JPH07501934A - Ｇｐａ神経栄養因子の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、ニューロンの生存および／または成長に関与するポリペプチドのを 椎動物神経系の成長および発達に影響を及ぼす多くのタンパク質神経栄養因子が 同定されている。これら因子は、成熟および未成熟の両方の神経系における二ニ ーロンの生存を維持するうえで重要な役割を果たしていると思われる。

ニューロンの生存および機能が神経栄養因子に依存しているとの見解は、神経成 長因子（ＮＧＦ）の仕事で確立された先例に基づいている。ＮＧＦは、インビト ロおよびインビボの両方において交感二ニーロン、知覚ニューロンおよび基底前 脳ニューロンの生存を支持することが示されている。外生ＮＧＦの投与は、発達 の間の細胞の死滅からニューロンを救う。反対に、抗ＮＧＦ抗体を投与すること により内生ＮＧＦを除去または追放すると、そのような細胞死が促進される。

ホイマン（Ｈｅｕｍａｎｎ）　、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、　１３２　：　１３３ 〜１５０　（１９８７）　；ヘフティ（Ｈｅｆｔｉ）　、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ 、旦：２１５５〜２１６２　（１９８６）；トエネン（Ｔｈｏｅｎｅｎ）および バード（Ｂａｒｄｅ）　、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、見立、２８ ４〜３３５　（１９８０）。

しかしながら、生理学的に重要な神経栄養因子としてのＮＧＦの役割は、ＮＧＦ の効果がある種のニューロンにのみ特異的であるように思われる限りにおいて限 られている。たとえば、ＮＧＦは、副交感ニューロン、ブラコード由来およびニ ューラルフレスト由来知覚ニューロン、または運動ニューロンに対しては生存因 子であるようには思われない。従って、他のタイプのニューロンに対して成長ま たは生存因子として働く他の神経栄養因子を同定することに大きな関心が向けら れている。

これまてに同定されたそのような他の神経栄養因子の例としては、脳由来神経栄 養因子（ＢＤＮＦ）、二二一口トロフィン−３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３ ）　（ＮＴ−３）、および毛様体（ｃｉｌｉａｒｙ）神経栄養因子（ＣＮＴＦ） が挙げられる。レイプロ・ツク（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ）　、Ｎａｔｕｒｅ　３４１ 　：１４９〜１５２　（１９８９）　：ホーン（Ｈ。

ｈｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４　：３３９〜３４１　（１９９０）；ローゼン クール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ　４　ニア６７〜７７３　（１ ９９０）；マンドープ（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ）ら、神経成長因子、３１〜５６頁 （ンａン・ウィリー＆サンズ、１９８９）。

毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、ニワトリ胚毛様体神経節ニューロンの生存 および成長をインビトロで支持することのできるタン（り質である。ＣＮＴＦは 、ニワトリの眼神経およびラットの座骨神経を含む種々の組織源から精製されテ ィる。マンドープら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、３８　：　２３３〜２３ ９　（１９８２）、マンドープら、Ｂｒａｊｎ　Ｒｅｓ、３６７　：　２８２〜 ２８６　（１９８６）、ウサギ、ラントおよびヒトのＣＮＴＦをコードするヌク レオチド配列並びに組換え宿主細胞中でのウサギおよびラットＣＮＴＦの発現が 報告されている。リン（Ｌｉｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：１０２３〜１ ０２５　（１９８９）；ストックリ（Ｓ　ｔｏｃｋｌｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３ ４２：９２０−９２３　（１９８９）：コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、米国特 許第４．９９７．９２９号。

本発明の共同発明者の一人は、以前にニワトリ眼の抽出物が成長促進活性（ＧＰ Ａ）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ刺激活性（ＣＳ　Ａ）として言及 される２つの独立に作用する神経栄養因子を含有することを報告してしする。二 ノ（Ｎｉｓｈｉ）ら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１　：　５０５〜５１３　（１９ ８１）ｏ最近、本発明の共同発明者のうちの２人は、ニワトリ座骨神経からのＧ ＰＡの部分精製および予備的特徴付けを報告した。エソケンスフィン（Ｅｃｋｅ ｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ　４６２３〜６３１　（１９８９）。ＧＰＡは 、毛様体神経節二ニーロン、背板神経節ニ二一ロン、および交感神経節ニ二一ロ ンの生存をインビトロで支持することがわかった。同上。そのような精製ＧＰ、 Ａについて得られた部分アミノ酸配列をウサギおよびラットＣＮＴＦの公知アミ ノ酸配列と比較したところ、分析したＧＰＡアミノ酸配列部分内でＧ　Ｐ　Ａと これらＣＮＴＦとの間に約５７％の同一性力（示された。同上。しかしながら、 ニワトリ座骨神経からたくさんのＧＰＡを得ることが困難であるため、Ｇ　Ｐ　 Ａをさらに特徴付ける努力が妨げられており、もちろんＧＰＡを臨床に使用する 可能性も排除されている。

従って、本発明の目的は、ＧＰＡタンパク質をコードする核酸を提供すること。

およびこの核酸を用いて神経学的疾患に診断用途または治療用途に使用するため に組換え宿生細胞中でＧＰＡタンパク質を産生させることにある。

池の目的は、種々の動物種の細胞または組織中で関連する核酸を同定するために そのようなＧ　Ｐ　Ａをコードする核酸、およびその部分を使用することにある 。

さらに他の目的は、アミノ酸配列変種およびその共有結合誘導体を念む、ＧＰＡ タンパク質の誘導体および修飾形を提供することにある。

他の目的は、ＧＰＡタンパク質またはその誘導体もしくは修飾形に結合し得る抗 体を産生させるための免疫原を調製すること並びに該抗体を得ることにある。

発明の概要 これら目的は、まず、ＧＰＡの配列をコードするヌクレオチドを含有する単離Ｄ ＮＡ、該ＧＰＡの配列をコードするヌクレオチドを含有する発現ベクター、該ベ クターで形質転換した宿主細胞（Ｏ１ｉｔ乳動物および細菌宿主細胞を含む）、 およびＧＰＡを産生させるためにＧ　Ｐ　Ａをフードする核酸分子を使用する方 法であって、そのような核酸分子を発現するようトランスフエクンヨンした宿生 細胞を培養し、宿主細胞培養液からＧＰＡを回収することを特徴とする方法を提 供することにより達成される。この方法において、好ましくはＧ　Ｐ　、Ａの配 列をコードするヌクレオチドを含有する発現ベクターで宿主細胞をトランスフェ クノヨンする。

ＧＰＡの配列をコードする全ヌクレオチドを提供することにより、本発明は、組 換えＤＮＡ法によるＧＰＡの産生を可能とし、それによって種々の神経学的疾患 に診断および治療目的で使用するための実質的に純粋なＧＰＡタンパク賀を充分 な量で利用することが初めて可能になった。好ましい態様において、本発明は、 ＧＰＡを天然に有する動物種の混入ポリペプチドを含まないＧＰＡ、およびその ような混入ポリペプチドを含まないＧＰＡからなる組成物を提供する。

ＧＰＡの修飾された形聾および変種形懸は、化学的または酵素的処理によりイン ビトロで、または組換えＤＮＡ法によりイ：／ヒポで製造される。そのようなポ リペプチドは、たとえば１または２以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入、ま たはグリコンレーンヨンの程度またはパターンによって天然ＧＰＡと異なるが、 天然ＧＰＡの生物学的活性を実質的に保持している。

ＧＰＡｉ：刻する抗体の製造は、場合により免疫原性ポリペプチドに結合させて ＧＰＡまたはその断片で動物を免疫し、その後に該免疫動物の血清から抗体を回 収することにより行う。別法として、免疫動物の細胞から常法に従ってモノクロ ーナル抗体を調製する。通常のスクリーニングで得られた抗体は、ＧＰＡには結 合するが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＣＮＴＦまたは他の神経栄養因子には 実質的に結合しない（すなわち、交差反応しない）であろう。固定化した抗ＧＰ 、へ抗体は、診断目的のための臨床試料中のＧＰＡの検出およびＧＰＡの精製に おいてとりわけ有用である。

ＧＰＡ、その誘導体、またはその抗体を、とりわけ治療目的のために生理学的に 許容し得る担体とともに調合する。そのような担体は、たとえば、ＧＰＡの徐放 製剤を提供するのに用いる。

別の態様において、本発明は、細胞、組織、または生物学的流体から調製した試 験試料中のＧＰＡをコードする核酸分子の存在を決定する方法であって、該試験 試料をＧＰＡのコード配列を含有する単離ＤＮＡと接触させ、ついで該単離ＤＮ Ａが試験試料中の核酸分子とハイブリダイズするかどうかを決定することを特徴 とする方法を提供する。ＧＰＡのコード配列を含有するＤＮＡはまた、ＧＰＡの コード配列と実質的な配列同一性を有する核酸を同定および単離するためのハイ ブリダイゼーションアッセイにも用いる。

本発明はまた、試験試料中に存在するＧ　Ｐ　Ａをコードする核酸分子を増幅す る方法てあって、ＧＰＡの配列をコードするヌクレオチドの一部を有するオリゴ ヌクレオチドを複製連鎖反応にプライマーとして用いることを特徴とする方法も 両図１は、ＧＰＡの全ヌクレオチドコード配列およびそれから導かれたアミノ酸 配列［ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２］を含む、λＣＥ　１５：：１９クローン中の ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列［ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１］を示す。

図２は、ウサギ、ラント、およびヒトのＣＮＴＦ　［それぞれ、５ＥＱＩＤＮＯ ２３，４，５コとＧＰＡとのアミノ酸配列の間の相同性を示す。

図３は、ＣＮＴＦもしくはＧＰＡのいずれかを発現する組換え宿生細胞の培養液 から調製したならし培地および細胞抽出物が毛様体神経節ニューロン成長に及ぼ す影響を示す。

図４は、ｐＨＥＢＯ３０のヌクレオチド配列［ＳＥＱ　］Ｄ　Ｎｏ：　６］　を 示ｔ。

ある種の制隈エントヌクレアーゼ開裂部位および制御要素の位１を括弧で示す。

該配列中、ｒＮＪはｐＨＥＢＯ３０中の任意の３５０塩基対ｃＤＮＡ挿入物かう なるヌクレオチドを示すのに用いである。

好ましい態様の詳細な記載 ｒＧＰＡＪまたはｒＧＰＡタンパク質」とは、図１に示すＧ　Ｐ　Ａヌクレオチ ド配列によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質１図１に示す翻訳アミ ノ酸配列であるポリペプチド；約５以上のアミノ酸残基を有しＧＰＡの免疫エピ トープまたは他の生物学的に活性な部位を有するその断片９図１に示すアミノ酸 配列または上記その断片のＮ末端もしくはＣ末端またはその内部に１または２以 上のアミノ酸残基が付加された該図１配列のアミノ酸配列変種；図１に示すアミ ノ酸配列または上記その断片の１または２以上のアミノ酸残基が欠失し、任意に １または２以上のアミノ酸残基で置換された該図１配列のアミノ酸配列変種；お よびアミノ酸残基が共有結合的に修飾されて天然には存在しないアミノ酸配列と なった上記タンパク賀、ポリペプチド、またはその断片の誘導体をいう。ＧＰＡ アミノ酸配列配列変種たとえば部位特異的またはＰＣＲ突勢変異誘発により合成 的に作製することができるし、または対立遺伝子形およびヒトおよび他の動物種 て存在するかもしれない図１に示す翻訳アミノ酸配列の他の天然に存在する変種 の場合のように、天然に存在していてもよい。いずれにしても、そのような断片 、変種および誘導体は、神経成長因子（ＮＧＦ）　、脳由来神経栄養因子（ＢＤ ＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）　、および毛様体神経栄養因子（ 、ＣＮ　Ｔ　Ｆ　）などの公知の神経栄養因子並びに法令上自明のその変種を含 む、これまでに同定されたポリペプチドを排除するものである。

ＧＰＡアミノ酸配列配列変種それが機能的に活性である限りにおいて本発明の範 囲に包含される。本明細書においてＧ　Ｐ　Ａに関連して使用する「機能的に活 性な」および「機能的な活性」とは、ＧＰ、へがニューロン、とりわけ毛様体神 経節ニューロン、背根神経助ニューロンまたは交感神経節ニューロンの成長、生 存および／または分化をインビボまたはインビトロにて促進することができるこ と、および、／または天然に存在するＧＰＡのエピトープに対して向けられた抗 体とＧＰＡが免疫学的に交差反応することを意味する。それゆえ、一般にＧＰＡ アミノ酸配列配列変種たとえばツイツチ（Ｆｉｔｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ、へ旦０：１３８２〜１３８６−（１９８ ３）（ニードルマン（Ｎｅｅｄｅｌｍａｎ）ら、Ｊ。

５ｉｏ１．Ｂｉｏｌ、＝１８　：　４４３〜４５３　（１９７０）により記載さ れたアルゴリズムの見解）により決定されるように、最大の相同性が得られるよ うに配列を並べたｉ麦に図１に示す翻訳アミノ酸残基と少なくとも約７５％（好 ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の配列同一性を有するであ ろう。

ＧＰＡのアミノ酸配列変種の調製は、ＧＰＡ　ＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変 化を導入し、得られた修飾ＤＮＡを宿主細胞中で発現させるか、またはインビト ロで合成することにより行う。そのような変種としては、たとえば、図１に示す ＧＰＡアミノ酸配列配列内ミノ酸残基の欠失、挿入または置換が挙げられる。

ＧＰＡのアミノ酸配列変種を得るため、欠失、挿入および置換のあらゆる組み合 わせを行うことができるが、そのような変種が本明細書に記載する所望の特性を 有することを条件とする。ＧＰＡのアミノ酸配列変種を得るために図１に示すア ミノ酸配列に生成させた変化はまた、たとえば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ３９１０ １０４１号（１９８９年２月９日公開）に記載されているように、グリコンレー ションの部位を導入または移動させたり膜付着配列を導入する変化により、宿主 細胞中に発現するときにＧＰＡをさらに修飾させもする。

ＧＰＡのアミノ酸配列変種の構築において２つの主要な変数：変異部位の位！お よび変異の性質が存在する。これらは図１に示すアミノ酸配列からの変異であり 、ＧＰＡの天然に存在する対立遺伝子形、またはＧＰＡ　ＤＮＡを変異させるこ とにより作製されるＧＰＡの旧態て決定された変異形を表し、対立遺伝子または 天然では認められない変種が得られる。一般に、選択する変異の位置および性質 は、修飾しようとするＧＰＡの特性に依存するであろう。

たとえば、ヌクレオチドコード配列の縮重のため、図１に示すＧＰＡヌクレオチ ド配列によってコードされるＧＰＡのアミノ酸配列に影響を与える。二となく、 該ヌクレオチド配列に変異を起こさせることができる。図１に示すアミノ酸配列 とは異なるアミノ酸配列を有するが機能的に活性なＧＰＡとなるような他の変異 を起こさせることができる。そのような機能的に活性なＧＰＡのアミノ酸配列変 種は、たとえば、図１に示すアミノ酸配列中の１または２以上のアミノ酸残基を 同じまたは異なる極性または電荷を有する他のアミノ酸残基で１換することによ り選択される。

一つの有用な方法は「アラニンスキャニング突然変異誘発（ａｌ、ａｎｉｎｅ　 ｓｃａｎｎｉｎｇｗｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　Ｊと呼ばれる。この場合、一つの アミノ酸残基または標的残基のグループを同定しくたとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、 ｈｉｓ、Ｉｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、ついで組換えＤＮＡ法により 中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン ）で置換して、これらアミノ酸と細胞の内部または外部の周囲水性環境との相互 反応に影響を与えさせる。カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４４　：１０８１〜１０８５　（１９８９）。

ついで、該置換部位にてまたは該置換部位に対してさらにまたは他の変異を導入 することにより、これら置換に対して機能的な感受性を示すドメインをさらに詳 細に調べる。明らかに、たとえば図１に示すアミノ酸配列を公知の神経栄養因子 （たとえば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦＳＮＴ−３、およびＣＮＴＦなと）や他の公知の ポリペプチドまたはタンパク質に変換するような変異は本発明の範囲には包含さ れないし、新規でないかまたは従来技術から自明のアミノ酸ＧＰＡの他の断片、 変種および誘導体も本発明の範囲には包含されない。それゆえ、アミノ酸配列変 異を導入する部位については前以て決定するが、変異の性質それ自体については 前以て決定する必要がない。たとえば、所定部位での変異の実行を最適にするた め、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域 にて行い、発現されたＧＰＡ変種を機能的活性についてスクリーニングする。

アミノ酸配列の欠失は、一般に約１〜３０残基、さらに好ましくは約１〜１０残 基の範囲であり、一般に隣接している。たとえばＣＮＴＦと実質的に相同な領域 からの欠失は、ＧＰＡの機能的な活性に一層影響を及ぼしやすい。一般に、連続 的な欠失の数は、影響を受けるドメイン中のＧＰＡの三次構造（たとえばβンー トまたはαヘリックス）を保存するように選択されるであろう。

アミノ酸配列の挿入には、１アミノ酸残基から１００またはそれ以上の残基を含 有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル 末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列 内挿入（すなわち、図１に示すアミノ酸配列内で行われる挿入）は、一般に約１ 〜１０残基、さらに好ましくは１．〜５残基、最も好ましくは１〜３残基の範囲 であってよい。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有するＧＰ、Ａ （組換え細胞培養液中でＧＰＡの直接発現によって傅られるものなど）、および 組換え宿主細胞からのＧＰＡの分泌を向上させるための異種Ｎ末端シグナル配列 を有するＧＰＡが挙げられる。そのようなシグナル配列は、一般にＧＰＡの発現 に使用した宿主細胞と同種であり、大腸菌については５ＴＩＩまたは１ｐｐを、 酵母についてはα因子を、哺乳動物細胞についてはヘルペスｇＤなどのウィルス シグナルを含む。他の挿入としては、免疫原ポリペプチド、たとえば細菌ポリペ プチド（たとえば、β−ラクタマーゼや大腸菌ｔｒｐ遺伝子座によってコードさ れる酵素など）、または酵母タンパク質のＧＰＡのＮ末端またはＣ末端への融合 物、および長い半減期を有するタンパク質、たとえば免疫グロブリン定常領域、 アルブミン、またはフェリチンなどとのＣ末端融合物が挙げられる（ＰＣＴ特許 公開第ＷＯ８９１０２９２２（１９８９年４月６日公開）ｌ：記載）。

変種の第三のグループは、図１に示すアミノ酸配列中の少なくとも一つのアミノ 酸残基、好ましくは一つだ１ブのアミノ酸残基が除去され、そこへ異なる残基が 挿入されたものである。そのような置換を行うのに最も興味が持たれる部位は、 図１に示すアミノ酸配列においてＣＮＴＦと最も大きな相同性を有する領域であ る。これら部位は、神経栄養因子の機能的活性にとって重要であるように思われ る。従って、機能的活性を維持するため、これら部位、とりわけ少なくとも３つ の池の同様に保存された部位の配列内に存在する部位を相対的に保存された仕方 で置換させる。そのような保存された置換は、表１に好ましい置換の表題で示し である。そのような置換によって機能的活性が変化しないならば、一層実賞的な 変化を、表１に例示的置換として挙げたように、またはアミノ酸クラスに関して 以下に記載するように、導入し、得られた変種ＧＰＡの機能的活性について分析 することができる。

］」 シ団玉　豆ゴ１狡　ヱｈ］漣 Ａｌｓ　ＩＡＩ　ｖｉｌ；　ｌ＠ｕ；　ｉｌ＠ｖａｌＡｒｇ　ＩＲＩ　ｌｙｓ； 　ｇｌｎ；　ａｓｎ　ｈａｓＡｓｎ　ＩＮＩ　ｇｌｎ；　ｈｉｓ；　ｌｙｓ；　 ｅｒｇ　ｇｌｎＡｓｐｌｏｌ　ｇｌｕ　ｇｌｕ Ｃｙｓ　ＩｃＩ　ｓｓｒ　ｓ＠ｒ Ｇｌｎ　ＩＱＩ　ａｓｎ　ａｓｎ Ｇｌｕ　ＩＥＩ　ａｓｐ　ｍａｐ Ｇｌｙ　ＩＧＩ　ｐｒｏ　ｐｒ。

Ｈｉｓ　ＩＨＩ　ａｓｎ；　ｇｌｎ；　ｌｙｓ；　ｅｒｇ　ａｒｇＬｙｅ　ＩＫ Ｉ　ａｒｏ；　ｇｌｎ：　ｍａｎ　ｅｒａＭｅｔ　ＩＭＩ　Ｉｅｕ；　ｐｈ＊Ｈ １１ｅ　ｌ＊ｕＰｈ＠ＩＦＩ　ｌａｕ；　ｖｓｌ；　ｉｔｓ；　ａｌｅ　１ｅｕ Ｐｒｏ　ｆＰｌ　ｇｌｙ　ｏｌｙ Ｓ＠ｒ　ｆｓｌ　ｔｈｒ　ｔｈｒ Ｔｈｒσｌ　ｓｉｒ　５ｅｒ Ｔｒｐ　＋ｗ＋　ｔｙｒ　ｙｒ ＴｙｒＩＹＩｔｒｐ；ａｈ＠：ｔｈｒ：＊＊ｒｐｈ＠図１に示すアミノ酸配列に おける挿入、欠失および置換による変化は、ＧＰＡの安定性を改善するために用 いることができる。たとえば、アルギニンまたはりシン残基についてコードアミ ノ酸配列を調べることによりトリプシンまたは他のプロテアーゼ開裂部位を同定 できる。これらは、該残基を他の残基、好ましくはグルタミンなどの塩基性残基 またはセリンなどの疎水性残基で置換することにより：該残基を欠失させること により、または該残基の直後にプロリン残基を挿入することにより、プロテアー ゼに対して不活化できる。また、Ｇ　Ｐ　Ａの機能的活性のための適当なコンフ ォメーションを維持するのに関与していないンステイン残基を、一般にセリンで 置換して、該分子の酸化的安定性を改善し、異所的な架橋を防ぐことができる。

Ｇ　Ｐ　Ａ分子の共有結合的な修飾も本発明の範囲に包含される。たとえば、Ｇ ＰＡの標的アミノ酸残基を、選択されたアミノ酸側鎖またはＮ末端もしくはＣ末 端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と反応させることにより、ＧＰＡ中に共有 結合的修飾を導入できる。

ノステイン残基は、最も一般的にα−ハロアセテート（および対応アミン）、た とえばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチルまた はカルボキンアミドメチル誘導体を与える。ノステイン残基はまた、プロモトリ フルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピオン酸、クロ ロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジル ジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾ工 −ト、２−クロロヌルクリ−ニトロトロフェノール、またはクロロ−７−二トロ ベンゾー２−オキサ−１，３−ノアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジン残基はｐＨ５，５〜７．０でジエチルピロカーボネートとの反応によ り誘導体化される。というのは、この試薬は、ヒスチジンの側鎖に対して相対的 に特異的であるからである。バラ−ブロモフェナシルブロマイドも有用である； この反応は、好ましくはｐＨ６，０で０１Ｎ（カコジル酸ナトリウム中で行われ る。

リノンおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応す る。これら試薬を用いた誘導体化は、リノン残基の電荷を逆転させる効果を有す る。α−アミノ含有残基を誘導体化させる他の適当な試薬としては、メチルピコ リンイミデートなどのイミドエステル：ピリドキサールリン酸：ピリドキサール 、シクロボロハイドライド（ｃｈｌｏｒｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）　；　トリ ニトロベンゼンスルホン酸：Ｏ−メチルイソ尿素：２．４−ペンタンジオン：お よびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。

アルギニン残基は、１または幾つかの通常の試薬（それらのうち、フェニルグリ オキサール、２，３−ブタンジオール、１．２−シクロヘキサンジオンおよびニ ンヒドリン）との反応により修飾される。グアニジン官能基の高いｐＫａのため 、アルギニン残基の誘導体化はアルカリ条件で反応を行う必要がある。さらに、 これら試薬はまた、アルギニュ７のε−アミノ基と同様にリジンの基と反応させ てもよい。

チロシン残基の特別の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメ タンとの反応によりチロノン残基にスペクトル標識を導入するという特別の興味 のもとに行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよび テトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシン種および３−二ト ロ誘導体を生成させる。チロシン残基は＋２５１または＋１１］を用いてヨード 化してラジオイムノアッセイに使用する標識タンパク質を調製する。上記クロラ ミンＴ法が適している。

カルボキシル側鎖基は、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリニル−４−エ チル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチ ルペンチル）カルボジイミドなどのカルボンイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’　 （式中、ＲおよびＲ゛は異なるアルキル基））との反応により選択的に修飾でき る。

さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオンとの反応 によりアスパラギンおよびグルタミン残基に変換できる。

２官能性試薬を用いた誘導体化は、抗ＧＰＡ抗体の精製法に使用するためまたは 治療目的に使用するために、水不溶性支持体マトリックスまｔ：は表面にＧＰＡ を架橋させるのに有用である。一般に用いられる架橋剤としては、たとえば、１ ゜１−ビス（ンアゾアセチル）−２−フェニルエタ７、ゲルタールアルデヒド、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば４−アジドサリチル酸とのエ ステル、ホモ２官能性イミドエステル（３，３°−ジチオビス（スクシンイミジ ルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む）、およびビス− Ｎ−マレイミドー１．８−オクタンなどの２官能性マレイミドが挙げられる。メ チル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体 化試薬は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を生成する。別法とし て、臭化シアン活性化炭水化物および米国特許第３，９６９．２８７号：３．６ ９１．０１６号：４．１９５．１２８号＋４．２４７．６４２号：４．２２９． ５３７号、および４．３３０．４４０号に記載された反応性基体をタンパク質の 固定化に用いることができる。

グルタミンおよびアスパラギン残基は、しばしば脱アミド化して、それぞれ対応 するグルタミン酸およびアスパラギン酸とすることができる。別法として、これ ら残基を穏やかな酸性条件下で脱アミド化する。これら残基のいずれの形態もこ の発明の範囲に包含される。

他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはスレ オニン残基のヒドロキシル化のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン 側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ−末端 カルボキシル基のアミド化が挙げられる。クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）　 、タンパク質：構造および分子的性質、７９〜８６頁（ダブリュー・エイチ・フ リーマン（Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ、）　、１９８３）　ｅ　ＧＰＡは また、米国特許第４．１７９゜３３７号：４．３０１．１４４号；４．４９６． ６８９号；４．６４０．８３５号、４゜６７０．４１７号：または４．７９１． １９２号に記載された仕方にて、非タンパク質性のポリマー、たとえばポリエチ レングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキンアルキレンに共有 結合的に結合させることができる。

「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養液」は、同じ意味で用い られ、そのような語はすべて子孫を含むと理解すべきである。それゆえ、「形質 転換体」および「形質転換した細胞」なる語は、−次揮的細胞および培養を継代 した回数にかかわらずその培養液を包含する。また、意図的または偶然の変異の ため、すべての子孫はＤ　Ｎ　Ａ含量において正確に同一であるわけではないこ とも理解すべきである。

「プラスミド」は、宿主細胞内において染色体外かまたは宿主細胞染色体の一部 としてのいずれかにより複製することのできるＤＮＡ分子であり、小文字の「ｐ 」とそれに続く大文字および／または数字で表される。本発明に用いる出発プラ スミドは、市販されているか、制限なく公的に利用することができるか、または 本発明に開示するようにおよび／または刊行された手順に従ってそのような利用 できるプラスミドから構築することができる。ある種の場合には、当業者には自 明であるように、当該技術分野で公知の他のプラスミドを本発明に記載するプラ スミドと同様に用いることができる。

「制御配列」は、特定の宿主細胞において機能的に連結したヌクレオチドコード 配列の発現に必要なりＮＡ配列をいう。原核生物における発現に適した制御１列 としては、たとえば、復製起点、プロモーター、リポソーム結合部位、および転 写停止部位が挙げられる。真核生物における発現に適した制御配列としては、た とえば、復製起点、プロモーター、リポソーム結合部位、ポリアデニル化／グナ ル、およびエンハンサ−が挙げられる。

「外来」要素とは、宿生細胞にとって外来のものであるか、または宿主細胞と同 種であるが該要素が通常Ｗめられｔい該宿生細胞内の位置にあるものをいう。

ＤＮＡの「消化Ｊとは、該ＤＮＡ中のある位置でのみ働く酵素によるＤＮＡの酵 素的開裂をいう。そのような酵素は制限酵素または制限エンドヌクレアーゼと呼 ばれ、そのような酵素が開裂するＤＮＡ内の部位は制限部位と呼ばれる。本発明 に用いる種々の制限酵素は市販されており、その反応条件、補助因子、および他 の条件は酵素製造集客によって確立されたものを用いる。制限酵素は一般に、各 制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字およびそれに続く他の文字ついで 特定の酵素を表す数字からなる略号によって示される。一般に、１μｇのＤＮＡ が約２０μｌの緩衝溶液中で約１〜２１１位の酵素で消化される。特定の制限酵 素に対する適当な緩衝液および基質の量は、製造業者によって特定されているか 、および／または当該技術分野でよ（知られている。

ＤＮＡの所定断片の「回収」または「単離」は、一般に、消化生成物（「制限断 片」と呼ばれる）をポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上の電気泳動 によって分離し、分子量の知られたマーカーＤＮＡ断片と比較した移動度に基づ いて目的断片を同定し、所望の断片を含有するゲル部分を切り出し、ついでゲル から該ＤＮＡをたとえばエレクトロエルーンジン（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏ ｎ）によって分離することによって行う。

「ライゲーション」とは、２つの二本ｆＪｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片間でホスホジエス テル結合を生成させる工種をいう。特に断らない限り、ライゲーションは、はぼ 等モル量のライゲーションしようとするＤＮＡ断片０５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリ ガーゼ１０単位を用いた公知の緩衝液および条件で行う。

「オリゴヌクレオチド」は、たとえばエンゲルス（Ｅｎｇｅｌｓ）ら（Ａｇｎｅ ｗ、　Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ、Ｅｄ、Ｅｎｇｌ、２８　＋　７１６〜７３４　（１９ ８９））によって記載された方法などの公知方法（たとえば、トリエステル、ホ スホールアミダイトまたはホスホネート化学を含む）により化学的に合成した長 さの短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。ついで、これら オリゴヌクレオチドをたとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する 。

本発明で用いる「複製連鎖反応」またはｒＰＣＲＪとは、一般に、米国特許第４ ．６８３．１９５号に記載されているように、所望のヌクレオチド配列をインビ トロで増幅させる方法をいう。一般に、ＰＣＲ法には、鋳型核酸に優先的に／％ ＜ブリダイズすることのできる２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたプ ライマー伸長合成のサイクルを繰り返すことが含まれる。一般に、ＰＣＲ法に用 いるプライマーは、増幅しようとするヌクレオチド配列の両端または両側にある 鋳型内のヌクレオチド配列に相補的であろうが、増幅しようとするヌクレオチド 配列に相補的なプライマーを用いることもできる。ワンプ（Ｗａｎｇ）ら、ＰＣ ＲブｒＰＣＲクローニング」とは、全ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡから転写 したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む過当な細胞または組織源からの核酸中に存在する特定 の所望ヌクレオチド配列を増幅するためにＰＣＲ法を用し・ることをいう。フロ ーマン（ＦｒＧＰＡ核酸」は、ＧＰＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。

ｒＧＰＡＤＮＡＪは、ＧＰＡをコードするＤＮＡである。ＧＰＡ　ＤＮＡは、ｃ ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、またはインビトロ合成により得ら れる。ＣＤＮＡまた１まゲノムＤＮＡライブラリー内、または種々のＤＮＡのあ る種の池の混合物中のＧＰＡ　ＤＮＡの同定は、放射性同位元素などの検出可能 な残基で標識したオリゴヌクレオチドハイプリダイゼーンコンブローブを用いて 都合よく行うことができる。ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、ＤＮＡプローブ、１４ ９〜２１３頁（ストックトンプレス、１９８９）。ＧＰＡをコードするＤＮＡを 同定するため、ノ）イブリダイゼーン四ンプローブが図１に示すＧＰＡアミノ酸 配列配列−ドするＤＮＡまたは本明細書に記載するその変種または誘導体と選択 したノλイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズすることができ るようにノーイブリダイゼーシ式ンブローブのヌクレオチド配列を選択する。Ｇ ＰＡ＊駿を得る他の方法は、記載された方法の一つ、たとえばエンプレスら（Ａ ｇｎｅｖ、　Ｃｈｅｗ、　Ｉ　ｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅ口ｇ１．２８＋７１６〜７３ ４　（１９８９））によって記載された方法を用いて化学的に合成することであ る。

たとえばＤＮＡシークエンシングまたは制限エンドヌクレアーゼ分析により決定 されるように、ＧＰＡの配列をコードする全ヌクレオチドが単一のｃＤＮＡ。

ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡ中で得られない場合は、適当なりＮＡ断片（たと えば、制限断片）を幾つかのＤＮＡから回収し、互いに共有結合的に結合させて 全コード配列を構築することができる。ＤＮＡ断片を共有結合的に結合させる好 ましい手段は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ醇素を用いたライゲー ン式ンによるものである。

「単離したＪ　ＧＰＡ核酸とは、他のポリペプチドをコードする混入核酸から同 定し分離された（さもなければそのような混入核酸を含まない）ＧＰＡ核酸であ る。単離し？、：　Ｇ　Ｐ　Ａ核酸は、診断アッセイおよび核酸ハイブリダイゼ ーシジン法に関する下記議論においてさらに記載および定義するように、標識を 用いて診断およびプローブ目的のために標識することができる。

たとえば、単離したＧＰＡ　ＤＮＡまたは少なくとも約１５ヌクレオチドを含む その断片は、知覚ニューロン障害によるものなどのＧＰＡ発現における変化が関 与する異常または疾患を検出、診断またはモニターするためのハイブリダイゼー ンコンブローブとして用いる。本発明の一つの態様において、麿者（すなわち、 ヒトまたは池の哺乳動物）からの組織試料中の全ＲＮへをＧＰＡ伝令ＲＮＡの存 在についてアッセイすることができ、その場合、ＧＰＡ伝令ＲＮＡ量の減少がニ ューロンの変性を示す。

単離したＧＰＡ核酸はまた、組換えＤＮＡおよび組換え細胞培養法によりＧＰＡ を製造するのに用いる。本発明の種々の態様において、単離ＧＰＡ　ＤＮＡを含 有する組換えＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクシヨンし、 ＧＰＡ　ＤＮＡの発現、それゆえＧＰＡの大量の産生を得る。ＧＰＡのアミノ酸 配列変種をコードするＤＮＡは、当該技術分野で公知の種々の方法により調製す る。これら方法には、天然源からの単離（ＧＰＡの天然に存在するアミノ酸配列 変種の場合）、または部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）突然変異誘 発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびＧＰＡの変種または非変種形態をコードする前 以て調製したＤＮＡのカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これら に限られるものではない。

部位特異的突然変異誘発は、ＧＰＡ　ＤＮへの置換、欠失および挿入変種を調製 するのに好ましい方法である。この方法は、当該技術分野でよ（知られており、 シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１００　：　４６６Ｂ〜５００ 　（１９８３）；シラーら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１５４　：３２９〜３５０　（ １９８７）；カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１５４　：　３ ８２〜４０３　（１９８７）；ホーウィッツ（Ｈａｒｔｉｔｚ）ら、λ４ｅｔｈ 、Ｅｎｚ、１８５　：　５９９〜６１１　（１９９０）　、たとえば、トリブ／ ンおよびＴ４リゾチームのアミノ酸配列変種（該変種は、ある種の所望の機能的 特性を有する）を製造するのに用いられている。ぺり−（Ｐ　ｅｒｒｙ）ら、Ｓ ｃｉ簡単に説明すると、ＧＰＡ　ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を行うには、 まず所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをそのようなＧＰＡ　ＤＮＡの 一本鎖にハイブリダイズさせる二とによりＧＰＡ　ＤＮＡを変化させる。ハイブ リダイズさせた後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして 用い、また一本積のＧＰＡＤＮＡを鋳型として用い、ＤＮＡポリメラーゼを用い て全第二鎖を合成する。かくして、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチド が、得られた二本鎖ＤＮＡ中に導入される。

ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いるオリゴヌクレオ チドは、天然に存在するＤＮＡの精製やインビトロ合成などのあらゆる適当な方 法によって調製することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドは、ナラシて いるような、有機化学における種々の方法を用いて容易に合成することができる 。適当なハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーを選択するための一 般法はよく知られている。ケラ−ら、ＤＮＡプローブ、１１〜１８頁（ストック トンプレス、１９８９）。一般に、ハイブリダイゼーションプローブまたはプラ イマーは１０〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含有し、該ヌクレオチドが 一本ＭＤＮＡ鋳型分子に優先的にハイブリダイズするのを確実にするため、所望 の変異をコードする配列の両側上の少なくとも５ヌクレオチドを含有するであろ う。

ＧＰＡＤＮＡ中に複数の変異を導入して、図１に示すアミノ酸配列と比べて幾つ かのアミノ酸残基の挿入、欠失または置換またはその組わせを有するＧＰＡのア ミノ酸配列変種を生成させる。変異を導入させようとする部位が互いに近接して 位置する場合には、所望の変異をすべてコードする単一のオリゴヌクレオチドを 用いてこれら変異を同時に導入することができる。ひかしな力喀ら、変異を導入 しようとする部位が互いに離れて装置する（約１０ヌクレオチド以上離れて０る ）場合には、所望の変化のすべてをコードする単一のオリゴヌクレオチドをイ乍 製することは一層困難である。代わりに、２つの別法の一つを用Ｌ）ること力（ できる。

第一の方法では、各所望の変異に対して別々のオリゴヌクレオチドを生成させる 。ついで、これらオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時ζ；アニールさ せると、該鋳型から合成されるＤＮＡの第二鎖は所望のアミノ酸置換のすべてを コードするであろう。

別法では、所望の変異を生成させるために突然変異誘発を２回まｔこ：まそれ以 上行−５ｃ１回目は単一の変異を導入するために記載したものと同じである；前 以て調製したＧＰＡ　ＤＮＡの一本鎖を鋳型として用（蔦、第一の所望の変異を コードするオリゴヌクレオチドを該鋳型にアニールさせ、つし）でヘテロ二本鎖 ＤＮＡ分子を生成させる。２回目の突然変異誘発では、１回目の突然変異誘発で 得られた変異ＤＮＡを鋳型として用いる。それゆえ、この鋳型１ますで１；１ま た１まそれ以上の変異を有している。ついで、別の所望のアミノ酸置換をコード するオリゴヌクレオチドを該鋳型にアニールさせると、得られたＤＮＡの鎖（ま １回目および２回目の突然変異誘発の両方からの変異をコードしてし）る。こう して得られたＤＮＡを３回目の突然変異誘発において鋳型として用し１、以下同 様Ｃニする。

ＰＣＲ突然変異誘発はまた、ＧＰＡのアミノ酸配列変種を作製するのＣ：も適し ている。ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）　、ＰＣＲプロトコール、１７７〜１８３頁 （アカデミツクプレス、１９９０）：パレット（Ｖａｌｌｅｔｔｅ）ら、Ｎｕｃ 、、へｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１７　：　７２３〜７３３　（１９８９）。簡単に 説明すると、ＰＣＲＩ：おし翫で少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合 には、鋳型ＤＮＡ中の対応領域と配フ１ｊ力（わずかに異なるプライマーを用い 、該プライマーが該鋳型と異なる部位でのみ該鋳型配列と異なる特定のＤＮＡ断 片を比較的大量に生成させること力（できる。プラスミドＤＮＡ中に変異を導入 するには、たとえば、プライマーの一方を該変異の位置と重複するように、およ び該変異を有するようζ＝設計する。他方のプライマ−の配列は該プラスミドＤ ＮＡの反刻饋内のヌクレオチド配列と同一でなければならいが、この配列は該プ ラスミドＤＮＡに沿っていずれに位置していてもよい。

しかしながら、これらプライマーによって結合されたＤＮＡの全増幅傾城を最終 的に容易にンークエンシングできるように、第二のプライマーの配列は第一のプ ライマーの配列から２００ヌクレオチド以内に位置しているのが好ましい。本明 細書に記載したようなプライマーペアを用いたＰＣＲ増幅の結果、該プライマー によって特定された変異の位置、およびおそらく他の位置（鋳型コピーは若干エ ラーを紀こしやすいので）において異なるＤＮＡ断片の集団が得られる。ワグナ −（Ｗａｇｎｅｒ）ら、ＰＣＲ）ビックス、６９〜７１頁（ンユブリンガー・フ ェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ）　、１９９１　）。

生成物増幅Ｄ　Ｎ　Ａに対する鋳型の比率が極めて低い場合には、生成物ＤＮＡ 断片の大部分に所望の変異が導入される。この生成物ＤＮＡは、標準組換えＤＮ Ａ法を用い、ＰＣＨの鋳型として働くプラスミド中の対応領域を置換するのに用 いられる。別の位置の変異の導入は、変異第ニプライマーを用いるか、または異 なる変異プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行い、得られた２つのＰＣＲ断片 を３（またはそれ以上）部ライゲーションにおいてプラスミド断片に同時にライ ゲートさせることにより同時に行うことができる。

変種を調製するための他の方法、カセット突然変異誘発は、ウェルズ（Ｗｅｌｌ ｓ）らのＧ　ｅｎｅ＾Ａ　３１５〜３２３　（１９８５）に記載された方法であ る。出発物賃は、変異させようとするＧＰＡ　ＤＮＡを含有するプラスミド（ま たはベクター）である。変異させようとするＣＰ、ＡＤＮＡ中のコドンを同定す る。該同定した変異部位の各側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在して いなければならない。そのような制限部位が存在しない場合は、上記オリゴヌク レオチド媒介突然変異誘発法を用いてＧＰＡＤＮＡ中の適当な位置にこれら制限 エンドヌクレアーゼ部位を導入することにより生成させる二とができる。このプ ラスミドｔ）ＮＡをこれら部位にて開裂して線状にする。制限部位の間のＤλＡ 配列をコートするが所望の変異を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用 いて合成するが、その際、該オリゴヌクレオチドの２つの伯を別々に合成し、つ いで標準法を用いて一緒にハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチ ドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、上記線状化プラスミドに直接ライ ゲートできるように該プラスミドの両端と適合するような５°および３°末端を 有するように設計されている。このプラスミドは、こうして変異したＧＰＡ　Ｄ ＮＡ配列を含有する。

さらにクローニングまたは発現させるため、ＧＰＡ　ＤＮＡ　（ｃＤＮＡである か、ゲノムＤＮＡであるか、またはインビトロ合成の産物であるかにかかわらず ）を複製可能なベクター中にライゲートする。「ベクター」は、宿主細胞内で自 律複製し得るプラスミドおよび他のＤＮＡであり、そのようなものとして、適合 宿主細胞とともに２つの機能を行うのに有用である（ベクター−宿生系）。一つ の機能は、ＧＰＡをコードする核酸のクローニングを容易にすること、すなわち 使用可能な量の核酸を産生させることである。他の機能は、Ｇ　Ｐ　Ａの発現を 指令することである。これら機能の一つまたは両方がベクター−宿生系により行 われる。

ベクターは、それが行う機能並びにクローニングまたは発現のために使用する宿 主細胞に依存して異なる要素を含有するであろう。

ＧＰＡを産生ずるためには、発現ベクターは上記ＧＰＡをコードする核酸を含有 しているであろう。この発明のＧＰＡは、組換え細胞培養液中に直接発現される か、または異種ポリペプチド、好ましくはシグナル配列または他のポリペプチド との融合物であって該異種ポリペプチドとＧＰＡとの間の結合部に特別の開裂部 位を有するものとして発現される。

組換え宿生細胞発現の一つの態様において、ＧＰＡ　ＤＮＡを含有する発現ベク ターて哺乳動物細胞をトランスフェクションし、それによってコードされたＧＰ Ａを組換え宿主細胞が増殖している培地から回収する。しかしながら、本明細書 において開示する発現ベクターおよび方法は、広範囲の原核および真核生物に使 用するのに適している。

原核生物は、ＤＮＡの最初のクローニングおよび本発明に有用なベクターの構築 のために用いることができる。しかしながら、原核生物はまた、ＧＰＡをコート するＤＮＡの発現のために用いることもできる。原核宿主細胞中で産生されたポ リペプチドは、一般にグリコシレージョンされていないであろう。

単離したＤＮＡのクローニングまたは発現のため、宿主細胞と適合する種由来の 復製起点および他の制御配列を含有するプラスミドまたはウィルスベクターを原 核宿主細胞とともに用いる。たとえば、一般に、大腸菌を大腸菌種由来のプラス ミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら 、Ｇｅｎｅ　２　＋　９５〜１１３　（１９８７）　。ｐＢＲ３２２はアンピシ リンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有するので、該プラスミドで形質 転換された細胞を容易に同定または選択することがてきる。それか発現ベクター として機能するためには、ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他のプラスミドまたは ウィルスベクターはまた、その下流に挿入されたＤ　Ｎ　Ａの伝令ＲＮ、Ａ　（ ｍＲＮＡ）転写物を提供するように宿主細胞中で機能するプロモーターをも含有 しているか含有するように修飾する必要がある。ランカブワラ（Ｒａｎｇａｇｔ ａｌａ）ら、Ｂ　ｉｏ／　Ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ旦。

４７７〜４７９　（１９９１）。

原核生物に加えて、酵母などの真核微生物も、本発明に有用なりＮＡのクローニ ングまたは発現のための宿主として用いることができる。サツカロミセス・セレ ビシエ、または一般的なパン酵母が最も一般的に用いられる真核微生物である。

酵母細胞中で機能してｍＲＮＡ転写物を生成する種々のブロモ−クーがよく知ら れているように、所望のＤＮＡの酵母細胞中でのクローニングまたは発現に有用 なプラスミドもよく知られている。

さらに、多細胞生物もまた、本発明に有用なりＮＡのクローニングまたは発現の ための宿主として用いることができる。哺乳動物細胞が最も一般的に用し）られ おり、そのような細胞をインヒドロで維持または増殖させる手順（該手順は一般 に組織培養と呼ばれる）はよく知られている。クルース（Ｋｒｕｓｅ）およびノ くダーリン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ’ｌ　ｆｌｇ、組織培ＩＩ（アカデミツクプレ ス、１９７７）ｅ有用な哺乳動物細胞の例としては、２９３、ヒーラおよびＷＩ 　−３８などのヒト細胞株、ＣＯ５−７およＵｖＥＲＯｔど（１）”ｔルｍＰＷ ｊｓ、およびＢＨＫ−２１およびＣＨＯなどのハムスター細胞株が挙げられ、こ れらはすべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク／ヨン（ＡＴＣＣ）、ロ ックヒル、メリーランド２０８５２米国から公的に利用できる。

発現ベクターは、クローニングベクターと違って、宿生生物によって認識されＧ ＰＡ核酸に機能的に連結したプロモーターを含有していなければならない。プロ モーターとは、遺伝子の開始コドンの上流に位置し、該遺伝子の転写（すなわち 、ｍＲＮＡの合成）を制御する非翻訳配列である。プロモーターは一般に、２つ のクラス、誘導プロモーターと構成的プロモーターに分けられる。誘導プロモー ターとは、培養条件のある種の変化、たとえば栄養物の存在または不存在または １度の変化に応答してその制御下にＤＮＡの高レベル転写を開始させるプロモー ターである。

宿主ｍ泡中てＧＰＡの発現を達成させるためにＧＰＡ　ＤＮＡＩ：１！能的に連 結した多数のプロモーターが知られている。天然に存在するＧＰＡ　ＤＮＡに付 随するプロモーターを用いることができないとは言えない。しかしながら、異種 プロモーターは一般に、一層高い転写および発現ＧＰＡの一層の高収量をもたら すてあろう。

原核生物宿主に使用するのに適したブロモ−クーとしては、β−ラクタマーゼお よびラクトースプロモーター（ゲラデルら、Ｎａｔｕｒｅス旦１：５４４〜５４ ８（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター（ゲ・ソデルら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　４０５７〜４０７４　（１９ ８０））、およびハイブリツドブＤ％−ター、たとえばｔａｃプロモーター（ド ウポア（ｄｅＢｏｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　８旦：　２１〜２５　（１ ９８０））などが挙げられる。

しかしｌＪがら、他の知られた細菌プロモーターも適している。それらのヌクレ オチド配列は刊行されており（ノーベンリスト（Ｓ　１ｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら、 Ｃｅ１１２０２６９〜２８１　（１９８０））　、それゆえ当業者は、必要とさ れる制限部位を提供するリンカ−またはアダプターを用いてＧＰＡをコードする ＤＮＡにそれら配列を機能的にライゲートすることができる（クー（Ｗｕ）ら、 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　１５２：３４３〜３４９　（１９８７））。

酵母宿主に使用するのに適したプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸 キナーゼのプロモーター（ヒソツエマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ　、　Ｂ　 ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５　：１２０７３−１２０８０　（１９８０）：キ ングズマン（Ｋ　ｉｎｇｓ＋ｇａｎ）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１８５　：　３２ ９〜３４１　（１９９０））　、または他の糖分解酵素、たとえば、エノラーゼ 、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イ ソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼな どが挙げられる（ドドソン（Ｄｏｄｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌ＋ｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　 ｒｅｓ、１０　：　２６２５〜２６３７　（１９８２）：工？　−（Ｅｍｒ）　 、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ。

よ旦互、２３１〜２７９　（１９９０）　）。

哺乳動物細胞に有用な発現ベクターには、一般に、ウィルス由来のプロモーター が含まれる。たとえば、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、サイトメガロウ ィルス（ＣＭＶ）　、およびンミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）由来のプロモ ーターが一般に用いられる。さらに、ＧＰＡをコードする天然のＤＮＡに付随す るプロモーターまたは他の制御配列を利用することも可能であるし、またしばし ば望ましいが、ただし、そのような制御配列が組換えＤＮＡ発現に使用する特定 の宿主細胞において機能し得ることを条件とする。

プロモーターに加えて発現ベクターに使用することが望ましい他の制御配列はリ ポソーム結合部位であり、真核宿主細胞に使用する発現ベクターの場合にはエン ハンサ−である。エンハンサ−は、プロモーターに作用して転写レベルを増加さ せる、通常的１０〜３００ｂｐのＤＮＡのノス作動（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）要 素である。

現在、多くのエンハンサ−配列が哺乳動物遺伝子（たとえば、グロビン、エラス ターゼ、アルブミン、α−フェトプロティンおよびインスシュリンの遺伝子）が ら知られている。しかしながら、使用するエンハンサ−は、一般に真核細胞ウィ ルス由来のものであろう。その例としては、複製起点の後期部位にある（ｂｐｌ ＯＯ〜２７０）ＳＶ４０エンハンサ−、サイトメガロウィルス早Ｘ１ｌ−７’ロ モーターエンハンサー、復製起点の後期部位にあるポリオーマエンハンサ−１お よびアデノウィルスエンハンサ−が挙げられる（クリ−グラ−（Ｋ　ｒｉｅｇｌ ｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚ、　１旦５：５１２〜５２７　（１９９０））ｃ発現ベクターはまた、転 写の終了に必要な配列および伝令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の安定化に必要な配列を 含んでいてよい。パルバス（Ｂ　ａｌｂａｓ）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ。

合は、そのような転写終了配列は真核生物またはウィルスのＤＮＡまたはｃＤＮ Ａの非翻訳領域から得たものであってよい。これら領域は、転写終了部位ととも にポリアデニル化部位を含有している。バーンステイル（Ｂｉｒｎｓｔｅｉｌ） ら、Ｃｅ１１４１：３４９〜３５９　（１９８５）。

一般に、制御配列は、特定の宿生細胞において機能的に連結したフード配列を発 現させるのに必要なりＮＡ配列である。「発現ｊとは、転写および／または翻訳 をいう。「機能的に連結した」とは、酵素的なライゲーンジンまたは他の仕方に より、２またはそれ以上のＤＮＡ配列が正常な機能を発揮できるようなコンフィ グレーシヨンで相互に共有結合的に結合していることをいう。たとえば、ポリペ プチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現される場合には、プレ配列ま たは分泌リーダーのＤＮＡが該ポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結している： プロモーターまたはエンハンサ−がコード配列の転写に影響を及ぼすなら、これ らプロモーターまたはエンハンサ−は該配列に機能的に連結している二またはリ ポソーム結合部位が翻訳を容易にするような位厘にあるなら、該部位はコード配 列に機能的に連結している。一般に、「機能的に連結している」とは、連結した ＤＮＡが隣接していること、および分泌リーダーの場合には隣接してかつリーデ ィングフレームにあることを意味する。連結は、都合のよい制限部位でライゲー トすることにより行うことができる。そのような部位が存在しない場合には、標 準組換えＤＮＡ法とともに合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカ−を 用いる。

発現およびクローニングベクターにはまた、１またはそれ以上の選択された宿生 細胞中で該ベクターが複製することを可能にする配列が含まれるであろう。一般 にクローニングベクターにおいては、この配列は、宿主染色体とは独立に複製す ることを可能にするものであり、複製起点または自律複製配列が含まれる。その ような配列は、種々の細菌、酵母およびウィルスにおいてよく知られている。

プラスミドｐＢＲ３２２由来の復製起点は殆どのグラム陰性細菌に適しており、 ２μプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウィルス起点（たとえば、ＳＶ ４０、ポリオーマまたはアデノウィルスからのもの）は哺乳動物細胞におけるク ローニングベクターに有用である。たいていの発現ベクターは「シャトル」ベク ターである、すなわち、それらベクターは生物の少なくとも一つのクラスにおい て複製可能であるが、発現のためには他の生物にトランスフェクションすること ができる。たとえば、ベクターを大腸菌にクローニングし、ついて宿主細胞染色 体と独立に複製することができないとしても、同じベクターを発現のため酵母ま たは哺乳動物細胞中にトランスフェクションする。

発現ベクターにはまた、たとえばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のコー ド配列を含有するものなどの増幅可能な遺伝子が含まれていてもよい。ＤＨＦＲ 遺伝子を含む発現ベクターを含有する細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストで あるメトトレキセートの存在下で培養することができる。このことにより、ＤＨ ＦＲ遺伝子の複数コピーが合成され、それと同時に発現ベクターに含まれる他の ＤＮＡ配列（たとえば、ＧＰＡをコードするＤＮＡ配列など）の複数コピーも合 成される（リンボルド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）ら、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｌ、　Ｇｅｎ ｅｔ、　１　：　１６５〜１７５　（１９８１））。そのようにして、細胞によ って産生されるＧＰＡレベルが増大する。

発現ベクターによってコードされるＤＨＦＲタンパク質はまた、成功したトラン スフェクションの選択マーカーとして用いることもできる。たとえば、形質転換 する前の宿生細胞がＤＨＦＲ活性を有していないなら、ＧＰＡおよびＤＨＦＲタ ンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによって首尾よく形質 転換されたことは、メトトレキセートを含む培地中で細胞を増殖させることによ って決定することができる。また、ＧＰＡ、ＤＨＦＲタンパク賃およびアミノグ リコノド３°ホスホトランスフエラーゼ（、ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列を 含有する発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞はまた、カナマイノンやネ オマイノンｔどのアミノグリコノド抗生物質を含有する培地中で細胞を増殖させ ることによって決定することができる。真核生物細胞は通常、内生ＡＰＩ活性を 発現しないので、ＡＰＩタンパク質をコードする遺伝子（一般にｎｅｏ’遺伝子 と呼ばれる）は広範囲の真核生物宿主細胞において主要な選択マーカーとして用 いることができ、それによって該ベクターでトランスフェクションされた細胞を ＧＰＡを発現する組換え宿主細胞を同定および単離するために用いることのでき る他の多くの選択マーカーが知られている。たとえば、酵母に用いるのに適した 選択マーカーは、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔ　ｒｐｌ遺伝子である 。

ｈｅｍｐｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ　１０　：　１５７〜１６６　（１９８０）。ｔｒ ｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、たとえば ＡＴＣＣＮｏ、４４０７６またはＰＥＰ４−１　（アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州２０８５２米国）のための選 択マーカーを提供する。

ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）　、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５　：１２　（１９７７） 　ｏついで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔ　ｒｐｌ病変の存在は、トリプトファン の不在下で増殖させることにより形質転換体を検出するための有効な環境を提供 する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣＮｏ、２０６２２または３８６２ ６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を含有する公知プラスミドにより補足される。

本発明において特に有用なのは、Ｇ　Ｐ　ＡをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞 中における一過性の発現を提供する発現ベクターである。一般に、一過性の発現 には、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、それによって該発現ベ クターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成できるように 、宿主細胞中で効率的に複製することのできる発現ベクターを使用する。適当な 発現ベクターと宿主細胞とからなる一過性の発現系によって、クローニングした ＤＮＡによってフードされるポリペプチドの都合のよい積極的な同定が可能とな るとともに、所望の生物学的または生理学的特性についてそのようなポリペプチ ド４３６０〜４３６４　（１９８５）。それゆえ、−過性発現系は、ＧＰＡのア ミノ酸配列変種をコードするＤＮＡを発現させて機能的に活性な変種を同定する うえで本発明において特に有用である。

ＧＰＡのアミノ酸配列変種の特性を前取て予測することはしばしば困難であるの で、機能的に活性なものを同定するために、そのような変種のある種のスクリー ニングが必要であろうことが評、価されるであろう。そのようなスクリーニング は、ニューロンの生存についての通常のアッセイを用い（エラケンスタイン（Ｅ ｃｋｅｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ４＋６２３〜６３１　（１９９０））、 または機能的に活性なＧＰＡに選択的に結合するモノクローナル抗体、たとえば ＧＰＡの活性部位またはレセプター結合部位に選択的に結合するモノクローナル 抗体を用いたイムノアッセイを用い、インビトロで行うことができる。

本発明の好ましい態様において、哺乳動物宿主細胞中でのＧ　Ｐ　Ａ、発現は、 エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）からの複製のｏｒｉＰ起点を含有する発 現ベクターおよびＥＢＶのＥＢＮＡ−１遺伝子で形質転換され該遺伝子を構成的 に発現する宿主細胞を使用して行われる。

ＥＢＶのｏｒｉＰ配列を含有するプラスミドは、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ−１） を発現するＥＢＶ形質形質転換宿主細胞種製することができる。サグデン（Ｓｕ ｇ９８４）ｅ以下の実施例にｒ載するＧＰＡの発現においては、ＥＢＶからのＯ ｒ】Ｐ起点を含有するプラスミド発現ベクター（ｐＨＥＢＯ３０）およびＥ　Ｂ 　Ｎ　Ａ−１を１３１１銭的に発現する細爬株（ＣＥＮ４）を使用する。詳細に は、ｐＨＥＢＯ３０は、強力なＣＭｖプロモーター、該ＣＭＶプロモーターの下 流にある外来遺伝子挿入用マルチプルクローニング領域、ＥＢＮＡ−１を発現す る宿主細胞（たとえば、ＣＥＮ４）中でプラスミドを複製させるためのＥＢＶの 。ｒｉＰ領域、真核生物中で選択するためのハイグロマイシン耐性遺伝子、原核 生物中で複製させるためのｐＢＲ３２２由来の複製起点、および原核生物中で選 択するためのアンピシリン耐性遺伝子を含む。

トランスフェクション後、ｐＨＥＢＯ３０（その組換え誘導体を含む）は、ＥＢ ＮＡ−１を発現する宿生細胞の核種でエビソームとして安定に保持される。予期 しないことに、そのような宿生細胞のｐＨＥＢＯ３０での安定なトランスフェク ションの効率は、ｏｒｉＰ領域とＥＢｖがらのＥＢＮＡ−１遺伝子の両方を含有 するプラスミドで得られるものに比べて数倍大きい。一般に、ＣＥＮ４細胞のｐ ＨＥＢＯ３０による安定なトランスフェクションの効率は、約５〜２５％または それ以上である。ｐＨＥＢＯ３０およびＣＥＮ４の他の利点としては、以下の点 が挙げられる：　（１）ｐＨＥＢＯ３０中にクローニングした外来遺伝子（たと えば、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰＡ）およびヒト可溶性ア ルカリホスファターゼ）のＣＥＮ４細胞中細胞−過性発現は、ＥＢＶからの。ｒ ｉＰを欠く発現ベクターで得られるものに比べて数倍高い；　（２）ｐＨＥＢＯ ３０中にクローニングした外来遺伝子のＣＥ　Ｎ　４細胞中での安定な発現は、 適当な選択（たとえば、ハイグロマイシン選択）で４力月またはそれ以上維持す ることができる：および（３）ｐＨＥＢＯ３０およびその組換え誘導体は、分析 または修飾のため、トランスフェクションした細胞から容易に回収できる。

本明細書において用いる「形質転換」および「トランスフェクション」なる語は 、プラスミドや発現ベクターなどの所望の核酸を宿生細胞中に導入する工程をい う。宿主細胞の性質に応じて、種々の形質転換およびトランスフェクション法が 利用できる。大腸菌細胞の場合は、最も一般的な方法は、塩化カルシウムその他 の塩の水溶液で該細胞を処理することを含む。哺乳動物細胞の場合は、最も一般 的な方法は、リン酸カルシウムもしくはＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−デキストランのいずれ かの媒介によるトランスフェクション、またはエレクトロポレーションである。

サンプルツク（Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ　）ら編、モレキュラークローニング、ｐ　 ｐ、　１．７４〜１．８４および１６．３０〜１６．５５（コールドスプリング ハーバ−ラボラトリ−プレス、１９８９）。形質転換またはトランスフェクショ ン後、所望の核酸は宿主細胞ゲノム中に組み込まれるか、または染色体外要素と して存在する。

上２プラスミドおよび発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした 宿主細胞を、プロモーターの誘導または薬剤耐性またはある種の他の選択マーカ ーまたは表現型の選択に適するように修飾した通常の栄養倍地中で培養する。

温度、ｐＨなどの培養条件は、場合により、クローニングまたは発現のために宿 主細胞を培養するのに以前に用いた条件が適しており、当業者には明らかであろ う。

本発明においてベクターをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は、 原核生物、醇丹、および高等真核生物（昆虫、を椎動物、および哺乳動物宿主細 胞を含む）のものである。適当な原核生物としては、グラム陰性生物やグラム陽 性生物などの真正細菌、たとえば、大腸菌、パンラス・サチリス（Ｂａｃｊｌｌ ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）などのバフラス種、ンユードモナス・アエルギノーサ （Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス種 、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｗｕｒｉｕ ｍ）　、またはセラチア・マルセンセンス（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓ ｃａｎｓ）が挙げられる。

原核生物に加えて、繊維状真菌や酵母などの真核微生物もＧＰＡをコードするベ クターに適した宿主である。サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ〜１ｓｉａｅ）　、または一般的なパン酵母が、低級真核 宿生微生物のなかでも最も一般的に用いられる。しかしながら、多くの他の属、 種および株が本発明において利用できて有用であり、たとえば、スキゾサノカロ ミセス・ポンプ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏ＋１ｂｅ）　 （ビーチ（Ｂｅａｃｈ）およびナース（Ｎｕｒｓｅ）　、Ｎａｔｕｒｅ　２９０ １１４０〜１４２　（１９８１））　、ピキア・バストリス（Ｐ　１ｃｈｉａ　 ｐａｓｔｏｒｉｓ）１２５　（１９８９）Ｌニューロスポラ・クラノサ（Ｎｅｕ ｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）　（ケース（Ｃａｓｅ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６　：　５２５９〜５２６３　（１９７９）） 、およびアスペルギルス宿主、たとえば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　（バランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ）ら 、Ｂ　１ｏｃｈｅｔ　Ｂ　１ｏｐｈｙよびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　（ケリー（Ｋｅｌｌｙ）ら、Ｅ＼ｉＢｏ　Ｊ、４ 　：４７５〜４７９　（１９８５））を用いることができる。

ＧＰＡの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物由来であってもよい。そのよ うな宿主細胞は、複合プロセシング（ｃｏＩＩｌｐｌｅｘ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ ｇ）およびグリコシレー／ジン活性が可能である。原則として、を椎動物に由来 するか無を椎動物に由来するかにかかわらず、あらゆる高等真核生物細胞培養液 を用いることができる。

しかしながら、グリコンレージジンの種特異性、組織特異性、および細胞特異性 のため（ラーデマソヒ＋　−（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ）ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　５７　：　７８５〜８３８　（１９８８））、外来宿主 細胞中でのＧＰＡのグリコンレージジンの程度およびパターンは天然で発現され る細胞から得られるＧＰＡのものとは一般に異なるであろうことが評価されるで あろう。

無を椎動物細胞の例としては昆虫および植物細胞が挙げられる。スポドブテラ・ フルンペルダ（Ｓ　ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　（毛虫）、 アエデス・アエジブチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇＹｌ）ｔｉ）　（蚊）、アエデス・ アルボビクッス（Ａｅｄｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）　（蚊）、ドロソフィラ ・メラノガスタ−（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）　（シ ョウジヨウバエ）、およびボンビノクス・モリ（Ｂｏｍｂｙλｍｏｒｉ）宿主細 胞などの宿主からの多数のバキュロウィルス株および変種および対応許容昆虫宿 主細胞が同定されてワタ、トウモロコノ、ジャガイモ、ダイス、ペチュニア、ト マトおよびタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することができる。一般に 、植物細胞のトランスフェリンジンは、ＧＰＡ　ＤＮＡを含有するように前取て 変化させておいた細菌のアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のある種の株とともにインキュベー トすることにより行う。植物細胞をアグロバクテリウム・ツメファシェンスとと もにインキュベートする間に、ＧＰＡをコードするＤＮＡは細胞中に移動し、か くして該細胞はトランスフェリンヨンされ、適当な条件下でＧＰＡ　ＤＮＡを発 現するであろう。加えて、ノバリンンンターゼプロモーターおよびポリアデニル 化／グナル配列およびリブロース２リン酸カルボキンラーゼプロモーターなどの 植物細胞に適合した制御およびシグナル配列を利用することができる。デピノカ −（Ｄ　ｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ　、　Ｍｏ１．　、八ｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１ ．５６１〜５７３　（１９８２）、ヘレラーエストレッラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅ ｓｔｒｅｌｌａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１０　：　１１５〜１２０　（１９８４ ）、加えて、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から単離したＤＮＡ切片は、組 換えＤＮＡ含有植物組織中での植物発現可能な遺伝子の転写レベルを活性化また は増加させることができる。ヨーロッパ特許公開第ＥＰ３２１．１９６号（１９ ８９年６月２１日公開）。

しかしながら、を椎動物細胞に最大の関心があり、を椎動物細胞の培養液（組織 培養液）中での増殖は近年、日常的な手順になっている。クルーズ＆パダーリン 編、組織培養（アカデミツクプレス、１９７３）。有用な哺乳動物宿主細胞の例 は、５ｖ４０で形質転換したサル腎１１ＣＶ１株（ＣＯ３−７、ＡＴＣＣＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株２９３（または懸濁培養中で増殖させるためにサブク ローニングした２９３細胞）（グラハム（Ｇ　ｒａｈａｍ）ら、Ｊ　、　Ｇｅｎ 、　Ｖｉｒｏｌ、　３旦：５９〜７２　（１９７７））：ベービーハムスター腎 臓細Ｉｆ！　（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）：チャイニーズハムスター卵巣細 胞（ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を含む、ウアラウブ（ｔＪ　ｒｌａｕｂ）ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７７　：　４２１６〜４２２０　（ １９８０））：マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー（Ｍａｔｈｅｒ）、Ｂｉｏ ｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、２３　：　２４：３−２５１　（１９８０））：サル腎臓細 胞（、ＣＶｌ、ＡＴＣＣＣＣｌ７０）ニアフリカミトリザル腎臓細胞（〜’ＥＲ Ｏ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）：ヒト頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣｌ２）：イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫＳＡＴＣＣＣＣｌ３４）：バノフ７０−ラ ット（ｂｕｆｆａｌｏ　ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４ ２）：ヒト肺細胞（Ｗ１３８１．ＡＴＣＣＣＣｌ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ 　Ｇ２、ＨＢ８０６５）１マウス乳１１１ｉ　（ＭＭＴＯ６０５６２、Ａ’ｒＣ ＣＣＣｌ５１）＋ＴＲＩ細胞（マザーら、Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、３８３　：　４４−６８　（１９８２））；ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞； およびヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。

Ｇ　Ｐ　、６．をコードするヌクレオチド配列および適当な制御配列を含有する 適当なベクターの構築には標準的な組換えＤＮＡ法を用いる。ＤＮＡを断片に開 裂し、修飾し、必要なベクターを生成するのに望ましい形態にて一緒にライゲー トする。

構築したベクター中の正確な配列を確認するための分析のため、ベクターを制限 消化（該ベクター中における予測される制限エンドヌクレアーゼの存在を確認す るため）および／またはサンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）らのチェインターミネータ −法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＩｊＳＡ　７２　：　３９１ ８〜３９２１　（１９７９）　）によりシーフェンシングすることにより分析す る。

この発明のＧＰＡを製造するのに使用する哺乳動物宿主細胞は、種々の培地中で 培養することができる。ハムのＦｌｏ（シグマ）、最小必須培地（ＭＥＭ、シグ マ）　、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベツコの変性イーグル培地 （ＤＭＥＭ、シグマ）などの市販の培地が宿主細胞を培養するのに適している。

、米国特許第４．５６０．６５５号、同第４．６５７．８６６号、同第４．７６ ７．７０４号、または同第４．９２７．７６２号：またはＰＣＴ特許公開第ＷＯ ９０１０３４３０（１９９０年４月５日公開）に記載された培地のいずれも、宿 主細胞のための培地として用いることができる。これら培地のいずれも、必要に 応じてホルモンおよび／または他の成長因子（イン／ニリン、トランスフェリン 、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム 、およびリン酸など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオノド（アデノノン およびチミジンなど）、抗生物質、微量元素（マイクロモルの範囲の最終１度で 通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価なエ ネルギー源を添加することができる。他の必要な添加物も、当業者に知られた適 当な濃度にて含有させることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現につ いて宿主細胞において以前に用いたものであり、当業者に明らかであろう。

この開示において言及する宿主細胞には、インビトロ培養中の細胞、並びにたと えば移植または埋め込みの結果として宿主動物内にある細胞が包含される。

さらに、たとえばＰＣＴ特許公開第ＷＯ９１１０６６６７（１９９１年５月１６ 日公開）に記載されているように、相同的組換えによってこの発明のＧＰＡを製 造することも考えられる。簡単に説明すると、この方法は、ＧＰＡをコードする 内生遺伝子を含有する細胞を相同ＤＮＡで形質転換することを含み、該相同ＤＮ Ａは、（１）ＤＨＰＲなどの増幅可能な遺伝子、および（２）少なくとも約１５ ０塩基対の長さを有する少なくとも一つのフランキング配列（細胞ゲノム中のＧ ＰＡをコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接するヌクレオチド配列に相同で ある）を含む。形質転換を、該相同ＤＮＡが組換えによって細胞ゲノム中に組み 込まれるような条件下で行う。ついで、該相同ＤＮＡが総み込まれた細胞を、増 幅可能な遺伝子の増幅、それによって同時に増幅されたＧＰＡ遺伝子を選択する 条件に供する。ついで、得られた細胞を、所望の量のＧＰ、Ａの産主についてス クリーニングする。ＧＰＡをコードする遺伝子に近接するフランキング配列は、 たとえば、出発点として図１に示すＧＰＡヌクレオチド配列を用いてゲノム歩行 法によって容易に同定できる。スボエレル（Ｓｐｏｅｒｅｌ）ら、Ｍｅｔｈ、　 Ｅｎｚ、　１５２・５９８〜６０３　（１９８７）。

遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、たとえば、本発明において提供する配 列に基づき、適当な標識オリゴヌクレオチドハイブリダイゼ−７ヨ／プローブを 用いて、ＤＮＡを定量するためのサザーンブロツティング、またはｍＲＮＡを定 量するためのノーザンブロッティングにより試料中で直接測定することができる 。種々の標識を用いることができるが、最も一般的には放射性同位元素、とりわ けｓｉｐを用いることができる。しかしながら、ポリヌクレオチド中に導入する だめのビオチン−修飾ヌクレオチドの使用などの他の方法を用いることもできる 。

ついで、ビオチンはアビジンまたは抗体への結合部位として働き、該アビジンま たは抗体は放射性同位元素、蛍光団、発色団などの広範囲の標識で標識すること ができる。別法として、ＤＮＡ二量体、ＲＮＡ二量体、およびＤＮＡ−ＲＮＡハ イブリッドニ量体またはＤＮＡ−タンパク質二量体を含む特定の二量体を認識す ることのできる抗体を用いることができる。表面上に二量体が形成されたときに 該二量体に結合した抗体の存在を検出することができるように、この抗体を今度 は標識し、表面に二量体が結合したアッセイを行うことができる。

別法として、遺伝子発現は、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養液ま たは体液のアッセイなどの免疫学的方法により、遺伝子産物（ＧＰＡ）の発現を 直接定量することによって測定することができる。免疫組織化学的染色法では、 一般に、脱水および固定、ついでカップリングした遺伝子産物に特異的な標識抗 体と反応させる（その際、標識は通常、酵素標識、蛍光標識、発光標識などの視 覚的に検出可能なものである）ことにより細胞試料を調製する。本発明に用いる のに適した特に感度の高い染色法が、フス（Ｈｓｕ）らのＡｍ、　Ｊ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｐａｔｈ、、７５　：　７３４〜７３８　（１９８０）に記載されている 。免疫組織化学的染色および／または試料流体のアッセイに有用な抗体は、モノ クローナルまたはポリクローナルのいずれであってもよい。都合のよいことに、 本発明において提供されるＤＮＡ配列に基づいて合成ペプチドに対して抗体を調 製することができる。

ＧＰＡは分泌ポリペプチドとして培地から回収するのが好ましいが、宿主細胞の 溶解液から回収することもできる。ＧＰＡが産生された宿主細胞の混入タンパク 質またはポリペプチドを実質的に含有しないＧＰＡを得るため、ＧＰＡに付随す る混入物と比較したＧＰＡの分別物理特性に基づいてＧＰＡを精製する必要があ る。たとえば、第−工種として、培地または溶解液を遠心分離にかけて粒状の細 胞破砕物を除去する。その後、たとえば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿 、ゲル濾過（分子排除クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、 イムノアフィニティークロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ，および／またはゲル 電気原動によって、混入する可溶性タンパク質およびポリペプチドからＧＰＡを 精製する。

ＧＰＡのアミノ酸配列変種および誘導体も、特定ＧＰＡの識別特性または物理特 性を考慮に入れて同様に回収する。たとえば、ＧＰＡと細菌またはウィルス抗原 などの他のタンパク質またはポリペプチドとからなる融合タンパク質の場合、該 抗原に対する抗体を含有するイムノアフィニティーカラムを用いることにより有 意程度の精製を得ることができる。いずれにしても、組換え宿生細胞中で産生さ れたＧＰＡまたはその変種または誘導体の特性の変化を償うため、天然に存在す るＧ　Ｐ　Ａに遇した精Ｖ法を修飾する必要があることを当業者は評価するであ ろう。

本発明に従って製造されたＧＰＡの純度は、分析的ドデンル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）ゲル電気泳動、イムノアッセイ、またはアミノ酸組成または配列分析電気 泳動などの当該技術分野でよく知られた方法に従って決定する。他のタンパク質 を実質的に含有しない程度にＧＰＡを精製するのが好ましい。治療用に使用する に際しては、精製ＧＰＡは９９％以上のＧＰＡであり、従って非ＧＰＡタンパク 質は精製ＧＰＡ組成物中の全タンパク質の１％未満を構成するであろう。

ＧＰＡは、抗ＧＰＡ抗体を産生させるために免疫原として用いることができる。

ＧＰＡに特異的に結合するそのような抗体は、ＧＰＡのアッセイにおける標準と して、たとえばラジオイムノアッセイ、酵素結合抗体免疫アッセイ、または競合 タイプのレセプター結合アッセイ、ラジオレセプターアッセイにおける標準とし て使用するために精製ＧＰＡを標識することにより、並びにアフィニティー精製 法において有用である。

ＧＰＡに対して向けられたポリクローナル抗体は、一般に、ＧＰＡおよびアジュ バントを複数回、皮下または腹腔内注射することにより動物中に産生される。２ 官能性試薬または誘導体化試薬、たとえば、マレイミドベニ／ジイルスルホスフ ノンイミドエステル（７ステイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクンジイ ミド（す／ン残基による結合）、ゲルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ Ｉ２、またはＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基）を用 い、ＧＰＡまたはそのペプチド断片を免疫しようとする種において免疫原である 担体タンパク質（キーホールリンベットヘモシアニン、血清アルブミン、ウンチ ログロブリン、またはダイズトリブシンインヒビターなど）に結合させるのが有 用である。

そのようなＧＰＡ−担体タンパク質結合体１ｍｇまたは１μｇ（それぞれ、ウサ ギまたはマウスに対して）を３容量のフロイント完全アジュバントと混合し、該 溶液を複数部位で皮肉注射して、動物を該ＧＰＡ−担体タンパク質結合体で免疫 する。１力月後、最初の量の１１５から１／１０の量の結合体をフロイント完全 アジュバント中で皮下注射により複数部位にて動物にブースター投与する。７〜 １４日後、動物を採血し、その血清を抗ＧＰＡ抗体力価についてアッセイする。

抗体力価が安定水準に達するまで動物にブースター投与する。好ましくは、同じ ＧＰＡと異なる担体タンパク質との結合体でおよび／または異なる架橋試薬を用 いて注射することにより動物６＝ブースター投与する。ＧＰＡと適当な担体タン パク質との結合体はまた、組換え細胞培養液中で融合タンパク質として製造する こともできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答を促進させるこ とができる。

ＧＰＡに対して向けられたモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗 体分子の産生を供するいかなる方法を用いても製造される。そのような方法の例 としては、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）らのオリジナルのハイブリドーマ法（Ｎａ ｔｕｒｅスΣ旦、４９５〜４９７　（１９７５））、およびヒトＢ細胞ハイブリ ドマ法（コズボー（Ｋｏｚｂｏｒ）　、Ｊ　、　］　ｍｍｕｎｏ１．１３旦：３ ００１　（１９８４）；プログ−（Ｂ　ｒｏｄｅｕｒ）ら、モノクローナル抗体 産生法および応用、５１〜６３頁（マーセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋ ｋｅｒ、　Ｉ　ｎｃ、　）　、ニューヨーク、１９８７））が挙げられる。

診断的応用のためには、抗ＧＰＡ抗体を一般に検出可能な残基で標識するであろ う。検出可能な残基は、直接または間接のいずれかで検出可能なシグナルを生じ 得るものであればいかなるものであってもよい。たとえば、検出可能な残基は、 ３）（，１４Ｃ，３２ｐ、３ＳＳまたは１２５１などの放射性同位元素、フルオ レセインイソンス化合物：たとえば＋２５１．３２ｐ、　＋１（：または用など の放射性同位元素標識、またはアルカリホスファターゼ、β−カラクトシダーセ または西洋ワサヒペルオキシダーゼなどの酵素であってよい。

デーピッド（Ｄａｖｊｄ）ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙよ３　：　１０１４ ′１０２１　（１９７４）：ベイン（Ｐａｉｎ）ら、Ｊ、］ｍｍｕｎｏ１．Ｍｅ ｔｈ、４０：２１９〜２３１　（１９８１）：およびベイヤー（Ｂａｙｅｒ）ら 、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１８４：１３８〜１６３　（１９９０）に記載された方法 を含む、検出可能な残基に抗体を別々に結合させるための当該技術分野で公知の いずれの方法も用いることができる。

抗ＧＰ、Ｉｌ、ｖＬ体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッ セイ、および免疫沈降アッセイ（シラ（Ｚｏｌａ）　、モノクローナル抗体、技 術のマニュニ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣプレス、１９８７））などの公知のア ッセイ法のいずれにおいても用いることができる。

競合結合アッセイは、限られた量の抗体への結合に対して標識標準（たとえば、 ＧＰＡまたは免疫学的に反応性のその部分）が試験試料分析対象物（ＧＰＡ）と 競合し得る能力に依存する。試験試料中のＧＰＡの量は、抗体に結合した標準の 量に反比例する。結合した標準の量の測定を容易にするため、一般に抗体を競合 の前または後に不溶化し、抗体に結合した標準および分析対象物を結合しないで 残ったｍｓおよび分析対象物から都合よく分離てきるようにする。

サンドイッチアッセイでは、検出しようとするタンパク質の異なった免疫原部分 、またはエピトープに対してそれぞれ結合し得る２つの抗体を使用する。サンド イッチアッセイにおいては、固体支持体上に固定化した第一抗体が試験試料分析 対象物に結合し、その後に第二抗体が該分析対象物に結合し、かくして不溶性の ３部分檀合体を形成する。デーヒツトら、米国特許第４．３７６．１１０号。こ の第二抗体はそれ自体検出可能な残基て標識されていてもよいしく＠接すントイ ソチアノセイ）、または検出可能な残基で標識した抗免疫グロブリン抗体を用い て測定することもてきる（間接サンドインチアッセイ）。たとえば、サンドイッ チアッセイの一つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイ、てあり、この場合は検出可能 な残基は酵素である。

本発明の抗ＧＰＡ抗体はまたインビボ造影にも有用であり、この場合には検出可 能な残基で標識した抗体を宿主に、好ましくは血流中に投与し、該宿主内の標識 抗体の存在および位置をアッセイする。この造影法は、種々の神経学的疾患の病 期の決定（ｓｔａｇｉｎｇ）および治療に有用である。抗体の標識は、核磁気共 鳴、放射線学または当該技術分野で公知の他の検出手段のいずれにせよ、宿主中 で検出し得る残基を用いて行うことができる。

ＧＰＡは、毛様体、知覚、および交感ニューロンを含むニューロンの発育、維持 または再生をインビボで促進するのに有用であると思われる。従って、ＧＰＡは 、種々の神経学的疾患および異常の診断法および／または治療法に利用すること ができる。

本発明の種々の態様において、外傷、手術、虚血、感染、代謝性疾患、栄養不良 、悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）　、または毒性薬剤によって神経系が障害を受 けた患者に精製ＧＰＡを投与し、ニューロンの生存または成長を促進させること ができる。

たとえば、外傷または手術によって障害を受けた運動ニューロンの生存または成 長を促進するのにＧＰＡを用いることができる。また、ＧＰＡは、筋萎縮性側索 硬化症（ルーデーリック病（Ｌｏｕ　Ｇｅｈｒｉｇ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）　） 　、ベル麻痺などの運動ニューロン疾轡１、およびを軸性筋萎縮または麻痺を伴 う種々の状態の治療に用いることができる。さらに、ＧＰＡは、アルツハイマー 病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、およびダウン症候群などのヒト神経 変性疾患の治療に用いることができる。

本発明のさらに別の態様において、ＧＰＡに対して向けられた抗体を、ＧＰＡの 過剰産生を特徴とする神経学的疾患および異常を患う患者に投与することができ る。抗ＧＰＡ抗体は、手術後に起こるような知覚ニューロンの真理的再生を防ぐ ため、または知覚ニューロンの選択的切除、たとえば慢性疼痛症候群（ｃｈｒｏ ｎｊｃ　ｐａｉｎ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）の治療に用いることができる。

神経学的疾患および異常の治療のためのＧＰＡおよび抗ＧＰＡ抗体の治療製剤は 、所望の純度を有するＧ　Ｐ　、Ａまたは抗ＧＰＡ抗体をよく知られた任意の生 理学的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより調製する 。許容し得る担体、賦形剤または安定化剤は、使用した投与量および濃度におい て非毒性であり、リン酸、クエン酸および池の有機駿などの緩衝液：アスコルビ ン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未Ａ）ポリペプチド、血清アルブミ ン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質：ボリビニルビロリドンな どの親水性ポリマーニゲリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたは りシンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノースまたはデキ スリンを含む池の炭水化物：　ＥＤＴＡなどのキレート試薬；マンニトールやソ ルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩を形成する対イオン：およ び／またはツイーン、プルロニックまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）な どの非イオン性界面活性剤を含む。

ンラスティック膜などの膜上にＧＰＡを吸着させ、これを障害を受けた神経組織 の近傍に埋め込むことができるし、またはＧＰＡをリポソームと複合体を形成さ せるのが望ましい。ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９１１０４０１４（１９９１年４月４ 日公開）。

ＧＰＡは場合により、所望の治療学的効果を達成するため他の神経栄養因子と組 み合わせ、または−緒に投与できる。たとえば、ＧＰＡをＮＧＦまたはＢＤＮＦ または他の神経栄養因子とともに用いて知覚ニューロンの増殖に対して相乗的刺 激効果を発揮させることができる。ここで「相乗的」なる語は、ＧＰＡと第二の 神経栄養因子との組み合わせの効果がそれぞれの物質を個々に用いた場合に達成 されるものよりも大きいことを意味する。

インビボ投与に用いるＧＰＡおよび抗ＧＰＡ抗体は無菌でなければならない。

このことは、ＧＰＡまたは抗ＧＰＡ抗体の溶液を滅菌濾過膜で濾過する二とによ り容易に達成することができる。その後、滅菌アクセスポートを有する容器、た とえば、皮下注射針で突き通すことのできるストッパーを有する静圧用溶液バッ グまたはバイアル中に濾過溶液を入れる。濾過溶液はまた、凍結乾燥して粉末状 の滅菌ＧＰＡまたは抗ＧＰＡ抗体とすることができる。

ＧＰＡおよび抗ＧＰＡ抗体をインビボで投与する方法としては、静脈内、腹腔内 、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変的経路による注射または注入、およ び徐放製剤によるものが挙げられる。

徐放製剤は、−９に、ＧＰＡまたは抗ＧＰＡ抗体、および該ＧＰＡまたは抗ＧＰ Ａ抗体が一定の期間で放出されるマトリックスからなる。適当なマトリックスと しては、成型製品の形態、たとえば膜、繊維またはマイクロカプセルの形態の半 透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放マトリックスは、ポリエステル 、ヒドロゲル、ポリラクチド、米国特許第３．７７３．９１９号、Ｌ−グルタミ ン酸とγエチルーし一グルタミン酸とのコポリマー、ンドマン（Ｓ　ｉｄ＋＊ａ ｎ）ら、Ｂ　ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、λ２：５４７〜５５６　（１９８３）、ポ リ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはエチレンビニルアセテー ト、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ、Ｒｅｓ、１ ５　：　１６’？”２７７　（１９８１）：ランガー、Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、１ ２　：　９８−１０５　（１９８２）からなっていてよい。

本発明の一つの態様において、徐放製剤はリポソーム内に捕捉されたまたはリポ ソームと複合体を形成したＧＰＡまたは抗ＧＰＡ抗体からなる。別の態様におい て、徐放製剤は、ＧＰＡまたは抗ＧＰＡ抗体を活発に産生ずる細胞からなる。

そのような細胞は患者組織中に直接導入することもできるし、または多孔質膜内 に包接しこれを患者内に埋め込むこともできるが、いずれの場合も、増加濃度ま たは低下濃度のＧ　Ｐ　Ａを必要とする磨者の体内の領域にＧＰＡまたは抗ＧＰ Ａ抗体を送達する。

治療に使用するＧＰＡまたは抗ＧＰＡ抗体の有効量は、たとえば、治療目的、投 与経路、および患者の健康状態に依存するであろう。従つて、最遍の治療効果を 得るために必要とされるように、治療者は投与量を滴定し投与経路を修飾する必 要があるであろう。典型的な１日の投与量は、上記因子に依存して約１μｇ／ｋ ｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であろう。可能なら、たとえば当 該技術分野で公知のニューロン細胞生存または成長のアッセイを用いてまずイン ビトロで適当な投与量範囲を決定し、ついで過当な動物モデルの投与量範囲から ヒト患者の投与量範囲を外挿するのが望ましい。そのようなインビトロアッセイ （エラケンスタインら、Ｎｅｕｒｏｎ　４　：６２３〜６３１　（１９９０）） におけるＧ　Ｐ　Ａの使用に基づき、本発明の特定の態様において、ニューロン の生存または成長を促進する効果を有する医薬組成物は約０１〜Ｌｏｎｇ／ｍｌ のインビボでの局所ＧＰ、ＡＩ度を提供するであろう。

要約すると、ＣＰ、八をコードする核酸分子を提供することにより、本発明は組 換えＤＮＡ法によるＧＰＡの製造を初めて可能とし、それゆえ種々の診断および 治療用途に使用するに充分な量のＧＰＡの信頼できる供給源を提供する。その独 特の生物学的特性のため、精製した組換えＧＰＡはニューロンの成長および生存 を確実にすることが必要なまたは望ましいが他の神経栄養因子を使用できないか または有効でない種々の状況において特ｌ＝有用であろう。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定することを 意図するものではない。

実施例 １、λ−ＨＥＢ○ベクターの構築 λ−ＨＥＢＯベクターの構築のための出発物質として哺乳動物発現プラスミドｐ ＲＫ、ＣＸＲＨＮ　（ｏインク（Ｌｅｕｎｇ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４旦：１ ３０６〜１３０９　（１９８９）　）を用イタ。ｐＲＫ、ＣＸＲＨＮは、ソノマ ルチフルクローニング領域の下流に５ｆｉｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を含有 するｅｃＩａｌおよびＮｏｔｌ制限エンドヌクレアーゼ部位の間に配列：を有す る合成Ｉ）ＮＡを挿入することにより、マルチプルクローニング領域中にさらに ５ｆｉＴ部位を導入した。

ついで、得られたプラスミドをＳｐｅ　ＩおよびＨｉｎＰＴ制限エンドヌクレア ーゼで開裂し、１１１０塩基対の制限断片を単離した。ＣＭＶプロモーター、有 効なｃ　Ｄ　ＮＡクローニングのための２つの５ｆｉ１部位、および転写終了の ためのＳ’ｌ’４０ポリアゾニレ−／ヨン配列を含む、ｐＲＫ、ＣＸＲＨＮから の完全な発現単位を含有する該制限断片をプラスミドｐ２２０．２の唯一のＸｂ ａｌ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入した。

プラスミドｐ２２０．２は、ウィリアム・サグデン（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｓｕｇｄ ｅｎ）博士（マツカードル・ラボラトリ−・フォア・キャンサー・リサーチ（Ｍ ｃＣａｒｄｌｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ）　、ライスコンノン大学、マジソン、ライスコンノン、米国）から入手した 。ｐ２２０．２は、ｐ２０１　（イエーツ（ＹａｔｅＳ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３ １３：８１２〜８１５　（１９８５））の単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）チミ ンンキナーゼ（ｔｋ）ターミネータ−配列内の唯一のＮａｒ１部位にｐＵＣＩ２ からのマルチプルクローニング領域（ＢａｍＨ４，Ｘｂａ　Ｉ。

５ａＩＩ、およびＨｊｎｄｌ［Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有）を挿入す ることによって構築したプラスミドｐ２０１の誘導体である。

ｐ２２０．２はＮａｒｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有しているはずである が、制限分析およびＤＮＡ配列分析の両分析により、この実施例に用いたクロー ニングした特定のｐ２２０．２は該部位を含有していないことが決定された。

それゆえ、上記１１１’０塩基対５ｐｅｌ−Ｈ４ｎＰ１制限断片をＸｂａｌ消化 したｐ２２０．２に、線状化したｐ２２０．２プラスミドの一方のＸｂａｌ末端 に対する該制限断片のＳｐｅ　Ｔ末端の適法ライゲーション、および該プラスミ ドの他方のＸｂａＩ末端に対する該制限断片のＨ４ｎＰＩ末端の強制ライゲーシ ョンにより結合させた。得られたプラスミド（ｐＨＥＢＯ２と称する）は、ＣＭ Ｖプロモーター、エプスタイン−バーウィルスのＥＢＮＡＩ遺伝子およびｏｒｉ Ｐ領域、およびハイグロマイノン耐性遺伝子、および大腸菌中での複製および選 択のためのｐＭＬ配列を含有する。

最後に、λ−ＤＡＳＨＩ＋ベクター（ストラタジーン（Ｓ　ｔｒａｔａｇｅｎｅ ）　、ラジョラ、カリフォルニア、米国）のＢａｍ８１部位にＢａｍＨＩで線状 化したｐＨＥＢ０２　ＤＮＡを挿入することによりλ−ＨＥＢＯベクターを構築 した。

２、ｃＤＮ、Ａライブラリーの調製 天熱に存在するＧＰＡが希少であるため、ＧＰＡをコードする核酸を単離するた めの重要な第一工程は、他の組織源に比べてどの組織源が相対的に多量のＧＰＡ タンパク質を含有しているかを決定することであった。ＧＰＡに富む組織源はま たＧＰＡをコードする核酸にも富むであろうことが期待された。

１５〜１７日目のニ日月リ胚の眼が他のニワトリ胚組織に比べて比較的多量のＧ Ｐ、Ａを含有するという知見に基づき、１５日口のニワトリ胚がらの眼をｃＤＮ Ａライブラリーを調製するための採取源として用いた。

伝令ＲＮＡを得るため、胚１５日月（Ｅ　１５）のニワトリ胚からの眼を切開し 、硝子液を除去し、ついでさらに処理する前に眼を一７０℃で貯蔵した。本質的 にカタラ（Ｃａｔｈａｌａ）らの記載（ＤＮＡ　２　＋　３２９〜３３５　（１ ９８３））に従い、３ｇの眼組織（約３０個の眼）から全ＲＮＡを調製した。全 ＲＮＡの収量は約２．８ｍｇであった。ホルムアルデヒド−アガロースゲル上の 全ＲＮＡのアリコートの電気泳動により全ＲＮＡのサイズ分布を分析した。サン プルツクら、モレキュラークローニング　ラボラトリ−マニュアル、第２版、７ ．４３〜７４５頁（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、１９８９ ）。

カラムから溶出したポリ（Ａ）”ＲＮＡをカラムに２回通して全部で２サイクル の選択とした他は本質的に記載されたようにして（サンプルツクら、モレキュラ ークローニング：ラボラトリ−マニュアル、第２版、７２６〜７．２９頁（コー ルドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、１９８９））　、オリゴ（ｄＴ） −セルロースカラム上の全ＲＮＡのアフィニティークロマトグラフィーによりポ リ（Ａ）−ＲＮＡ　（伝令ＲＮＡ）を単離した。全ＲＮＡの約５％がポリ（Ａ） 　”ＲＮＡとして回収された。

オリゴ−ｄＴプライマーおよびＲＮａｓ＝Ｈ活性を欠く逆転写酵素（ベセスダ・ リサーチ・ラボラトリーズ、ガイセルスパーク、メリーランド）を用いたポリ（ Ａ）−ＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡを調製した。第一および第二鎖の合成のた めの反応条件は、製造業者によって特定されたものを用いた。

得られた二本ＭｃＤＮ、Ａを、配列 ５’　ＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣ３’　ｌ５ＥＱ１ＯＮ０９ １３’ＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＧＳ’　ｌ５Ｅ０１Ｏ ＮＯ：＋ＯＩ。

を有するモル過剰の５゛リン酸化５ｆｉｌ制隈エンドヌクレアーゼアダプターに ライゲートした。粘着５ｆｉｌ末端を有するｃＤＮＡをポリアクリルアミドケル 電気泳動により分画し、長さが６００塩基対以上のｃＤＮＡをゲルがら溶出し、 ５ｆｉｌ″ｒ−消化したλ−ＨＥ　Ｂ　Ｏベクターにライケートした。

３、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング復製連鎖反応（ＰＣＲ）核酸増幅法 を用いてＧＰＡ　ｃＤＮＡを同定および単離しようと繰り返し試みたが、成功し なかった。

その代わり、ＧＰＡ　ｃＤＮＡを同定および単離するため、複数のオリゴヌクレ オチドプローブを用いた低厳格ハイブリダイゼーシジンによりＣＥ１５ライブラ リーをスクリーニングする必要があった。これらオリゴヌクレオチドプローブは 、精製ＧＰＡタンパク質の３つの異なるペプチド断片のマイクロシークエンンン グによって得たＧＰＡの部分アミノ酸配列に基づいて設計した。

ニワトリＥ１５ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして用い るため、下記配列： を有する３つのオリゴヌクレオチド（ｏ−ＧＰＡ−１、ｏ−ＧＰＡ−２、および ｏ−ＧＰＡ−３と称する）をγ−”Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼを用いて５゛末端を放射標識した。

ライブラリーのスクリーニングは、本質的にワール（Ｗａｈｌ）らの記載（Ｍｅ ｔｈ。

Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、よ５２：４１５〜４２３　（１９８７））に従ってフィルタ ーハイプリダイゼ＝／ヨンによって行った。λフアージプラークがら得たＤＮＡ を含有する３つのフィルターを、２０％ホルムアルデヒド、６ｘＳＳＣ（１ｘＳ ＳＣは０゜１５Ｍ　ＮａＣ］、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０） 　、５ｘデンハルト溶液（１×デンハルト溶液は０．０２％フィコール、０．０ ２％ウソ血清アルブミン、および０．０２％ポリビニルピロリドン）、０．１％ ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、および５０Ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ 中、４２℃で５時間プレハイブリダイズさせた。ついで、各放射標識プローブ（ ｏ−ＧＰＡ−１、〇−Ｇ　Ｐ　Ａ　−２、ｏ−ＧＰＡ−３）をこれらフィルター に別々にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションはプレハイブリダイゼ ーションに使用したのと同じ緩衝液中で行った。ハイブリダイゼーション後、フ ィルターをｌＸ５ＳＣ中、４２℃にて洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた 。

スクリーニングしたニワトリＥ１５ｃＤＮＡライブラリーからの約２Ｘ１０’λ −ファー／クローンのうち、６つのクローンが上記３つのプローブのうちの少な くとも一つとハイブリダイズすることが同定された。これら６つのクローンを再 スクリーニングしたところ、一つだけが３つのすべてのプローブとハイブリダイ ズした（λＣＥ１５：１９と称する）。

４、ＧＰへ　ｃＤＮＡのヌクレオチド／−クエン／ングλＣＥ１５’１９クロー ン中のｃＤＮへ挿入物のヌクレオチドノークエンンングを、サンカーらのチエイ ンターミ不−／ヨ＞ｉＡ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ７２：３９１８〜３９２１　（１９７９））に幾つかの修飾を加えて 行った。

詳しくは、最初に認められたＤＮＡンークエンンング断片の電気泳動移動度にお ける種々の異常さを、ンークエンンング反応における一重鎖結合タンパク質ｇｐ ３２（／ユワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、よ８：１０７９（１９９０））、およびヌクレオチド類似体７−ジアザ−ｄＧ ＴＰ　（ミズサヮ（Ｍｉｚｕｓａｖａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ工４　：１３１９〜１３２４　（１９８６））、および７−ジアザ−ｄＡＴＰ （イユリゼン（Ｊ　ｅｎｓｅｎ）ら、Ｊ　、　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｓ　ｅｑｕｅｎｃｉ ｎｇａｎｄ　ｈｉａｐｐｉｎｇ　１　：　２３３−２３９　（１９９１）　）の 使用により克服した。

５、ｐＨＥＢＯ２−ＧＰ、Ａの構築 λＣＥＩ５：１９ＤＮＡを制限エンドヌクレアー七Ｎｏｔ＋で消化し、ＧＰＡの 全ヌクレオチドコード配列とその両側のｐＨＥＢＯ２プラスミドのヌクレオチド 配列からなる制限断片を生成した。この断片をＴ４ＤＮＡリガーセでライゲート することにより環化し、プラスミドｐ　ＨＥ　Ｂ　Ｏ２−Ｇ　Ｐ　Ａを得た。

６、大８！菌におけるＧＰＡＤＮＡのクローニングおよび発現ｐ　ＨＥ　Ｂ　Ｏ ２−Ｇ　Ｐ　、Ａ、を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌで完全消化および制限エ ンドヌクレアー七Ｅｓｐｌて部分消化することにより、該プラスミドＤＮＡから Ｇ　Ｐ　Ａの全ヌクレオチドフード配列を切り出した。このＧＰＡの全コード配 列を含有するＮｃｏｌ−Ｅｓｐｌ　ＤＮＡ断片を、該断片のＮｃｏ＋粘着末端に 配列： を有するＸｂａｌ−Ｎｃｏｌアダプター（該Ｘｂａｌ−Ｎｃｏｌアダプターはリ ポソーム結合部位（ツヤイン−ダルガノ配列）を含有する）をライゲートし、該 断片のＥｓｐｌ粘着末端に配列。

を有するＥｓｐｌ−Ｂｇｌｌｌアダプターをライゲートすることにより修飾して 、ＧＰＡをコードするＸｂａ　Ｉ−Ｂｇ］　Ｉ　Ｉ　ＤＮＡ断片を得た。

つぎに、ｔｒｐプロモーター−オペレーターの制御下にヒト成長ホルモン遺伝子 を含有するプラスミドｐＨＧＨ２０７−１（米国特許第４．５５１．４３３号に 記載）を制御エンドヌクレアーゼＸｂａｌおよびＢｇｌｌｌで消化してヒト成長 ホルモン遺伝子を放出させた。ｐＨＧＨ２０？−１中のＸｂａ１部位は、ｔｒｐ プロモーター−オペレーターのすぐ下流である。ついで、上記ＧＰＡをコードす るＸｂａｌ−Ｂｇｌｌｌ　ＤＮＡ断片をｐＨＧＨ２０７−１の残りの制限ＤＮＡ 断片にライゲー／ヨンにより結合させ、ヒト成長ホルモン遺伝子をＧＰＡヌクレ オチドコード配列で有効に置換した。

それゆえ、得られたプラスミド（ｐｔｒｐ−ＧＰＡと称する）は、ｐＨＧＨ２０ ７−１のｔｒｐプロモーターおよび上記Ｘｂａｌ−Ｎｃｏｌアダプターによって 提供されたリポソーム結合部位の下流に、およびその制御下に発現するため正確 な方向にて、全ＧＰＡヌクレオチドコード配列を含有する。

大脹菌ＤＨＩＯＢ細胞（ＢＲＬ／ギブコ、ガイセルスパーク、メリーランド、２ ０８７７米国）をチャンク（Ｃｈｕｎｇ）らの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６：２１７２〜２１７５　（１９８９））に従 ってｐｔｒｐ−ＧＰＡで形質転換した。形質転換した大腸菌中でのクローニング ＧＰＡＤＮＡの発現は、全細胞タノバク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動に より確認された。形質転換した大腸菌ではＧＰＡに期待されるサイズ（約２１． ５００ダルトン）のタンパク質が含まれていたが、形質転換していない大腸菌に は含まれていなかった。

７、）４ＥＢＯ３０の構築 上記のように、プラスミドｐＨＥＢＯ２はエプスタイン−バーウィルスのＥＢＮ ＡＩ遺伝子およびｏｒｉＰ領域を含有している。これら２つのウィルス要素を含 有するプラスミドは宿主細胞の液中で自律的に複製することができる。ＥＢＮＡ １遺伝子の機能はＥＢＮＡＩを構成的に発現する細胞によって提供されるので、 ＥＢＮＡＩ遺伝子のほとんどの範囲を包含する１８４０塩基対ＥｃｏＮＩ−３ｇ ｒＡＩ制限断片をプラスミドｐＨＥＢＯ２から除去する二とにより該プラスミド のサイズを小さくすることが可能である。詳しくは、ｐＨＥＢ○２ＯＮＡを制限 エンドヌクレアーゼＥｃｏＮＩおよびＳｇｒ、ＡＩで消化し、得られた大きい方 の制限断片の粘着末端を４つのすべてのデオキ／リボヌクレオチドの存在下でフ レノウＤＮＡポリメラーゼ■で充填した。ついで、得られた平滑末端断片をＴ４ ＤＮ、Ａリガーゼを用いてライゲーシヨンすることにより環化してプラスミドｐ ＨＥＢ○２０を得た。

ｃＤＮＡをｐＨＥＢＯ２０中に有効にクローニングできることを確立するため、 マウス心房ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ断片を配列５’　ＴＧＧＣＣＡＧＣＴ ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣ３’　ｌ５ＥＯＩＤ　ＮＯ：１８１３’ＡＣＣＡＣＣ ＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＧ５’　ｌ５ＥＱＩＤＮＯ：１９１゜を有 する５ｆｉｌアダプターに結合させ、得られた５ｆｉＩ粘着末端を含有するｃＤ ＮＡを５ｆｉｌで線状化したｐＨＥＢＯ２０ＤＮＡにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い たライゲーシヨンにより結合させた。得られたクローンのうち一つでｐＨＥＢＯ ２０の５ｆｉＩ部位に任意の３５０塩基対ｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ挿入物を有するもの をｐ）（ＥＢＯ３０と称する。

８、ｐｃＥＮｌの構築 ｐｃＥＮｌの構築のための出発プラスミドはｐＲＫ、ＣＸＲＨｈ、ｐＨＥＢ。

２、ｐＫＡＮ２およびｐＳＷ２．ＲＸＲであるｅｐＲＫ、ｃＸＲＨＮおよびｐＨ ＥＢ○２は上記に記載しである。ｐＫＡＮ２はイエーツらのＰ　ｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＴＪｓ、Ａ８１　：　３８０６−３８１０　（１９ ８４）に記載されてあり、ライ１ノアム・サグデン博士（マツカードル・ラボラ トリ−・フォア・キャ／サー・１ノサーチ、ライスコンノン大学、マンソン、ウ イスコンンン米国）から入手しｔ二。ｐＳＷ２．ＲＸＲは、大腸菌中でのプラス ミドの復製および選択に必須でなＬｌｐＲＫ。

ＣＸＲＨＮのｐＵｃ１１８由来配列内の３つの小さな領域を欠失させること１こ より、およびＰＣＲ突然変異誘発法（ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）　、ＰＣＲプロ トコール、１７７〜１８３頁（アカデミツクプレス、１９９０））を用し１てｐ ＲＫ、ＣＸＲＨＮのＭ１３遺伝子間領域の上流にＥｃｏＲ１部位を導入すること １＝より、ｐＲＫ、ＣＸＲＨＮから得た。

ｐＲＫ、ＣＸＲＨＮ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで消化し、得ら れたＸｈｏｌ粘着末端を４つのすべてのデオキ／リボヌクレオチドの存在下でフ レノウＤＮＡポリメラーゼを用いて充填した。ついで、この平滑末端ＤＮＡをＩ ＩＩ限エンドヌクレアーゼＳｐｅ　＋で消化し、ｐＲＫ、ＣＸＲＨＮのＣＭＶプ ロモーターを含有する９００塩基対５ｐｅｌ−Ｘｈｏｌ’制限断片を単離しｔ二 。

ｐＨＥＢＯ２ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｆ　Ｉで消化し、得られた Ｈｉｎｆｌ粘着末端を４つのすべてのデオキシリボヌクレオチドの存在下でフレ ノウＤＮＡポリメラーゼを用いて充填した。ついで、この平滑末端ＤＮＡをＩＩ 限エンドヌクレアーゼＭ　ｒ　ｏ　Ｉで消化し、ＥＢＮＡＩ遺伝子のＮ末端コー ド配７１１を含有する２１５塩基対Ｈｉｎｆｌ’−Ｍｒｏ＋制限断片を単離した 。

ライフ、上記９００塩基対５ｐｅｌ−Ｘｈｏｌ’ｌｌｌｌ６断片（ｐＲＫ、ＣＸ ＲＨＮから）および２１５塩基対旧ｎｆｌ’−Ｍｒｏ！制限断片（ｐＨＥＢ０２ 力１ら）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーシヨンにより結合させて１１１ ５塩基対のＳｐｅｌ−Ｍｒｏｌ　ＤＮＡ断片を得た。

上記１１１５塩基対Ｓｐｅｌ−Ｍｒｏｌ　ＤＮＡ断片を、（１）ＥＢＮＡＩ遺伝 子の残りの部分（すなわち、上記２１５塩基対Ｈｉ　ｎ　ｆ　ｌ’−Ｍｒ　ｏ　 Ｌ制限断片中には存在しないＥＢＮＡＩ遺伝子の部分）およびｏｒｉＰを含有す るｐＨＥＢＯ２からの４２９０塩基対Ｍｒｏｌ−ＢａｍＨＩ制限断片、（２）Ｇ ４１８耐性遺伝子を含有するｐＫａｎ２からの１６００塩基対ＢａｍＨＩ−Ｅｃ ｏＲＩ制限断片、および（３）大腸菌中での複製および選択に必要な要素を含有 するｐＳＷ、　ＲＸ　Ｒからの２９００塩基対ＥｃｏＲＩ−３ｐｅ　Ｉ制限断片 と混合し、これら４つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーシヨ ンによりし１つしよに結合させてプラスミドｐＣ，ＥＢＮＡを得た。

ｏｒ　ｉＰを欠失させるため、ｐＣ，ＥＢＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡｃｅ ｌおよびＢａｍＨＩで消化した。得られた粘着末端を４つのすべてのデオキシ１ ノボヌクレオチドの存在下でフレノウＤＮＡポリメラーゼで充填し、つ【１で大 きし）方の制限断片を単離し、Ｔ　４　ｃ＋ＮＡリカーゼを用いたライゲーシヨ ンによりｉ（ヒしてプラスミドｐ、ｃＥＮ１を得た。

９、細胞株ＣＥＮ４の調製 細胞株ＣＥＮ４はヒト胚腎臓細胞株２９３の誘導体であり、２９３細胞のゲノム 中にプラスミドｐｃＥＮ１を安定に組み込むことにより調製しｔこ。

ｐｃＥＮＩ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ｃａｌ　（ｐｃＥＮｌ中の唯一 のＳｃａ　１部位はアンビシ１ル耐性遺伝子内に存在する）で消化すること１＝ より線状化した。ついで、線状化したプラスミドＤＮＡを２９３細胞中１ニエレ クトロポレーシヨンによりトランスフェクションした。ボッター（ｐｏｔｔｅｒ ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ旦１ニア１６１−７１６５　（ １９８４）、ｐｃＥＮＩＤ　Ｎ　Ａを線状化することにより、該プラスミドＤＮ Ａの細胞染色体ＤＮＡ中への安定な組み込みの頻度が増大する。

ｐｃＥＮＩ　ＤＮＡが組み込まれたトランスフェクション細胞を同定するため、 細胞をネオマイノン存在下で増殖させ、６つのネオマイノン耐性クローンを選択 してさらに研究した。詳しくは、６つのクローンのそれぞれの細胞１’−ｐＨＥ Ｂ。

２０をエレクトロボレー／コンによりトランスフェクションし、各場合１：つ（ Ａて、得られたハイグロマイノン耐性コロニーの数をカクントすること１＝よＩ ））ランスフエク／ヨンの効率を決定した。ｐＨＥＢＯ２０はＥＢＮ、Ａ１遺伝 子を欠り蚤３するがｏｒｉＰからの？Ｉ製にはＥ　Ｂ　Ｎ　Ａ　１遺伝子産物が 必要であるので、有効なトランスフェクションは、組み込まれたｐｃＥＮＩ　Ｄ ＮＡによって細ＩＩ包内（＝存在するＥＢＮ、へ１遺伝子を発現することのでき る宿主細胞（二依存する。上も己６つのクローンのうち一つが、ｐＨＥＢＯ２０ ＤＮＡで最も有効にトランスフェクションされていることがわかった。該クロー ンの細胞をＣＥＮ４細胞と称する。

１０、哺乳動物細胞中でのＧＰＡ　ＤＮＡのクローニングおよび発現ｐＨＥＢＯ ２−ＧＰＡを制限エンドヌクレアーゼ５ｓｔＩで消化すること１：より、該プラ スミドＤＮＡからＧＰＡの全ヌクレオチドコード配列を切り出した。

ついで、このＧＰＡ　ＤＮＡを５ｓｔｌで線状化したプラスミドｐＬｉｃ２１９ ｔ＝ライゲートしてプラスミドｐＵｃ２１９−ＧＰＡを得た。

ついで、ｐＵｃ２１９−ＣＰ、Ａを制限エンドヌクレアーゼＥａｇｌおよびＥｃ ｏＮＩで消化した。得られたＧＰＡの全ヌクレオチドコード配列を有するＤＮＡ 断片の粘着末端をフレノウＤＮＡポリメラーゼおよび４つのすべてのデオキシヌ クレオシド３リン酸を用いて充填し、ついで該ＤＮＡ断片に５ｆｉＩ粘着末端を 有するアダプターをライゲーシヨンにより結合させた。つも）で、この５ｆｉＩ 粘着末端を有する断片を５ｆｉＩで線状化したｐＨＥＢＯ３０にライゲートしｔ 二。

それゆえ、得られたプラスミド（ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡと称する）１マ、該プ ラスミドのＣＭｖプロモーターの下流に、および該プロモーターからの翻訳のた め正確な方向にて、全ＧＰＡヌクレオチドコード配列を含有する。ＣＥＮ４細胞 をｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡでエレクトロポレーションによりトランスフェクショ ンした。ボッターら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ 　Ａ　８１７１６１〜７１６５（１，９８４）。トランスフェクションした細胞 を高グルコースＤＭＥＭ、１０％ウン胎仔血渭、２００μｇ　／　ｍ　ｌ　ｔ　 ％イグロマイシン、８００μｇ／ｍｌネオマイシン中で培養した。発現されたＧ ＰＡの生物学的活性のアツセイのｔ二め、トランスフェクションした細胞を血清 不含培地に移し、ついで血清不含ｆ＝らし培地を成長促進活性についてアッセイ した。

１１　組換えＧＰＡの生物学的活性 ２５ｍＭカリウム、１０％熱不活化ウマ血清、５０単位／ｍｌベニノ１ノン、お よび５ｍｇ／ｍｌストレプトマイ／ンを添加しｔこイーグルの最小必須培地（λ １ＥＮ１、ジブコ）中、ウニ九当たり一つの毛様体神経節の密度にて２４ウ工ル 組織培養プレート中で培養させた毛様体神経節ニューロンＩ：、ｐＨＥＢＯ３０ −ＧＰＡでトランスフェクション／したＣＥＮ４細胞の培養液から調製したなら し培地および細胞抽出物を加えた。ｐＨＥＢＯ３０またはｐＨＥＢ○３Ｏ−ｔＰ Ａ（ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターのコード配列を含有するｐ＋−！ ＥＢＯ３０）のいずれかでトランスフェクションしたＣＥＮ４細胞の培養液から のならし培地および細胞抽出物をコントロールとして用いた。

毛様体神経節ニューロンを全部で９日間培養し、斬ｔ；に解凍したならし培地の 試料または細胞抽出物を含有する培地を３日目ごとに与えた。組織培養プレート の各ウェル中のニューロンを界面活性剤で抽出して放出されるラクトースデヒド ロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量を測定することにより、９日後に存在するニューロン 細胞質の量を定量した。それゆえ、ＬＤＨレベルは、生存するニューロンの数並 びにニューロ／突起成長の量および体細胞容量の増大の指標である。

詳しくは、二ニーロン培！！！液を平衡塩溶液で１回洗浄し、ついで１００μＩ のホモジネート緩衝液（０，０５Ｍ　）リス、ｐＨ７，２，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ０．５％トリトンＸ−１００、および２ｍｇ／ｍｌウン血清アルブミン）で抽出 した。界面活性剤抽出物の２つずつの２０〜２５μｍアリコートにおけるＬＤＨ 活性の測定は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびテトラ ゾリウム染料の存在下での乳酸のピルビン酸への変換を測定する分光測光アッセ イを用いて行った。反応速度の測定は、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）カイネティックマイクロプレートリーダー上で行った。

下記表１および■において、１単位の活性とは二ニーロン培養中のＬＤＨの最大 レベルの半分を与える試料の量をいう。Ｎ／Ｄは、バックグラウンドレベルを越 える活性を検出できないことを示す。

表■ ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ（１０μｇＤＮＡ）　３３３ｐＨＥＢＯ３０−ｃｐＡ（ １０μｇ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）　２３３ｐＨＥＢＯ３０ＧＰＡ　（１μｇＤＮＡ）　 １３３４ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（２μｇＤＮＡ）　１２５０ｐＨＥＢＯ３０ −ＧＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　３４４８ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（２０μｇ ＤＮＡ）　５２０７ｐＨＥＢＯ３０（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０ （１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ｔＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ ／ＤｐＨＥＢＯ３０−【ＰＡ　（１０８ｇＤＮＡ）　Ｎ／Ｄ表■ トランスフェクションしたＣＥＮ４細胞からの細胞抽出物のアツセイトランスフ エク／！！ンしたもの　ｋ単位／ｍ１ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（１０μｇＤＮ Ａ）　２６３１ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　２５３８ｐＨＥ ＢＯ３０−ＧＰＡ　（１８ｇＤＮＡ）　２００００ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（ ２μｇＤＮＡ）　２０４０８ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　２ ８０００ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（２０μｇＤＮＡ）　２５０００ｐＨＥＢＯ ３０（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／Ｄｐ ＨＥＢ○３Ｑ−１ＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ｔＰＡ　 （１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡでトランスフェクションし たＣＥＮ４細胞の培養液からのならし培地中のＧＰＡ活性の存在が細胞溶解によ るものかどうかを決定するため、ならし培地の４０〜５０μｍ試料をＬＤＨ活性 について直接ア・ソセイした。

下記表■において、ＬＤＨ活性はＬＤＩ−１分光測光アツセイにおける反応速度 （］９分たりの光学密度（ＯＤ）の変化）にて示しである。Ｎ／Ｄは、ノ（・ツ クグラウンドレベルを越える活性を検出できなかったことを示す。

表■ トランスフェクションしたＣＥＮ４細胞からのならし培地におけるＬＤＨ活性の ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ 　（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（１μｇ　Ｄ　ＮＡ　 ）　Ｎ　／　ＤｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（２μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢ○ ３Ｏ−ＧＰＡ（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡ　（２０μｇ ＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢ○３０（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０（ １０μｇＤＮＡ）　Ｎ／ＤｐＨＥＢＯ３０−ｔＰＡ　（１０μｇＤＮＡ）　０． ０３２ｐＨＥＢＯ３０−ｔＰ、Ａ　（１０μｇＤＮＡ）　Ｎ／Ｄならし培地の試 料中に検出可能なＬＤＨ活性が存在しないことは、ならし培地中のＧＰＡが組換 えＣＥＮ４細胞からのＧＰＡの分泌の結果によるものであり、細ｌｔｉ！溶解に よるものではないことを示している。

１２、ＣＥＮ４細胞からのＧＰＡの分泌ｐＨＥＢ○３Ｏ−ＧＰＡかまたはｐＨＥ Ｂ○３Ｏ−ＣＮＴＦ　（ラット毛様体神経栄養因子のコード配列を含有するｐＨ ＥＢＯ３０）のいずれかでトランスフェクションしたＣＥＮ４細胞から調製した ならし培地および細胞抽出物を、上記毛様体神経節ニューロン峻長を促進する能 力についてアッセイした。これらアッセイの結果を図３．へおよび３Ｂｌ二示す 。ｐＨＥＢＯ３０−ＧＰＡてトランスフエタン３ンしたＣＥＮ４細胞からのなら し培地および細胞抽出物の成長促進活性は囚３Ａに示す。ｐＨＥＢＯ３０−ＣＮ ＴＦてトラ／スフエクノヨンしたＣＥＮ４ｍ胞からのならし培地および細胞抽出 物の成長促進活性は図３Ｂに示す。これら図のそれぞれにおいて、種々の試料希 釈を横軸に示し、二ニーロン培養液から抽出したＬＤＨ活性の相対レベルを縦軸 に示す。各Ａは、毛様体神経節ニューロンの２つの培養液から得たアッセイ結果 の平均である。

ｐＨＥＢ○３Ｏ−ＧＰＡでトランスフェクションしたＣＥＮ４細胞からのならし 培地には有意の量のニューロン成長促進活性が含まれていたが、ｐＨＥＢＯ３０ −ＣＮＴＦでトランスフェクションしたＣＥＮ４細胞からのならし培地には、ト ランスフェクションしなかったＣＥＮ４細胞のならし培地で認められたものより も多かったが、そのような活性は含まれていなかった。しかしながら、ｐＨＥＢ Ｏ３０−ＣＮＴＦでトランスフェクションしたＣＥＮ４細抱から調製した抽出物 は有意のニューロン成長促進活性を有し、これら細胞においてｐＨＥＢＯ３０− ＣＮＴＦ　ＤＮＡが発現されたことを示していｔ二。これら結果は、ＣＥＮ４細 胞中に発現された組換えＧＰＡは細胞から培地中に分泌されるが、同じタイプの 細胞中で発現された組換えＣＮＴＦは分泌されないことを示している。

配列表 配列番号・１ 配列の長さ：１４６９塩基 配列の型・核酸 鏑の数：１本鎖 トボロノー、直鎖状 配列： ＧＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴ ｒＡＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣＣＣ７３０ＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴ ＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴｒＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧ７８０ＧＧ ＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣｎＣＴＧＣＴｒＣＣＴＡＡＴＧ ＧＧＣＣＣＡＣＴｒＣＣ８３０ＣＴＧＣＧＡＴＧＧＡ　ＡＡＣ丁ＧＡＧＧＣＡ　 ＣＧＧＧＧＡＧＧＧＡ　ＡＣＴＣＣＣＧＧＴＧ　ＡＧＧＴＧＧＧＣＣＴ８８０丁 ＧＣ丁ＧＴＧＣＡＧ　ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧ　ＴＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＧＧＧＴ ＴＧＣＴＧ　ＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴ　９８０ＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣ ＴｒＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧ　ＧＧＧＣＡｎＧＣＡ　１ ０３０ＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴ　ＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＣｍＧ　ＣＣＴ ＣＣＴＣＣＡＧ　ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＴ　Ｉ　＋　３０ＧＡＡｍＣＴＧＣＴＣＴ ＧＡＣＣＧＣＴ　ＴＧＧＧＧＣＣｍ　ＣＴＣＡＧＧＡＧ’ＧＧ　ＧＧＧＧＴＧＧ ＡＴＴ　１２３０ｎＧＡＧＣＴＧＧＡ　ＴＧＧＣＡｍＣＴ　ＴＡＧＣＴＧＧＴＣ Ｇ　ＧＡＣＧＧＧＡＴＡＴ　ＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡ　１２８０ｍＡＴＡＴＡＧＡ 　ＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴ　ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴ　ＣＴＧＣＣＡＧＧＧＴ　Ｃｍ ＧＴＧＣＣＴ　＋　３３０ＡＡＡＧＣＡＴＣＴＧ　ＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡ　ＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　１４６９配列番号：２ 配列の長さ・１９５アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー：ｉｌｉ鎖状 配列・ 配列番号、３ 配ダ１１の長さ・１９９アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列 ＭｅｔＡｌｅＰｈｏＭ＠＋ＧｌｕＷｓＳｅｒＡＩＩＬ＊ｕＴｈｒＰｒｏＨｉｓＡ ｒｇＡｒｇＧｌｕ＋　ｓ　ｔｏ　ｔｓ Ａｓｎ　Ｌ＠ＬＩ　Ｇｌｎ　Ａ−丁ｙｒＡｒｇＴｈｒ　Ｐｈ＠Ｈｉｓ　ＩＩｓ　 Ｍｅｔ　Ｌｓｕ　Ａｌｓ　Ａｒｇ　Ｌ＠Ｌ＋特表千７−５０１９３４　（１７） 配列番号：４ 配列の長さ、２００アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直鎖状 配列・ Ｍａｙ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ａｌｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｔｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐｌ　５　１０　１５ Ｌ＊ｕ　Ｃｙｓ　Ｓｓ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　ｌｌｅ　Ｔｒ（ｓ　Ｌｅｕ　Ａｌｍ　 Ａｕｇ　Ｌｙｉ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＬ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ａｌｓ　Ｌ ｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓｇｒ　Ｔｙｒ　Ｖｓｌ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　Ａ＊ｎＬｙｓＡｇｎＩｔ＠ＡｓｎＬｓｕＡｇｏＳｉｒＶ口ＩＡｓ ｐＧｌｙＶ＊１ＰｒｏＶａｔＡｌｅＳｉｒＳｏ　５５　６０ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｏ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 ＡｌａＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｌ＠ＬＩ　Ｇ１１ｌ　ＧｌｕＡｓｎＬ＠１７０１１１Ａ ｌｅＴｙｒＡｒｇＴｈｒＰｈ＠ＧｌｎＧｌｙＭｅｔＬ＊ｕＴｈｅＬｙｓＬｓｕし ｅｕＧｌｕＡｓｐＧｌｎＡｒｇＶｓ＋ＨＩｓＰＭＴｈｒＰｒｏＴｈｒＧｌｕＧｌ ｙＡｇｏＰｈ・Ｈｉｓ　ＧＩｒ＋　Ａｉｍ　ＩＩ！　Ｈａｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 Ｍｅｔ　Ｌ會ｕ　Ｇｌｎ　Ｖｓｌ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｐｈ＊　Ａ１ｍ１１０　Ｕ Ｓ　＋２０ Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ｌｔｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　ＩＩ＠Ｐｒ。

＋２５　１３０　１３５ ＧｌｕＡｓｎＧｌｕＡｌｅＡｓｐＧｌｙＭｓｔＰｅａＡｌａＴｈｒＶａｔＧｌｙ ＾５ｐＧｌｙＧｌｙ＋４０　１４５　１５０ Ｌ＊ｕ　Ｐｈ＠Ｇｌｕ　Ｌｙｍ　Ｌｙｉ　Ｌｅｕ　Ｔｒｏ　Ｇｌｖ　Ｌｅｕ　Ｌ ｖｓ　Ｖｓｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ１５５　＋６０　１６５ Ｓ＠ｒ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＩＩｓ　Ｈｉｓ　 Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＩＩ＠　５ａｒＳａｒ　＋４ｉｔ　Ｏｌｎ　 Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　ＩＩ＠　Ｓｅｒ　Ｊｌ、Ｉａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｈｉ ｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａ１ｍ１１３５　１９０　＋９５ 記列番号・５ 配列の長さ　２００アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー二直鎮状 配列 Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｔｈ＋　Ｇｌｕ　ｌ−１ｉｓ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐｌ　５　ＴＯＩ５ 配列番号　６ 配列の長さ：　８５７５塩基 配列の型・核酸 鏑の数：１本鎖 トポロジー二直鎮状 配列； ＣｎＡＡＡＴＴＣＡ　ＣＣ丁ＡＡＧＡＡＴＧ　ＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡ　ＧＣＡＧ ＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣ８（Ｘ）ＧＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＣＣＣ ＴＴＧＧ　ＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧ　ＣＡＴＡＴＧＣＡＡＡ　ＧＧＡＴＡＧＣＡＣ Ｔ　８５０ＴＴＧＴＣｍＧＴＴＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧ ＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＴｒｒｒＣＧＧ　１８５０ＴＡＡＡＧＧＣＡＡＴＧｎＧＴ ＧｎＧＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡ２８ ００ＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧｍＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡ ＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣ３７００ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＧＴ ＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＧＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧ　ＣＧＧＴＣＣＡＴＧＣ４６５ ０σロ’ＣＧＧＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＡ ＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧ　５５５０ＡＣＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧ ＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧｍＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧ５６００ ＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＧＧＡＡＴＣＴｒＧＣＡ ＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧ６４５０ＣＣＴｒＣＧＴＣＡＣＴＧＧＴＣＣＣＧ ＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴ　ＴＣＧＧＣＧＡＧＡＡ　ＧＣＡＧＧＣＣＡＴｒ　６ ５００ＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡ　ＧＡＴＣＣｍＧＡ　ＴＣＴｍＣＴＡＣＧＧＧＧＴ ＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡ　７３５０ＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡ ＡＧＧＧ　ＡＴＴＴｒＧＧＴＣＡ　ＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣ ７４００ＴｒＣＧＡＴＧＴＡＡ　ＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧ　ＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧ 　ＡＴＣＴｒＣＡＧＣＡ　ＴＣＴｒＴＴＡＣＴｒ　８２５０ＴＣＡＣＣＡＧＣＧ ＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧ ＣＡＡＡＡ８３００ＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡ ＧＡＡＡＣＣＡＴｒＡＴｒＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴｒ８５００ＡＡＣＣ了ＡＴＡＡ Ａ　ＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡ　ＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣｍＣＧＴＣＴｒ　ＣＡＡＧ ＡＡＴＴＣＴ　８５５０ＣＡＴＧｍＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡ１１ ５７５配列番号　７ 配列の長さ、２７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー・直鎖状 配列： ＣＧＡＴｒＧＧＣＣＴ　ＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡ　ＡＧＣＴＴＧＣ２７配列番号・ ８ 配列の長さ・２９塩基 配列の型、核酸 鎮の数：１本鎖 トポロジー　直鎖状 配列 ＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴｒＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴ　２９配列番号 　９ 配列の長さ・２１塩基 配列の型、核酸 鍮の数・１本鎖 トボロ／−直鎖状 配列 ＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧ　Ｃ２１配列番号・１０ 配列の長さ　２４塩基 配列の型　核酸 鎖の数、１本鎖 トポロジー・［鎮状 配列： ＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡ　２４配７１番号　１１ 配列の長さ　３８塩基 配列の型　核酸 鎖の数　１本鎖 トポロジー　直鎖状 配列 ＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧ　ＣＴＧＣＣＴＡＣＣＧ　ＣＧＣＣｎＣＣＧＣＡＣＣＣＴ ＧＴＴ　３Ｂ配列番号　１２ 配列の長さ　３８塩基 配列の型・核酸 稙の数　１本鎖 トポロジー　＠鎮状 配列 ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴｒＣＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＴＧ ＧＡ　３８配列番号＝１３ 配列の長さ：４１塩基 配列の型・核酸 鎖の数　１本鎖 トポロジー二直鎮状 配列・ ＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＣＴ　ＧＴＧＡＧ ＧＴＣＴＧ　Ｔ　ＡＴ配列番号、１４ 配列の長さ　１３塩基 配列の型　核酸 鎖の数、１本鎖 トポロジー　直鎮状 配列： ＣＴＡＧＧＡＧＣＴｒ　ＴｒＧ　１３ 配列番号：１５ 配列の長さ・１３塩基 配列の型　核酸 鎖の数　１本鎖 トポロジー　直鎖状 配列 ＣＡＴＧＣＡＡＡＡＧ　ＣＴＣ１３ 配列番号　１６ 配列の長さ、１５壌基 配列の型：核酸 鎖の数＝１本鎖 トポロジー・＠輪状 配列： ＴＴＡＧＡＡＴＴＣＧ　ＣＧＡＴｒ　１５配列番号・１７ 配列の長さ、１６塩基 配列の型　核酸 鎖の数・１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ＧＡ丁ＣＡＡＴＣＧＣＧＡＡＴＴＣ＋６配列番号、１８ 配列の長さ　２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数・１本鎖 トポロジー。直鎖状 配列・ ＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧ　Ｃ２１配列番号　１９ 配列の長さ　２４塩基 配列の型：核酸 鎖の数＝１本鎖 トポロジー・直鎖状 配列 ＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡ　２４１　１０　１００　 １．０００１０００００　１００００００廊籾 介釈 １゜＋＊ｓ＋＋＋ｅｅｔｌ　Ａ＊、＋。１．い。　ＰＣＴ／ｌｌｓ　９２１０８ ２５１１．、、、、、、、、−、、、、、、Ｎ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０８２ ５Ｂ国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４１００　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ Ｃ１２Ｑ　１／６８　Ａ　９４５３−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｂ　８３１０ −２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　カシアンズ、ジョージアメリカ合衆国カリフォルニア９４１２ １、サンフランシスコ、ナンバー１１、トウニンティーフォース・アベニュー４ ４１番 （７２）発明者　エッケンスタイン、フェリックス・ピーアメリカ合衆国オレゴ ン９７２１９、ポートランド、サウス・ウェスト・ウラドリー・ハイツ・コート １１５３６番 Ｉ （７２）発明者　リュング、デビット・ワイーハングアメリカ合衆国カリフォル ニア９４４０４、フォスター・シティ−、バーバドス・レイン５１５番 （７２）発明者　ニジ、レイ アメリカ合衆国オレゴン９７２１９、ポートランド、サウス・ウェスト・ウラド リー・ハイツ・コート１１５３６番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ＧＰＡをコードする単離核酸分子。
2. ２．ＤＮＡであり、成熟ＧＰＡについての図１に示すヌクレオチド配列からなる 請求項１に記載の核酸分子。
3. ３．成熟ＧＰＡについての図１に示すヌクレオチド配列に機能的に連結したプロ モーターをさらに含む請求項２に記載の核酸分子。
4. ４．形質転換した宿主細胞によって認識される制御配列に機能的に連結した請求 項２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
5. ５．請求項４に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
6. ６．（ｉ）放熟ＧＰＡについての図１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０ ％の配列同一性を有し、および（ｉｉ）毛様体神経節ニューロン、背根神経節ニ ューロンまたは交感ニューロンの成長、生存および／または分化を促進し得るタ ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ。
7. ７．ＧＰＡをコードする核酸分子の使用方法であって、宿主細胞によって認識さ れる制御配列に機能的に連結した該核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形 質転換し、該核酸分子を該宿主細胞中で発現させ、ついで該宿主細胞からＧＰＡ を回収することを特徴とする方法。
8. ８．ＧＰＡを宿主細胞培地から回収する請求項７に記載の方法。
9. ９．神経系の疾患または異常の診断方法であって、（ａ）相補的ヌクレオチド配 列のハイブリダイゼーションが可能な条件下、図１に示すヌクレオチド配列の少 なくとも１０ヌクレオチドを含む標識ＤＮＡに細胞または組織からの核酸を接触 させ、ついで（ｂ）生じたハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする 方法。
10. １０．（ａ）相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーシヨンが可能な条件下 、図１に示すヌクレオチド配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含む標識ＤＮＡ に細胞または組織からの核酸を接触させ、（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡがハイブリ ダイズした核酸を複製連鎖反応で増幅させ、ついで （ｃ）工程（ｂ）の複製連鎖反応により生成した核酸を検出することを特徴とす る方法。
11. １１．（ａ）内生ＧＰＡ遺伝子を含有する細胞を、増幅可能な遺伝子と、該内生 ＧＰＡ遺伝子内または該内生ＧＰＡ遺伝子の近傍にあるＤＮＡ配列と相同な少な くとも約１５０塩基対のブランキング配列とを含む相同ＤＮＡで形質転換して該 相同ＤＮＡを組換えによって該細胞ゲノム中に組み込ませ、（ｂ）該増幅可能な 遺伝子の増幅について選択する条件下で該細胞を培養してＧＰＡをも増幅させ、 ついで （ｃ）該細胞からＧＰＡを回収する ことを特徴とするＧＰＡの製造方法。
12. １２．付随する天然グリコシレーションを伴わないＧＰＡ。
13. １３．ＧＰＡを天然に有する動物種の他のポリペプチドを含まないＧＰＡからな ることを特徴とする組成物。
14. １４．生理学的に許容し得る担体をさらに含む請求項１３に記載の組成物。
15. １５．無菌である請求項１３に記載の組成物。
16. １６．ＧＰＡには結合し得るがＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＣＮＴＦには 結合し得ない抗体。
17. １７．モノクローナル抗体である請求項１６に記載の抗体。
18. １８．請求項１５に記載の組成物を治療学的有効量で投与することを特徴とする 、哺乳動物における神経学的疾患または異常の治療方法。
19. １９．神経学的疾患または異常がアルツハイマー病または筋萎縮性側素硬化症で ある請求項１８に記載の方法。
20. ２０．治療学的有効量のＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３を投与することをさら に含む請求項１８に記載の方法。