KR20030012281A - 돼지콜레라 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는형질전환 감자 및 이의 제조방법 - Google Patents

돼지콜레라 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는형질전환 감자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지콜레라 바이러스(Hog Cholera Virus)의 당 단백질을 코딩하는 gp55 유전자 또는 캡시드 단백질을 코딩하는 core 유전자를 감자에 도입하여, 이 유전자들을 발현할 수 있는 형질전환 감자를 제조하는 방법 및 gp55 유전자에 의해 형질전환된 감자 및 core 유전자에 의해 형질전환된 감자의 혼합물을 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과를 유발하기 위해, 식물 유래 백신으로 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

돼지콜레라 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환 감자 및 이의 제조방법{Transformed potato for using vaccination on hog cholera virus and method for preparation thereof}
본 발명은 돼지콜레라 바이러스(Hog Cholera Virus)의 당 단백질을 코딩하는 gp55 유전자 또는 캡시드 단백질을 코딩하는 core 유전자를 감자에 도입하여, 이 유전자들을 발현할 수 있는 형질전환 감자를 제조하는 방법 및 gp55 유전자에 의해 형질전환된 감자 및 core 유전자에 의해 형질전환된 감자의 혼합물을 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과를 유발하기 위해, 식물 유래 백신으로 사용하는 것에 관한 것이다.
돼지콜레라(Hog cholera : HC)는 돼지콜레라바이러스(Hog cholera virus : 이하 "HCV"라 함)가 원인체로써 현재 국내 돼지질병중 양돈산업에 경제적 손실을 크게 입히는 전염성 질병의 하나로 매년 지속적으로 생독 백신을 접종하고 있음에도 불구하고 산발적으로 발생하고 있는 실정이다. 돼지콜레라 바이러스는 전염성, 폐사율 및 이환률이 매우 높으며 감수성 있는 모든 연령의 돼지에 감염될 수 있다. 감염된 돼지는 일반적으로 고열, 피부발적, 식욕결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소,후구마비, 유사산 등의 번식장애 등을 수반한다.
돼지콜레라는 1830년에 미국에서 처음 발생된 이래 전세계적으로 발생하였으나 최근에는 박멸정책에 의해 미국, 캐나다, 영국, 아이슬란드, 아일랜드, 스칸디나비아 3국, 뉴질랜드, 호주 등에서는 발생하지 않고 있다. 우리나라에서는 1947년 서울근교 농장에서 발생한 것이 처음 공식적으로 보고되었으며, 이 후 돼지콜레라 순화생독 바이러스인 LOM BK+주(株)에서 EXD(Exaltation of Newcastle disease Virus: 수리주) 음성주를 클로닝하여 이를 생독 백신으로 사용하고 있으나, 매년 전국에서 산발적으로 발생되고 있어, 이 질병의 근본적인 근절이 필요한 실정이다.
HCV는 플라비비리데(Flaviviridae)과의 페스티바이러스(pestivirus)속에 속하는 바이러스이다. 이 바이러스의 염기는 단일가닥의 (+) 센스 RNA이며, 그 크기는 12,283bp이다. 이 바이러스는 한 개의 커다란 단백질 전구물질을 암호화하며, 바이러스가 돼지에 감염될 때 세포와 바이러스의 프로테이나아제에 의해 분리되어 여러개의 완성된 단백질이 된다(Moormann R. J. M.et al.(1990)Virology 177 : 184 - 198). 이 바이러스가 코딩하는 단백질들은 염기서열 순서대로 처음 비 구조 단백질(non structural protein)인 P23을 코딩하는 부위, 구조 단백질(structural protein)인 core 부위, 세 개의 당 단백질 E0(gp44), E1(gp33), E2(gp55)(Virus Genes 16:2, 225-234, 1998)를 연속적으로 코딩하는 부위, 그 다음으로 비 구조 단백질인 NS 그룹 6개를 코딩하는 부위가 존재하는 것으로 밝혀져 있는데(Meyers G.et. al.(1996)J.Virology 70 : 1588 - 1595), 이중 중요 방어 항원인 gp55가 HCV에 대한 중화항체 생산에 가장 중요한 역할을 한다.
따라서, 종래 분자생물학의 발달과 더불어 돼지콜레라 바이러스의 항원유전자인 gp55 유전자를 이용하여 효과가 우수한 백신을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 본 발명도 이러한 연구의 일환으로 이루어진 것이다.
그러나, 본 발명자들은 돼지콜레라 바이러스에 대한 예방효과가 우수할 뿐만 아니라 누구나 손쉽고, 안전하게 투여할 수 있으며, 그 제조 또한 용이한 백신을 개발하고자 하였다.
그 결과, 식물 발현 시스템을 이용하여 돼지콜레라 바이러스의 당 단백질인 GP55 단백질을 발현할 수 있는 형질전환 감자를 제조하고, 이 형질전환 감자를 사료로서 돼지에게 섭취시키는 것에 의해, 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과를 유발시킬 수 있으며, 따라서, 이 형질전환 감자를 식물 유래 백신으로서 이용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
또한, 본 발명자들은 돼지콜레라 바이러스와 유사한 C형 감염 바이러스에서 T-세포와 B-세포에 의해 조절되는 면역반응에 캡시드 단백질의 에피토프(epitope)가 관여한다는 사실로부터, 돼지콜레라 바이러스의 캡시드 단백질을 발현할 수 있는 형질전환 감자를 제조한 후, 이를 상기 GP55 단백질을 발현하는 형질전환 감자와 혼합하여 돼지에게 사료로 섭취시키는 경우에, 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과가 더욱 향상된다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지콜레라 바이러스의 당 단백질인 gp55 유전자와 캡시드 단백질인 core 유전자가 도입된 형질전환 감자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 감자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 gp55 유전자가 도입된 형질전환 감자와 core 유전자가 도입된 형질전환 감자의 혼합물을 돼지콜레라 바이러스에 대한 식물 유래의 백신으로 이용하여, 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역을 유발시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 식물 유래 백신으로서의 형질전환감자를 제조하는 방법은,
1) 돼지콜레라 바이러스로부터 PCR을 이용하여 당단백질인 GP55를 코딩하는 gp55 유전자 또는 캡시드 단백질인 CORE를 코딩하는 core 유전자를 분리하는 단계;
2) 상기 유전자를 감자에 발현시키기 위해서,아그로박테리움의 플라스미드에 클로닝할 수 있는 감자 발현벡터를 구축하는 단계;
3) 상기 발현벡터를아그로박테리움에 도입하여아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;
4) 상기 형질전환된아그로박테리움과 감자 식물조직을 함께 배양하여,아그로박테리움내의 식물 발현벡터에서의 상기 당 단백질 유전자 또는 캡시드 단백질 유전자를 감자 식물의 크로모좀내로 삽입시킴으로써 형질전환 감자를 제조하는 단계;
5) 형질전환된 감자의 발현특성을 분석하는 단계; 및
6) 상기 발현특성이 검정된 감자의 발아된 조직 절편을 배양하여 형질전환 감자를 재분화시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 감자의 형질전환 방법은, 형질전환 감자에서 이들 당 단백질또는 캡시드 단백질의 발현을 더욱더 효과적으로 유도하기 위해서, 상기 단계 1)에서 돼지콜레라 바이러스로부터 PCR을 이용하여 당 단백질 또는 캡시드 단백질을 분리할 때, 3´-말단 측에서 소포체 잔류 시그날 펩티드를 코딩하는 염기서열(ER retension singnal peptide)을 더 부착한 형태의 유전자로 분리하여, 이를 감자에서 발현시키기 위한 유전자로서 이용할 수 있다.
또한, 상기 단계 4)에서 형질전환된 감자의 발현 특성을 분석하기 위해서, 서던 블랏 분석 및 노던 블랏 분석 뿐만 아니라, 상기 단백질들에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 분석할 수 있다.
이때, 모노클로날 항체의 생산 방법은, 돼지콜레라 바이러스로부터 PCR을 이용하여 당 단백질 gp55 유전자 또는 캡시드 단백질 core 유전자를 분리하는 단계; 상기 당 단백질 유전자 또는 캡시드 유전자를 곤충세포 발현 벡터에 삽입하는 단계; 베큘러바이러스와 곤충세포 발현벡터와의 상동 재조합을 통해 재조합 베큘러바이러스를 생산하는 단계; 상기 재조합 베큘러바이러스를 곤충세포에 형질감염시키는 단계; 재조합 곤충세포로부터 상기 당 단백질 GP55 또는 캡시드 단백질 CORE를 정제하는 단계; 상기 정제된 단백질 각각을 쥐에 면역시키고, 면역된 쥐로부터 각각 비장세포를 분리하는 단계; 분리된 비장세포를 골수종세포와 융합시킨 후, 융합세포로부터 모노클로날 항체를 얻는 단계를 포함한다.
상기에서 얻어진 모노클로날 항체들은 각각 상기 형질전환 감자에서의 당 단백질 또는 캡시드 단백질 발현을 확인하는데, 예를 들면 웨스턴 블랏 분석 등에 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 제조한 형질전환 감자는 이를 사료화하여 돼지에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 돼지에게서 돼지콜레라 바이러스에 대한 항체 형성을 유도하여 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과를 유발시킬 수 있다. 이때, gp55 유전자로 형질전환된 감자를 단독으로 사용할 수 있지만, gp55 유전자로 형질전환된 감자와 core 유전자로 형질전환된 감자를 혼합하여 이를 백신으로 사용하는 것이 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과가 더 우수하다.
한편, 당 단백질 또는 당 단백질과 캡시드 단백질의 혼합물은 돼지콜레라 바이러스의 활성에 전혀 관여하지 않고 돼지에게서 면역효과를 유발시킬 수 있기 때문에, 생독백신(attanuated virus vaccine) 보다 안전성 면에서 우수하다.
또한, 형질전환된 감자를 사료로서 이용할 수 있기 때문에, 일반인들도 쉽게 이를 이용하여 돼지의 면역화를 유발시킬 수 있는 장점이 있다.
한편, 본 발명의 형질전환 감자를 이용하여 면역화를 얻어낼 수 있는 가축의 예로는, 돼지, 멧돼지, 흑 돼지 등의 돼지콜레라 바이러스에 쉽게 노출되어 질병을 일으키는 돼지종이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
(1) 프라이머 작성과 염기서열 확인
돼지콜레라 바이러스의 당 단백질 GP55를 코딩하는 gp55 유전자와 캡시드 단백질 CORE를 코딩하는 core 유전자 절편을 합성하기 위해, 돼지콜레라 바이러스의 RNA를 역전사 효소 및 리버스 5´-프라이머를 사용하여 역전사-연쇄중합반응 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)으로 일차 cDNA(First cDNA)를 합성하였다. 그런 다음, 일차 cDNA, 포워드 5´-프라이머 및 리버스 5´-프라이머를 사용하여, 해당 유전자 절편을 합성하였다(SAIKI, R.K.,et al.(1988)Science 239: 487-491).
이때 사용된 프라이머 서열은 Moormann R. J. M.et al.(1990)Virology 177 : 184 - 198와 JAU-JUN LIU,et al.(1998)Virus Genes 16(2) : 225 - 234에서 발표된 돼지콜레라 바이러스 전체 염기서열을 근거로 제작하였다.
이들 유전자를 증폭하기 위한 각 프라이머들은, 포워드 5´-프라이머 내에 밑줄친 부분의 XbaⅠ 제한효소 인식 위치를 포함하고 있으며, 번역개시 코돈을 포함하고 있다. 또한, 리버스 5´-프라이머에는 밑줄친 부분의SacI 제한효소 인식 위치 및 번역종료 코돈을 포함하고 있다. 그러한 프라이머의 서열은 다음과 같다.
① gp55 증폭용 프라이머 쌍(염기서열 2426~3462 부위 증폭용)
포워드 5´-프라이머(gp55f1): 5´-GGAGCTCATGCAAGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATCA-3´
리버스 5´-프라이머(gp55r1): 5´-GGAGCTCTTTGAACAAATTAGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3´
② core 증폭용 프라이머 쌍(염기서열 753-1229 부위 증폭용)
포워드 5´-프라이머(coref1): 5´-GGAGTCTATGTACGTGTGCATCGATGGTTGCATCCTGCT-3´
리버스 5´-프라이머(corer1): 5´-GGAGCTCTTTGAACAAATTAACTAAGGTACATAGCGTGC-3´
상기 프라이머를 사용하여 증폭된 각 cDNA 절편을, 유전자 전달용 플라스미드인 pGEM-T 벡터(Promega사에서 구입)에 클로닝하였다. 그런 다음, 이 벡터를 형질전환용 DH5(GibcoBRL life Techologies 사에서 구입) 대장균에 형질전환시켜 상기 cDNA 절편들을 증폭하였고, 각 절편의 염기서열은 ABI 377 염기서열 자동분석기 (Perkin Elmer사)를 이용하여, 클로닝된 플라스미드의 염기서열을 확인하였다. pGEM-T 벡터를XbaI과SacI 제한효소로 처리하여, 확인된 돼지콜레라 바이러스 gp55 및 core 유전자 절편을 분리하였다.
(2) 식물에서 발현 가능한 벡터 pBIHCV-gp55 또는 pBIHCV-core의 제작
아그로박테리움의 Ti-플라스미드 내에, 식물체 발현효율을 높이기 위한 35S 프로모터, 형질전환 감자를 선발하기 위한 카나마이신 저항성 유전자nptII 및 외부 유전자 삽입에 필요한 다중 클로닝 부위를 포함하고 있는 식물체 발현벡터 pBI121(Clontech사)를아그로박테리움을 형질전환시키기 위한 벡터로 사용하였다 (Wicher, D.R.et. al.(1988)Mol Breed 4:301-312).
상기 pBI121 벡터를XbaI 및SacI로 처리하여, β-글루쿠론니다아제 (glucuronidase;gus) 유전자를 제거한 다음, 이 부위에 상기 (1)에서 분리된 gp55 유전자 및 core 유전자 절편을 각각 삽입하여, 재조합 식물체 발현벡터 pBIHCV-gp55 및 pBIHCV-core를 제조하였다.
한편, 식물체 발현벡터 pBI121 및 여기에 상기 유전자들이 삽입된 발현벡터의 순서는 다음과 같다.
pBI121 벡터: - RB - NOS -nptII - NOS - CaMV -GUS- NOS - LB-
pBIHCV-gp55 또는 pBIHCV-core 벡터: CaMV(XbaI)- gp55 또는 core-종결코돈 -(SacI)NOS
여기에서, RB/LB는 오른쪽/왼쪽 경계부위를, NOS는아그로박테리움이 이용할 수 있는 특이적 아미노산인 노팔린을 만드는 유전자의 프로모터를, CaMV는 코울리플라워 모자익 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 프로모터(35S 프로모터)를 의미한다.
(3) 감자에서 단백질 발현효율을 높이기 위한 벡터 제조
소포체내 잔류 시그날 펩타이드(Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu; -SEKDEL)를 코딩하는 DNA 염기서열을 돼지콜레라 바이러스의 당 단백질인 GP55 및 캡시드 단백질 CORE의 뒷부분에 삽입하기 위해 다음의 방법을 수행하였다. 우선, 상기 (1)에 기재된 gp55f1 및 coref1의 포워드 5´-프라이머 및 하기의 ERpr5-1 및 ERpr5-2의 리버스 5´-프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, (1)에서 제조된 것과는 약간 변형된 당 단백질 및 캡시드 단백질 cDNA 절편을 얻었다.
5´-프라이머(ERpr5-1) : 5´-GAAGGGAAGCTTCTGTTTTGCGGGTGCCACAA-3´
5´-프라이머(ERpr5-2) : 5´-GAAGGGAAGCTTCTCTTTAGAGGGGAGCTCAC-3´
그런 다음, Haq, A. T.et. al.(1995)Science 268 :714-715에 기재된 방법에 따라, 하기의 포워드 5´-프라이머(Hindpf6) 및 리버스 5´-프라이머(Hindpr6)를 사용하여, TEA 완충액에서 94℃에서 변성(denature)시킨 후, 37℃에서 배양시킴으로써, 소포제 잔류 시그날 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 올리고 DNA(Hindp)를 합성하였다.
5´-프라이머(Hindpf6): 5´-AGCTTTCTGAGAAAGATGAGCTATAAGAGCT-3´
5´-프라이머(Hindpr6): 5´-CTCATAGCTCATCTTTCTCAGAA-3´
상기 리버스 5´-프라이머 ERpr5-1 및 ERpr5-2로 PCR 증폭시킨 산물을 제한효소 HindⅢ로 처리한 후, 각각에 접합효소와 완충용액으로 16℃에서 12시간 배양하여, PCR 산물에 상기 올리고 DNA를 접합시켰다.
이렇게 Hindp가 접합된 ERpr5-1 및 ERpr5-2에 의해 생성된 PCR 산물을, pBI121의 GUS 유전자 부위에 도입하여 클로닝한 식물 발현벡터를 각각 pBERHCV-gp55 및 pBERHCV-core로 명명하였다.
(4) 곤충세포 발현벡터 제작
돼지콜레라 바이러스 gp55 유전자 및 core 유전자를, 곤충세포(Spodoptera frugierda,sf9 cells, Pharmingen사)에서 발현시키기 위해서, 다음 4개의 프라이머를Vet. Microbiol.(2000)74(3): 207-216에 기재된 방법으로 제작하였다.
① HCV-gp55(염기서열 2426~3462 부위 증폭용)
psfHCV-gp(55)1f: 5´-GAATTCCAAGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATC-3´
psfHCV-gp(55)1r: 5´-GAGCTCTTAGGCGAGTTGTTCTGTTAGAACTATG-3´
② HCV-core(염기서열 753-1229 부위 증폭용)
psfHCV-core2f: 5´-GAATTCTACGTGTGCATCGATGGTTGCATCCTGCT-3´
psfHCV-core2r: 5´-GAGCTCTTAACTAAGGTACATAGCGTGCTGGATACC-3´
이 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 gp55 또는 core 유전자를 증폭한 후, pGEM-T 벡터에 접합효소와 완충용액으로 클로닝한 다음, 형질전환용 숙주세포 DH5에서 상기 유전자들을 증폭하였고, gp55 또는 core 유전자 절편을EcoRI 및SacI 제한효소로 처리하여 돼지콜레라 바이러스의 gp55 또는 core 유전자를 분리하였다.
베큘러바이러스 전이용 벡터 pAcHLT-A(Pharmingen사에서 구입한 제품, 1999, Baculovirus Expression Vector System Manual 6th Edition)를EcoRI 및SacI 제한효소로 처리한 후, 상기에서 제조된 gp55 또는 core 유전자를 삽입하여, 곤충세포 발현벡터 pAcHLT-HCVgp55 및 pAcHLT-HCVcore를 제조하였다.
(5) 베큘러바이러스 벡터에 의한 곤충세포 형질감염 및 발현
Kid, I.M.et. al., (1993) Applied Biochemistry and Biotechology.42:137-159에 기재된 방법에 따라, 상기 발현벡터 pAcHLT-HCVgp55 또는 pAcHLT-HCVcore와Bsu361이라는 제한효소로 처리되어 선형화된 베큘러바이러스 DNA를, 곤충세포(sf9 cells, Pharmingen사)와 함께 박펙틴(Bacfectin) 완충용액을 이용하여 27℃에서, 3시간 동안 그레이스 배지에서 배양하였다. 형질감염 키트(Transfection kit)는 Pharmingen사에서 구입한 것을 사용하였다. 12시간 배양한 후, 10% 우태아 혈청과 항생제가 함유되어 있는 새로운 그레이스 배지에 재조합 감염세포를 옮긴후, 7일 동안 27℃에서 배양하였다. 7일 후, 곤충세포가 완전히 파괴되기 전에, 배양배지를 멸균된 50㎖ 튜브로 옮기고, 분해용액으로 세포막을 완전히 파괴하였다. 원심분리로 여러가지 세포 분해물질과 pAcHLT-HCVgp55 또는pAcHLT-HCVcore에 의해 발현된 재조합 단백질(6x His Tag이 붙어 있는 목적 단백질)을 친화 매트릭스 (affinity matrix)로부터 추출한 후, 트롬빈을 처리한 다음, 아가로스 비드를 이용하여 돼지콜레라 바이러스 재조합 단백질 HCVRGP55 또는HCVRCORE 각각을 정제하고, SDS-PAGE로 확인한 후, -70℃에서 보관하였다.
(6) 재조합 단백질(HCVRGP55 또는 HCVRCORE)을 이용한 쥐에서의 모노클로날 항체(Anti-HCVRGP55 또는 Anti-HCVRCORE)의 생산
상기에서 분리한 재조합 단백질을, 형질전환 감자의 형질전환 여부를 확인하기 위한 모노클로날 항체 생산을 위해서 면역원으로 사용하였다.
면역 당일은, HCVRGP55 또는 HCVRCORE의 항원 재조합 단백질 및 플로인트의 완전 아쥬반트(FCA, Gibco BRL life Techologies LTd에서 구입)를 피스톤 운동으로 잘 혼합하여 얻은 용액을, 쥐(Balb/C 암쥐; 대한 바이오 링크 실험동물 쎈터에서 구입)의 복강에 주사하여 면역시키고, 상기 항원 단백질 및 플로인트의 불완전 아주반트(Freund´s incomplete adjuvent)를 혼합한 용액을 쥐의 발바닥, 꼬리 및 복강에 주사하여 2차∼4차 면역을 더 유도하였다. 그런 다음, 면역화된 쥐의 비장 세포를 확보하기 전에, 혈액을 채취하여 폴리클로날 항체를 얻어내었다. 폴리에틸렌글리콜(Polyethlyleneglycol : PEG)을 이용하여, 6주령 Balb/C 암쥐의 비장 세포및 골수종 세포(SP2/0)를 융합시킨 후, 96-웰 플레이트에서 융합세포를 증식시켰다. 그런 다음, 니겔 젠킨스(Nigel Jenkins)가 이용한 방법(Nigel Jenkins, 1999.Animal cell Biotechology73-98)에 따라 하이브리도마 세포(hybridoma cell)를 선발하였다. 그런 다음, 하브리도마 세포에서 생산된 모노클로날 항체를 이후 실험에서 웨스턴 블랏 검사에 이용하였다.
(7) 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciences LBA4404)의 형질전환
상기 (3)에서 제조된 벡터 pBERHCV-gp55 또는 pBERHCV-core를 일렉트로포레이션법(electroporation)에 의해,아그로박테로움 투메파시엔세스LBA4404에 도입하여 형질전환시키고, 카나마이신이 함유된 LB 배지에 접종하여, 28℃, 250rpm으로 현탁배양하였다. 48시간 배양한 후, 형질전환된아그로박테리움을 선발하고, An, G.et. al.(1988)In Plant Molecular Biology Manual A3: 1-19, Kluwer Academic Publisher에 기재된 방법에 따라,아그로박테리움으로부터 분리한 DNA를 제한효소로 처리한 후, 전기영동법 및 PCR법으로 상기 형질전환 벡터의 삽입을 확인하였다.
(8) 아그로박테리움( A.tumefaciences LBA4404)을 이용한 감자의 형질전환
상기 (7)에서 선발한 형질 전환된아그로박테리움을 재배 적응성이 좋은 수미품종을 공시재료로 이용하여 형질전환 실험을 Yl,Jung-Yoon,et. al.(1998) Korean J. Plant Tissue Culture25:109-113에 의거하여 수행하였다.
즉, 감자 뿌리를 옥신 계열의 2,4-D 호르몬이 첨가된 배지에서 배양하고, 이로부터 분리한 감자 뿌리절편을 형질전환 효율을 높이기 위하여 광 상태에서 30분 정도 단독으로 전처리하였다. 그런 다음, 돼지콜레라 바이러스의 당 단백질 유전자 또는 캡시드 단백질 유전자를 감자 세포의 크로모좀 DNA에 삽입하기 위해서 상기 (7)의 pBERHCV-gp55 또는 pBERHCV-core로 형질전환된아그로박테리움을 28℃, 암 상태에서 48시간 동안 더 배양하여 감자에 형질감염시켰다. 접종된 감자절편으로부터,아그로박테리움을 제거하기 위해 배양배지 내에 카베니실닌(cabenicillin)을 처리하였다. 감자 절편의 표면에 묻어있는 배지와 항생제는 여과지를 이용하여 제거하였고, 이를 건조시킨 후, 이 절편을 MS배지에 2,4-D 2㎎/ℓ가 첨가된 공동배양배지(Co-culture mediume)에서 2일정도 배양하였다. 그 후, 절편을 MS배지에 카나마이신 50㎎/ℓ, 카베니실린 1000㎎/ℓ, 지아틴(Zeatin) 2㎎/ℓ, 알파-나프틸아세트산(NAA) 0.01㎎/ℓ 및 지베릴릭 산(Gibelellic Acid:GA) 0.1㎎/ℓ가 첨가된 유도배지에서 캘러스를 유기하였다. 그 다음, Conger, et.. al.(1983)Science 221: 850-851에 기재된 방법에 따라, 체세포에서 배(embryo)가 유도되도록 발생초기에 옥신계열 식물생장 호르몬인 2,4-D 2㎎/ℓ를 첨가하여 캘러스(callus)가 생기도록 유도하였다.
성숙한 체세포를 2,4-D가 제거된 MS배지에서 뿌리와 잎을 유도하였다. 이 캘러스를 MS배지에 벤질아데닌(Benzyl Adenine:BA) 0.25㎎/ℓ, 지베리니 산 0.1㎎/ℓ, 카나마이신 100㎎/ℓ및 카베니실린 500㎎/ℓ가 첨가된 재분화 배지에 옮겨 식물체의 재분화를 유도하였고, 재분화된 감자는 카나마이신이 첨가된 MS배지에 옮겨형질전환 감자를 선별하였다.
(9) 형질전환 감자의 선별
형질전환된 감자를 Valvekens, D.et. al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5536-5540에 기재된 방법에 따라 선별하였다.
즉, 상기 (8)의 재분화 유도 배지에 형질전환 감자를 선발할 수 있는 일정량의 카나마이신을 첨가하여nptII 유전자를 갖지 않는 감자를 괴사(necrosis)시켜 형질전환 감자를 선별하였다. 형질전환 감자에 삽입된 박테리아 효소인 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(Neomycin phosphotransferase)를 encode하는nptII 유전자는 인산화작용(phosphorylation)에 의해서 항생제 카나마이신을 불활성화시켜서 선택배지에서도 형질전환 감자를 얻을 수 있었다.
(10) 형질전환 감자분석
선별된 형질전환 감자의 확인은 서던 블랏 분석, 노던 블랏 분석, 웨스턴 블랏 분석을 통해 수행할 수 있다.
ⓐ 서던 블랏 분석
gp55 유전자 또는 core 유전자의 감자의 염색체 내로의 삽입 여부와, 감자 염색체의 어느 부분에 들어갔는지 확인하기 위해, Southern, E. M. (1975)J. Mol. Biol.98: 503-517에 기재된 방법에 따라 서던 블랏 분석을 수행하였다.
ⓑ 노던 블랏 분석
형질전환된 감자에서 도입된 돼지콜레라 바이러스 gp55 유전자 또는 core 유전자의 발현정도를 전체 세포질의 RNA(Total cellular RNA)의 발현정도로 확인하기 위해, 감자의 줄기, 잎 또는 씨알(0.5g 내지 1.0g)을 잘 갈아서 Alwine, J. C.et. al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350-5354에 기재된 방법에 따라 노던 블랏을 수행하였다.
ⓒ 웨스턴 블럿 분석
단백질 수준에서, 돼지콜레라 바이러스 GP55 단백질 또는 CORE 단백질의 발현량을 확인하기 위해서, 상기 (6)의 쥐로부터 분리한 모노클로날 항체(Anti-HCVRGP55 또는 Anti-HCVRCORE)를 이용하여 SDS-PAGE 분석을 수행함으로써, 돼지콜레라 바이러스의 당 단백질인 GP55 단백질 또는 캡시드 단백질인 CORE 단백질의 발현량을 확인하였다(Higgins, J. V. and Spencer, D.(1991)Plant Science 74:89-98).
(11) 생체에서 면역화 정도 측정
먼저, 형질전환 감자가 생산하는 단백질 GP55와 CORE를 각각 다음과 같은 방법으로 분리하였다.
즉, 2㎖ 에펜드로프 튜브에 단백질 추출 완충용액(100mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM EDTA, 5% SDS 및 20% Sucrose) 300~500㎕와 최대한 잘 분쇄한 형질전환된 감자 1.5㎖를 넣은 다음, 튜브를 약하게 교반해서 잘 섞이게 한 후, 얼음에서 20분 동안 저장하고, 다시 약하게 교반해서 잘 섞은 다음, 15,000rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액의 일부(5㎕)는 5% 머캅토에탄올과 10분정도 열처리하여 SDS-PAGE로 전기영동하여 해당 단백질 GP55(55KDa) 및 CORE(23KDa)을 확인하였다.
그런 다음, 확인된 GP55 단백질과 CORE 단백질 일정량을 혼합하여 30일령 돼지에 피하 주사하여 생성된 항체의 역가를 ELISA법으로 검사하여 항원 단백질의 생체내 면역화 유발 정도를 측정하였다.
(11-1) ELISA법
재조합 항원 단백질이 코팅된 ELISA용 플레이트에 GP55와 CORE 단백질을 각각 피하주사한 돼지로부터 7일 후에 채혈을 한 다음, 이 혈액을 3,000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고, 이 혈청을 사용하여 John R.C.(1995)Methods in Moleculor Biology 42 :131-160에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
(12) 후대발현 및 후대 안전성검증
형질전환 감자의 후대 발현 및 안전성 검정은 멘델리안 경향(Medelian fashion) 검정 분석 및In situ기법을 이용한 식물염색체 내에 형질전환 유전자 위치의 결정으로 행할 수 있다(Angerer, L. M.et. al(1987)Methods Enzymol. 152: 649 - 661).
즉, 형질전환된 감자가 도입된 형질을 차세대로 전달할 경우, 멘델의 유전법칙에 따라 우성인자와 열성인자의 비가 3:1로 유전되는지를 확인하여 후대에 도입된 형질을 안전하게 전달하는지를 검정하였다.
(13) 방어시험 및 동물시험
두 가지 단백질, 즉 GP55와 CORE 단백질을 발현하는 감자 혼합한 것을 먹인 돼지와 공지의 백신주 LOM을 접종한 돼지 및 대조군 돼지로부터 5일, 10일, 20일, 및 30일 후 채혈한 혈청 50㎕를 2배 희석한 96웰 플레이트에 돼지콜레라 바이러스 105.0TCID50를 동량 첨가하여 16시간동안 37℃(5% CO2)에서 감작한 후 돼지 신장세포 (PK15 cell, 수의과학검역원에서 구입)에 첨가하여 2일 배양한 다음, 세포변성효과 (CPE)를 관찰하였고, 항체가를 검증하였다.
그 결과, 돼지에서도 이 감자백신이 돼지콜레라 바이러스에 충분한 방어 능력이 있다는 것이 확인되었다.
한편, 형질전환 감자를 5일, 15일, 20일 및 30일 동안 먹인 30일령의 각각 6마리씩 24마리 돼지에, 백신주를 접종한 1마리씩 4마리 돼지와, 병원성 콜레라 바이러스인 ALD를 접종한 2마리씩 8마리 돼지와 국내발생 YII를 접종한 2마리 돼지 및 대조군으로 1마리씩 4마리 돼지에 103.0TCID50를 접종하여 공격하여 돼지콜레라 방어능을 확인하였다.
본 발명에 의한 형질전환 감자는 형질전환 감자를 기존의 감자 재배기술로도 대량 생산할 수 있으므로, 돼지콜레라 바이러스에 대한 면역효과를 갖는 감자사료 백신을 대규모 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제조한 형질전환 감자를 사료화하여 돼지에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 돼지에게서 돼지콜레라 바이러스에 대한 항체 형성을 유도하여 면역효과를 유발시킬 수 있다. 따라서, 당 단백질 GP55와 캡시드 단백질 CORE의 혼합물은 돼지콜레라 바이러스의 활성에 전혀 관여하지 않고, 돼지에게서 면역효과를 유발시킬 수 있기 때문에, 생독 백신(attanuated virus vaccine)보다 안전성 면에서 우수하다. 또한, 형질전환 감자는 사료로서 이용할 수 있기 때문에, 일반인들도 쉽게 이용하여 돼지의 면역화를 유발시킬 수 있으며, 돼지에게서 지속적으로 백신을 투여하는 효과를 나타낼 수 있어서, 농가에 고부가 수익을 기대할 수 있다.

Claims (5)

  1. 식물 유래의 백신의 제조방법에 있어서,
    1) 돼지콜레라 바이러스로부터 PCR을 이용하여 당 단백질인 gp55 유전자를 분리하는 단계;
    2) 상기 유전자를 감자에 발현시키기 위해서아그로박테리움의 플라스미드에 클로닝할 수 있는 감자 발현벡터를 구축하는 단계;
    3) 상기 발현벡터를아그로박테리움에 도입하여아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;
    4) 상기 형질전환된아그로박테리움과 감자 식물조직을 함께 배양하여,아그로박테리움내의식물 발현 벡터에서의 상기 당 단백질 유전자를 감자 식물의 크로모좀내로 삽입시킴으로써 형질전환 감자를 제조하는 단계;
    5) 형질전환된 감자의 발현특성을 분석하는 단계; 및
    6) 상기 발현특성이 검정된 감자의 발아된 조직 절편을 배양하여 형질전환 감자를 재분화시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 식물 유래 백신용 형질전환 감자를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 1) 단계의 유전자가 소포체내 잔류 시그널을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 방법으로 제조된 형질전환 감자.
  4. 제 3항에 기재된 형질전환 감자를 사료 또는 돼지콜레라 바이러스에 대한 식물 유래의 백신으로 돼지에 섭취시킴으로써 돼지를 면역시키는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 하기 방법으로 제조된 형질전환 감자를 더 혼합하여 돼지를 면역시키는 방법.
    1) 돼지콜레라 바이러스로부터 PCR을 이용하여 캡시드 단백질인 core 유전자를 분리하는 단계;
    2) 상기 유전자를 감자에 발현시키기 위해서아그로박테리움의 플라스미드에 클로닝할 수 있는 감자 발현벡터를 구축하는 단계;
    3) 상기 발현벡터를아그로박테리움에 도입하여아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;
    4) 상기 형질전환된아그로박테리움과 감자 식물조직을 함께 배양하여,아그로박테리움내의 식물 발현 벡터에서의 상기 캡시드 단백질 유전자를 감자 식물의 크로모좀내로 삽입시킴으로써 형질전환 감자를 제조하는 단계;
    5) 형질전환된 감자의 발현특성을 분석하는 단계; 및
    6) 상기 발현특성이 검정된 감자의 발아된 조직 절편을 배양하여 형질전환 감자를 재분화시키는 단계.
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