KR100713712B1 - 돼지 유행성 설사병 예방용 항원 단백질을 발현하는형질전환 식물체 및 이의 제조방법 - Google Patents

돼지 유행성 설사병 예방용 항원 단백질을 발현하는형질전환 식물체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원단백질을 생산하는 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 식물체에서 발현하는 프로모터 및 고구마 저장뿌리에서 고발현하는 프로모터 등을 이용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에 발현시켜 항원단백질을 생산하는 형질전환 식물체에 관한 것이며, 본 발명의 돼지 유행성 설사병 바이러스의 항원단백질을 생산하는 형질전환 식물체는 돼지의 설사병 예방용 사료 등의 용도로 유용하게 이용되어 돼지 유행성 설사병 바이러스의 감염을 예방할 수 있다.
돼지 유행성 설사병 바이러스, 형질전환 고구마

Description

돼지 유행성 설사병 예방용 항원 단백질을 발현하는 형질전환 식물체 및 이의 제조방법{Transgenic plant to express antigen for preventing porcine epidemic diarrhea and method for producing the same}
도 1의 A는 본 발명에서 개발한 돼지 유행성 설사병 예방 항원단백질을 식물체에서 발현시키기 위한 형질전환 벡터 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300의 모식도를 나타낸 것이고 [35Sp, CaMV 35S promoter; PEDV-sp1, PEDV spike protein 단편을 코딩하는 유전자; NosT, nopaline synthase terminator; LB, left border; RB, right border], 도 1의 B는 본 발명에서 개발한 돼지 유행성 설사병 예방 항원단백질을 식물체에서 발현시키기 위한 형질전환 벡터 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300의 모식도를 나타낸 것이고 [Spop, 고구마 저장뿌리 고발현 sporamin 프로모터; PEDV-sp1, PEDV spike protein 단편을 코딩하는 유전자; NosT, nopaline synthase terminator; LB, left border; RB, right border],
도 2의 A는 본 발명에서 개발한 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입된 형질전환 고구마 식물체가 카나마이신 선발배지에서 배발생 캘러스로부터 식물체로 재분화 되는 사진이고, 도 2의 B는 본 발명에서 개발한 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입된 형질전환 고구마 식물체가 카나마이신 선발배지에 서 배발생 캘러스로부터 식물체로 재분화 되는 사진이고,
도 3의 A는 본 발명에서 개발한 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입된 형질전환 고구마 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 단백질을 코드하는 유전자의 도입을 PCR로 확인한 것을 나타낸 것이고 [M, 사이즈마커이고, 1부터 14는 카나마이신 저항성 고구마 식물체이고, N은 비형질전환 고구마 식물체이고, P는 형질전환 벡터 DNA], 도 3의 B는 본 발명에서 개발한 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입된 형질전환 고구마 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 단백질을 코드하는 유전자의 도입을 PCR로 확인한 것을 나타낸 것이고 [M, 사이즈마커이고, 1부터 14는 카나마이신 저항성 고구마 식물체이고, N은 비형질전환 고구마 식물체이고, P는 형질전환 벡터 DNA],
도 4는 본 발명의 형질전환 고구마 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 일부가 도입된 것을 서던블럿 (Sourthern blot)으로 분석한 결과를 나타낸 것이고 [NT는 비형질전환 고구마 식물체; 1, 2, 3, 4는 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300가 도입된 형질전환 고구마; 5, 6, 7은 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입된 형질전환 고구마],
도 5의 A는 본 발명의 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300가 도입된 형질전환 고구마 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 단백질 일부분을 코딩하는 유전자가 발현되는 것을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이고 [NT는 비형질전환 고구마 식물체; 1부터 7은 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300가 도입된 형질전환 고구마], 도 5의 B는 본 발명의 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입된 형질전환 고 구마 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 단백질 일부분을 코딩하는 유전자가 발현되는 것을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다 [NT는 비형질전환 고구마 식물체; 1부터 8은 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300가 도입된 형질전환 고구마].
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 항원성을 나타내는 유전자를 도입하여 단백질을 발현하는 형질전환 식물체, 이의 제조 방법 및 상기 형질전환 식물체를 돼지 유행성 설사병 바이러스 감염에 대한 예방용 경구백신으로 사용하는 것에 관한 것이다.
최근 양돈산업에 가장 큰 경제적 피해를 준 질병은 돼지 유행성 설사병(porcine epidemic diarrhea: PED)이다. 돼지 유행성 설사의 원인체는 코로나비리다계에 속하는 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)이다(Pensaert and de Bouck, Arch. Viol., 58, 243-247, 1978). PEDV는 전염성 위장염 바이러스 (transmissible gastroenteritis virus: TGEV)와 같은 과(family) 코로나비리다계에 속하며, 임상증상 또한 매우 유사하지만 항원적으로 뚜렷이 구별된다. PEDV 입 자의 직경은 120-160 nm이며 외피(envelope)를 가진 다양한 형태를 가지고 있다.
PEDV는 S(spike protein, 스파이크 단백질), M(membrane glycoprotein), E (small envelope protein), HE(hemagglutinin-esterase protein), N (nucleocapsid phosphoprotein) ICS(internal core-shell composed of M glcoprotein), NC (nucleocapsid) 등으로 구성되어 있다(Egberink et al., Am. J. Vet. Res., 49, 1320-1324, 1988). PEDV의 항원성은 외피 단백질과 스파이크 단백질에 의해서 결정되며, 특히 스파이크 당단백질은 중화 항체(neutralizing antibody) 형성에 관여하며 또한 세포수용체(cellular receptor)에 결합하여 세포간에 융합을 유발한다.
PEDV는 돼지 소장의 융모 상피세포에서 증식하며, 감염 돼지에서는 설사, 식욕부진, 구토를 일으키고, 1주령 이내의 신생자돈에서는 탈수가 심하며, 감염 후 3-4일 이내에 폐사한다(de Bouck and Pensaert, Am. J. Vet. Res., 41, 219-223, 1980). 감염 모돈에서 우유의 분비가 감소하거나 무유증으로 인하여 포유 신생자돈의 탈수를 더욱 심하게 하여 폐사율을 높이는 원인이 된다.
돼지 유행성 설사병은 1972년 영국에서 처음으로 발생 보고가 있었으며 한국에서는 1993년 PEDV를 분리함으로써 PED의 발생이 확인되었고, PEDV에 의한 자돈의 설사병이 1980년 대부터 양돈장에서 발생된 것으로 추정된다. 실제로 1990 이후 국내 양돈산업에 가장 많은 피해를 준 질병은 PED와 TGE라고 할 수 있다. 그러나, PEDV에의 한 피해를 통계학적으로 분석한 보고서가 없어서 정확한 경제적인 손실을 계산할 수 없지만 PEDV 감염자돈의 치사율이 최소 30%에서 최대 80%에 이르는 점으로 미루어 볼 때 과거 10 여년 동안 PED로 인한 양돈 농가가 입은 피해는 실로 막대하다고 할 수 있다.
돼지 유행성 설사병의 예방법에는 돼지 구입시 비감염 농장에서 구입하고 농장 간에 전파를 예방하는 것 이외에 순화 생독바이러스백신(live attenuated virus vaccine) 접종 등이 있으나 완벽한 효과를 보이지 못하고 있다. 그 이유는 현재 사용되고 있는 백신이 근육 주사용이기 때문에 혈중 IgG의 형성은 잘 되나 PED 예방에 정작으로 중요한 점막 면역(mucosal immunity, sIgA)의 형성이 잘되지 않기 때문에 양호한 예방효과를 얻지 못하고 있다.
식물체로부터 항원단백질을 발현시켜 경구용 백신으로 이용하는 것은 비용이 절감되고 정제가 용이하며 사용지역에서 식물을 재배할 수 있어 이동과 보관이 쉬울뿐만 아니라 대량생산이 가능한 장점이 있다. 1992년 메이슨 등에 의해 담배에 HBV(B형 간염 바이러스)의 표면 항원유전자(HBdAg)를 발현시켜 면역원성을 가진 항원단백질이 생산된 것을 시작으로 식물체로부터 백신 개발이 가능하였다(Mason et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11745-11749, 1992). 그 이후 다양한 식물체가 개발되어 왔으나 항원단백질의 특성을 고려하여 고구마처럼 생식이 가능한 식물을 이용하는 것이 중요하다.
형질전환 식물체에서 PEDV에 대한 항원 단백질 생산에 관한 보고로는 PEDV 중화항체 에피토프를 생산하는 형질전환 담배가 보고된 바 있다(Bae et al., Vaccine, 21: 4052-4058, 2003; Kang et al., Protein Express. Purif., 38, 129-135, 2004; Kang et al., Vaccine, 23, 2294-2297, 2005). 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 생산하는 형질전환체에 대해 기술한 대한민국특허 출원, 특허출원번호 제 10-2002-0024424호에서는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 유전자를 포함하는 형질전환 담배에 관해 개시하고 있다. 그러나, 담배의 경우 독성 알칼로이드(toxic alkaloid)를 함유하여 구강 면역에 부적합할 뿐만 아니라 포장에서 LMO(Living modified organism)로서 환경 위해성이 있는 단점이 있다. 이에 반하여, 본 발명의 형질전환 식물체는 PEDV에 대하여 항원성을 나타내는 스파이크 단백질의 유전자 일부만을 pCAMBIA2300 벡터에 도입하였고, 특히 고구마 저장뿌리에서 특이적으로 발현하는 스포라민 프로모터를 이용하여 고구마를 형질전환 시킴으로써 경구백신용으로 용이할 뿐만아니라 영양번식 특성으로 인해 환경 위해성이 없는 등의 장점으로 상기 특허와 차이를 나타낸다.
또한, 대한민국특허 출원, 출원번호 제 2003-0012280호에는 CaMV 35S 프로모터를 이용하여 PEDV 스파이크 단백질 서브유닛을 코딩하는 유전자와 막 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시킨 형질전환 감자가 보고된 바 있다. 그러나, 상기의 경우 감자의 괴경에 상대적으로 단백질 함량이 낮고, 생식하기에 적당하지 않아 가공시 단백질 변성으로 인해 항원성이 낮은 단점이 있으며, PEDV 스파이크 단백질 서브유닛을 코딩하는 유전자와 막 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시킨 형질전환 감 자의 경우 스파이크 단백질을 생산하는 감자와 막단백질을 생산하는 형질전환 감자를 각각 생산하여야 하는 단점이 있다. 이에 반해, 본 발명은 PEDV에 대하여 스파이크 단백질에서 항원성을 나타내는 유전자 일부만을 도입함으로써, PEDV 스파이크 단백질 서브유닛을 코딩하는 유전자와 막 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 형질전환시키는 것에 비해 훨씬 더 용이하게 형질전환이 가능한 장점이 있다.
고구마는 국내 재배조건에서 꽃이 피지 않으며 영양번식으로 유지되기 때문에 LMO(Living modified organism)의 환경위해성이 없으며, 괴근, 엽병 및 잎 등 식물체의 모든 부위를 이용할 수 있는 식물체로서, 특히 괴근은 생식이 가능하여 경구용 백신으로 사용하는 경우 항원 단백질의 변성을 최소화할 수 있다. 또한, 영양번식 작물로 품종화가 용이하며 실용화까지의 소요기간이 짧고, 척박한 토양에서도 잘 자랄 수 있어 재배가 용이할 뿐만 아니라 단위 면적당 생산성이 가장 높은 작물이다.
상기한 바와 같이 고구마는 많은 장점을 가짐에도 불구하고, 형질전환이 비교적 용이하지 않아 산업적으로 유용한 형질전환 고구마가 개발되지 못하였으나, 본 발명자들은 고구마 재분화 및 형질전환 체계를 확립하였으며, 재해 내성 형질전환 고구마 식물체를 개발한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 고구마 저장뿌리에서 고발현하는 프로모터 등을 이용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자를 고구마에 발현시켜 항원단백질을 생산하는 형질전환 고구마를 제조하였으며, 본 발명의 형질전환 고구마가 돼지 유행성 설사병 바이러스의 항원단백질을 생산함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)에 대한 항원단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 형질 전환 식물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사병 예방용 경구투여용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물세포로부터 재분화시켜 제조되는 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 발현용 프로모터, 서열번호 2로 기재되는 PEDV 유전자 및 전사 종결자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1의 PEDV 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 발현 벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및
3) 단계 2)의 아그로박테리아와 식물 세포를 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 경구투여용 백신 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 항원 단백질을 포함하는 PEDV 예방용 사료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물세포로부터 재분화시켜 제조되는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 PEDV 단백질은 서열번호 1로 기재되는 PEDV 단백질 또는 "변이형 단백질(variants)"을 포함할 수 있으며, 또한 이를 암호화하는 PEDV 유전자는 서열 번호 2로 기재되는 유전자, 이의 "상동형 유전자(homologs)" 및 이의 "변이형 유전자(varients)"를 포함할 수 있다. 따라서, 상동형 유전자의 범주에는 발현시 서열번호 1로 기재되는 PEDV 단백질을 생산할 수 있는 모든 종류의 유전자가 포함된다.
상기 PEDV 단백질의 "변이형 단백질"은 서열번호 1로 기재되는 PEDV 단백질 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실, 부가, 삽입 또는 치환시킨 단백질을 의미하며, 상기 PEDV 유전자의 "변이형 유전자(varients)"는 PEDV 단백질의 변이형 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 의미한다. 상기 PEDV 단백질의 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것이 바람직하며, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.
서열번호 1의 PEDV 항원 단백질은 PEDV 스파이크 단백질 중 항원성을 나타내는 활성 부위로서, 본 발명자들은 PEDV 항원으로 작용하는 PEDV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자를 획득하였고, 이를 서열번호 2로 나타내었다.
상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 재조한 후 이를 아그로박테리움에 도입하고, 이를 고구마 세포와 공동배양하여 PEDV 항원을 발현하는 형질전환 고구마 세포를 제조하였다.
발현 벡터는 폴리에틸렌 글리콜(polyerhylene glycol)방법, 전기천공법(electroporation), 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의해 매개되는 전달 및 입자 충격(particle bombardment)방법과 같은 공지의 방법에 의하여 식물 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다.
본 발명에서 상기 형질전환 식물 세포를 제조하기 위한 PEDV 항원으로 작용하는 PEDV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 균주 및 형질전환 식물 세포는 모두 본 발명의 범위에 포함되며, 상기 발현 벡터 및 아그로박테리움 균주는 실시예에서 제시된 고구마 이외 다양한 작물에도 응용이 가능하다. 즉, 상기 PEDV 항원을 발현하는 식물 세포에 특별히 제한이 있는 것은 아니며, 돼지에 직접 식용가능한 작물인 것이 바람직하며, 특히 우리나라 전역에서 재배 가능한 고구마는 국내의 재배조건에서는 꽃이 피지 않으며 삽식(揷植)에 의해 번식하는 영양번식 작물이기에 LMO로서 환경 위해성이 없어 더욱 바람직하다.
본 발명자들은 상기 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 단백질을 암호화하는 PEDV 유전자를 포함하는 형질전환 식물세포를 각각 한국 생명공학연구원 유전자은행에 2005년 10월 5일자로 KCTC 10857BP 및 KCTC 10858BP로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 상기 식물 발현용 프로모터, 서열번호 2로 기재되는 PEDV 유전자 및 전사 종결자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명자들은 돼지 유행성 설사병 바이러스로부터 PCR을 이용하여 PEDV 스파이크 단백질의 일부분을 코딩하는 유전자(sp1)를 분리한 후 재조합 벡터를 제작하였다. 본 발명에서 제작한 재조합 벡터는 pCAMBIA2300 벡터를 기본으로 하여 CaMV 35S 프로모터 및 고구마 저장뿌리에서 고발현하는 스포라민 프로모터를 각각 이용하였다. 도 1과 같이 CaMV 35S 프로모터(35Sp), 스포라민 프로모터를(Spop), 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 PCR로 합성된 PEDV 스파이크 단백질 일부를 코딩하는 유전자(sp1) 및 노팔린 합성효소 종결자(nopaline synthase terminator; NosT)를 포함한다. 본 발명에서는 CaMV 35S 프로모터를 이용한 35Sp::PEDV-sp1 및 스포라민 프로모터를 이용한 Spop::PEDV-sp1 유전자 콘스트럭트(construct)를 식물체 발현벡터인 pCAMBIA2300에 도입하고 이들을 각각 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 및 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300로 명명하였으며, 이를 아그로박테리움에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움을 제조하고 이를 각각 한국 생명공학연구원 유전자은행에 2005년 10월 5일자로 KCTC 10855BP 및 KCTC 10856BP로 기탁하였다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1의 PEDV 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 발현 벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및
3) 단계 2)의 아그로박테리아와 식물 세포를 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 단계 1의 발현 벡터는 서열번호 1의 PEDV 항원 단백질을 암호화하는 유전자가 CaMV 35S 프로모터 또는 스포라민(sporamin) 프로모터에 정방향으로 위치하고, 카나마이신 저항성 유전자를 선별 마커로 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300, Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300을 사용하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단계 2의 발현 벡터는 통상의 방법에 따라 아그로박테리움에 도입될 수 있으며, 단계 3에 의해 제조된 형질전환 세포는 재분화 과정을 통하여 형질전환 식물체를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 PEDV 항원 유전자로 형질전환된 배발생 캘러스로부터 체세포배 및 식물체를 유도하기 위하여 MS 기본 배지(BMCK)에서 1개월 정도 배양한 결과 체세포배가 유도되었으며 1-2개월 배양 결과 줄기와 뿌리가 유도되어 소식물체로 재분화되었다.
상기와 같이 제조된 형질전환 고구마를 PCR과 서던 블랏으로 분석한 결과 본 발명의 PEDV 항원 유전자가 식물체내로 도입되어 보존됨을 확인할 수 있었고, RT-PCR(reverse transcriptase-PCR) 방법을 통하여 본 발명의 항원 유전자가 발현됨을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명의 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 경 구투여용 백신 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 상기 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 PEDV 예방용 사료 조성물을 제공한다.
유효성분으로서 본 발명의 형질전환 고구마 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 유효성분인 고구마는 통상 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 특정한 최대 허용범위가 없이 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 재조합 PEDV 단백질의 분리 방법은 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 상기 조성물은 형질전환 식물체를 그대로 사용하거나 건조시킨 후 분말 형태로 사용할 수 있고 또한, 다른 사료 또는 사료 첨가물과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 제조한 형질전환 고구마는 이를 사료화하여 돼지에 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 돼지에게서 돼지 PEDV에 대한 항체 형성을 유도하여 PEDV에 대한 면역효과를 유발시킬 수 있다. 또한, 형질전환된 고구마를 사료로서 이용하기 때문에, 고구마는 일반인들도 쉽게 재배할 수 있을 뿐만 아니라, 이전부터 농가에서 사료로 이용되어 왔기 때문에 거부감이 없어 일반인들도 쉽게 이용하여 돼지의 면역화를 유발시킬 수 있다.
한편, 스파이크 단백질의 염기서열 중에서 항원성이 알려진 444 bps 단편만을 삽입하여 제조한 발현 벡터를 이용하여 단백질을 발현시켰고, 본 발명의 형질전환 고구마를 돼지에게 섭취시킴으로써 지속적으로 백신을 투여하는 효과를 나타낼 수 있어 기존의 불활화 바이러스 백신(attanuated virus vaccine)보다 안전성 면에 서 우수하다. 따라서, 형질전환된 고구마를 경구투여하여 돼지의 점막면역을 유도할 수 있을 것이며, 궁극적으로 돼지의 설사병에 대한 경구 백신 효과를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다.
그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 재조합 벡터의 제조
PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 벡터 제작을 위하여 충남대 김현수 교수로부터 제공받은 PEDV를 RT-PCR방법을 이용하여 플라스미드로 전환하였다. 먼저 CaMV 35S 프로모터 앞뒤에 HindIII(Roche)와 XbaI(Roche) 서열을 각각 붙여 pCAMBIA2300 벡터(cambia.org)의 동일 제한효소 자리에 삽입하였다(35Sp/pCAMBIA). PEDV 스파이크 단백질 염기서열 중에서 항원성이 알려진, 서열번호 2로 기재되는 444 bps 단편(Chang et al., Mol. Cells, 14, 295-299, 2002)을 BamHI(Roche) 서열(GGATCC)을 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR로 합성한 후 (sp1) TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다. 사용한 프라이머(primer)는 서열번호 3으로 기재되는 5'- GGA TCC ATG GAA CAG CCA ATT TCT TTT GTT-3'과 서열번호 4로 기재되는 5'- GGA TCC AAA AGA AAC GTC TGT GAT ACC-3'이다. 또한, 서열번호 3으로 기재되는 프라이머에는 본 발명의 단백질 발현을 위하여 개시코돈 서열(ATG)이 포함되어 있다.
PCR로 합성된 DNA 단편을 EcoRV(Roche)와 SacI(Roche)으로 절단한 후 35Sp/pCAMBIA2300를 SmaI(Roche)과 SacI으로 절단한 자리에 삽입하여 35S::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 재조합 벡터를 완성하였다(도 1의 A).
또한, CaMV 35S 프로모터 이외에 고구마 저장뿌리 고발현 스포라민 프로모터(Hattori and Nakamura, Plant Mol. Biol., 11, 417-426, 1988)를 사용한 벡터를 제작하기 위하여 스포라민 프로모터를 HindIII와 XbaI으로 절단한 다음 앞서 제작된 35S::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터를 같은 효소를 처리하여 CaMV 35S 프로모터를 제거하고 그 자리에 스포라민 프로모터를 삽입하여 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 재조합 벡터를 제작하였다(도 1의 B).
상기 두 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105에 도입하여 고구마 형질전환에 이용하였다. 상기의 도입방법은 An, G 등의 방법에 따라 재조합 벡터 DNA와 아그로박테리아를 혼합하여 액체질소에 넣어 급냉시킨 후 37℃에서 5분 동안 녹인 후 YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 1시간 배양시킨 후 100 mg/L 리팜피신과 50 mg/L 카나마이신를 포함한 YEP배지에 도말하여 28℃에서 2일 동안 배양하였다(An et al., In Plant Molecular Biology Mannual Part A3: 1-19 Kluwer Academic Publisher, 1988). 상기 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리아를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2005년 10월 5일자로 KCTC 10855BP 및 KCTC 10856BP로 기탁하였다.
< 실시예 2> 아그로박테리움 매개에 의한 형질전환 및 식물체 재분화
고구마 식물체 정단분열조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 MS(Murashige and Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497, 1962) 기본배지 무기염에 100 ㎎/L 미오-이노시톨(myo-inositol), 0.4㎎/L 티아민(thiamine)·HCl, 30g/L 슈크로스(sucrose), 1 ㎎/L 2,4-D 및 4 g/L 젤라이트(Gelrite)가 첨가된 배지(MS1D)에서 4주 간격으로 계대배양하면서 유지하였다(Kwon et al., Korean J. Plant Biotechnol., 29, 189-192, 2002). MS1D 고체배지에 계대 배양한지 1주일된 배발생 캘러스를 형질전환 재료로 이용하였다.
실시예 1에서 제작한 아그로박테리움을 1일 동안 배양한 후 아그로박테리아를 원심분리하여 모은 후 10 mL의 MS1D 액체배지에 현탁하여 배발생 캘러스와 혼합하여 30분 동안 방치한 후 멸균된 필터 페이퍼(filter paper)를 이용하여 캘러스에 묻은 아그로박테리아와 배지를 제거하고 2일 동안 MS1D 배지에 공동배양하였다. 400 mg/L 클라포란(claforan)이 함유된 멸균수로 공동배양한 캘러스를 3회 세척하여 아그로박테리아를 제거한 후 100 mg/L 카나마이신과 400 mg/L 클라포란이 함유된 선발배지(MS1DCK)에서 약 4개월 동안 3주 간격으로 계대배양하면서 카나마이신 저항성 캘러스를 선발하였다. MS1DCK 선발배지에서 계대배양이 진행되면서 대부분의 캘러스는 죽었지만 일부 캘러스가 배발생능을 그대로 유지하면서 증식되었다.
상기에서 35S::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 벡터가 도입되어 선발된, 재분화가 가능한 식물세포를 35S-PEDV(고구마 캘러스)로 명명하였고, spop::PEDV-sp1/ pCAMBIA2300 벡터가 도입되어 선발된, 재분화가 가능한 식물 세포를 spop-PEDV(고구마 캘러스)로 명명하였으며, 상기 형질전환이 확인된 고구마 식물세포를 한국생 명공학연구원 유전자은행에 2005년 10월 5일자로 KCTC 10857BP 및 KCTC 10858BP로 기탁하였다.
선발배지에서 4개월 동안 배양되어 살아남은 배발생 캘러스로부터 체세포배 및 식물체를 유도하기 위하여 2,4-D를 제거한 MS 기본배지(100 mg/L kanamycin, 400 mg/L claforan 함유: BMCK)에 옮겨 25℃, 약 40 μmol·m-2·sec-1의 cool-white 형광, 광주기 16시간 조건에서 배양하였다. BMCK 배지에서 1개월 정도 배양한 결과 체세포배가 유도되었으며 1-2개월 배양 결과 줄기와 뿌리가 유도되어 소식물체로 재분화되었다(도 2).
<실시예 3> 형질전환 식물체 분석
카나마이신 함유배지에 재분화된 식물체로부터 염색체 DNA를 분리하여 PCR로 분석하였다. PCR에 사용된 프라이머는 실시예 1의 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 사용하였다. 분석 결과 재분화 식물체의 50% 이상에서 444 bps의 밴드가 각각 관찰되었다(도 3).
PCR로 PEDV 유전자의 도입이 확인된 고구마 식물체를 대상으로 서던 (Southern) 블랏 분석을 실시하였다. 배양기에서 생육중인 고구마 식물체의 잎으로부터의 DNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA (30 μg)를 XbaI으로 각각 절단하여 0.8% 아가로스 젤에 전기영동한 후, 제타 프로브 막(Zeta Probe membrane)(Bio-Rad)으로 전이시켰다. 프로브 (probe)는 PEDV 스파이크 단백질의 특이부분에서 제작된 상기 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 이용하여 PCR로 합성하여 이용하였다(444 bps). 이 DNA를 동위원소 [α-32P] dCTP로 표지시켜 전융합(prehybridization)용액 (제타 프로브 막 용)에 첨가하여 60℃에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 반응을 마친 막(membrane)을 세척하고 X-선 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다. 그 결과 형질전환된 고구마 식물체에 PEDV 유전자가 1-2 카피(copy) 도입된 것으로 나타났다(도 4).
형질전환 고구마에서 도입된 PEDV 유전자가 정상적으로 발현되는지를 알아보기 위하여 RNA를 추출해 RT-PCR을 수행하였다. RNA를 추출하기 위하여 재분화된 고구마 잎 1 g을 액체질소를 이용하여 막자사발에서 곱게 분쇄하였다. 여기에 5 mL의 TRI 시약(Molecular Research Center, MRC)를 이용하여 일상의 방법에 의해 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 1 μg을 올리고(oligo) dT와 섞어 70℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 1차 cDNA 합성키트(ImProm-ⅡTM Reverse Transcription System, Promega)의 반응액과 혼합하여 25℃로 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분 동안 반응하여 1차 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 1-2 μL 취하여 상기의 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 처음 94℃에서 5분 동안 DNA를 변형시킨 다음 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 30회 수행하고 이어서 72℃로 7분 동안 수행하였다. 그 결과 형질전환 고구마에서 모두에서 444 bps의 DNA 단편이 합성되었다.
CaMV 35S 프로모터를 이용한 형질전환 고구마에서는 도입한 유전자가 비슷한 수준으로 발현되었다(도 5의 A). 한편, 스포라민 프로모터를 이용한 형질전환체에서는 도입 유전자가 식물체마다 다른 수준으로 발현되었으며(도 5의 B), 이는 스포라민 프로모터가 고구마 저장뿌리에서 고발현 하며, 다른 조직에서는 약하게 발현되기 때문에 나타난 현상으로 파악된다.
본 실험을 통해, RT-PCR에 의해서 얻어진 산물들이 도입된 PEDV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자가 발현된 mRNA에서 유래된 것임이 입증되었으며, 고구마에서 도입된 PEDV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자가 정상적으로 발현됨을 의미한다.
이상에서 살펴본 바와 같이,
본 발명의 PEDV 항원 단백질을 발현하는 형질전환 고구마는 농가에서 재배가 용이하고 생산성이 높은 작물이면서 이미 사료로 이용되고 있어 자돈 농가에서 쉽게 PEDV 항원 단백질을 생산하는 형질전환 고구마를 대량생산할 수 있다. 이 형질전환 고구마를 사료 백신으로 이용할 경우 기존의 불활화 바이러스 백신과 같이 주기적으로 백신을 투여할 필요가 없을 뿐만 아니라 비용절감 등 자돈 농가의 소득증대를 가져올 수 있다.
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Claims (16)

  1. 서열번호 1의 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus) 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 세포.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 세포.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 수탁번호 KCTC 10857BP로 기재되는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 세포.
  5. 제 1항에 있어서, 수탁번호 KCTC 10858BP로 기재되는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 세포.
  6. 제 1항, 4항 및 5항 중 어느 한 항의 식물 세포로부터 재분화시켜 제조되며, 삽식(揷植)에 의해 영양번식되는 고구마(Ipomoea batatas) 식물체.
  7. 1) 서열번호 1의 PEDV 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 단계 1)의 발현 벡터를 아그로박테리아에 도입시키는 단계; 및
    3) 단계 2)의 아그로박테리아와 고구마(Ipomoea batatas) 세포를 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 식물체 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 단계 1)의 발현벡터는 식물 발현용 프로모터, 서열번호 2로 기재되는 PEDV 유전자 및 전사 종결자를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 식물체 제조 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(수탁번호 KCTC 10855BP)에 도입된 재조합 벡터 35Sp::PEDV-sp1/pCAMBIA2300인 것을 특징으로 하는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 식물체 제조 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(수탁번호 KCTC 10856BP)에 도입된 재조합 벡터 Spop::PEDV-sp1/pCAMBIA2300 인 것을 특징으로 하는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 식물체 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 6항의 형질전환 고구마(Ipomoea batatas) 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 6항의 형질전환 고구마 식물체, 상기 형질전환 식물체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환 식물체로부터 분리된 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 PEDV 예방용 사료 조성물.
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