CN105101796B - 衍生自b型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集区的抗菌胜肽 - Google Patents

衍生自b型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集区的抗菌胜肽 Download PDF

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Abstract

一医药组成物，用于杀死及/或抑制一需要的个体内一细菌的生长及/或增殖，或用于治疗一受细菌感染的个体。该医药组成物包含：(a)一有效量的一单离胜肽，其中该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)的精氨酸密集羧基端区域(arginine‑rich carboxy‑terminal region)，并表现一抗菌活性；以及(b)一药学上可接受的载体。该单离胜肽表现一抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、及/或真菌的活性。

Description

衍生自B型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集区的抗菌胜肽
技术领域
本发明是关于抗菌胜肽。
背景技术
因广泛使用传统抗生素而造成病原体抗药性提升，是全球所重视的问题，因此迫切需要研发更多有效的治疗并克服抗药性问题。抗菌胜肽(Antimicrobial peptides，AMP)是一种新的抗生素种类，具有新颖作用模式及卓越的治疗效果。一般来说，抗菌胜肽含有10～50个氨基酸，整体带有正电并具有双极性结构(amphipathic structure)。大部份的抗菌胜肽可直接与细菌膜键结，并藉由使细胞膜瓦解或是攻击细胞内的成分而致死。最重要的是，抗菌胜肽对抗药性病原体是有效的，此种性质使得近几十年作为新型抗生素的抗菌胜肽被大量研究。
先前未有文献报导衍生自B型肝炎病毒核蛋白(hepatitis B virus coreprotein，HBc)的胜肽拥有抗菌活性。B型肝炎病毒核蛋白(21KDa)为病毒复制所必需，其在N端(第1至149个氨基酸残基)包含一蛋白壳(capsid)组装区域，且在C端(第150至183个氨基酸残基)有一个精氨酸密集区(arginine-rich domain，ARD)(Birnbaum et al.(1990)JVirol 64:3319-3330；Nassal M(1992)J Virol 66:4107-4116)。ARD含有16个精氨酸，分成4个精氨酸密集群(ARD I、II、III、IV)，并具有键结至核苷酸的功能。当其键结至HBV前基因体RNA或是聚阴离子时，HBc可组装为一稳定的蛋白壳。此外，ARD包含HBc核蛋白与粒子的核输出与输入的重要讯号。我们意外地发现，表现HBc1～183的大肠杆菌比表现HBc1～149的大肠杆菌其生长慢得多(此结果尚未发表)，而这现象的原因文献上并没有任何报告提出一个合理的解释。
发明内容
本发明的一目的是关于一医药组成物，包含：
(a)一有效量的一单离胜肽，其中该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白(hepatitisB virus core protein，HBc)的精氨酸密集羧基端区域(arginine-rich carboxy-terminal region)，并表现一抗菌活性；以及
(b)一药学上可接受的载体。
本发明的另一目的是关于一医药组成物，包含：
(a)一有效量的一单离胜肽，该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白的一片段，该片段包含一个以上的精氨酸密集区(ARD)，是选自由下列(i)、(ii)及(iii)所组成的群组：
(i)HBc ARD I～IV；
(ii)HBc ARD I～III；
(iii)HBc ARD II～IV；
其中该单离胜肽具有一抗菌活性；以及
(b)一药学上可接受的载体。
本发明另一目的是关于一种医药组成物包含一有效量的一单离胜肽，该单离胜肽包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白的C端区域的精氨酸密集序列，其中该单离胜肽的特征在于具有一抗菌活性。
本发明又一目的是关于一种如前所述的医药组成物用于杀死及/或抑制一微生物的生长及/或增殖的用途，是经由前述医药组成物与该微生物接触。
本发明又一目的是关于一种如前所述的医药组成物用于杀死及/或抑制一需要的个体内一微生物的生长及/或增殖的用途，或用于治疗受一微生物感染的一个体。该个体可为感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumonia)。
后述较佳实施方式的说明与后附的图式使得本案的目的变得显而易见，本发明的变体与修饰可能有些许不同，但不脱离本发明所揭露新颖概念的精神与范畴。
后附图式说明本发明一或多个实施方式，并且与说明书的说明一同用于解释本发明原理。只要有可能，于所有图中同样的标号是关于一实施方式的相同或类似元件。
附图说明
图1显示为测试抗菌能力的不同HBc ARD的氨基酸序列。下方呈现不同的磷酸化胜肽与R替代成A的变异胜肽，是在HBc147～183的ARD-III与ARD-IV有总共4个Arg替代成Ala。
图2显示HBc147～183抗绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的杀伤动力学。细菌以HBc147～183(1x MBC)处理。于指定的时间点(每隔20分钟)量测细菌的存活率。样本以三重复方式量测。
图3显示FITC-HBc147～183胜肽于细菌上的位置。将近107CFU的绿脓杆菌TCC9027、ATCC27853(A及B)、克雷伯氏肺炎杆菌ATCC13884(C)、大肠杆菌ATCC25922(D)、以及金黄色葡萄球菌ATCC19636、ATCC25923与ATCC 29213(E、F与G)与HBc147-183(0.5x MBC)一起培养1小时。细菌经清洗、固定并以DAPI染色(蓝色)。影像以共焦显微镜拍摄。
图4显示HBc147～183可能的杀菌机制。(A)绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌经由HBc147～183的SYTOX Green染剂摄入。每分钟记录以荧光测量的数据。(B)绿脓杆菌经由0.5、1与2μM的HBc147～183与HBc153～176的细胞膜穿透化剂量依赖曲线。2μM的蜜蜂毒素迷力挺(melittin)作为正控制组。样本以三重复方式测量。(C)HBc147～183的DNA键结活性。HBc147～183与pSUPER质体DNA以指定的N/P比(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2及3)混合30分钟。DNA的流动性以凝胶阻滞实验评估。
图5显示LPS与LPS抗体于HBc147～183的杀菌活性的剂量反应作用。绿脓杆菌及大肠杆菌来源的LPS及LPS抗体与绿脓杆菌及HBc147～183(1x MBC)混合3小时。细菌置于MH琼脂上以测量存活率。样本以三重复方式测量。
图6显示ARD胜肽HBc147～183在数个不同的体外键结分析中，可键结至LPS与A脂。每个分析中，样本以三重复方式量测。(A)草图显示胜肽LPS与胜肽A脂键结的体外分析，以及LPS/A脂的竞争分析。(B)恒定量的LPS与卵白素偶联微球上渐增浓度的生物素化ARD HBc147～183胜肽(0、0.004、0.02、0.1、0.5与2.5μM)一起培养。以LAL ELISA分析量测悬浮液中未键结的LPS。将EU值以一不含胜肽的控制组标准化。HBc147～1838p(含有8个磷酸化的氨基酸)亦作为一控制组胜肽，因其与LPS的键结微弱。(C)微珠键结的LPS经由胰蛋白酶琼脂糖消化隔夜而释放至悬浮液中。以LAL ELISA分析悬浮液中自由的LPS。悬浮液中被释放的LPS的量是与微珠上ARD胜肽HBc147～183的量成比例。(D)恒定量的A脂分别与增加浓度的HBc147～183以及HBc147～1838P培养。以LAL ELISA试剂检测悬浮液。这里的结果与先前发现一致，是A脂可直接键结至HBc147～183。(E)LPS/A脂竞争分析。恒定量的LPS(1μg)涂布于ELISA盘上的每一孔，然后与一含有10nM恒定量的HBc147-183与增加浓度的A脂的反应混合物培养。A脂的增加以剂量依赖的方式降低盘上键结ARD胜肽HBc147～183的量。
图7显示ARD胜肽HBc147～183的细胞毒性分析。(A)以10％人类红血球细胞(RBC)测量HBc147～183与迷力挺的溶血活性。与迷力挺相较，未显示HBc147～183具有溶血活性。(B)Huh7、HepG2、Vero以及HEK293细胞与不同浓度(0至100μM)的HBc147～183与迷力挺于37℃培养1小时。对细胞存活率的影响以MTT分析测定。迷力挺用于作为一正控制组。未检测到HBc147～183对于细胞存活率的影响，而迷力挺则显示强烈的细胞毒性。(C)肾脏细胞Vero与HEK293以CFSE染色并于第0天植入。第1天时细胞以不同浓度(0至100μM)的HBc147～183培养1小时。以流式细胞仪评估第1天及第3天的细胞增殖。与空的控制组(mock control)实验相似，在Vero与HEK293细胞上未有显著作用。于第7A～C图的样本是以三重复的方式分析。(D)利用3周大ICR公小鼠评估ARD胜肽HBc147～183的体内细胞毒性。小鼠腹膜内注射胜肽(10与20mg/体重kg)。所有的小鼠于7天后仍存活。
图8显示体内ARD胜肽HBc147～183抗金黄色葡萄球菌的保护活性试验。(A)3周大ICR公小鼠接受致命浓度的金黄色葡萄球菌ATCC 19636，然后分为5组不同的时间点。于每一时间点(n＝5)收集、稀释血液样本，并将其覆于BHI琼脂上。第二天计算细菌的数目。观察到接种后2小时血液中有最大细菌量。数据以平均值±标准偏差(SD)表示。(B)如前所述以致命浓度的金黄色葡萄球菌培养的ICR小鼠，分别在接种后1、1.5或2小时以腹膜内注射ARD胜肽(10mg/kg)治疗。每组包含10只小鼠。以PBS治疗的控制组小鼠全数(100％)于第一天死亡，而以ARD胜肽于接种后1、1.5或2小时治疗的小鼠，7天后存活率分别为100％、70％与40％。(C)如前所述，ICR小鼠腹膜内接种金黄色葡萄球菌，随即腹膜内注射PBS(n＝5)或于接种后1小时腹膜内注射10mg/kg ARD胜肽(n＝5)。接种后4小时，收集血液、肝脏及脾脏。肝脏及脾脏样本经均质化、稀释，并与血液样本一同覆于BHI琼脂上。于隔日计算细菌量。与用PBS治疗的小鼠相较，ARD胜肽的治疗能有效降低血液、肝脏及脾脏中的细菌量。(D)以PBS治疗(空心的圆形、菱形与正方形)与ARD胜肽HBc147～183治疗(实心的圆形、菱形与正方形)的小鼠血液、肝脏及胰脏样本细菌量的量化比较。图中的线表示细菌量的平均值。**表示于PBS与ARD胜肽HBc147～183治疗结果的间的P<0.01(Mann-Whitney U test)。
图9显示ARD胜肽抗克雷伯氏肺炎杆菌的体内抗菌活性的IVIS分析。(A)感染克雷伯氏肺炎杆菌的小鼠，在接种后1小时以PBS(n＝5)或10mg/kg ARD胜肽(n＝5)治疗。接种后4小时，麻醉小鼠并摄影。细菌量显示于生物冷光迭加的摄影影像中。假色影像(Falsecolor imaging)将强冷光处以红色表示，中度冷光处以绿色表示，低冷光处以蓝色与紫色表示。(B)总光通量以IVIS影像软件量化。**表示于PBS与ARD胜肽HBc147～183治疗结果的间的P<0.01(Mann-Whitney U test)。
图10为一显示HBC ARD胜肽的抗菌活性表。
图11为一显示ARD胜肽HBc147～183对于对黏菌素具有抗药性与敏感性的绿脓杆菌与鲍氏不动杆菌的抗菌活性的表。
图12显示人类B型肝炎病毒(HBV)核蛋白(HBc)的精氨酸密集区(ARD)的序列组合。HBc ARD区域从目前不同地域的病患中分离出来的不同血清型中，是为高度保守。
图13A～B显示从灵长类、啮齿动物及禽类来源嗜肝病毒的HBc ARD区域的序列组合。HBc ARD序列在人类、绒毛猴(wooly monkey)、地松鼠、土拨鼠以及蝙蝠的间是高度保守的。在HBc ARD的精氨酸(正电荷)群集的次区域为ARD-I、ARD-II、ARD-III、以及ARD-IV。第13B图进一步显示在鸭、苍鹭、鹦鹉、罗斯雁及雪雁的核蛋白C端也有4个群集正电荷氨基酸。不论灵长类、啮齿动物及禽类嗜肝病毒的间的序列歧异度与演化距离，可考虑这些啮齿动物(A)及禽类(B)来源嗜肝病毒的核蛋白的C端正电荷密集区域亦具有抗菌活性(参考表1)。
具体实施方式
在以下实施例更具体地描述本发明，本发明中有众多本领域具有通常知识者认为明显的修饰与变体，因此实施例仅为例示。在此详细说明本发明不同的实施方式。关于图式，所有的图中相同的数字表示相同的元件。本说明书及随后的申请专利范围所使用的描述，除非清楚指明，「一」及「该」的意思是包括复数的范围。相同地，本说明书及随后的请求项所使用的描述，除非清楚指明，「内」(in)包含「其内」(in)以及「其上」(on)的意思。此外，说明书中的标题或副标题可使读者方便阅读，不应影响本发明的范畴。另外，本说明书中的一些用词更具体地定义如下。
定义
本说明书所使用的用词，于本发明整体以及于该用词所用的特定上下文中，皆具有本领域通常所习知的意义。用于描述本发明的一些用词讨论如下或是说明书中其他地方，以提供操作者于本发明描述的额外指引。为方便起见，一些用词以强调方式显示，例如以斜体或是引号标示。强调方式的使用不影响用词的范围与意义；一用词的范围与意义在相同的脉络中是一样的，无论该用词是否以强调方式显示。同一件事以不同的方式说明是可以被理解的。因此，本文一个以上的用词皆可用替换的说法及同义词，不论该用语是否有在此有被详细描述。本说明书会提供一些用词的同义词。此处列举一或多个同义词并不排除其他同义词的使用。本说明书所载的实施例，包括这里任何讨论的用词的例子，皆仅为例示，不限制本发明或任何示例性用词的范围及意义。同样地，本发明不局限于本说明书中所载的实施方式。
除非另有定义，这里所使用的所有的技术上与科学上的用词，其意义与本领域及相关领域中通常知识者所通常知悉的意义相同。在有冲突的情况下，以本说明书所定义者为准。
本说明书所使用的「大约」、「大概」或是「约略」意思为所给数值或范围的±20％以内，较佳为±10％以内，更佳为±5％以内。本说明书所给的数值为大致估计的，因此如果没有特别说明，可推测含有「大约」、「大概」或是「约略」的意思。
抗微生物活性是关于杀死或抑制微生物的生长，该微生物例如细菌、真菌及/或原生动物。
如同这里所使用的，「B型肝炎病毒核蛋白的精氨酸密集羧基端区域」指的是一高度保守的B型肝炎病毒核蛋白的精氨酸密集C端区域(第12图与第13A、B图)，且其特征在于具有一抗菌活性。以禽类及/或啮齿目动物肝炎病毒科(Hepadnaviruses)为来源的精氨酸密集羧基端区域有相同的抗菌活性，是可以被理解的。B型肝炎病毒核蛋白的C端含有称为ARD I～IV的四个精氨酸密集群或区域。每一精氨酸密集群或区(ARD)含有二或多个连续或很接近的精氨酸残基(所述很接近的精氨酸残基，例如被一或二个不同的氨基酸残基隔开)。在一实施例中，每一ARD可含有2、3或4个连续的精氨酸残基。
如同这里所使用的，「衍生自HBc的一氨基酸序列」指的是「一氨基酸序列源自B型肝炎病毒核蛋白，并具有抗菌活性」。可能是HBc的一个片段，可能经修饰或未经修饰，且含有ARD并拥有抗菌活性。经修饰的HBc的一个片段包含但不限于聚乙烯二醇化(PEGylation)。
「二群」与「二重复」用词是可替换的。用词「二群的SPRRRR」意为「二重复SPRRRR」或「2SPRRRR」。
「双极性结构」用词意为一分子具有亲水性及疏水性。
B型肝炎病毒分为四种主要的血清型(adr、adw、ayr、ayw)，是基于其包膜蛋白上的抗原决定位。用词「血清型」、「血清变型」意为一种菌、病毒或不同个体的免疫细胞当中可区分的变体。
「保护基」用词意为附于一有疗效的蛋白质或胜肽的一功能基，以延长该蛋白质或胜肽的循环时间(circulatory time)。保护基包括但不限于一聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)。聚乙二醇化亦可提供疏水性蛋白质或胜肽的水溶性。
「治疗」用词意为施予一需要的个体一有效量的治疗剂，使痊愈、减轻、缓解、补救、改善或预防该疾病、该疾病的症状或疾病的倾向。这样的个体可由健康照护专业人员基于任何适合诊断方法的结果判断出。
「一有效量」意指一给予接受治疗个体的活性剂，为达到治疗效果所需要的量。有效剂量会有所不同，如同本领域中通常知识者所了解的，依据给药途径、赋形剂的使用、以及共同使用其他治疗药物的可能而有所不同。
美国健康与人类食品及药品管理局(U.S.Department of Health and HumanServices Food and Drug Administration)所公布的「健康成人受试者于工业与治疗性临床试验安全剂量审查准则(Guidance for Industry and Reviewers Estimating theSafe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult HealthyVolunteers)」揭露「一人类相等剂量」可自下式计算而得：
人类相等剂量(HED)＝动物剂量(mg/kg)×(动物体重(kg)/人类体重(kg))0.33。以腹膜内注射举例，若一体重为20g的小鼠的剂量为10mg/kg，则一人类的剂量可用10mg/kg×(0.02/患者体重)0.33计算。人类相等计量可能不同，取决于其他因素，例如给药途径。
关于大肠杆菌表现HBc1-183的上升非常少，且比大肠杆菌表现HBc1-149的上升慢得多，这是一个意外地发现与未解之谜。这显示HBc 150-183会以某种方式减缓大肠杆菌的生长，且会急遽降低HBc 1-183蛋白质产生。本发明揭露HBc147-183的体外抗菌活性，可广泛地抗不同种的细菌，包括多重抗药性与对黏菌素(colistin；polymyxin E)有抗药性的鲍氏不动杆菌(A.baumannii)。来自B型肝炎病毒核蛋白(HBc)精氨酸密集区(ARD)的抗菌胜肽主要由SPRRR重复组成，并除了可有效抗革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的外，亦可有效抗真菌。利用腹腔脓毒症小鼠模型，使小鼠面临致命剂量的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的情况下，进一步显示ARD胜肽可有效保护所有的小鼠。ARD胜肽的治疗亦造成受感染小鼠体内金黄色葡萄球菌(S.aureus)与克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)含菌量的显著降低。对于杀菌活性的潜在机制进行研究，ARD胜肽在数个不同的键结分析中，显示可直接键结至脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)的A脂基(lipid A moiety)。总体来说，因为在人类细胞以及动物模型中的高抗菌活性及非常低的细胞毒性，这些HBc ARD胜肽在未来可能具有治疗潜力(Chen et al.“Identification of a Novel Antimicrobial Peptidesfrom Human Hepatitis B Virus Core Protein Arginine-Rich Domain(ARD)”PLoSPathog 9(6):e1003425，以参考的方式整体并入本说明书中)。
本发明的一目的是关于一医药组成物，包含：
(a)一有效量的一单离胜肽，其中该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白(hepatitisB virus core protein，HBc)的精氨酸密集羧基端区域(arginine-rich carboxy-terminal region)，并表现一抗菌活性；以及
(b)一药学上可接受的载体。
本发明的另一目的是关于一医药组成物，包含：
(a)一有效量的一单离胜肽，该单离胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白的一片段，该片段包含一个以上的精氨酸密集区(ARD)，是选自由下列(i)、(ii)及(iii)所组成的群组：
(i)HBc ARD I～IV；
(ii)HBc ARD I～III；或
(iii)HBc ARD II～IV；
其中该单离胜肽具有一抗菌活性；以及
(b)一药学上可接受的载体。
HBc可选自由哺乳动物的HBc以及禽类的HBc所组成的群组。哺乳动物的HBc包括但不限于人类B型肝炎病毒核蛋白(HBc)、绒毛猴HBc、地松鼠HBc、土拨鼠HBc、以及蝙蝠HBc。禽类的HBc包括但不限于鸭HBc，苍鹭HBc，鹦鹉HBc，罗斯雁HBc和雪雁HBc。
本发明另一目的是关于一种医药组成物包含一有效量的一单离胜肽，该单离胜肽包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白的C端区域(HBc)的精氨酸密集序列，其中该单离胜肽的特征在于具有一抗菌活性。
本发明又一目的是关于一种如前所述的医药组成物用于杀死及/或抑制一微生物的生长及/或增殖的用途，是经由将该医药组成物与该微生物接触，该微生物可存在于一个体中。
本发明又一目的是关于一种如前所述的医药组成物用于杀死及/或抑制一需要的个体内一微生物的生长及/或增殖的用途，或用于治疗受一微生物感染的一个体，该个体是感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumonia)。
本发明的该抗菌胜肽含有少数几个疏水性氨基酸或无疏水性氨基酸，因此没有双极性结构。
本发明的一实施例，该单离胜肽包含Ser Pro Arg Arg Arg Arg(SPRRRR；SEQ IDNO:13)或Arg Arg Arg Ser(RRRS；SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
该单离胜肽可选择性地包含二群SPRRRR(SEQ ID NO:13)，或三群SPRRR(SEQ IDNO:15)。该单离胜肽可包含RRRS(SEQ ID NO:14)。
本发明另一实施例，该单离胜肽包含至少2群位于RRRS(SEQ ID NO:14)上游的ProArg(脯氨酸精氨酸，PR)。至少二群的PR可相邻，或是靠近RRRS序列并以几个残基隔开，例如以7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸残基隔开。
该单离胜肽的C端不含有RRGGRRRR序列(SEQ ID NO:17)。该单离胜肽可包含一保护基。
本发明的另一实施例中，该单离胜肽的C端具有一个半胱氨酸(cysteine)。
本发明的另一实施例中，该单离胜肽长度至少有19个氨基酸。
本发明另一实施例中，该单离胜肽的特征在于具有一抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、及/或真菌的活性。
本发明另一实施例中，该单离胜肽包含一个以上的HBc精氨酸密集区，该HBc精氨酸密集区是选自由下列(i)、(ii)及(iii)所组成的群组：
(i)HBc ARD I、II、III及IV；
(ii)HBc ARD I、II及III；
(iii)HBc ARD II、III及IV。
该单离胜肽包含3或4个精氨酸密集区。在本发明另一实施例中，该单离胜肽表现一对于具有黏菌素抗药性的鲍氏不动杆菌(A.baumannii)的抗菌活性。
在本发明的另一实施例中，该单离胜肽在C端不具有SQSRESQC(SEQ ID NO:16)序列，且特征在于具有一抗革兰氏阴性菌的活性。
该单离胜肽可选择性地包含HBc ARD II～IV但不包含HBc ARD I，并表现出抗绿脓杆菌(P.aeruginosa)的活性，或是该单离胜肽可包括HBc ARD I～III但不包括HBc ARDIV，并表现出抗克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumonia)的活性。
在本发明另一实施例中，该单离胜肽表现以下特征：
i)抗菌活性降低的条件是存在于二群SPRRRR(SEQ ID NO:13)其中一群的Ser被磷酸化；及/或
ii)抗菌活性丧失的条件在于各群SPRRR(SEQ ID NO:15)内的Ser被磷酸化。
该单离胜肽表现抗菌活性并对红血球、肾脏细胞及/或肝脏细胞无细胞毒性。
在本发明另一实施例中，前述单离胜肽包含：i)该单离胜肽的C端部分ARD IV下游为Ser或Pro氨基酸残基。该单离胜肽可进一步包含：ii)在每一ARD的间有Ser及/或Pro氨基酸残基(即ARD I及II的间、ARD II及III的间、以及ARD III及IV的间)。
在本发明另一实施例中，该单离胜肽氨基酸序列中Ser残基未被磷酸化。
该医药组成物的剂型为外用剂、喷雾剂、口服剂、全身性静脉注射剂、腹膜内、眼内、或直肠给药、或是吸入给药。
在本发明另一实施例中，该单离胜肽包含选自于由SEQ ID NOs:1～10及其任何血清型所组成的群组的氨基酸序列。
该医药组成物中单离胜肽的量为有效杀死及/或抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及/或真菌的生长及/或增殖。
实施例
根据本发明实施方式的示例性的仪器、器材、方法及其相关结果如后，且未意图限制本发明的范畴。为使读者方便阅读实施例可能使用标题与副标题，但不应用于限制本发明的范畴。此外，这里提出与揭露一些理论；然而无论该些理论对错与否，本发明的范畴应以本发明实际操作所限制而无关于任何特定理论或动作的过程。
材料与方法
所有动物实验的进行皆经中央研究院动物实验管理小组核准(ASIACUC核准号12-02-322)。研究符合国家研究委员会于1996年所发布的实验动物的照顾与使用指引的原则。
细菌分离株
HBc ARD胜肽的抗菌活性以ATCC中大量的菌株测试，包括绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)Migula株(ATCC 27853，抗安比西林)、绿脓杆菌Migula株(ATCC 9027，抗安比西林)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC 17593)、大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)亚种菌株(ATCC 25923，抗二甲氧苯青霉素)、金黄色葡萄球菌亚种菌株(ATCC 29213，抗二甲氧苯青霉素)、金黄色葡萄球菌亚种菌株(ATCC 19636，抗二甲氧苯青霉素)、以及白色念珠菌(Candida albicans)(ATCC 10231)。
临床上分离绿脓杆菌(NHRI-01、NHRI-02以及NHRI-04)，是经由台湾卫生研究院的台湾抗生素耐药性监控计划取得。鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(ATCC17989,ATCC 17978CR,ATCC19606,ATCC 19606CR,TCGH 45530以及TCGH 46709)由台湾慈济佛教医院取得，临床分离株(TCGH45530and TCGH 46709)以Vitek系统(Biomerieux Vitek,Inc.,MO,USA)辨识。当鲍氏不动杆菌对必倍西林(piperacillin)、必倍西林-他唑巴坦(piperacillin-tazobactam)、安比西林/舒巴克坦(ampicillin/sulbactam)、亚胺培南(imipenem)、头孢他汀(ceftazidime)、建它霉素(gentamicin)、丁胺卡那霉素(amikacin)、四环素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)、塞普沙辛(ciprofloxacin)、以及cotrimoxazole有抗药性时，定义为具有多重抗药性。对黏菌素的敏感性以肉汤培养基稀释法(broth-dilution method)测试，是依据临床与实验室标准协会的准则实行。
抗微生物活性
所有的胜肽购自曜鸿生物科技有限公司(台北，台湾)，同时提供胜肽特征的数据，包括HPLC及分子量。抗微生物活性的测试与胜肽的一些修饰，详细说明如后。细菌在米勒亨顿液态培养基(Mueller–Hinton broth，Difco)，37℃的环境中培养隔夜，在对数生长中期(mid-log phase)，细菌以磷酸盐缓冲液(10mM磷酸钠以及50mM氯化钠，pH 7.2)稀释至106菌落形成单位(colony formation unit，CFU)/ml。将胜肽依序以相同的缓冲液稀释。50μl的细菌与不同浓度的50μl胜肽混合，培养于37℃3小时且不摇晃。培养结束时，将细菌放置米勒亨顿培养盘(Mueller-Hinton broth agar plate)，培养于37℃隔夜以测量最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)。由MBC测试琼脂培养基上最低胜肽浓度，显示无细菌生长(零菌落)。所有的胜肽皆以三重复试验。
为测试杀伤动力学(killing kinetics)，细菌与胜肽的准备如前所述。将50μl的细菌与对应于MBC浓度的50μl的胜肽混合，并于37℃下培养。培养期间，将细菌依次稀释并置于米勒亨顿培养盘上作存活率测试。
共焦荧光显微镜
利用共焦荧光显微镜观察胜肽的位置。细菌生长至对数生长中期时离心收集。将接近107CFU置于磷酸盐缓冲溶液中再悬浮，该磷酸盐缓冲溶液含有浓度为0.5x MBC的FITC标记的HBc 147-183。接着于37℃培养1小时，冲洗、固定细胞并固定于涂布聚赖氨酸(poly-L-lysine)的载玻片(glass slide)上。在固定前于载玻片中加入含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的ProLong Gold antifade reagent(Invitrogen公司)。已标记胜肽的位置以装载100x油浸镜头的Olympus Ultraview共焦显微镜观察。
SYTOX Green染剂摄入
简短地说，将细菌(107CFU)与1μM SYTOX Green(Invitrogen公司)于黑暗中混合15分钟。在加入胜肽至对应的个别MBC最终浓度后，在37℃利用485nm及520nm滤光片量测其激发波长与发散波长，以测量荧光强度。迷力挺(Melittin，Sigma公司)是蜂毒的一种主要毒素，用于作为一正控制组以提供最大通透性。
凝胶阻滞实验(Gel retardation assay)
HBc 147～183的氨基氮(amino nitrogen，NH3+)与DNA的磷酸根(PO4-)的比例定义为N/P比。简单地说，HBc 147～183与不同N/P比(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3及4)的pSUPER质体DNA一起在37℃培养30分钟。pSUPER质体DNA的流动性以1％的琼脂糖凝胶电泳分析。
ARD胜肽与LPS/LipidA的体外键结分析
数种LPS胜肽或是A脂胜肽键结分析以下列步骤操作：
1)与卵白素(Streptavidin)结合的微珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1，Invitrogen公司)以绿脓杆菌LPS(Sigma公司)于37℃阻隔1.5小时。以PBST(含有0.1％(w/v)Tween-20的PBS，pH 7.4)冲洗的后，将含有250pmol等份的卵白素结合微珠与一反应混合物于4℃培养隔夜。该反应混合物为将放大的生物素标记的胜肽HBc147-183(0、0.004、0.02、0.1、0.5与2.5μM)以及5μg/ml的绿脓杆菌LPS(Sigma公司)或200μg/ml大肠杆菌A脂(Sigma公司)，在37℃混合3小时。于4℃培养隔夜的后，悬浮液中LPS(或A脂)降低的量利用ELISA读取器(Molecular Devices公司)以美洲鲎试验法(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)(Charles River Endosafe公司)测试。LPS的量(EU/ml)是依据原厂的内毒素标准比对曲线计算。
2)为直接量测放大的LPS键结至胜肽涂布微珠上放大的HBc147-183胜肽的数量，将微珠以PBST冲洗三次并以100μl含有0.15单位的胰蛋白酶琼脂糖(Sigma公司)的PBS于37℃培养隔夜。经胰蛋白酶的消化作用后，收集悬浮液中胰蛋白酶释放的LPS，并以美洲鲎试验法分析。在另一LPS分析方法：Endosafe-PTS Cartridges(Charles River Laboratories公司)得到相似的结果。
3)为制作LPS/A脂竞争分析，1μg的LPS涂布于高键结ELISA培养盘(Corning)上于4℃隔夜。将LPS涂布培养盘以PBST清洗并以含有5％BSA的PBST于37℃阻隔1小时。清洗的后，将HBc 147-183(10nM)与不同浓度的大肠杆菌A脂(0至10μg/ml)混合置入培养盘的每一孔(well)中于37℃培养1小时。键结于培养盘上的HBc 147-183以卵白素偶联HRP(稀释比1:10000)于37℃1小时测量。每孔加入TMB受质以显色。测量波长为450nm的吸收度，并以波长655nm为参考波长。
溶血活性
胜肽的溶血活性以溶血抗人类红血球细胞(hemolysis against human redblood cells，hRBCs)评估。人类血液取自于含有EDTA的试管，并以450g离心10分钟。将沉淀物以PBS清洗三次，并制成10％hRBCs溶液。hRBCs溶液与连续稀释的含有胜肽的PBS缓冲液混合，然后反应混合物于37℃培养1小时。以450g离心10分钟后，溶血的百分比以悬浮液的波长405nm的吸亮度评估。空白组与100％溶血组是分别为PBS缓冲液以及加入1％TritonX-100的溶液。
细胞毒性
细胞毒性是以HepG2、Huh7、HEK293以及Vero细胞并经由MTT分析评估。细胞以104个细胞/孔的密度植入96孔培养盘，并将连续稀释的胜肽加入每孔内。PBS用于作为负控制组，迷力挺(melittin)用于作为正控制组。1小时的培养的后，培养液换成含有10％MTT溶液(PROMEGATM)的新鲜培养液，且将培养盘置于37℃5％CO2的环境下培养4小时。利用ELISA读取器(BIO-RADTMmodel 680)读取波长为595nm的吸收值。
CFSE细胞增殖试验
为建立CFSE细胞增殖试验，HEK293细胞(来源为人类肾脏)以及非洲绿猴肾(Vero)细胞(来源为猴肾脏)于PBS中再悬浮，至密度为106个细胞/ml的最终浓度，并以10μM CFSE染剂(CELLTRACETMCFSE细胞增殖套组，INVITROGENTM)于37℃培养10分钟。为停止染色，加入冰的培养液并于冰上培养5分钟。收集被标记的细胞并以含有10％FBS新鲜培养液清洗三次，以3.3×105个细胞/孔的密度植入六孔培养盘中。20小时后，去除培养液并培养于含有5、25与100μM HBc 147-183的新鲜培养液中1小时(在加入ARD胜肽至HepG2细胞的培养液中10分钟后，标记FITC的ARD胜肽大量内化)。48小时后，收集细胞并以流式细胞仪分析(FACSCanto，BD Bioscience公司)。动物体内试验
3周大ICR公小鼠(19至21g)购自BioLASCO公司(台湾)。于脑心浸出物培养液(BHIbroth，Difco公司)中培养隔夜的细菌，于新鲜脑心浸出物培养液继代培养至对数增殖期(log phase)。接种物以脑心浸出物培养液稀释至所指定的密度。为准确测试ARD胜肽的体内毒性，ICR公小鼠分别接受腹膜内接种(i.p.)10与20mg/kg含有HBc147-183的PBS溶液。每组有5只小鼠。胜肽注射后，注射后7天内每天记录小鼠死亡的数量。为测试ARD胜肽的体内抗菌活性，所有的小鼠皆以腹膜内接种含有金黄色葡萄球菌ATCC 19636(4x 106CFU/mouse)的脑心浸出物培养液。于接种后1、1.5以及2小时给予胜肽HBc147-183(10mg/kg)。于接种后1小时给予PBS(10ml/kg)作为控制组。每组有10只小鼠。接种后7天内每天记录小鼠的死亡率。另外实验细菌含量，小鼠以腹膜内接种含有金黄色葡萄球菌ATCC 19636(106CFU/mouse)的脑心浸出物培养液。所有的小鼠在接种后1小时给予胜肽HBc 147-183(10mg/kg)或是PBS(10mg/kg)控制组，并于接种后4小时牺牲。血液样本(200μl)先与100mMEDTA(10μl)混合，再以PBS(无Ca2+及Mg2+)稀释20倍。肝脏及脾脏样本(0.1g)于灭菌的PBS中均质化(500μl)。样本稀释约100倍并置于脑心浸出物琼脂上，以记录其菌落数。
为测试ARD胜肽在体内对于革兰氏阴性菌的抗菌活性，小鼠接种克雷伯氏肺炎杆菌Xen39(107cfu/mouse)(Caliper LifeSciences公司)，是一株含有一光杆菌(Photorhabdus luminescens)luxABCDE操纵子修饰的基因工程菌。接种1小时后，小鼠接受10ml/kg的PBS(n＝5)或是10mg/kg的ARD胜肽(n＝5)。接种后4小时拍摄体内影像。先麻醉小鼠并移至活体分子影像系统(IVIS spectrum)，测量冷光1分钟以下。影像系统测量光子的数量并转换数据为假色影像(false color image)，假色影像中将强冷光区域以红色显示，中度冷光区域以黄色及绿色显示，微弱冷光区域以蓝色显示。生物冷光的增加表示细菌数减少。这些影像是摄影影像与生物冷光利用计算机产生的色阶迭合而成。感兴趣区域(ROI)的总光通量(RLU)以活体分子影像系统软件量化。
结果
HBc胜肽的体外抗微生物活性
如第1及10图所示，HBc147～183表现出广泛的抗革兰氏阴性菌(绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌以及大肠杆菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)以及真菌(白色念珠菌)的活性。在这些测试菌株中，绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌对此胜肽最为敏感。对于绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌来说，HBc147-183的MBCs低于4μM，而大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的MBCs约为4μM。白色念珠菌是对此胜肽最不敏感的(MBCs约为8μM)。
为进一步指出具有抗菌活性的序列，合成不同长度的胜肽(第1图)并如前述方法测试。胜肽HBc 147-175，于C端删除最后8个氨基酸，尽管它丧失了抗金黄色葡萄球菌与白色念珠菌的活性，但仍维持强烈的抗革兰氏阴性菌活性。胜肽ARD I～II(HBc147～159)或ARD III～IV(HBc164～176与HBc162～175)未具有抗所有测试的细菌与真菌的活性。相对地，所有含有ARD II～IV(HBc153～176、HBc157～176、HBc153～175、HBc155～175及HBc157～175)以及ARD I～III(HBc147～167)的胜肽显示分别具有抗绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌的强烈活性，虽然它们抗大肠杆菌的活性微弱(第10图)。因此，胜肽ARD II～IV与ARD I～III是必要的且能有效抗绿脓杆菌与克雷伯氏肺炎杆菌。
ARD胜肽的正电荷对于杀菌活性是具有关键性
丝氨酸残基S155、S162、S170、S176及S181的磷酸化研究显示丝氨酸磷酸化通常会使抗菌活性减弱。我们发现所有的HBc胜肽一旦磷酸化就会丧失对白色念珠菌的抗菌活性(第11图)。对细菌来说，在S181磷酸化未有任何作用，但在S155、S162、S170、及S176磷酸化会减弱其抗菌能力。HBc155p及HBc176p的MBCs降至8μM，HBc162p及HBc170p则降至32μM。当S155、S162及S170同时磷酸化(HBc155p162p170p)时，抗菌活性则完全丧失(>32μM)。此结果显示，除了S181的外，丝氨酸磷酸化通常不利于HBc ARD的抗菌活性。为确认精氨酸残基对于杀菌活性的重要性，我们合成并测试胜肽HBc147-183-III-IV AA，是于每个ARD III与ARD IV具有二个R替换成A的变异。与磷酸化HBc ARD胜肽相似，与HBc147-183相较，HBc147-183-III-IV AA的MBC显著地提升，这个结果指出精氨酸残基对于抗菌活性是必要的。抗药性
测试HBc147-183对于对黏菌素有抗药性的绿脓杆菌与鲍氏不动杆菌的抗菌活性。如第11图所示，HBc147～183于4μM可杀死对黏菌素敏感的绿脓杆菌，而对黏菌素有抗药性的绿脓杆菌对HBc147～183有交叉抗性(MBC>16μM)。与绿脓杆菌相反，HBc147～183对于抗黏菌素敏感绿脓杆菌与抗对黏菌素有抗药性的鲍氏不动杆菌的MBCs有着在0.5～1μM的相似范围。这个结果显示，我们的ARD胜肽HBc147～183对黏菌素有抗药性的鲍氏不动杆菌未有交叉抗性。
杀伤动力学
依时间的细菌存活率在试验菌株(绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌)以依据MBC浓度的HBc147～183处理的后评估(第2图)。这个结果显示绿脓杆菌在添加HBc147-183(2μM)20分钟内即被杀死。虽然克雷伯氏肺炎杆菌及大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其于180分钟内被4μM的HBc147～183杀死。而金黄色葡萄球菌，可发现其于120分钟内被4μM HBc147～183杀死。
HBc147～183的定位与机制
绿脓杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌以FITC标记的HBc147～183依据0.5xMBC处理，HBc147～183的位置利用共焦荧光显微镜观察(第3图)。在胜肽治疗下，绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌以荧光显示为空的杆状物，清楚定义细菌的表面，表示HBc147～183累积在细胞膜上(第3A～D图)。为更了解HBc胜肽对细胞膜的作用，做SYTOXGreen摄入分析。绿脓杆菌在添加2μM HBc147～183的情况下，引起细胞膜显著的穿透化(第4A图)。虽然4μM的HBc147～183也会累积在克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌的细胞膜上，但其未能造成金黄色葡萄球菌的细胞膜穿透化。如同HBc147～183对于绿脓杆菌的杀菌能力，HBc153～176在10分钟内以剂量依赖的方式造成相同的细胞膜穿透化(第4B图)。这结果表示HBc胜肽对绿脓杆菌的杀菌作用是直接经由一个与杀伤动力学相似的快速动力的细胞膜透化(第2图)。另一方面，发现HBc147～183穿过金黄色葡萄球菌的细胞膜，并位于细胞质中(第3E～G图)。为研究HBc 147～183与DNA潜在的交互作用，将HBc147～183与pSUPER质体DNA以不同的N/P比(如材料与方法中所述)混合，并以胶体电泳分析(第4C图)。结果显示当胜肽/DNA比例升高时DNA的流动性降低，且在比例为1时质体DNA完全滞留，表示HBc147～183对质体DNA有强烈的键结活性。总体来说，HBc147～183于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的杀菌机制可能完全不一样。
HBc147～183直接键结至LPS
为评估革兰氏阴性菌的LPS是否可作为一有潜力的HBc147～183标靶，将绿脓杆菌或大肠杆菌(Sigma公司)的LPS(0.05至50μg/ml)分别与绿脓杆菌及2μM HBc147-183培养3小时。结果显示，HBc147～183的杀菌能力因为添加50μg/ml的其中一种LPS而显著降低(第5图)。此外，HBc147～183优先键结至绿脓杆菌的LPS，而不是大肠杆菌的LPS。然而，添加抗LPS多株抗体(Genetex Co.公司)不能有效中和HBc147～183的杀菌活性(第5图)。这表示HBc147～183不只与LPS键结，也与细胞膜上其他标靶分子键结。或者，HBc147～183与这里使用的抗LPS多株抗体可主要键结至LPS上2个不同的抗原决定位。
如第6A图所示，利用不同的键结分析研究体外HBc147～183与LPS(或A脂基；LipidA moiety)的间潜在的交互作用。第6B图中，当HBc147～183键结至卵白素偶联的Dynabeads的量上升，并维持培养基中LPS的量时，渐增的LPS量来自悬浮液中减少的量。HBc147～1838p是具有8个ser/thr磷酸化，用于作为控制组胜肽。相似的结果以另一个LPS测试方法得到：Endosafe-PTS Cartridges(Charles River Laboratories公司)。在第6C图，经由ARD胜肽HBc147～183的胰蛋白酶琼脂糖消化法自微珠分离微珠所捕捉的LPS。释放的LPS量以LAL测试测量(如材料与方法所述)。LPS主要含有多醣及A脂基。为评估ARD胜肽是否可直接键结至A脂基，我们在第6D图中经由与第6B图相似的方法，测试A脂基与ARD胜肽的间的键结。如所预期的，微珠上的HBc147-183增加导致留存在悬浮液中的A脂数量减少。这个微球上ARD胜肽与悬浮液中A脂的间的负相关性(第6D图)明显地与先前在微球上ARD胜肽HBc147～183与LPS的间所发现的相似(第6B图)。为直接表示ARD胜肽可键结至LPS的A脂基，我们做了一个A脂与LPS的竞争实验(第6E图)。涂布LPS的ELISA培养盘内培养定量的HBc147-183(10nM)，该HBc147～183已预先与不同浓度的大肠杆菌A脂(0至10μg/ml)混合。在大范围的冲洗后，与培养盘结合的(即与LPS结合)生物素化胜肽HBc147～183以卵白素偶联HRP检测，接着加入TMB受质与显色剂。HBc147-183键结至LPS经由增加A脂的浓度而显著降低(第6E图)。此结果支持LPS的A脂基可作为ARD胜肽HBc147～183的直接标靶。
细胞毒性
为评估HBc胜肽的细胞毒性，我们测量HBc147～183的溶血活性。与迷力挺控制组相较，在培养1小时后未检测出HBc147～183有溶血性(第7A图)。此外，利用MTT分析评估HBc147～183对于人类肝癌细胞(Huh 7细胞与HepG2细胞)以及肾脏细胞(Vero细胞与HEK293细胞)的细胞毒性。以低剂量(3.125μM)迷力挺处理的细胞的存活率显著降低。相反地，HBc147～183对于人类肝癌细胞(Huh 7细胞与HepG2细胞)以及肾脏细胞(Vero细胞与HEK293细胞)，只有在100μM的剂量时具有低程度的细胞毒性(第7B图)。做CFSE细胞增殖分析以评估HBc147-183于Vero与HEK293肾脏细胞增殖的影响。与第1日相较，以HBc147-183(5、25与100μM)处理过细胞的CFSE强度降低至与第3日空控制组(mock control)相同(第7C图)，显示ARD胜肽HBc147～183对于细胞增殖未有显著影响。
动物实验
为达到实验上的细菌感染，我们使小鼠腹膜内接种金黄色葡萄球菌ATCC19636(4x106cfu/mouse)。评估小鼠在接种后1、2、4及6小时血液中的细菌量。如第8A图所示，细菌快速地自腹腔移至血液。在2小时以内，血液中的细菌数达到最大值(106cfu/ml)。之后，血液中的细菌数自发性地渐渐降低。为从自然清除细菌的作用中区别ARD胜肽的效果，我们测试ARD胜肽在接种后2小时内，于体内的保护活性。简单地说，小鼠以腹膜内接种金黄色葡萄球菌ATCC 19636并于接种后1、1.5、2小时分别接受单一剂10ml/kg PBS或是单一剂10mg/kgARD胜肽。以PBS处理的小鼠(n＝10)于接种后24小时内死亡(第8B图)。相反地，接种后1小时施予ARD胜肽(10mg/kg)在第7天可有效保护所有的小鼠免于死亡。当我们在接种后1.5小时(n＝10)与2小时(n＝10)施予ARD胜肽，存活率分别降至70％与40％。除了以死亡作为ARD胜肽抗菌活性的替代指标之外，我们也直接评估受感染小鼠体内ARD胜肽对于细菌量的影响(第8C图)。小鼠如先前方法接种金黄色葡萄球菌，并于接种后1小时以10ml/kg PBS(n＝5)或10mg/kg ARD胜肽(n＝5)处理。接种后4小时，控制组的小鼠于血液、肝脏、及脾脏样本的细菌量在106cfu/ml的范围(第8C及8D图)。施予ARD胜肽的小鼠于血液、肝脏、及脾脏样本的细菌量(～104cfu/ml)明显比PBS控制组小鼠低100倍(P<0.01)。除了金黄色葡萄球菌的外，我们也以IVIS影像系统测试了ARD胜肽于体内对克雷伯氏肺炎杆菌的抗菌活性。与金黄色葡萄球菌的细菌量变化相似，接种克雷伯氏肺炎杆菌Xen39的小鼠的生物荧光，于接种后2小时达到最大值(数据未显示)。接着我们在接种后1小时分别以PBS或ARD胜肽处理感染克雷伯氏肺炎杆菌Xen的小鼠。结果显示以ARD胜肽处理的小鼠，其生物冷光非常微弱，而PBS控制组的小鼠显示更强的生物冷光(第9A图)。在所有以PBS处理与以ARD胜肽处理之RLU值具有显著差异(P<0.01)(第9B图)。综上所述，实验结果显示HBc147～183具有显著的体内抗菌活性。表1显示人类HBc ARD与土拨鼠HBc ARD抗革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的最小杀菌浓度比较。
表1 人类HBc ARD与土拨鼠HBc ARD抗革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的最小杀菌浓度(MBC)比较
本发明关于一种分离自HBc的C端区域的新颖抗菌胜肽(HBc147～183)。基于该抗菌胜肽数据库的计算机软件(Wang et al.(2004)Nucleic Acids Res 32:D590-592)预测HBc147～183不利于作为一抗菌胜肽，因其疏水性氨基酸的含量非常低。然而，我们惊讶地发现，HBc147～183显示出广泛的抗菌活性，与计算机所预测的相反。当对黏菌素具有抗药性的绿脓杆菌表现对ARD胜肽HBc147～183的交互抗性，我们发现HBc147～183对所有测试的具有黏菌素抗药性的鲍氏不动杆菌，具有强烈抗菌活性(MBC＝0.5～1μm)。我们的ARD胜肽可键结至大肠杆菌的A脂与绿脓杆菌的LPS(第6图)。全长的HBc147～183(ARD I～IV)对所测试的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有抗性；较短长度的ARD II-IV(HBc153-176)以及ARD I-III(HBc147-167)，分别显示对绿脓杆菌以及克雷伯氏肺炎杆菌的革兰氏阴性菌(但不包括大肠杆菌)具有优异抗性。
与其他AMPs比较
HBc蛋白的ARD区域(HBc147～183)显现出新颖且广泛的杀菌活性是令人惊讶的。此胜肽与数个文献中的抗菌胜肽有一些相似度，例如鱼精蛋白(PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；SEQ ID NO:11)与蝇肽(drosocin，GKPRPYSPRPTSHPRPIRV；SEQ ID NO:12)。辐射扩散分析显示单一精氨酸密集区(RRRR)对抗菌活性是足够的，特别是抗革兰氏阴性菌(Lesmes et al.(2009)Peptides 30:2150-2160)。不像鱼精蛋白，HBc147-183的精氨酸密集区，例如ARD I-II与ARD III-IV，不具有抗菌活性。此外，抗菌胜肽数据库的序列组合显示HBc153～176与蝇肽共享44％的氨基酸序列一致性，蝇肽是一个自果蝇分离出来的脯氨酸密集胜肽。然而，除了绿脓杆菌，蝇肽有着优越的抗多数革兰氏阴性菌的活性。蝇肽明显地是经由非膜溶解机制杀死细菌。HBc ARD是一个具有广泛杀菌活性的新颖胜肽，与其它已知精氨酸密集抗菌胜肽不同。鱼精蛋白含有RRGGRRRR(SEQ ID NO:17)，但HBc147～183在HBc的C端是含有SQSRESQC(SEQ ID NO:16)。
抗菌机制
结果显示革兰氏阴性菌上HBc147～183的膜定位(第3图)，绿脓杆菌或大肠杆菌的LPS的中和活性(第5图)，表示HBc147～183具有强烈键结至LPS的活性。这个结果揭露HBc147～183直接键结至LPS及A脂(第6B、6C与6D图)。而且，LPS的A脂基表现为HBc147～183的一主要直接标靶(第6E图)。然而，LPS抗体与绿脓杆菌、HBc147～183的培养未中和HBcARD胜肽的杀菌活性(第5图)。这个负面结果的一解释为HBc147～183可不仅键结至LPS，亦可键结至其他细菌膜上的分子。我们在发现绿脓杆菌比大肠杆菌中的LPS有较好的中和效果(第5图)。HBc147～183与绿脓杆菌的LPS键结的优先度是关于其较强烈的抗绿脓杆菌活性。
HBc147～183对绿脓杆菌的作用模式，基于快速动力学(第2图)及其膜定位(第3A及3B图)的结果，是关于细胞膜穿透化。这个推测也被SYTOX Green摄入实验的结果支持(第4A图)。如同绿脓杆菌，HBc147～183也累积于克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌的细胞膜上。然而，克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌的杀伤动力学及SYTOX Green摄入实验并不支持细胞膜透化机制的结果。ARD胜肽除了经由细胞膜透化，是如何杀死细菌，仍待进一步的研究。
在革兰氏阳性菌的例子中，我们发现HBc147～183并未累积于其细胞膜上(第3图)。但可以在没有任何明显的细胞膜穿透化的情况下，进入金黄色葡萄球菌(第4A图)。除了LPS之外，HBc147～183也可以强力键结至质体DNA(第4C图)。总而言之，HBc147～183对于革兰氏阳性菌的杀菌机制较相似于Buforin II，Buforin II为一种习知经由穿透细菌细胞膜后，键结至DNA与RNA以杀菌的胜肽。
虽然HBc147～183可穿透Huh 7与HepG2细胞的细胞膜(数据未显示)，我们在MTT分析(第7B图)与增殖分析(第7C图)中发现，HBc147～183对于Huh7与HepG2细胞、肾脏细胞Vero与HEK293未有显著的细胞毒性，即使是在高胜肽浓度(100μM)的情况下。与溶血分析的结果(第7A图)综合来看，细胞培养实验中HBc147～183比迷力挺更安全。动物模型实验显示ARD胜肽对于ICR小鼠经由腹腔注射20mg/kg的剂量下，未有明显毒性(第7D图)。在如10mg/kg的低剂量下，ARD胜肽的治疗可保护小鼠免于死亡(第8B图)。相反地，PBS控制组的小鼠在接种细菌之后很快就死亡。除了脓毒症存活模型(sepsis survival model)，ARD胜肽的治疗(10mg/kg)亦可造成金黄色葡萄球菌与克雷伯氏肺炎杆菌的含菌量显著降低，而PBS控制组的小鼠表现高细菌量(第8C～D图与第9图)。这个结果表示HBc ARD胜肽的体内抗菌潜力。

Claims (17)

1.一种医药组成物，包含：
(a)一有效量的一单离胜肽，其中该单离胜肽包含三或四个B型肝炎病毒核蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)的羧基端区域的精氨酸密集区(arginine-richcarboxy-terminal region)，并表现一抗菌活性；以及
(b)一药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的医药组成物，其中该三或四个精氨酸密集区中的一个包含SerPro Arg Arg Arg Arg(SPRRRR；SEQ ID NO:13)或Arg Arg Arg Ser(RRRS；SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的医药组成物，其中该三或四个精氨酸密集区中的二个各包含SPRRRR(SEQ ID NO:13)。
4.如权利要求1所述的医药组成物，其中该三或四个精氨酸密集区包含三群(clusters)的SPRRR(SEQ ID NO:15)。
5.如权利要求1所述的医药组成物，其中该三或四个精氨酸密集区包含RRRS(SEQ IDNO:14)，且该单离胜肽包含二群位于RRRS(SEQ ID NO:14)上游的脯氨酸精胺酸(prolineArginine，PR)序列。
6.如权利要求5所述的医药组成物，其中该单离胜肽的C端不包含RRGGRRRR序列(SEQID NO:17)。
7.如权利要求1所述的医药组成物，其中该单离胜肽的C端具有一半胱氨酸(cysteine，C)。
8.如权利要求1所述的医药组成物，其中该单离胜肽不包含双极性结构。
9.如权利要求1所述的医药组成物，其中该单离胜肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的医药组成物，其中该单离胜肽的特征在于具有一抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、及/或真菌的活性。
11.如权利要求1所述的医药组成物，其中该单离胜肽包含一保护基。
12.如权利要求1所述的医药组成物，其中该三或四个精氨酸密集区是选自于由下列(i)、(ii)及(iii)所组成的群组：
(i)HBc ARD I、II、III及IV；
(ii)HBc ARD I、II及III；
(iii)HBc ARD II、III及IV。
13.如权利要求1所述的医药组成物，其中该单离胜肽表现一对于具有黏菌素抗药性的鲍氏不动杆菌(A.baumannii)的抗菌活性。
14.如权利要求13所述的医药组成物，其中该单离胜肽包含HBc ARD II-IV但不包含HBc ARD I，并表现出抗绿脓杆菌(P.aeruginosa)的活性。
15.如权利要求13所述的医药组成物，其中该单离胜肽包含HBc ARD I-III但不包含HBc ARD IV，并表现出抗克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumonia)的活性。
16.如权利要求1至15中任一项所述的医药组成物，其中该医药组成物的剂型为外用剂、喷雾剂、口服剂、全身性静脉注射剂、腹膜内、眼内、或直肠给药、或是吸入给药。
17.一种如权利要求1至15中任一项所述的医药组成物的用途，是用于杀死及/或抑制一需要的个体内一微生物的生长及/或增殖，或用于治疗受一微生物感染的一个体。
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