度依存的に高い生存率を示すので、当該マウスモデルで効果があることを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想または必須の特徴を変更せずに他の実施形態で実施することができることを理解できるだろう。これに関連して、以上で記述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
配列番号１： 合成エンドリシンＬＮＴ１０１
配列番号２： 合成エンドリシンＬＮＴ１０１コード遺伝子
配列番号３： 合成フォワードプライマー
配列番号４： 合成リバースプライマー
配列番号５： 合成ＰＢＰＡ９０ゲノム
配列番号６： 合成エンドリシンＬＮＴ１０２
配列番号７： 合成エンドリシンＬＮＴ１０２コード遺伝子
配列番号８： 合成セクロピンＡ
配列番号９： 合成セクロピンＡコード遺伝子
配列番号１０： 合成エンドリシンＬＮＴ１０３
配列番号１１： 合成エンドリシンＬＮＴ１０３コード遺伝子
配列番号１２： 合成リンカー
配列番号１３： 合成融合ポリペプチドＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１
配列番号１４： 合成融合ポリペプチドＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１コード遺伝子
配列番号１５： ＭＡＳ、Ｈｉｓタグおよび余分な配列を含む合成融合ポリペプチドＬＮＴ１０３
配列番号１６： ＭＡＳ、Ｈｉｓタグおよび余分な配列を含む合成融合ポリペプチドＣｅｃＡ－ＬＮＴ１０１

Claims (33)

  1. 配列番号１または配列番号６のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドはエンドリシン活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  4. 配列番号２または配列番号７の核酸配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む、組換え細胞。
  7. 配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
  8. 配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列を含む、請求項７に記載のバクテリオファージ。
  9. 前記バクテリオファージは、シュードモナス属細菌に対して抗生物活性を有する、請求項７または８のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
  10. セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、および
    配列番号１または配列番号６のポリペプチド
    を含む、融合ポリペプチド。
  11. セクロピンＡは、配列番号８のアミノ酸配列であり得る、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
  12. 前記セクロピンＡおよび配列番号１または配列番号６のポリペプチドは、Ｎ－末端から順に連結される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
  13. 前記セクロピンＡおよび配列番号１または配列番号６のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって連結される、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
  14. 配列番号１０または配列番号１３のアミノ酸配列であり得る、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
  15. 請求項１０～１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  16. 配列番号１１または配列番号１４の核酸配列であり得る、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  18. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターを含む、組換え細胞。
  19. 請求項１に記載のポリペプチド、
    請求項１０～１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、
    前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、
    前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
    前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞
    からなる群より選択される１種以上を含む、抗生物質。
  20. ポリミキシン系抗生物質をさらに含む、請求項１９に記載の抗生物質。
  21. 前記ポリミキシン系抗生物質は、ポリミキシンＢ、コリスチン、またはこれらの組み合わせである、請求項２０に記載の抗生物質。
  22. グラム陰性菌に対して抗生物活性を有する、請求項１９に記載の抗生物質。
  23. 前記グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、およびクレブシエラ属細菌からなる群より選択される１種以上である、請求項２２に記載の抗生物質。
  24. 前記シュードモナス属細菌はシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり、前記アシネトバクター属細菌はアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）であり、前記エシェリヒア属細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、前記エンテロバクター属細菌はエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）であり、前記クレブシエラ属細菌はクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項２３に記載の抗生物質。
  25. 請求項１に記載のポリペプチド、
    請求項１０～１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、
    前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、
    前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
    前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞
    からなる群より選択される１種以上を含む、グラム陰性菌の感染またはグラム陰性菌によって引き起こされる疾病の予防または治療用である、薬学組成物。
  26. 前記グラム陰性菌は、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、およびクレブシエラ属細菌からなる群より選択される１種以上である、請求項２５に記載の薬学組成物。
  27. 前記シュードモナス属細菌はシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり、前記アシネトバクター属細菌はアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）であり、前記エシェリヒア属細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、前記エンテロバクター属細菌はエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）であり、前記クレブシエラ属細菌はクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項２６に記載の薬学組成物。
  28. 前記グラム陰性菌はシュードモナス属細菌であり、シュードモナス属細菌によって引き起こされる疾病は、皮膚感染症、床ずれ、肺炎、菌血症、敗血症、心内膜炎、髄膜炎、外耳道炎、中耳炎、角膜炎、骨髄炎、腸炎、腹膜炎、または嚢胞性線維症である、請求項２６に記載の薬学組成物。
  29. 前記グラム陰性菌はアシネトバクター属細菌であり、アシネトバクター属細菌によって引き起こされる疾病は、皮膚感染症、肺炎、菌血症または敗血症である、請求項２６に記載の薬学組成物。
  30. 前記グラム陰性菌はエシェリヒア属細菌であり、エシェリヒア属細菌によって引き起こされる疾病は、腸炎、クローン病、潰瘍性大膓炎、細菌性赤痢、尿路感染症、皮膚感染症、菌血症または敗血症である、請求項２６に記載の薬学組成物。
  31. 請求項１９に記載の抗生物質を含む、飼料添加剤。
  32. 請求項１９に記載の抗生物質を含む、消毒剤。
  33. 請求項１９に記載の抗生物質を含む、洗浄剤。
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