KR20030012279A - 구제역 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환감자 및 이의 제조방법 - Google Patents

구제역 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환감자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구제역 바이러스(Food-and-Mouth Disease Virus)의 외막 재조합 단백질(Recombinant coat protein)을 발현할 수 있는 형질전환 감자의 제조방법 및 이 형질전환 감자를 소, 돼지 등의 가축에서 구제역 바이러스에 대한 면역효과를 유발하기 위해, 식물 유래 백신으로 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

구제역 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환 감자 및 이의 제조방법{Transformed potato for using vaccination on Food-and-mouth disease virus and method for preparation thereof}
본 발명은 구제역 바이러스(Food-and-Mouth Disease Virus)의 외막 재조합 단백질(Recombinant coat protein)을 발현할 수 있는 형질전환 감자의 제조방법 및 이 형질전환감자를 소, 돼지 등의 가축에게서 구제역 바이러스에 대한 면역효과를 유발하기 위해, 식물 유래 백신으로 사용하는 것에 관한 것이다.
구제역은 피콜나우일스과 아후토우일스속(Picornaviridae Aphthovirus)으로 분류되는 구제역 바이러스의 감염에 의한 급성 열성 전염병으로 전염력이 강하며, 소, 물소, 돼지, 양, 염소 등의 가축 뿐만 아니라, 야생동물을 포함한 대부분의 우제유 동물이 감염된다. 병명은 발병 동물의 입, 제 및 유방 주변의 피부나 점막에 수포가 형성되는 것으로부터 유래되었다.
구제역에 의한 치사율은, 유축에서 때로는 50％를 넘을 정도로 높지만, 성축에게서는 일반적으로 수％ 정도로 낮다. 그러나, 바이러스의 전염력이 일반 바이러스들보다 훨씬 강하고, 발병후에 생기는 발육 장해, 운동 장해 및 비유 장해 등에 의해 가축은 산업동물로서의 가치를 잃어버리기 때문에, 직접적인 경제 피해는 매우 크다. 또한, 한 번 발생하면, 나라 또는 지역마다 엄격한 생축과 축산 이동의 제한이 가해지기 때문에, 국제 유통에도 영향이 크게 작용하고, 간접적으로 생기는 사회 경제적인 피해 또한 막대하게 된다.
따라서, 축산 농가 및 국가적으로의 막대한 손실을 막기 위해서, 구제역 자체에 대한 연구 및 구제역 바이러스 백신의 개발에 관하여 많은 연구가 진행되었다.
그러한 연구 결과로, 구제역 바이러스는 A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 등 7개의 주요 혈청형으로 분류되고, 이 주요 혈청형은 다시 80가지의 아형으로 나누어지며, 구제역 바이러스에는 외피 단백질(envelop protein)은 존재하지 않지만, 4개의 외막 단백질(coat protein)로 이루어진 20면체 대칭형의 구조를 갖는다는 것 등이 밝혀졌다(Brooksby, J. B.(1982)intervirol. 18 :1-23).
또한, 구제역 바이러스는 높은 전염성을 갖지만, pH 6.0 이하와 pH 9.0 이상의 조건에서는 불활화되며, 2% 가성소다, 4% 탄산소다 및 0.2% 구연산에서도 불활화되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 냉장 또는 냉동 조건에서는 오래 동안 바이러스 활성이 유지된다는 것도 밝혀져 있다.
따라서, 이러한 발견으로 사료의 관리 및 가축장의 관리 조건을 조절함으로써, 구제역에 대해 어느 정도의 방제효과를 볼 수 있지만, 구제역은 공기중으로 전파되는 바이러스이기 때문에 근본적인 구제역 바이러스 백신이 요구되었다.
종래 구제역 바이러스에 대한 백신은 구제역 바이러스를 특수 시설하에서 증식시키고, 이를 순수 정제한 다음, 에텔렌이민(etheleneimine) 등의 화학물질을 사용하여 구제역 바이러스를 불활화시킨 후, 이 항원 바이러스를 미네랄 오일 (mineral oil)과 혼합하여 미세한 입자의 형태로 제조하여 왔다.
그러나, 이러한 종래의 방법에 의해 제조된 항원 바이러스는, 제조에 4∼5일, 완제품 생산까지 4개월 정도의 시간이 소요되며, 항원 바이러스 제조과정에서는 실험용 바이러스가 외부로 유출되는 것을 막기 위하여 완벽한 차단이 요구되는 문제점이 있으므로, 현재 우리나라에서는 이러한 백신을 만들지 못하고 있는 것이 현실이다. 더구나, 접종 방법도 수의사가 아닌 일반인에 의해서 행하기 어렵고, 1차 백신 접종 후 한달 후에 다시 보강 접종, 그 후에 6개월마다 계속적인 접종이 필요하기 때문에, 국가적으로 청정화를 선포한 후에야 백신 투여를 마칠 수 있는 문제점이 있다.
또한, 백신을 접종한 소들은 가격이 현저히 하락되는 문제점도 있다 (McCullough K,et al., J. Viol.(1992)66:1835-1840).
또한, 구제역 바이러스 백신의 생산 및 개발은 구제역 바이러스의 위험성 때문에, 생산 시설이 우수한 극히 일부 국가의 회사에서의 생산에만 의존하고 있다. 많은 연구자들이 136∼150개의 아미노산 수를 갖는 외막 단백질 펩티드인VP1을 재조합 기술을 이용하여 생산하고, 이를 모노클로날 항체(Monoclonal anti-VP1)로 이용하려는 면역방법을 이용하고 있지만, 바이러스의 다양한 변이체로 인하여, 중화 항체의 불활성화가 일어나거나 정확한 항원 결정부위(epitope)를 찾지 못하여 만족할만한 결과는 얻지 못하고 있는 것이 현실이다( McCormick, A.et al. (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96: 703-706 ; Carillo, C.et. al.(1998)J. Viol.72: 1688-1690).
따라서, 구제역 바이러스에 대한 백신효과가 우수하여, 가축의 질을 떨어뜨리지 않으면서도, 일반인에 의해서도 손쉽게 이용할 수 있는 구제역 바이러스 백신에 대한 요구가 많아지고 있다.
이에, 본 발명자들 또한 구제역 바이러스에 대한 백신효과가 우수하면서도 일반인에 의해서도 손쉽게 이용할 수 있는 구제역 바이러스 백신을 찾고자 연구를 수행한 결과, 생명공학 및 면역학적인 방법을 이용하여 구제역 바이러스의 외막 재조합 단백질(Recombinant coat protein)을 발현할 수 있는 형질전환 감자를 제조하고, 이 형질전환 감자를 사료로서 소, 돼지 등의 가축에게 섭취시키는 것에 의해, 구제역 바이러스에 대한 면역효과를 유발시킬 수 있으며, 따라서, 이 형질전환 감자를 식물 유래 백신으로서도 이용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 구제역 바이러스의 항원성 단백질인 외막 단백질 유전자가 도입된 형질전환 감자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 감자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 감자를 가축의 구제역에 대한 식물 유래의 백신으로 이용하여, 소, 돼지 등의 가축에 구제역에 대한 면역을 유발시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 식물 유래의 백신으로서의 형질전환감자를 제조하는 방법은,
1) 구제역 바이러스로부터 PCR을 이용하여 외막단백질vp1, vp2, vp3또는vp4유전자를 분리하는 단계;
2) 상기 유전자를 감자에 발현시키기 위해서,아그로박테리움의 플라스미드에 클로닝할 수 있는 감자 발현벡터를 구축하는 단계;
3) 상기 발현벡터를아그로박테리움에 도입하여아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;
4) 상기 형질전환된아그로박테리움과 감자 식물조직을 함께 배양하여, 아그로박테리움내의 식물 발현벡터에서의 상기 외막 유전자를 감자 식물의 크로모좀내로 삽입시킴으로써 형질전환 감자를 제조하는 단계;
5) 형질전환된 감자의 발현특성을 분석하는 단계; 및
6) 상기 발현특성이 검정된 감자의 발아된 조직 절편을 배양하여 형질전환 감자를 재분화시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 감자 형질전환 방법은, 형질전환 감자에서 이들 외막 항원성 단백질의 발현을 더욱더 효과적으로 유도하기 위해서, 상기 단계 1)에서 구제역 바이러스로부터 PCR을 이용하여 외막 단백질을 분리할 때, 3´-말단 측에서 소포체 잔류 시그날 펩티드를 코딩하는 염기서열(ER retension singnal peptide)을 더 부착한 형태의 유전자로 분리하여 상기 외막단백질 유전자로서 이용할 수 있다.
또한, 상기 단계 4)에서 형질전환된 감자의 발현 특성을 분석하기 위해서, 서던 블랏 분석 및 노던 블랏 분석 뿐만 아니라, 상기 외막단백질에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 분석할 수 있다.
이때, 모노클로날 항체의 생산 방법은, 구제역 바이러스로부터 PCR을 이용하여 외막단백질vp1, vp2, vp3또는vp4유전자를 분리하는 단계; 상기 외막단백질 유전자를 곤충세포 발현 벡터에 삽입하는 단계; 베큘러바이러스와 곤충세포 발현벡터와의 상동 재조합을 통해 재조합 베큘러바이러스를 생산하는 단계; 상기 재조합 베큘러바이러스를 곤충세포에 형질감염시키는 단계; 재조합 곤충세포로부터 상기 외막 단백질 VP1, VP2, VP3 또는 VP4를 정제하는 단계; 상기 정제된 외막단백질 각각을 쥐에 면역시키고, 면역된 쥐로부터 비장세포를 분리하는 단계; 분리된 비장세포를 골수종세포와 융합시킨 후, 융합세포로부터 모노클로날 항체를 얻는 단계를 포함한다.
상기 얻어진 구제역 바이러스의 외막단백질에 대한 모노클로날 항체는 상기 형질전환 감자에서의 외막단백질 발현을 확인하는데, 예를 들면 웨스턴 블랏 분석 등에 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 제조한 형질전환 감자는 이를 사료화하여 가축에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 가축에게서 점막면역 및 구제역 바이러스 외피에 대한 항체 형성을 유도하여 구제역에 대한 면역효과를 유발시킬 수 있다.
따라서, 외막단백질은 구제역 바이러스의 활성에 전혀 관여하지 않고, 가축에게서 면역효과를 유발시킬 수 있기 때문에, 불활화 바이러스 백신(attanuatedvirus vaccine) 보다 안전성 면에서 우수하다.
또한, 형질전환된 감자를 사료로서 이용하기 때문에, 일반인들도 쉽게 이용하여 가축의 면역화를 유발시킬 수 있으며, 가축에게서 지속적으로 항원성 단백질을 투여하는 효과를 나타낼 수 있어 기존의 불활화 바이러스 백신과 같이 일정한 간격을 두고 백신을 투여할 필요가 없고, 백신의 투여에 의해서 가축의 상품성이 떨어지지도 않는 장점이 있다.
한편, 본 발명의 형질전환 감자를 이용하여 면역화를 얻어낼 수 있는 가축의 예로는, 소, 물소, 돼지, 양, 염소 등의 구제역에 쉽게 노출되어 질병을 일으키는 동물 들을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
(1) 프라이머 작성과 염기서열 확인
구제역 바이러스의 구조 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 코딩하는vp1, vp2, vp3 및vp4 유전자 절편을 합성하기 위해, 구제역 바이러스의 RNA를 역전사 효소 및 리버스 5´-프라이머를 사용하여 역전사-연쇄중합반응(Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)으로 일차 cDNA(First cDNA)를 합성하였다. 그런 다음, 일차 cDNA, 포워드 5´-프라이머 및 리버스 5´-프라이머를 사용하여, 해당 유전자 절편을 합성하였다(SAIKI, R.K.,et al.(1988)Science 239: 487-491).
이때 사용된 프라이머 서열은Vet. Microbiol.(2000)74(3): 207-216에서발표된 O형 구제역 바이러스 전체 염기서열을 근거로 제작하였다. 외막단백질vp1, vp2, vp3및vp4를 증폭하기 위한 각 프라이머들은, 포워드 5´-프라이머 내에 밑줄친 부분의 XbaⅠ 제한효소 인식 위치를 포함하고 있으며, 번역개시 코돈을 포함하고 있다. 또한, 리버스 5´-프라이머에는 밑줄친 부분의SacI 제한효소 인식 위치 및 번역종료 코돈을 포함하고 있다. 그러한 프라이머의 서열은 다음과 같다.
①vp1 증폭용 프라이머(vp1; O형 구제역 바이러스의 염기서열 2840-3478 부위 증폭용)
포워드 5´-프라이머(vpf1): 5´-GGAGTCTATGACCACCTCTGCGGGTGAGTCTGCG-3´
리버스 5´-프라이머(vpr1): 5´-GGAGCTCTTTGAACAAATTACTGTTTTGCGGGTGCCAC-3´
②vp2증폭용 프라이머(vp2; O형 구제역 바이러스의 1526-2179 부위 증폭용)
포워드 5´-프라이머(vpf2): 5´-GGAGTCTATGGACAAGAAGACGGAAGAAACCCAC-3´
리버스 5´-프라이머(vpr2): 5´-GGAGCTCTTTGAACAAATTACTCTTTAGAGGGGAGCTC-3´
③vp3 증폭용 프라이머(vp3; O형 구제역 바이러스의 염기서열 2840-3478 부위 증폭용)
포워드 5´-프라이머(vpf3): 5´-GGAGTCTATGGGGATTTTCCCCGTGGCATGCAGC-3´
리버스 5´-프라이머(vpr3): 5´-GGAGCTCTTTGAACAAATTATTGGGTTCGGGCGTCGAC-3´
④vp4 증폭용 프라이머(vp4; O형 구제역 바이러스의 염기서열 1319-1525 부위 증폭용)
포워드 5´-프라이머(vpf4): 5´-GGAGTCTATGGACAAGAAGACGGAAGAAACCACC-3´
리버스 5´-프라이머(vpr4): 5´-GGAGCTCTTTGAACAAATTATGCAAGAAGAGCACCGAAG-3
상기 프라이머를 사용하여 증폭된 각 cDNA 절편을, 유전자 전달용 플라스미드인 pGEM-T 벡터(Promega사에서 구입)에 클로닝하였다. 그런 다음, 이 벡터를 형질전환용 DH5(GibcoBRL life Techologies 사에서 구입) 대장균에 형질전환시켜 상기 cDNA 절편들을 증폭하였고, 각 절편의 염기서열은 ABI 377 염기서열 자동분석기 (Perkin Elmer사)를 이용하여, 클로닝된 플라스미드의 염기서열을 확인하였다. pGEM-T 벡터를XbaI과SacI 제한효소로 처리하여, 확인된vp1, vp2,vp3 및vp4의 유전자 절편을 분리하였다.
(2) 식물에서 발현 가능한 벡터 pBI- vp 1 , pBI -vp 2, pBI -vp 3 또는 pBI -vp 4의 제작
아그로박테리움의 Ti-플라스미드 내에, 식물체 발현효율을 높이기 위한 35S 프로모터, 형질전환 감자를 선발하기 위한 카나마이신 저항성 유전자nptII 및 외부 유전자 삽입에 필요한 다중 클로닝 부위를 포함하고 있는 식물체 발현벡터 pBI121(Clontech사)를아그로박테리움을 형질전환시키기 위한 벡터로 사용하였다 (Wicher, D.R.et. al.(1988)Mol Breed 4:301-312).
상기 pBI121 벡터를XbaI 및SacI로 처리하여, β-글루쿠론니다아제 (glucuronidase;gus) 유전자를 제거한 다음, 이 부위에 상기 (1)에서 분리된vp1, vp2, vp3 및vp4 유전자 절편을 삽입하여, 재조합 식물체 발현벡터 pBI-vp1, pBI-vp2, pBI-vp3 또는 pBI-vp4를 제조하였다.
한편, 식물체 발현벡터 pBI121 및 여기에 구제역 바이러스 외막 단백질이 삽입된 발현벡터의 유전자 연결순서는 다음과 같다.
pBI121 벡터: - RB - NOS -nptII - NOS - CaMV -GUS- NOS - LB-
pBI-vp벡터: CaMV(XbaI)-vp1, vp2,vp3 또는vp4-종결코돈 -(SacI)NOS
여기에서, RB/LB는 오른쪽/왼쪽 경계부위를, NOS는아그로박테리움이 이용할 수 있는 특이적 아미노산인 노팔린을 만드는 유전자의 프로모터를, CaMV는 코울리플라워 모자익 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 프로모터(35S 프로모터)를 의미한다.
(3) 감자에서 단백질 발현효율을 높이기 위한 벡터 제조
소포체내 잔류 시그날 펩타이드(Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu; -SEKDEL)를 코딩하는 DNA 염기서열을 구제역 바이러스의 외막단백질 뒷부분에 삽입하기 위해 다음의 방법을 수행하였다. 우선, 상기 (1)에 기재된 vpf1, vpf2, vpf3 및 vpf4의 포워드 5´-프라이머 및 하기의 ERpr5-1, ERpr5-2, ERpr5-3 및 ERpr5-4의 리버스 5´-프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, (1)에서 제조된 것과는 약간 변형된 구제역 바이러스 외막단백질 cDNA 절편을 얻어내었다.
5´-프라이머(ERpr5-1) : 5´-GAAGGGAAGCTTCTGTTTTGCGGGTGCCACAA-3´
5´-프라이머(ERpr5-2) : 5´-GAAGGGAAGCTTCTCTTTAGAGGGGAGCTCAC-3´
5´-프라이머(ERpr5-3) : 5´-GAAGGGAAGCTTTTGGGTTCGGGCGTCGACCG-3´
5´-프라이머(ERpr5-4) : 5´-GAAGGGAAGCTTTGCAAGAAGAGCACCGAAG-3´
그런 다음, Haq, A. T.et. al.(1995)Science 268 :714-715에 기재된 방법에 따라, 하기의 포워드 5´-프라이머(Hindpf6) 및 리버스 5´-프라이머 (Hindpr6)를 사용하여, TEA 완충액에서 94℃에서 변성(denature)시킨 후, 37℃에서 배양시킴으로써, 소포제 잔류 시그날 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 올리고 DNA(Hindp)를 합성하였다.
5´-프라이머(Hindpf6) : 5´-AGCTTTCTGAGAAAGATGAGCTATAAGAGCT-3´
5´-프라이머(Hindpr6): 5´-CTCATAGCTCATCTTTCTCAGAA-3´
상기 리버스 5´-프라이머 ERpr5-1, ERpr5-2, ERpr5-3 및 ERpr5-4로 PCR 증폭시킨 산물을 제한효소 HindⅢ로 처리한 후, 각각에 접합효소와 완충용액으로 16℃에서 12시간 배양하여, PCR 산물에 상기 올리고 DNA를 접합시켰다.
이렇게 Hindp가 접합된 ERpr5-1, ERpr5-2, ERpr5-3 및 ERpr5-4에 의해 생성된 PCR 산물을, pBI121의 GUS 유전자 부위에 도입하여 클로닝한 식물 발현벡터를 각각 pBERHV1, pBERHV2, pBERHV3 및 pBERHV4로 명명하였다.
(4) 곤충세포 발현벡터 제작
구제역 바이러스의 외막 단백질 유전자vp1, vp2, vp3 및vp4 유전자를, 곤충세포(Spodoptera frugierda,sf9 cells)에서 발현시키기 위해서, 다음 8개의 프라이머를Vet. Microbiol.(2000)74(3): 207-216에 기재된 방법으로 제작하였다.
①vp1(O형 구제역 바이러스의 염기서열 2840-3478 부위 증폭용)
psfVP1f : 5´-GAATTCACCACCTCTGCGGGTGAGTCTGC-3´
psfVP1r : 5 -GAGCTCTTACTGTTTTGCGGGTGCCACAA-3´
②vp2(O형 구제역 바이러스의 염기서열 1526-2179 부위 증폭용)
psfVP2f : 5´-GAATTCGACAAGAAGACGGAAGAAACCA-3´
psfVP2r : 5´-GAGCTCTTACTCTTTAGAGGGGAGCTCAC-3´
③vp3(O형 구제역 바이러스의 염기서열 2840-3478 부위 증폭용)
psVP3f : 5´-GAATTCGGGATTTTCCCCGTGGCATGCAG-3´
psfVP3r : 5´-GAGCTCTTATTGGGTTCGGGCGTCGACCG-3´
④vp4(O형 구제역 바이러스의 염기서열 1319-1525 부위 증폭용)
psfVP4f : 5´-GAATTCGGCGCCGGGCAATCCAGCCGGG-3´
psfVP4r : 5´-GAGCTCTTATGCAAGAAGAGCACCGAAG-3´
이 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여vp1, vp2, vp3 또는vp4 유전자를 증폭한 후, pGEM-T 벡터에 접합효소와 완충용액으로 클로닝한 다음, 형질전환용 숙주세포 DH5에서 상기 구제역 외막 단백질 유전자를 증폭하였고,vp1, vp2, vp3 또는vp4 유전자 절편을EcoRI 및SacI 제한효소로 처리하여 구제역 바이러스의 외막단백질 유전자를 분리하였다.
베큘러바이러스 전이용 벡터 pAcHLT-A(Pharmingen사에서 구입한 제품, 1999, Baculovirus Expression Vector System Manual 6th Edition)를EcoRI 및SacI 제한효소로 처리한 후, 상기 제조된vp1, vp2,vp3 또는vp4 유전자를 삽입하여, 곤충세포 발현벡터 pAcHLT-vp1,pAcHLT-vp2,pAcHLT-vp3 또는 pAcHLT-vp4를 제조하였다.
(5) 베큘러바이러스 벡터에 의한 곤충세포 형질감염 및 발현
Kid, I.M.et. al.,(1993)Applied Biochemistry and Biotechology.42:137-159에 기재된 방법에 따라, 상기 발현벡터 pAcHLT-vp1,pAcHLT-vp2,pAcHLT-vp3또는 pAcHLT-vp4와Bsu361 이라는 제한효소로 처리되어 선형화된 베큘러바이러스 DNA를, 곤충세포(sf9 cells, Pharmingen사)와 함께 박펙틴(Bacfectin) 완충용액을 이용하여 27℃에서, 3시간 동안 그레이스 배지에서 배양하였다. 형질감염 키트(Transfection kit)는 Pharmingen사에서 구입한 것을 사용하였다. 12시간 배양한 후, 10% 우태아 혈청과 항생제가 함유되어 있는 새로운 그레이스 배지에 재조합 감염세포를 옮긴 후, 7일 동안 27℃에서 배양하였다. 7일 후, 곤충세포가 완전히 파괴되기 전에, 배양배지를 멸균된 50㎖ 튜브로 옮기고, 분해용액으로 세포막을 완전히 파괴하였다. 원심분리로 여러 가지 세포 분해물질과 pAcHLT-vp1,pAcHLT-vp2,pAcHLT-vp3또는 pAcHLT-vp4에 의해 발현된 재조합 단백질(6x His Tag이 붙어 있는 목적 단백질)을 친화 매트릭스(affinity matrix)로부터 추출한 후, 트롬빈을 처리한 다음, 아가로스 비드를 이용하여 구제역 바이러스 재조합 외막단백질 RVP1, RVP2, RVP3 또는 RVP4을 정제하고, SDS-PAGE로 확인한 후, -70℃에서 보관하였다.
(6) 재조합 단백질(RVP1, RVP2, RVP3 또는 RVP4)을 이용한 쥐에서의 모노클로날 항체(Anti-RVP1, Anti-RVP2, Anti-RVP3 또는 Anti-RVP4)의 생산
상기에서 분리한 재조합 단백질을, 형질전환 감자의 형질전환 여부를 확인하기 위한 모노클로날 항체 생산을 위해서 면역원으로 사용하였다.
면역 당일은, RVP1, RVP2, RVP3 또는 RVP4의 항원 재조합 단백질 및 플로인트의 완전 아쥬반트(FCA, Gibco BRL life Techologies LTd에서 구입)를 피스톤 운동으로 잘 혼합하여 얻은 용액을, 쥐(Balb/C 암쥐; 대한 바이오 링크 실험동물 쎈터에서 구입)의 복강에 주사하여 면역시키고, 상기 항원 단백질 및 플로인트의 불완전 아주반트(Freund´s incomplete adjuvent)를 혼합한 용액을 쥐의 발바닥, 꼬리 및 복강에 주사하여 2차∼4차 면역을 더 유도하였다. 그런 다음, 면역화된 쥐의 비장 세포를 확보하기 전에, 혈액을 채취하여 폴리클로날 항체를 얻어내었다. 폴리에틸렌글리콜(Polyethlyleneglycol : PEG)을 이용하여, 6주령 Balb/C 암쥐의 비장 세포 및 골수종 세포(SP2/0)를 융합시킨 후, 96-웰 플레이트에서 융합세포를 증식시켰다. 그런 다음, 니겔 젠킨스(Nigel Jenkins)가 이용한 방법(Nigel Jenkins, 1999.Animal cell Biotechology73-98)에 따라 하이브리도마 세포(hybridoma cell)를 선발하였다. 그런 다음, 하브리도마 세포에서 생산된 모노클로날 항체는 이후 실험에서 웨스턴 블랏 검사에 이용하였다.
(7) 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciences LBA4404)의 형질전환
상기 (3)에서 제조된 벡터 pBERHV1, pBERHV2, pBERHV3 또는 pBERHV4를 일렉트로포레이션법(electroporation)에 의해,아그로박테로움 투메파시엔세스LBA4404에 도입하여 형질전환시키고, 카나마이신이 함유된 LB 배지에 접종하여, 28℃, 250rpm으로 현탁배양하였다. 48시간 배양한 후, 형질전환된아그로박테리움을 선발하고, An, G.et. al.(1988)In Plant Molecular Biology Manual A3: 1-19,Kluwer Academic Publisher에 기재된 방법에 따라,아그로박테리움으로부터 분리한 DNA를 제한효소로 처리한 후, 전기영동법 및 PCR법으로 상기 형질전환 벡터의 삽입을 확인하였다.
(8) 아그로박테리움( A.tumefaciences LBA4404)을 이용한 감자의 형질전환
상기 (7)에서 선발한 형질 전환된아그로박테리움을 재배 적응성이 좋은 수미품종을 공시재료로 이용하여 형질전환 실험을 Yl,Jung-Yoon,et. al.(1998) Korean J. Plant Tissue Culture25:109-113에 의거하여 수행하였다.
즉, 감자 뿌리를 옥신 계열의 2,4-D 호르몬이 첨가된 배지에서 배양하고, 이로부터 분리한 감자 뿌리절편을 형질전환 효율을 높이기 위하여 광 상태에서 30분 정도 단독으로 전처리하였다. 그런 다음, 구제역 바이러스의 외막단백질 유전자를 감자 세포의 크로모좀 DNA에 삽입하기 위해서 상기 (7)의 pBERHV1, pBERHV2, pBERHV3 또는 pBERHV4로 형질전환된아그로박테리움을 28℃, 암 상태에서 48시간 동안 더 배양하여 감자에 형질감염시켰다. 접종된 감자절편으로부터,아그로박테리움을 제거하기 위해 배양배지 내에 카베니실닌(cabenicillin)을 처리하였다. 감자 절편의 표면에 묻어있는 배지와 항생제는 여과지를 이용하여 제거하였고, 이를 건조시킨 후, 이 절편을 MS배지에 2,4-D 2㎎/ℓ가 첨가된 공동배양배지(Co-culture mediume)에서 2일정도 배양하였다. 그 후, 절편을 MS배지에 카나마이신 50㎎/ℓ, 카베니실린 1000㎎/ℓ, 지아틴(Zeatin) 2㎎/ℓ, 알파-나프틸아세트산(NAA) 0.01㎎/ℓ 및 지베릴릭 산(Gibelellic Acid:GA) 0.1㎎/ℓ가 첨가된 유도배지에서 캘러스를유기하였다. 그 다음, Conger, et.. al.(1983)Science 221: 850-851에 기재된 방법에 따라, 체세포에서 배(embryo)가 유도되도록 발생초기에 옥신계열 식물생장 호르몬인 2,4-D 2㎎/ℓ를 첨가하여 캘러스(callus)가 생기도록 유도하였다.
성숙한 체세포를 2,4-D가 제거된 MS배지에서 뿌리와 잎을 유도하였다. 이 캘러스를 MS배지에 벤질아데닌(Benzyl Adenine:BA) 0.25㎎/ℓ, 지베리니 산 0.1㎎/ℓ, 카나마이신 100㎎/ℓ및 카베니실린 500㎎/ℓ가 첨가된 재분화 배지에 옮겨 식물체의 재분화를 유도하였고, 재분화된 감자는 카나마이신이 첨가된 MS배지에 옮겨 형질전환 감자를 선별하였다.
(9) 형질전환 감자의 선별
형질전환된 감자를 Valvekens, D.et. al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5536-5540에 기재된 방법에 따라 선별하였다.
즉, 상기 (8)의 재분화 유도 배지에 형질 전환감자를 선발할 수 있는 일정량의 카나마이신을 첨가하여nptII 유전자를 가지지 않는 감자를 괴사(necrosis)시켜 형질전환 감자를 선별하였다. 형질전환 감자에 삽입된 박테리아의 효소인 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(Neomycin phosphotransferase)를 encode하는nptII 유전자는 인산화작용(phosphorylation)에 의해서 항생제 카나마이신을 불활성화시켜서 선택배지에서도 형질전환 감자를 얻을 수 있었다.
(10) 형질전환 감자분석
선별된 형질전환 감자의 확인은 서던 블랏 분석, 노던 블랏 분석, 웨스턴 블랏 분석을 통해 수행할 수 있다.
ⓐ 서던 블랏 분석
vp1, vp2, vp3 또는vp4 유전자의 감자의 염색체 내로의 삽입 여부와, 감자 염색체의 어느 부분에 들어갔는지 확인하기 위해, Southern, E. M. (1975)J. Mol. Biol.98: 503-517에 기재된 방법에 따라 서던 블랏 분석을 수행하였다.
ⓑ 노던 블랏 분석
형질전환된 감자에서 도입된 구제역 바이러스 외막단백질 유전자의 발현정도를 전체 세포질의 RNA(Total cellular RNA)의 발현정도로 확인하기 위해, 감자의 줄기, 잎 또는 씨알(0.5g 내지 1.0g)을 잘 갈아서 Alwine, J. C.et. al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350-5354에 기재된 방법에 따라 노던 블랏을 수행하였다.
ⓒ 웨스턴 블럿 분석
단백질 수준에서, 구제역 바이러스 외막 단백질 VP1, VP2, VP3 또는 VP4의 발현량을 확인하기 위해서, 상기 (6)의 쥐로부터 분리한 모노클로날 항체(Anti-RVP1, Anti-RVP2, Anti-RVP3, Anti-RVP4)를 이용하여 SDS-PAGE 분석을 수행함으로써, 구제역 바이러스 외막 단백질 VP1, VP2, VP3 또는 VP4의 발현량을 확인하였다 (Higgins, J. V. and Spencer, D.(1991)Plant Science 74:89-98).
(11) 생체에서 면역화 정도 측정
먼저, 형질전환 감자가 생산하는 항원단백질을 다음과 같은 방법으로 분리 확인하였다.
즉, 2㎖ 에펜드로프 튜브에 단백질 추출 완충용액(100mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM EDTA, 5% SDS 및 20% Sucrose) 300~500㎕와 최대한 잘 분쇄한 형질전환 감자 1.5㎖를 넣은 다음, 튜브를 약하게 교반해서 잘 섞이게 한 후, 얼음에서 20분 동안 저장하고, 다시 약하게 교반해서 잘 섞은 다음, 15,000rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액의 일부(5㎕)는 5% 머캅토에탄올과 10분정도 열처리하여 SDS-PAGE로 전기영동하여 해당 단백질 VP1(25KDa), VP2(26KDa), VP3(25KDa), VP4(8KDa)을 확인하였다.
그런 다음, 확인된 각 항원 단백질 일정량을 소에 피하 주사하여 생성된 항체의 역가를 ELISA법으로 검사하여 항원 단백질의 생체내 면역화 유발 정도를 측정하였다.
(11-1) ELISA법
재조합 항원 단백질이 코팅된 ELISA용 플레이트에 외막 단백질을 각각 피하주사하고 7일 후에 채혈을 한 다음, 이 혈액을 3,000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고, 이 혈청을 사용하여 John R.C.(1995)Methods in Moleculor Biology 42 :131-160에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
(12) 후대발현 및 후대 안전성검증
형질전환 감자의 후대 발현 및 안전성 검정은 멘델리안 경향(Medelianfashion) 검정 분석 및In situ기법을 이용한 식물염색체 내에 형질전환 유전자 위치의 결정으로 행할 수 있다(Angerer, L. M.et. al(1987)Methods Enzymol. 152: 649 - 661).
즉, 형질전환된 감자가 도입된 형질을 차세대로 전달할 경우, 멘델의 유전법칙에 따라 우성인자와 열성인자의 비가 3:1로 유전되는지를 확인하여 후대에 도입된 형질을 안전하게 전달하는지를 검정하였다.
(13) 시험 백신의 야외 접종시험
먼저 실험용 쥐를 가지고 본 발명의 형질전환 감자의 백신으로서의 유용성을 검정하였다.
즉, 형질전환된 감자 얼린 것 50~100mg을 인산염 생리식염수에 0.025% 트윈20(phosphate-buffered saline-0.025% Tween 20)이 포함된 용액 1㎖에서 잘 갈아서 원심분리한 다음, 상층액을 불완전 아주반트(Freund´s incomplete adjuvent) 0.5㎖와 혼합한 후, 쥐(Balb/C)의 복강에 당일, 21일 후 및 35일 후 세차례 접종하였다.
20마리의 쥐(Balb/C)에게 감자 백신을 처음 접종한 다음 140일이 지난 후(마지막 접종 60일 후) 104TCID50(50% 종말점) 구제역 바이러스를감염시켜 식물유래 백신의 효과를 검증하였다. 즉, 감자 백신이 투여된 쥐에 바이러스를 감염시킨 후 5-6일 후에 혈액중에 존재하는 바이러스 유무로 판정하였다.
그 결과, 쥐에서 이 감자백신의 구제역 바이러스에 대한 유용성이 확인되었다.
한편, 소에도 이를 적용하였다. 즉, 소는 다른 동물과는 달리 항원에 대한 항체의 형성비가 매우 낮기 때문에 많은 양의 감자 추출물을 3개월 이상 직접 먹여서 항체의 역가를 높인후 상기에서 언급한 방법대로 실시하였다. 그 결과, 소에서도 이 감자백신의 구제역 바이러스에 대한 유용성이 확인되었다.
본 발명에 의한 형질전환 감자는 형질전환 감자를 기존의 감자 재배기술로도 대량 생산할 수 있으므로, 구제역 바이러스에 대한 면역효과를 갖는 감자사료 백신을 대규모 생산할 수 있다.
본 발명의 구제역 바이러스 백신은 종래 불활화 백신이 아형(type)이 다르면 면역효과가 현저하게 줄어들기 때문에 아형에 따라 백신을 제조하여야 하는 것과 달리 모든 아형에 대해서 유사한 백신효과를 가짐으로 유용성이 있다.
또한, 본 발명에서 제조한 형질전환 감자를 사료화하여 가축에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 가축에게서 점막면역을 통해, 구제역 바이러스 외피에 대한 항체 형성을 유도하여 면역효과를 유발시킬 수 있다. 따라서, 외막단백질은 구제역 바이러스의 활성에 전혀 관여하지 않고, 가축에게서 면역효과를 유발시킬 수 있기 때문에, 불활화 바이러스 백신(attanuated virus vaccine) 보다 안전성 면에서 우수하다. 또한, 형질전환 감자는 사료로서 이용할 수 있기 때문에, 일반인들도 쉽게 이용하여 가축의 면역화를 유발시킬 수 있으며, 가축에게서 지속적으로 항원성 단백질을 투여하는 효과를 나타낼 수 있어 기존의 불활화 바이러스 백신과 같이 일정한 간격을 두고 백신을 투여할 필요가 없고, 백신의 투여에 의해서 가축의 상품성이 떨어지지도 않기 때문에, 농가에 고부가 수익을 기대할 수 있다.

Claims (4)

  1. 식물 유래의 백신의 제조방법에 있어서,
    1) 구제역 바이러스로부터 PCR을 이용하여 외막단백질인vp1, vp2, vp3또는vp4유전자를 분리하는 단계;
    2) 상기 유전자를 감자에 발현시키기 위해서아그로박테리움의 플라스미드에 클로닝할 수 있는 감자 발현벡터를 구축하는 단계;
    3) 상기 발현벡터를아그로박테리움에 도입하여아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;
    4) 상기 형질전환된아그로박테리움과 감자 식물조직을 함께 배양하여,아그로박테리움내의 식물 발현벡터에서의 상기 외막 유전자를 감자 식물의 크로모좀내로 삽입시킴으로써 형질전환 감자를 제조하는 단계;
    5) 형질전환된 감자의 발현특성을 분석하는 단계; 및
    6) 상기 발현특성이 검정된 감자의 발아된 조직 절편을 배양하여 형질전환 감자를 재분화시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 식물 유래 백신용 형질전환 감자를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 1) 단계의 외막단백질vp1, vp2, vp3또는vp4유전자가 소포체내 잔류 시그널을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 방법으로 제조된 형질전환 감자.
  4. 제 3항에 기재된 형질전환 감자를 사료 또는 구제역 바이러스에 대한 식물 유래의 백신으로 가축에 섭취시킴으로써 가축을 면역시키는 방법.
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