PL201419B1 - Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina - Google Patents
Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślinaInfo
- Publication number
- PL201419B1 PL201419B1 PL357517A PL35751702A PL201419B1 PL 201419 B1 PL201419 B1 PL 201419B1 PL 357517 A PL357517 A PL 357517A PL 35751702 A PL35751702 A PL 35751702A PL 201419 B1 PL201419 B1 PL 201419B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- sequence encoding
- amino acid
- cysteine proteinase
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 5
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 title 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 title 1
- 208000006275 fascioliasis Diseases 0.000 claims abstract description 69
- 241000242711 Fasciola hepatica Species 0.000 claims abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 82
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 claims description 81
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 claims description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 75
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 73
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 48
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 48
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 46
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 35
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 34
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 21
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 19
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 241000935974 Paralichthys dentatus Species 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 4
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 57
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 31
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 22
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 9
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710132348 Flagellar regulator flk Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 244000000050 gastrointestinal parasite Species 0.000 description 5
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 5
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 2
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018390 Ubiquitin-Specific Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010066496 Ubiquitin-Specific Proteases Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 101001123526 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 1
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 1
- 102100028007 Cystatin-SA Human genes 0.000 description 1
- 101710144510 Cysteine proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101001120037 Siganus canaliculatus L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940126576 edible vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010891 electric arc Methods 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
- C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
- C12N9/641—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Przedmiotami wynalazku s a bia lko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka ro slinna, spo- sób otrzymywania bia lka chimerycznego, transgenicznej ro sliny, transgeniczna ro slina. Ogólnie wyna- lazek dotyczy sposobu wywo lywania odpowiedzi immunologicznej, obejmuj acego podawanie szcze- pionki przez uk lad pokarmowy. Przedmioty wynalazku s luza do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko motylicy w atrobowej. PL PL PL PL
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201419 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 357517 (51) Int.Cl.
C12N 15/82 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 04.12.2002 A01H 5/00 (2006.01)
C07K 16/18 (2006.01) C07K 14/435 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01)
Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina (73) Uprawniony z patentu:
Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań,PL Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Warszawa,PL
Instytut Parazytologii im. Witolda Stefańskiego PAN, Warszawa,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:
14.06.2004 BUP 12/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2009 WUP 04/09 (72) Twórca(y) wynalazku:
Andrzej B. Legocki,Poznań,PL Katarzyna Miedzińska,Rawicz,PL Magdalena Czaplińska,Łęczyca,PL Anna Modelska,Poznań,PL
Tomasz Pniewski,Poznań,PL Andrzej Płucienniczak,Warszawa,PL Małgorzata Kęsik,Warszawa,PL
Anna Porębska,Warszawa,PL Halina Wędrychowicz,Warszawa,PL Juliusz Mieszczanek,Warszawa,PL Luiza Jedlina-Panasiuk,Warszawa,PL (74) Pełnomocnik:
Aleksandra Twardowska, Jan Wierzchoń & Partnerzy (57) Przedmiotami wynalazku są białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko motylicy wątrobowej.
PL 201 419 B1
Opis wynalazku
Przedmiotami wynalazku są białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko motylicy wątrobowej.
Motylica wątrobowa (Fasciola hepatica) jest pasożytem wewnętrznym bydła. Zaliczana jest do przywr digenicznych, co oznacza, że w cyklu życiowym wyróżnia się kilka stadiów rozwojowych, zachodzących z udziałem żywiciela pośredniego - ślimaka błotniarki moczarowej. Zwierzę zostaje zaatakowane po spożyciu roślin, na których znajdują się otorbione formy inwazyjne motylicy - metacerkarie. W przewodzie pokarmowym kręgowców otoczka metacerkarii ulega rozpuszczeniu, a młodociana postać poprzez jamę otrzewnową wędruje do wątroby i przedzierając się przez miąższ tego narządu dociera do przewodów żółciowych, gdzie stopniowo osiąga dojrzałość płciową. Choroba wywołana przez motylicę wątrobową, zwana chorobą motyliczą lub fascjolozą, powoduje chudnięcie zwierząt, spadek wydajności w produkcji mleka, obniżenie płodności a także może prowadzić do śmierci zwierzęcia (Kadłubowski i wsp. 1999). Jest to więc choroba o ogromnym znaczeniu gospodarczym, powodująca olbrzymie straty ekonomiczne. Ponadto odnotowuje się coraz więcej przypadków zachorowań wśród ludzi - szczególnie w krajach rozwijających się, gdzie przypuszcza się, że zakażony może być co trzeci mieszkaniec, a cięższe przypadki zakażeń motylicą wątrobową mogą zakończyć się śmiercią.
Motylicą wątrobowa uważana jest za jeden z najistotniejszych weterynaryjnych problemów pasożytniczych na świecie, równocześnie to właśnie szczepienia ochronne stają się najbardziej efektywną i opł acalną interwencją medyczną. O ich skuteczności decyduje nie tylko ich zdolność immunizacyjna, ale także dostępność, na którą wpływa głównie cena. Obecne badania skupiają się również na obniżeniu kosztów uzyskania szczepionek.
Leczenie polega na stosowaniu środków przeciwmotyliczych, a zapobieganie - na zwalczaniu ślimaka, pośredniego żywiciela pasożyta oraz na osuszaniu łąk i pastwisk. Jak do tej pory nie ma skutecznej szczepionki, chociaż podejmowanych jest wiele prób mających na celu znalezienie odpowiedniego antygenu motylicy, który wywołałby wysoką odpowiedź immunologiczną. Do tej pory jako szczepionki wykorzystywano antygeny pochodzące z motylicy (Wędrychowicz i Klockiewicz, Acta Parasitologica 1994, 39:173).
Wędrówka przywry wewnątrz tkanek żywiciela ostatecznego możliwa jest dzięki wydzielanym enzymom proteolitycznym, w tym proteinaz cysternowych. (Piacenza L. i wsp. Parasitol Int., 1998, 47S:266), które rozpuszczają białka substancji międzykomórkowej - najpierw ścian przewodu pokarmowego, później przewodów żółciowych i wątroby. Jest on więc czynnikiem kluczowym, który pozwala na rozwój pasożyta, a także pierwszym elementem kontaktu pasożyt - żywiciel. Enzymy proteolityczne odgrywają bardzo ważną rolę w cyklu życiowym wszystkich pasożytów, gdyż umożliwiają inwazję komórek i tkanek gospodarza - degradują elementy układu immunologicznego, hydrolizują białka żywiciela na własne potrzeby żywieniowe. W wyniku ewolucji enzymy stały się bardziej specyficzne co wpłynęło na sukces adaptacyjny pasożytów.
Proteinaza cysteinowa należy do grupy białek zwanych katepsynami L (cahtepsin like protein).
Znane są dwie niejednorodne formy tych enzymów - L1 i L2 (27 kDa i 29,5 kDa). cDNA proteinazy cysteinowej zostało zastosowane jako szczepionka przeciwmotylicza z zakończoną sukcesem immunizacją szczurów (Kofta i wsp., Vaccine 2000, 18:2985).
Jeszcze kilkanaście lat temu uważano, że enzymy proteolityczne wydzielane przez komórki gastrodermalne motylicy wątrobowej zaangażowane są tylko do ułatwienia penetracji tkanki gospodarza i przyswajania składników odżywczych. Obecnie wiadomo, że katepsyny L mogą ciąć przeciwciała w regionie zawiasowym i chronić pasożyta przed atakiem immunologicznym. Ponadto mają zdolność fragmentacji fibrynogenu tak, że tworzy on skrzepy otaczające wędrującą w organizmie żywiciela przywrę i przez to osłabiają skuteczność odpowiedzi immunologicznej, hamując dostęp makrofagów. Jedna z katepsyn jest też obecna u dorosłych przywr w gruczołach Melisa, gdzie uczestniczy w wytwarzaniu jaj. Oznacza to więc, że enzym ten jest wydzielany na każdym etapie życia pasożyta.
Transgeneza umożliwiła wykorzystanie organizmów zwierzęcych i roślinnych jako swoistych bioreaktorów. Otrzymywane tą drogą organizmy transgeniczne produkują białka antygenowe, które wprowadzają system immunologiczny w stan gotowości przed inwazją patogenów (Charon i wsp.,
Genetyka zwierząt, PWN, Warszawa, 2000). W szczepionkach tego typu materiał szczepionkowy
PL 201 419 B1 stanowią pojedyncze antygeny - białka wirusowe, bakteryjne bądź pasożytnicze. Stymulacja układu immunologicznego jest możliwa, gdy białko zachowuje niezmienioną, natywną strukturę, co oznacza, że czynniki chorobotwórcze organizmów wyższych wymagają zwykle eukariotycznego systemu ekspresji. Dlatego też produkcja takich białek w drożdżach, czy też bakteriach, pomimo że tańsza i bardziej wydajna, ze względu na brak możliwości odpowiedniej modyfikacji białek często okazuje się nieskuteczna.
Opis patentowy US6084156 (opublikowany 2000.07.04) opisuje rozwiązanie dotyczące roślin wytwarzających peptydy lityczne. Poza opisem US6084156 rozwiązanie dotyczące stabilizującego połączenia polipeptydów z peptydem litycznym ubikwityny oraz sposobu wytwarzania poprzez subklonowanie kwasu nukleinowego kodującego sekwencje peptydów litycznych do wektora plazmidu zawierającego promotor i sekwencję kodującą polipeptyd ubikwitynę, w którym sekwencja polipeptydu ubikwityny jest połączona z 5' końcem sekwencji kwasu nukleinowego peptydu litycznego ulegającego translacji jako polipeptyd fuzyjny przedstawione jest także w opisach patentowych US 6448391 (opublikowany 2002.09.10) oraz US6018102 (opublikowany 2000.01.25) i US5955573 (opublikowanym 1999.09.21). Przy czym opisy US6018102 i US5955573 opisują ponadto rozwiązania dotyczące konstruktów genowych połączenia peptydu litycznego ubikwityny, produktów białkowych z nich otrzymywanych oraz ich wytwarzania i zastosowania.
Opis patentowy US6306663 (opublikowany 2001.10.23) opisuje rozwiązanie dotyczące nowych związków zawierających element rozpoznania ubikwityny oraz białkowy czynnik wiążący. Wynalazek dotyczy także zastosowania tych związków w celu zmodulowania poziomu i/lub aktywności białka docelowego. Związki te są przydatne w zastosowaniu przeciwko infekcjom, stanach zapalnych, nowotworach i chorobach genetycznych, a także jako herbicydy i insektycydy.
Opis patentowy US6068994 (opublikowany 2000.05.30) opisuje wynalazek dotyczący ekspresji ubikwityny. Rozwiązanie przedstawia system przyłączenia ubikwityny, umożliwiający możliwy do regulowania wysoki poziom wytwarzania heterologicznych białek posiadających destabilizujące reszty aminokwasowe w pozycji terminalnej. Białka fuzyjne ubikwityny ulegające ekspresji w drożdżach są cięte precyzyjnie in vivo przez hydrolazy endogeniczne specyficzne dla ubikwityny do heterologicznych białek drożdży takich jak ludzka alfa-1-antytrypsyna, ludzki gamma-interferon i ludzkie białko wirusa HIV, wszystkich które inicjują z resztami destabilizującymi. Wektor ekspresji zawierający syntetyczny gen monomerycznej ubikwityny drożdży został skonstruowany i ulegał ekspresji pod kontrolą drożdżowego promotora regulatorowego dla glukozy. System ten może być zastosowany do podwyższenia poziomu ekspresji w przypadku białek wykazujących niski poziom ekspresji oraz do wytwarzania białek posiadających destabilizujące reszty aminokwasowe w pozycji terminalnej.
W opisach patentowych US 5847097 (opublikowanym 1998.12.08) oraz US5646017 (opublikowanym 1997.07.08) przedstawiony jest sposób tworzenia lub modyfikowania struktury białka na poziomie białka bądź genu w celu wytwarzania specyficznych amino-końców in vivo lub in vitro. Sposoby te opierają się na nienaturalnym wprowadzeniu połączenia białko-ubikwityna oraz stwierdzeniu, że czas pół-rozpadu białka in vivo jest funkcją N-końcowego aminokwasu białka.
Opis patentowy US5620923 (opublikowany 1997.04.15) opisuje sposób wytwarzania syntetycznych produktów białkowych zawierających do około czterdziestu reszt aminokwasowych powiększonych o ubikwitynę na końcu karboksylowym ulegających ekspresji w komórkach prokariotycznych takich jak E.coli. Proces ten można zastosować do wytwarzania peptydów zawierających od 2 do ok. 40 reszt aminokwasowych i jest w szczególności dostosowany do produkcji peptydów zawierających od 5 do 40 reszt aminokwasowych.
Opis patentowy US 5494818 (opublikowany 1996.02.27) dotyczy klasy generycznej ubikwitynospecyficznych proteaz, które specyficznie rozcinają grupy przy grupie C-końcowej reszty ubikwityny w białku fuzyjnym ubikwityny, niezależ nie od jego wielkoś ci.
Dokładniej wynalazek dotyczy proteaz ubikwityno-specyficznych z klasy wyizolowanej z komórki oraz wyizolowanych sekwencji DNA kodujących białka tej klasy.
Próby wytworzenia antygenów dla celów szczepionkowych przeprowadzane w hodowlach komórkowych ssaków lub owadów związane były z bardzo dużymi kosztami, koniecznością ciągłej kontroli procesu syntezy i precyzyjnego oczyszczania preparatów szczepionkowych tak by nie stanowiły potencjalnego źródła czynników wywołujących odczyny alergiczne bądź wystąpienia reakcji autoimmunologicznych.
Bioreaktory roślinne są znacznie tańsze i bezpieczniejsze. Białka powstające w komórce roślinnej na bazie egzogennego DNA mają identyczny skład aminokwasów, ulegają podobnym modyfikacjom
PL 201 419 B1 oraz uzyskują analogiczne właściwości do tych pojawiających się w procesie patogenezy w organizmie gospodarza. Rośliny transgeniczne we wszystkich komórkach zawierają fragment obcego DNA, kodujący odpowiedni antygen i produkują określone białko antygenowe. Wprowadzony obcy gen jest przekazywany potomstwu.
Rośliny zmodyfikowane mogą być spożywane w stanie surowym, dzięki czemu pominięte zostają koszty związane z oczyszczaniem antygenu. Doustna droga immunizacji wydaje się najdogodniejsza ze względu na nieinwazyjny i bezbolesny sposób podania, wysoką efektywność ogólnoustrojowej odpowiedzi (McGhee J.R., Lamm M.E., Strober W. 1999, w: Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., red.), str. 485 - 505, Academic Press).
Opisy patentowe: US6281345 (opublikowany 2001.08.28), US6265198 (opublikowany 2001.07.24) opisują kompozycje farmaceutyczne zawierające kwasy nukleinowe, białka, przeciwciała i inhibitory oraz ich zastosowanie do ochrony zwierzą t przed chorobami spowodowanymi pasoż ytami układu pokarmowego.
Opis patentowy US6066503 (opublikowany 2000.05.23) opisuje rozwiązanie dotyczące sekwencji nukleotydowych kodujących enzymy aminopeptydazy pasożytów układu pokarmowego, ich antygeny oraz ekwiwalenty funkcjonalne i zastosowanie ich jako szczepionki przeciwko tym pasożytom.
W opisie patentowym US5885814 (opublikowanym 1999.03.23) przedstawiona jest szczepionka przeciwko pasożytom układu pokarmowego, zawierająca proteazę serynową otrzymaną z motylicy wątrobowej.
Opisy patentowe US6419923 (opublikowany 2002.07.22), US6365392 (opublikowany 2002.04.02), US5795768 (opublikowany 1998.08.18), US5792624 (opublikowany 1998.08.11), US5750391 (opublikowany 1998.05.12) oraz US5691186 (opublikowany 1997.11.25) opisują sposoby otrzymywania białek proteinazy cysteinowej, przeciwciał, związków inhibujących aktywność proteinazy cysteinowej nicieni, a także ich zastosowanie jako kompozycji farmaceutycznych do ochrony zwierząt przed chorobami wywoływanymi przez pasożyty układu pokarmowego, wyizolowane rekombinowane komórki wykazują ekspresję. W opisie US6365392 kompozycja zawierająca poszczególne, wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego stanowi szczepionkę rekombinowanego wirusa.
Opis patentowy US5863775 (opublikowany 1999.01.26) opisuje sposób zwalczania pasożytów układu pokarmowego w zwierzętach będących żywicielami ostatecznymi, polegający na dostarczeniu doustnie zwierzęciu białka antyparazytologicznego, w formie lekarstwa bądź pożywienia, tak by białko to trafiło do pasożyta. Białko antyparazytologiczne może być inhibitorem enzymu pasożyta, na przykład inhibitorem enzymu trawiennego takiego jak inhibitor proteinazy cysteinowej. Zgodnie z tym rozwiązaniem białko antyparazytologiczne jest białkiem ulegającym ekspresji w transgenicznej kukurydzy i ryż u, stanowią cych paszę dla zwierzą t.
Pomimo opisanych powyżej wstępnych badań poświęconych dostarczeniu szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznych narzędzi pozwalających na łatwe uzyskiwanie skutecznych szczepionek uodparniających przed tym pasożytem.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do otrzymywania szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie białek chimerycznych, które zawierałyby wybrane antygeny pochodzące z proteinazy cysteinowej izolowanej z Fasciola hepatitca i mogłyby być wykorzystane do szczepień przeciwko motylicy wątrobowej, a także narzędzi pozwalających na ich ekspresję, zwłaszcza w układach roślinnych. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie środków pozwalających otrzymać transgeniczną roślinę, która mogłaby być zastosowana do produkowania jadalnych szczepionek przeciwko motylicy wątrobowej.
Nieoczekiwanie realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z białkami powstającymi w komórkach na bazie egzogennego DNA zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest białko chimeryczne charakteryzujące się tym, że zawiera sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc (hepatitis B core) albo sekwencji ubikwityny. Korzystnie, białko według wynalazku zawiera jedną z następujących sekwencji: sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc, albo sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wą trobowej połączoną z sekwencją biał ka rdzeniowego HBc, albo sekwencję domeny kataPL 201 419 B1 litycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego albo sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją ubikwityny.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja kodująca białko chimeryczne, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny. Korzystnie sekwencja według wynalazku zawiera jedną z następujących sekwencji: sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę. Szczególnie korzystne sekwencje zostały przedstawione na fig. 1 - fig. 14.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko chimeryczne, charakteryzujący się tym, że jako sekwencję kodującą białko chimeryczne zawiera zdefiniowaną powyżej sekwencję kodującą białko chimeryczne według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna charakteryzująca się tym, że zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka chimerycznego, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzenie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor i ekspresję białka chimerycznego, przy czym wektor zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznej rośliny, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzanie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor, i regenerację roślin, przy czym wektor zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest transgeniczna roślina, charakteryzująca się tym, że posiada komórki transformowane konstruktem według wynalazku zdefiniowanym powyżej.
Zgodnie z wynalazkiem sekwencję kodującą proteinazy podzielono na odcinki kodujące domenę katalityczną oraz liderową enzymu, gdyż wykorzystanie całej sekwencji kodującej proteinazy cysteinowej mogłoby powodować powstawanie w pełni aktywnego enzymu z zachowaniem jego aktywności hydrolitycznej, mogącej powodować zaburzenia rozwoju roślin transgenicznych. W szczególnej realizacji wynalazku fragmenty te połączono z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc (hepatitis B core) wirusa HBV. Takie chimeryczne geny umieszczono pod kontrolą promotora konstytutywnego 35S CaMV w wektorze binarnym ROK2 otrzymując pMKCROK2 i pMLCROK2. Dodatkowo wykonano wektory z wykorzystaniem sekwencji domeny katalitycznej, połączonej z białkiem rdzeniowym HBc oraz kilkoma resztami glicynowymi, a także podłączono sekwencję katalityczną do ubikwityny. Plazmidy te zostały wprowadzone do roślin z wykorzystaniem procedur pozwalających na ich integrację do genomu roślinnego.
Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.
Figura 1 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::liderową część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i SacI.
Figura 2 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Figura 3 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Figura 4 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i Hindlll.
PL 201 419 B1
Figura 5 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i Hindlll.
Figura 6 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniową część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i SacI.
Figura 7 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Xbal i BamHI.
Figura 8 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::liderowa część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Figura 9 przedstawia sekwencję kodującą część katalityczną proteazy cysternowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Figura 10 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Figura 11 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK (-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną EcoRI i Hindlll.
Figura 12 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną EcoRI i Xhol.
Figura 13 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::liderowa część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i SacI.
Figura 14 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora ROK2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHI i Asp718. Wklonowany Fragment zawiera na początku (do miejsca cięcia nukleazą restrykcyjną EcoRI) i na końcu (od miejsca cięcia nukleazą restrykcyjną Hindlll) sekwencję pochodzącą z wektora Bluescript SK (-).
Figura 15 przedstawia analizę transformantów metodą PCR z zastosowaniem specyficznych starterów oligonukleotydowych. Potwierdzona jest obecność transgenów w wektorze: a - pMKCROK2, A. tumefaciens LBA4404pMKCROK2, b - pMLCROK2, A. tumefaciens LBA4404pMLCROK2, c - A.tumefaciens EHAlOSMOTUBIKatROK, d-A.tumefaciens EHAlOSMOTGlyKatROK;
Figura 15a: 1-8. A.t LBA4404 pMKCROK2, 9. kontrola negatywna, 10. marker DNA 1 kpz (Sig ma), E.coli pMKCROK2, 18. kontrola pozytywna, pMKCROK2;
Figura 15b: 1-5. A.t LBA4404 pMLCROK2, 6-8. E.coli pMLCROK2, 9. marker DNA 1 kpz (Sigma), 10 kontrola pozytywna pMLCROK2;
Figura 15 c: 1=10. A.tumefaciens, EHA105MOTUBIKatROK, 11. kontrola pozytywna pMOTUBIKatROK, 12. marker DNA l kpz (Sigma);
Figura 15 d: 1-10 A.tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK, 11 kontrola pozytywna MOTGlyKatROK, 12. marker DNA 1 kpz (Sigma)
Figura 16 przedstawia analizę PCR pod kątem obecności hybrydowej sekwencji MotKat - C lub MotLid - C. Użyto starterów MotLS i MotL3 specyficznej do sekwencji domeny liderowej oraz Mot5 i MotK3 dla sekwencji domeny katalitycznej;
Figura 16a: sałata nietransformowana 1 - kontrola negatywna, 2 kontrola pozytywna pMKCROK, 3. woda - kontrola negatywna, 5. marker DNA 1 kpz (Sigma), 6-14. próbki DNA z roślin transgenicznych;
Figura 16 b: 1- marker DNA 1 kpz (Sigma), 2-12 próbki DNA z roślin transgenicznych; kontrola pozytywna pMLCROK; woda - kontrola negatywna
Figura 17 przedstawia analizę PCR pokolenia T1 transformowanych roślin sałaty na obecność transgenów: a - MotKat -C, b - MotLid - C;
Figura 17 a: 1-14. genotyp A1, 15. kontrola pozytywna, 16. kontrola negatywna, 12 . marker
DNA 1 kpz,
PL 201 419 B1
Figura 17b 1-12. genotyp A1, 14-20. genotyp A2, 22. kontrola pozytywna, 23. kontrola negatywna, 13,24. marker DNA 1 kpz.
Figura 18 przedstawia hybrydyzację typu Western ekstraktu białkowego z liofilizatu sałaty transformowanej za pomocą wektora pMLCROK2, gdzie kolejne ścieżki oznaczają:
1. marker białkowy (Promega)
2. preparat białkowy liofilizatu kontrolnego, nietransformowanego
3. preparat białkowy liofilizatu kontrolnego, nietransformowanego z dodatkiem antygenu (100 ng)
4. kontrola pozytywna, oczyszczone białko hybrydowe zawierające fragment liderowy proteinazy cysternowej połączony z białkiem c wirusa HBV (100 ng)
5,6. preparat białkowy liofilizatu transgenicznego, zaznaczono produkt - białko antygenowe wielkości 28,8 kDa.
Figura 19 przedstawia hybrydyzację typu Western ekstraktu białkowego z liofilizatu sałaty transformowanej za pomocą wektora pMKCROK2, gdzie kolejne ścieżki oznaczają:
1. marker białkowy (Promega)
2. preparat białkowy liofilizatu kontrolnego, nietransformowanego
3. preparat białkowy rośliny kontrolnej, nietransformowanej z dodatkiem antygenu (100 ng)
4. kontrola pozytywna, oczyszczone białko hybrydowe zawierające fragment katalityczny proteinazy cysteinowej połączony z białkiem c wirusa HBV (100 ng)
5,6. preparat białkowy liofilizatu transgenicznego, zaznaczono produkt - białko antygenowe wielkości 43,2 kDa
Figura 20 przedstawia analizę immunoenzymatyczną metodą ELISA na potwierdzenie ekspresji antygenu w roślinach sałaty:
a) kontrola roślin, do których wprowadzono sekwencje liderową proteinazy cysteinowej połączoną z białkiem c wirusa HBV, gdzie:
c- - ekstrakt białkowy z sałaty nietransgenicznej
- - ekstrakt białkowy sałaty nietransgenicznej z dodatkiem antygenu 0,5 ng, 1 ng, 2 ng, ng, 8ng
1-12 - ekstrakt białkowy z sałaty transgenicznej zawierający fragment liderowy proteinazy
- cysteinowej połączony z białkiem c wirusa HBV(100 ng)
b) kontrola roślin, do których wprowadzono sekwencje katalityczną proteinazy cysteinowej połączoną z białkiem c wirusa HBV, gdzie:
1-22- ekstrakt biał kowy z sał aty transgenicznej zawierający fragment katalityczny proteinazy cysteinowej połączony z białkiem c wirusa HBV (100 ng)
- ekstrakt białkowy sałaty nietransgenicznej
Figura 21 przedstawia analizę immunoenzymatyczną metodą ELISA na potwierdzenie ekspresji antygenu w liofilizacie sałaty:
a) analiza liofilizatu zawierającego sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV, gdzie:
- liofilizat sałaty transgenicznej
- liofilizat sa łaty nietransgenicznej
- liofilizat sałaty nietransgenicznej z dodatkiem antygenu 1,5 ng, 6 ng, 12 ng
- II przeciwciało - kontrola negatywna, układ bez dodatku II przeciwciała poliklonalnego anty L5
b) analiza liofilizatu zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HB V, gdzie:
- liofilizat sałaty transgenicznej liofilizat sałaty nietransgenicznej liofilizat sałaty nietransgenicznej z dodatkiem antygenu 1,5 ng, 6 ng, 12 ng II przeciwciało - kontrola negatywna, układ bez dodatku II przeciwciała poliklonalnego anty K4
Figura 22 przedstawia bakteryjny plazmid ekspresyjny pIGCmT7 (4056 pz.), który powstał w oparciu o plazmid pIGDM1, który jest plazmidem z grupy Co1E1 Enterobacter agglomerans. Plazmid pIGCmT7 powstał przez dostawienie genu oporności na chloramfenikol, polilinkera wraz z promotorem RNA polimerazy z faga T7 oraz sekwencją kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7, przy czym:
PL 201 419 B1
ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG
ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1
Cm-R - gen oporności na chloramfenikol
T7 - promotor stop - terminacja transkrypcji.
Figura 23 przedstawia roślinny plazmid ekspresyjny ROK2, gdzie:
RB - prawa sekwencja flankowa
LB - lewa sekwencja flankowa pNOS - promotor Nos
NPT II (Kanamycyna R) - gen oporności na kanamycynę tNOS - terminator Nos pCaMY 35S - promotor wirusa mozaiki kalafiora Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.
P r z y k ł a d 1. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin
Pierwszy wariant dotyczył konstrukcji wektora pMKC35SROK zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc (hepatitis B core) wirusa HBV.
Drugi wariant doświadczenia dotyczył konstrukcji wektora pMLC35SROK zawierającego sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc (hepatitis B core) wirusa HBV.
Trzeci wariant dotyczy konstrukcji wektora p35SMOTKatUBIROK zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą ubikwitynę.
Czwarty wariant dotyczył konstrukcji wektora p35SMOTGlyKatROK zawierającego sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej połączonej z sekwencją kodującą ubikwitynę oraz resztami glicynowymi.
Bakterie zawieszone w glicerolu i przechowywane w ultrazamrażarce (temperatura -70°C) rozmrażano w łaźni lodowej. Do rozmrożonych bakterii dodawano 1 - 20 ng DNA plazmidowego, lekko mieszano i inkubowano w lodzie 2 - 6 min. Bakterie przenoszono do schłodzonej kuwety do elektroporacji. Kuwetę umieszczano w aparacie do elektroporacji i włączano łuk elektryczny. Parametry elektroporacji wynosiły 25 μF i 2500 V. Po elektroporacji zawieszano bakterie w 1 ml pożywki SOC i przenoszono odpowiednio do kolbki. Bakterie wytrząsano przez 1-2 godz. w 28°C, 50 - 60 rpm. Zawiesinę bakterii wysiewano na pożywki YEB z antybiotykami w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l i hodowano 2 dni w 28°C.
Wstępną selekcję transformowanych komórek, przeprowadzano na podłożu z dodatkiem czynników selekcyjnych w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l. Drugą metodą była wizualizacja odcinka wprowadzonego DNA poprzez namnożenie go metodą PCR (na zagotowanych komórkach A. tumefaciens przez 10 min w 150 μl wody) z zastosowaniem specyficznych starterów oligonukleotydowych.
Wyrosłe agrobakterie posiewano na 10 ml płynnego podłoża YEB z antybiotykami w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l w 100 ml kolbkach Erlenmayera i hodowano w temp. 28°C. Po 16-20 godzinach hodowli zawiesiną agrobakterii inokulowano na świeżą pożywkę YEB z antybiotykami w stężeniu rifampicyna 100 mg/l i kanamycyna 50 mg/l w stosunku 1:100 i prowadzono dalej hodowlę w temp. 28°C do osiągnięcia przez bakterie logarytmicznej fazy wzrostu. Fazę wzrostu bakterii oceniano na podstawie pomiaru OD zawiesiny przy długości fali 600 nm.
P r z y k ł a d 2. Transformacja i otrzymywanie roślin transgenicznych
T a b e l a 1
Warianty przeprowadzonych doświadczeń
| Wariant doświadczenia | Szczep Agrobacterium | Odmiana sałaty |
| LT-12 | A.tumefaciens LBA4404 pMKC35SROK | Syrena |
| LT-13 | A.tumefaciens LBA4404 pMLC35SROK | Bipp Burple |
| LT-14 | A.tumefaciens EHA105MOTUBIROK | Aramir |
| LT-16 | A.tumefaciens EHA105SMOTGlyKatROK | Aramir |
PL 201 419 B1
Nasiona pobierano do kolby i przez 2 min płukano w 70% etanolu. Następnie zbierano etanol a nasiona przepł ukiwano sterylną wodą . Póź niej inkubowano przez 20 min w 25% roztworze komercyjnego wybielacza Clorox z dodatkiem detergentu Tween 20 (stężenie 0,01%). Następnie materiał przemywano 4-5 razy po 2-3 minuty sterylną wodą destylowaną, aż do całkowitego wypłukania Clorox'u. Wysterylizowane nasiona sałaty wykładano na szalki z 0,8% agarem. Nasiona kiełkowały w temp. 22 - 24°C, w warunkach słabego oświetlenia. Po upływie 2-3 dni odcinano liścienie, umieszczano w zawiesinie A. tumefaciens i inkubowano przez 10 min, lekko mieszając. Po inokulacji liścienie wykładano stroną brzuszną na pożywkę LR3A. Kokulturę prowadzono przez 2- 4 dni, w ciemności, w temp. 28°C. Po zakończeniu kokultury liścienie przenoszono na pożywkę selekcyjną LR3A z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l.
Liścienie, na których powstawał kalus, co 5 dni przeszczepiano na świeżą pożywkę LR3A z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Regenerujące rośliny odcinano od kalusa i przeszczepiano na pożywkę LR2A z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Gdy rośliny osiągały rozmiar około 2-3 cm, przenoszono je do słoików zawierających pożywkę 1/2SH z antybiotykami w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Ukorzenione rośliny wysadzano do doniczek zawierających piasek zmieszany z perlitem w stosunku 1 : 1 i adaptowano do warunków in vivo.
Zebrane z pierwotnych transformantów nasiona sterylizowano i wykładano na szalki Petriego zawierające 0,8% agar z dodatkiem antybiotyków w stężeniu kanamycyna 200 mg/l i augmentyna 300 mg/l. Nasiona kiełkowały przez 1-2 dni w temperaturze 28°C w ciemności. Rozwijające się z nasion siewki przenoszono do doniczek oraz warunków in vivo.
Regeneracja roślin
T a b e l a 2
Warunki regeneracji roślin
| Hodowla roślin w warunkach in vitro w pokoju hodowlanym | Hodowla roślin w warunkach in vivo w szklarni |
| - temperatura 22 - 24°C - fotoperiod 16/8 - natężenie światła fluorescencyjnego ok. 3000 luksów | - temperatura 18 - 22°C w dzień, 14-18°C w nocy - fotoperiod 14/10 (14 h światła i 10 h ciemności) w okresie jesienno-zimowym oraz oświetlenie naturalne wiosną i latem. - nawożenie: azofoska |
P r z y k ł a d 3. Ekspresja i analiza.
Analiza transformowanych bakterii
Wstępną selekcję transformantów przeprowadzono na podłożu z dodatkiem czynnika selekcyjnego, na którego oporność zawierał wprowadzany fragment DNA (rifampicyna 100 mg/ml, kanamycyna 50 mg/ml).
Kolejnym etapem była analiza transformantów metodą PCR z zastosowaniem specyficznych starterów oligonukleotydowych.
T a b e l a 3
Startery oligonukleotydowe używane do reakcji PCR oraz do sekwencjonowania
| gen | starter | Sekwencja startera | t° przyłączenia, °C | Wielkość produktu, pz |
| MotLidC | MOTL5 MOTL3 | GGA TCC ATA TGT CGA ATG ATG ATT TG ATA CGA TTG TTC GTC TCA TAC GGG A | 65 65 | 240 |
| MotKatC | MOT5 MOTK3 | TGA CTG GCG TGA ATC TGG TTA TG TTC CAC ACA TGT TAC CTC GAT TCC | 65 65 | 546 |
| MotKatGly | MOTGlyS MOTGly3 | GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG AGC TTA AAC AAC AGT AGT TCCG | ||
| MotKatUbi | UBIROCK MOTKATRO | GGG GTC TAG ACC ATG CAG ATT TTC GTC AAA ACT TTG GGG GAT CCT TAA TGG ATG CCG GAA ATC GTG CC | 100 100 | 912 |
PL 201 419 B1
Potwierdzenie obecności transgenów w wektorze: a - pMKCROK2, A. tumefaciens
LBA4404pMKCROK2, b - pMLCROK2, A. tumefaciens LBA4404pMLCROK2, c - A. tumefaciens
EHA105MOTUBIKatROK, d - A. tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK przedstawiono na fig. 15.
Analiza mieszańców pokolenia T0 metodą PCR.
Uzyskane rośliny transgeniczne sprawdzono pod kątem obecności hybrydowej sekwencji MotKat - C lub MotLid - C za pomocą metody PCR. Użyto starterów MotLS i MotLS specyficznej do sekwencji domeny liderowej oraz Mot5 i MotK3 dla sekwencji domeny katalitycznej.
Rośliny z transformacji LT14 i LT16 znajduje się w fazie regeneracji w warunkach in vitro na pożywce 1ASH lub w multi-platach w warunkach in vivo. Sprawdzenie transformowanych roślin sałaty na obecność transgenów: a- MotKat -C, b - MotLid - C przedstawiono na fig. 16.
Kolejnym etapem było wyprowadzenie jednorodnego pod względem genetycznym pokolenia transformantów T1. Wybrano po dziesięć nasion z pięciu linii transformantów F0 a następnie przeanalizowano rośliny metodą PCR na obecność sekwencji wprowadzonych genów.
Sprawdzenie pokolenia T1transformowanych roślin sałaty na obecność transgenów: a-MotKat -C, b - MotLid - C przedstawiono na fig. 17.
Analiza uzyskanych transformantów T1 metodami immunologicznymi
Wykorzystanie metod immunologicznych pozwala nam na wykrycie poziomu ekspresji białka.
Do chwili obecnej nie dysponujemy przeciwciałami monoklonalnymi anty- MotKat i anty- MotLid. Mamy natomiast przeciwciała poliklonalne. Białko hybrydowe można więc wykryć wykorzystując przeciwciała monoklonalne anty - C, które posiadamy w pracowni oraz przeciwciała poliklonalne anty MotKat i anty - MotLid w kanapkowym teście ELISA.
Z roślin, które w teście ELISA dały najwyższy sygnał wyizolowano białko do hybrydyzacji typu Western Blot. Uzyskano pozytywny wynik, wskazujący na obecność białka w roślinach [fig. 18, 19].
Analiza typu Western nie jest metodą pozwalającą na dokładne oszacowanie ilości białka. Ponadto, jak widać na żelach, białko może ulegać fragmentacji, bądź też agregacji- stąd w kontroli pozytywnej nie uzyskujemy jednego, wyraźnego prążka. Musimy również pamiętać, że białko wprowadzone do rośliny jest białkiem chimerycznym, które oprócz domeny motyliczej zawiera białko wirusowe. Białko to ma zdolność tworzenia struktur, przypominających wirusowy kapsyd. Stad, mimo iż Western przebiega w warunkach denaturujących, część domen pozostaje złączona, dając na żelu dodatkowe sygnały w postaci większej ilości prążków.
Dla dokładnego określenia zawartości antygenu w materiale roślinnym, posługiwano się opracowanym testem ELISA.
Przebadano wszystkie rośliny pokolenia T1 (transformanty T1) testem ELISA na obecność białek hybrydowych celem wyselekcjonowania roślin, w których zachodzi najwyższa ekspresja. Tylko rośliny o najwyższej ekspresji antygenu były hodowane na masę zieloną [fig. 20].
Wynik testu ELISA wskazuje, że nie we wszystkich roślinach dochodzi do ekspresji białka, mimo iż ich transgeniczność została potwierdzona na poziomie DNA. Uzasadnionym wiec wydaje się sprawdzenie roślin testem immunologicznym zanim przystąpi się do gromadzenia materiału do liofilizacji. Dzięki temu możemy wyeliminować rośliny, które dają niski sygnał a przez to „rozrzedzają stężenie antygenu w liofilizacie.
Liście roślin, które dały najwyższy sygnał w teście ELISA zbierano i liofilizowano, aby zagęścić materiał. Uzyskany materiał sprawdzono testem ELISA, aby oszacować ilość antygenu do dalszych doświadczeń [fig. 21].
Przeprowadzone analizy pokazują, że poprzez selekcję roślin udało nam się uzyskać wysoki poziom antygenu w liofilizacie. Dzięki opracowanemu testowi immunologicznemu, możliwe stało się określenie poziomu antygenu w liofilizatach i zaplanowanie doświadczenia z immunizacją zwierząt. Test ELISA wskazuje, że poziom antygenu wynosi około 10 μg w 1 g liofilizatu zawierającego domenę liderową genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBVoraz 12 μg antygenu w 1 g liofilizatu zawierającego domenę katalityczną genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV.
P r z y k ł a d 4. Immunizacji myszy za pomocą materiału transgenicznego.
Grupy myszy: Do eksperymentu użyto 10 - tygodniowych samic myszy rasy Balb/C.
Utworzono trzy grupy doświadczalne liczące po 6 myszy każda oraz jedną grupę składającą się z czterech myszy:
A - grupa, której podawano liofilizat zawierający antygen - białko hybrydowe składające się z domeny liderowej genu proteinazy cysteinowej połączonej z białkiem c wirusa HBV
PL 201 419 B1
B - grupa, której podawano liofilizat zawierają cy antygen - biał ko hybrydowe skł adające się z domeny katalitycznej genu proteinazy cysteinowej połączonej z biał kiem c wirusa HBV
C - grupa, której podawano liofilizat sałaty nietransgenicznej
D - grupa, której podawano bufor PBS
Materiał roślinny użyty do eksperymentu. Liofilizat z liści sałaty odmiany Bipp Burple i Syrena zawierający chimeryczne białko-fragment liderowy proteinazy cysternowej połączony z białkiem c wirusa HBV oraz fragment domeny katalitycznej połączony z białkiem c. Jako kontrolę stosowano liofilizat sałaty nietransgenicznej tej samej odmiany, co sałata transgeniczna.
Droga immunizacji. Liofilizat podawano drogą pokarmową przy użyciu tubki gastrycznej.
Schemat immunizacji:
a) Grupy immunizowane A i B otrzymały liofilizat sałaty transgenicznej.
Grupa kontrolna C otrzymała liofilizat sałaty nietransgenicznej.
Grupa D otrzymała bufor PBS.
Immunizacja dwukrotna w określonym odstępie czasowym.
Dawka każdej immunizacji dla odpowiedniej grupy myszy wynosiła:
Dawka antygenu:
g liofilizatu zawiera:
MLC - 10 μg antygenu MKC -12 μg antygenu
I immunizacja. Myszom podawano po 100 ng antygenu, czyli po 10 mg liofilizatu zawieszanego w 200 μΐ buforu PBS - MLC.
Myszom podawano po 100 ng antygenu, czyli po 8,3 mg liofilizatu zawieszanego w 200 μl buforu PBS - MKC. Po podaniu antygenu myszom odstawiono karmę na 20 godzin.
1. Pobieranie materiału od zwierząt.
Pobieranie krwi odbywa się ze splotu pozagałkowego przy użyciu tubki kapilarnej w ilości 150 μl przed rozpoczęciem doświadczenia, 2 i 4 tygodnie po I immunizacji oraz 2 i 4 tygodnie po II immunizacji.
Pobieranie kału odbywa się w tym samym czasie, co pobieranie krwi.
2. Przygotowanie materiału do analizy.
KREW:
a) bezpośrednio po pobraniu odwirowano w Eppendorfach, 4°C, 3 rpm, 20 min.
b) odseparowaną surowicę przechowywano w -20 °C do czasu wykonania analiz
KAŁ:
a) pobrany materiał rozcierano w buforze PBS w stosunku 1:5 tłuczkiem polipropylenowym
b) odwirowano 10 min, 4°C, 12 rpm.
c) supernatant oddzielano i magazynowano w - 20°C do dalszych analiz.
3. Analiza immunologiczna.
Zebrane próbki po odmrożeniu są wykorzystane do przeprowadzenia testów za pomocą wysokoczułej metody ELISA.
a) Opłaszczono płytkę polisorp (Nunc) antygenem K+C (domena katalityczna z białkiem c wirusa HBV) lub L+C (domena liderowa z białkiem c wirusa HBV) w stężeniu 1 μg/ml w buforze PBS w ilości 50 μl/dołek
b) Inkubowano płytkę w 4°C przez noc.
c) Trzykrotnie odpłukano buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem Tween (0,05%), pH 7,4.
d) Blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem rozpuszczonym w buforze PBS, 30 min w temperaturze pokojowej, 380 μl/dołek
e) odpłukano jak w ptk.c.
f) Nałożono próbki surowicy w odpowiednich, gradientowych rozcieńczeniach po 40 μl/dołek
g) Inkubowano 2 godziny w temperaturze pokojowej,
h) Odpłukano jak w ptk.c
i) Inkubowano z przeciwciałami anty mysie IgG i IgA skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą w ilości 100 μl/dołek. Rozcieńczenie przeciwciał 1:2 tys., czas inkubacji 1 godzina w 37°C.
j) Odpłukano jak w ptk.c
k) Inkubowano z substratem do alkalicznej fosfatazy, 100 μl/dołek, 30 min w ciemności.
l) Zatrzymano reakcję 1N kwasem siarkowym
m) Odczytano reakcję w czytniku firmy BioRad, model 550. Długość fali λ 405 nm.
PL 201 419 B1
Claims (15)
- Zastrzeżenia patentowe1. Białko chimeryczne, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysternowej z motylicy wą trobowej połączoną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc (hepatitis B core) albo sekwencji ubikwityny.
- 2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy w ątrobowej- połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc,- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej- połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc,- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy w ątrobowej- połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBc oraz resztami glicynowymi,- tworzącymi strukturę mostka glicynowego albo- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy w ątrobowej- połączoną z sekwencją ubikwityny.
- 3. Sekwencja kodująca białko chimeryczne, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny.
- 4. Sekwencja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodują c ą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysternowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę.
- 5. Sekwencja według zastrz. 3, znamienna tym, że została wybrana spośród sekwencji przedstawionych na fig. 1 - fig. 14.
- 6. Konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko chimeryczne, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą białko chimeryczne zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny.
- 7. Konstrukt według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą białko chimeryczne zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodując ą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę.
- 8. Komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny.
- 9. Komórka według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysternowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,PL 201 419 B1- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę.
- 10. Sposób otrzymywania białka chimerycznego, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor i ekspresję białka chimerycznego, przy czym wektor zawiera konstrukt zawierający sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie konstruktu zawierającego jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę.
- 12. Sposób otrzymywania transgenicznej rośliny, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor, i regenerację roślin, przy czym wektor zawiera konstrukt obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie konstruktu zawierającego jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, albo- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę.
- 14. Transgeniczna roślina, znamienna tym, że posiada komórki transformowane konstruktem zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji białka rdzeniowego HBc albo sekwencji ubikwityny.
- 15. Transgeniczna roślina według zastrz. 14, znamienna tym, że posiada komórki transformowane konstruktem zawierającym jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny literowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBc oraz reszty glicynowe, alboPL 201 419 B1- sekwencję nukleotydową kodując ą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją nukleotydową kodującą ubikwitynę.Rysunki
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL357517A PL201419B1 (pl) | 2002-12-04 | 2002-12-04 | Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina |
| PCT/PL2003/000135 WO2004050883A2 (en) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Chimaeric protein containing cysteine protease of liver fluke fused to hepatitis b core protein or ubiquitin, plants expressing said protein, and uses thereof as vaccine |
| AT03786456T ATE362988T1 (de) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Chimaeres protein enthaltend die cystein protease aus dem grossen leberegel fusioniert an das hepatitis b core protein oder ubiquitin; pflanzen,welches dieses protein exprimieren, sowie deren verwendung als vakzine |
| ES03786456T ES2288223T3 (es) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Proteina quimerica que contiene proteinasa cisteinica de fasciola hepatica fusionada con la proteina del nucleo del virus de la hepatitis b o de la ubiquitina; plantas expresando dicha proteina; y su utilizacion como vacuna. |
| DE60314017T DE60314017T2 (de) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Chimaeres protein enthaltend die cystein protease aus dem grossen leberegel fusioniert an das hepatitis b core protein oder ubiquitin; pflanzen, welches dieses protein exprimieren, sowie deren verwendung als vakzine |
| DK03786456T DK1613752T3 (da) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Molekyle af nukleinsyre, plantecelle, fremgangsmåde til fremstilling af kimærisk protein, fremgangsmåde til fremstilling af transgen plante, transgen plante, anvendelse af transgen plante, farmaceutisk komposition, vaccine mod leverikten |
| NZ540582A NZ540582A (en) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Chimaeric protein containing cysteine protease of liver fluke fused to hepatitis B core protein or ubiquitin, plants expressing said protein, and uses thereof as vaccine |
| EP03786456A EP1613752B1 (en) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Chimaeric protein containing cysteine protease of liver fluke fused to hepatitis b core protein or ubiquitin, plants expressing said protein, and uses thereof as vaccine |
| AU2003295293A AU2003295293B2 (en) | 2002-12-04 | 2003-12-04 | Chimaeric protein containing cysteine protease of liver fluke fused to hepatitis B core protein or ubiquitin, plants expressing said protein, and uses thereof as vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL357517A PL201419B1 (pl) | 2002-12-04 | 2002-12-04 | Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL357517A1 PL357517A1 (pl) | 2004-06-14 |
| PL201419B1 true PL201419B1 (pl) | 2009-04-30 |
Family
ID=32464755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL357517A PL201419B1 (pl) | 2002-12-04 | 2002-12-04 | Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1613752B1 (pl) |
| AT (1) | ATE362988T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003295293B2 (pl) |
| DE (1) | DE60314017T2 (pl) |
| DK (1) | DK1613752T3 (pl) |
| ES (1) | ES2288223T3 (pl) |
| NZ (1) | NZ540582A (pl) |
| PL (1) | PL201419B1 (pl) |
| WO (1) | WO2004050883A2 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL196114B1 (pl) * | 2002-12-31 | 2007-12-31 | Inst Biotechnologii I Antybiot | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt |
| CN101014711A (zh) * | 2004-06-25 | 2007-08-08 | 阿尔特生物科学公司 | 植物中组织因数的制造 |
| CA2783968A1 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Escola Superior Agraria De Coimbra | Immunogens, process for preparation and use in systems of polyclonal antibodies production |
| US10214564B2 (en) | 2013-02-06 | 2019-02-26 | Academia Sinica | Antimicrobial peptides derived from hepatitis B virus core protein arginine-rich domain |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3048689A (en) * | 1988-01-13 | 1989-08-11 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Immunogenic peptides |
| JPH08502404A (ja) * | 1992-10-21 | 1996-03-19 | マリンクロット ベテリナリー，アイエヌシー， | チオールプロテアーゼを含有するワクチン |
| AU5996294A (en) * | 1993-02-05 | 1994-08-29 | Daratech Pty Ltd | Polypeptides obtainable from species of fasciola, and vaccines, methods of treatment and DNA sequences of the same |
| GB9312324D0 (en) * | 1993-06-15 | 1993-07-28 | Pitman Moore Inc | Vaccine |
| US6319503B1 (en) * | 1998-02-19 | 2001-11-20 | Proteinix Company | Heat shock fusion-based vaccine system |
-
2002
- 2002-12-04 PL PL357517A patent/PL201419B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-12-04 AU AU2003295293A patent/AU2003295293B2/en not_active Ceased
- 2003-12-04 NZ NZ540582A patent/NZ540582A/en unknown
- 2003-12-04 ES ES03786456T patent/ES2288223T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-04 AT AT03786456T patent/ATE362988T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-12-04 EP EP03786456A patent/EP1613752B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-04 DK DK03786456T patent/DK1613752T3/da active
- 2003-12-04 WO PCT/PL2003/000135 patent/WO2004050883A2/en active IP Right Grant
- 2003-12-04 DE DE60314017T patent/DE60314017T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60314017D1 (de) | 2007-07-05 |
| AU2003295293A1 (en) | 2004-06-23 |
| WO2004050883A2 (en) | 2004-06-17 |
| PL357517A1 (pl) | 2004-06-14 |
| EP1613752B1 (en) | 2007-05-23 |
| DE60314017T2 (de) | 2008-01-17 |
| ES2288223T3 (es) | 2008-01-01 |
| WO2004050883A3 (en) | 2004-11-04 |
| AU2003295293B2 (en) | 2009-12-03 |
| DK1613752T3 (da) | 2007-09-10 |
| EP1613752A2 (en) | 2006-01-11 |
| NZ540582A (en) | 2008-05-30 |
| ATE362988T1 (de) | 2007-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2106315C (en) | Gene construct for production of transgenic fish | |
| CA2101070C (en) | Antigen-presenting capsid with fusion ms2-coat protein | |
| JPH02502876A (ja) | ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体 | |
| JPH09511381A (ja) | インフルエンザワクチン | |
| JPH09511143A (ja) | アルファーウイルスｃＤＮＡベクター | |
| US6210736B1 (en) | Transgenically produced prolactin | |
| ES2336861T3 (es) | Produccion de il-10 en biorreactor de planta de cultivo no alimenticia. | |
| CN101260398B (zh) | 神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用 | |
| JP2958643B2 (ja) | 遺伝子導入動物由来の特定の蛋白質産生のための安定なセルラインの製造法、腫瘍性セルライン及びそれにより得られた蛋白質 | |
| Hardy et al. | Expression of recombinant mouse sperm protein sp56 and assessment of its potential for use as an antigen in an immunocontraceptive vaccine | |
| PL201419B1 (pl) | Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina | |
| JP2003532681A (ja) | 遺伝子導入により産生されたデコリン | |
| EP0094887B1 (fr) | Nouveaux vecteurs d'expression de la protéine antigénique de la rage et leur application à la préparation de vaccins | |
| JP2003531633A (ja) | ライノウイルス感染を防止するための免疫接着物 | |
| Pierrot et al. | Schistosoma mansoni elastase: an immune target regulated during the parasite life-cycle | |
| JPH03503122A (ja) | ヒトマラリアワクチン抗原をコードする遺伝子 | |
| CN109055379A (zh) | 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法 | |
| US20030077640A1 (en) | Process for producing a marker vaccine against a mammalian virus | |
| EP1578791B1 (en) | Inclusion bodies for the oral vaccination of animals | |
| RU2191826C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ СИНТЕЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (ВАРИАНТЫ), СОДЕРЖАЩИЙ ПРОМОТОРНЫЙ САЙТ ГЕНА β-КАЗЕИНА КОРЕЙСКИХ МЕСТНЫХ КОЗЛОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (ВАРИАНТЫ) | |
| WO2004050692A2 (en) | Fusion of the e2 protein of csfv with kdel , vts and/or ubiquitin for expression in transgenic plants for vaccine production | |
| TWI291963B (en) | Expression of zebrafish bone morphogenetic protein 4 | |
| JP5105272B2 (ja) | アミロイドβペプチドをコードする遺伝子を含有したイネ | |
| KR102627008B1 (ko) | 아디포넥틴 및 목적 단백질을 생산하는 조류의 제조방법 | |
| KR20010086357A (ko) | 재조합 ｃｅｌｏ 바이러스 및 ｃｅｌｏ 바이러스 ｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20131204 |