KR20100015187A

KR20100015187A - 형질전환 식물체를 이용한 돼지 콜레라 백신 및 그의제조방법

Info

Publication number: KR20100015187A
Application number: KR1020080076124A
Authority: KR
Inventors: 김종범; 한범수; 오상수; 강한철; 김용환; 박종석; 하선화; 김기용; 성병렬; 송재영; 김병한; 임성인; 양주성; 배지영
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청); 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2008-08-04
Filing date: 2008-08-04
Publication date: 2010-02-12

Abstract

본 발명은 새로운 콜레라 백신, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 돼지 콜레라 균주의 피막 단백질인 E2 항원 유전자, 그의 염기서열, 상기 E2 항원 단백질, 그의 아미노산 서열, 상기 E2 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물 운반체 및 그의 제조방법, 상기 E2 항원 유전자를 발현하는 형질전환 식물체 및 그의 제조방법, 이로부터 돼지 콜레라 균주의 피막 단백질인 E2 항원 단백질을 대량으로 얻는 생산방법 그리고 상기 형질전환 식물체 및/또는 이로부터 발현된 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원을 유효성분으로 하는 돼지 콜레라 백신 및 이를 기능성 가축사료로 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 E2 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 식물 운반체는 돼지 콜레라 균주의 피막 단백질 E2 항원 백신을 대량으로 생산하는 데 널리 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환 알팔파 식물체는 생초 또는 건초의 형태로 가축 사료에 첨가되어 돼지 등의 가축에서 E2 항원 단백질에 대한 항체를 생산하고 중화반응을 유도하며 그 항혈청은 콜레라 바이러스도 효과적으로 중화시킬 수 있으므로, 기능성 사료작물로서 돼지 등의 가축들에 인력이 절감하고 다른 질병균 오염 및 강독 균주로의 변이에 따른 위험성을 배제하면서 경구 투여할 수 있는 백신으로 가축 질병을 효과적으로 예방하는 데 널리 사용될 수 있다.

돼지 콜레라, 피막 단백질, E2 항원 유전자, E2 항원 단백질, 돼지 콜레라 백신, 형질전환 알파파, 기능성 가축사료

Description

형질전환 식물체를 이용한 돼지 콜레라 백신 및 그의 제조방법{Edible swine cholera vaccine using plant transformant and method for preparing the same}

돼지 콜레라는 1급 법정 전염병으로서 발병 시 주위 농가의 돼지를 모두 살처분해야 하므로 농가에 막대한 피해를 주게 된다. 지금까지 돼지 콜레라 백신은 동물세포를 이용하여 생산되었기 때문에, 생산 비용이 많이 들어 소비자인 농가가 사용하는 데에 적지 않은 경제적인 부담을 주고 있다. 또한 이러한 콜레라 백신은 각 돼지에게 여러 차례 모두 주사로 투여해야 하므로 인력 손실도 많았다.

그러나 식물이 생산하는 콜레라 백신이 사료작물로서 돼지를 포함한 가축들에게 투여되는 경우라면, 백신 효과를 유도하면서 동시에 다수의 가축들에 대하여 편리하게 백신을 투여할 수 있어 인력손실이 상당히 절감될 것이다. 이외에도 새로운 백신을 생산하는 소득 작물의 보급으로 농가소득에 기여할 수 있다. 그러나 아직까지 돼지 콜레라를 예방하기 위한 식용 백신 개발은 전혀 보고된 바가 없었다.

참고로 지금까지 재조합 콜레라 백신의 사례로는, 2005년 배큘로바이러스 시스템에서 재조합 돼지콜레라 E2 서브유닛 백신을 디에트마 크레츠돈 (Dietmar Kretzdorn) 등이 개발한 바 있었다 (2005년 7월 19일; 미국특허 6919085). 또한, 2003년 폴란드에서 레고키 (LEGOCKI, Andrzej, B.) 등이 돼지콜레라 백신을 생산하는 형질전환 식물을 개발하여 돼지콜레라 E2 단백질과 KDEL, VTS 또는 유비키틴을 결합시킨 융합 단백질을 생산한 바도 있었다 (2003년 4월 30일; 국제특허 PCT/PL2003/000136). 이외에도 2001년 중국에서 돼지 콜레라 바이러스의 에피토프 백신과 이의 생산 방법에 관하여 첸 (CHEN, Yinghua) 등이 특허출원한 바도 있었다 (2001년 7월 20일 / 중국, 국제특허 PCT/CN2001/001189).

돼지 콜레라균에서 피막단백질 E2 항원은 식용 백신 개발에 유용할 것으로 예상되는 당단백질이다. 이와 같은 당단백질은 세포질에 있는 리보좀에서 단백질이 만들어지기 위해서는 먼저 특정 아미노산 서열 (leader sequence)의 인도로 세포 ER 내로 이동하고 ER 내부에서 특정한 아미노산 잔기에 당이 공유 결합하는 과정을 반드시 거쳐야 한다. 따라서 돼지 콜레라 피막단백질 E2 항원이 대량으로 생산되는 과정에서 당화가 일어나는 세포 장소인 ER에 선택적으로 먼저 태그 (tagging)되고 다시 세포 내에 고농도로 집적되는 과정이 반드시 필요하다.

이에 본 발명자들은 새로운 콜레라 백신을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 먼저 5'-말단에 ER-태그 (tagging) 아미노산 서열 그리고 3'-말단에 ER-보유 (retention) 아미노산 서열을 포함하는 E2 항원 유전자를 제작하고 상기 E2 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조한 다음 이로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 제조하고 이를 다시 사료작물인 알팔파에 형질전환시켰다. 그 다음 이 형질전환된 알팔파 식물체를 재분화 및 순화과정을 거쳐 형질전환된 식물체를 제조하고, 이를 생초 또는 건초의 형태로 가축 사료에 첨가하여 돼지에서 E2 항원 단백질에 대한 항체가 생산되고 중화반응이 유도되며 그 항혈청은 콜레라 바이러스를 효과적으로 중화시킬 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 새로운 돼지 콜레라 백신, 그의 제조방법 및 그의 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ER-태그 (ER-tagging) 서열 및 ER- 보유 (ER-retention) 서열을 포함하는 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하여 E2 항원을 발현할 수 있는 식물 형질전환 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하는 형질전환된 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아그로박테리움 속 미생물로 형질전환되어 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원을 발현하는 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 돼지 콜레라 백신으로서의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 발현하는 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 콜레라의 E2 항원 단백질을 대량 생산하는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 기능성 가축사료로서의 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 당단백질 형태의 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원을 발현할 수 있는 E2 항원 유전자를 제공한다.

본 발명의 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자는 ER-태그 (ER-tagging) 서열 및/또는 ER-보유 (ER-retention) 서열을 포함하도록 구성되는 것이 바람직하고, 상기 ER-태그 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 것이 바람직하고, 상기 ER-보유 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 것이 바람직하다. 본 발명의 E2 항원 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 E2 항원 유전자를 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하여 E2 항원을 항상 발현할 수 있는 식물 형질전환 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원을 35S 프로모터로부터 항상 발현할 수 있는 식물 형질전환 발현 벡터를 제공하고, 바람직하게는 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하는 식물 형질전환 발현 벡터 E2/pB7WG2D (수탁번호: KACC 95087P)를 제공한다.

상기 식물 형질전환 발현 벡터는 2008년 07월 16일자로 농업생명공학기술원 부설 미생물기탁기관에 기탁하였다.

또한, 본 발명은 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하는 형질전환된 식물 운반체를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 E2 항원 유전자로 형질전환된 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물을 제공하고, 바람직하게는 상기 E2 항원 유전자로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 식물 운반체로 형질전환되어 상기 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원을 발현하는 식물체를 제공한다.

상기 E2 항원을 발현하는 식물체는 가축사료용 작물을 포함하는 것이 바람직하고, 알팔파 작물 등을 포함하는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 (1) 식물체의 잎을 절단하고; (2) 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 감염시키고; (3) 암상태에서 공동 배양하고; (4) 선발배지를 사용하여 재분화를 유도하고; (5) 뿌리를 유도하여 순화시키고; 및 (6) 유전자의 형질전환을 분석하는; 과정으로 이루어진 상기 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원을 발현하는 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 과정들에서 기본 조직배양 배지로는 감보그 B-5 (Gamborg B-5) 배지 등을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 (2) 과정에서는 MS0 및 1/2 MS0 배지를 순차적으로 사용하는 것이 바람직하며, 또한 상기 (4) 및 (5) 과정에서 선발배지로는 MS 배지 등을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 (1) 상기 형질전환된 식물체의 잎을 파쇄하여 잎조직을 분말화하고; (2) 용액을 첨가하여 균질화하고; (3) 원심분리하여 상층액을 분리하고; 및 (4) 순수 분리 및 정제하는; 과정으로 이루어진 상기 돼지 콜레라의 E2 항원 단 백질의 제조방법을 제공한다.

상기 (1) 과정에서는 액체질소하 조건에서 잎조직을 파쇄하는 것이 바람직하고, 상기 (2) 과정에서는 PBS 완충용액 등을 첨가하여 식물 잎 분말을 현탁하고 호모지나이저 (homogenizer) 기기 등을 사용하여 균질화하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 식물체를 유효성분으로 하여 콜레라 백신으로 사용될 수 있는 기능성 가축사료를 제공한다. 상기 콜레라 백신은 돼지 콜레라 백신을 포함하는 것이 바람직하다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 돼지 콜레라 균주의 피막 단백질인 E2 항원 유전자, 그의 염기서열, 상기 E2 항원 단백질, 그의 아미노산 서열, 상기 E2 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물 운반체, 상기 식물 운반체로 형질전환된 식물체 및 그의 제조방법, 이로부터 돼지 콜레라 균주의 피막 단백질인 E2 항원 단백질을 대량으로 얻는 생산방법 그리고 상기 형질전환 식물체 및/또는 이로부터 발현된 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원을 유효성분으로 하는 돼지 콜레라 백신 및 그의 기능성 가축사료로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 알팔파 식물체는 생초 또는 건초의 형태로 가축 사료에 첨가되어 돼지 등의 가축에서 E2 항원 단백질에 대한 항체를 생산하고 중화반응을 유도하며 그 항혈청은 콜레라 바이러스도 효과적으로 중화시킬 수 있으므로, 기능성 사료작 물로서 돼지 등의 가축들에 인력이 절감하고 다른 질병균 오염 및 강독 균주로의 변이에 따른 위험성을 배제하면서 경구 투여할 수 있는 백신으로 가축 질병을 효과적으로 예방하는 데 널리 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 기능성 사료 작물은 백신의 장기저장에 대한 안전성도 기대할 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원 유전자의 제조

본 발명에서는 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원 유전자를 얻기 위하여, 5'-말단에 ER-태그 (tagging) 아미노산 서열 그리고 3'-말단에 ER-보유 (retention) 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 E2 항원 유전자를 제작하였다.

구체적으로 상기 돼지 콜레라 피막단백질 E2 항원은 당단백질로서, 이러한 당단백질은 세포질에 있는 리보좀에 의하여 단백질이 만들어진 당화되기 위하여 먼저 특정 아미노산 서열 (leader sequence)의 인도로 세포 ER 내로 이동하고 ER 내부에서 특정한 아미노산 잔기에 당이 공유 결합하는 과정을 반드시 거쳐야 한다. 따라서 당화가 일어나는 세포 장소인 ER에서 먼저 태그 (tagging)시켜야 하므로, E2 단백질의 아미노 말단에 ER-태그에 해당하는 서열번호 3의 아미노산 서열 (MDWTWILFLVAAATRVHS)을 결합시키고, 다시 세포 내에 고농도로 집적시키기 위하여 카복시 말단에 ER-보유에 해당하는 서열번호 4의 아미노산 서열 (KDEL)을 결합시켰다 (도 1 참조).

실시예 2. 돼지 콜레라 피막단백질인 E2 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제작

본 발명에서는 돼지 콜레라 피막단백질 E2 항원을 발현하는 형질전환된 식물 운반체를 제작하기 위하여, 먼저 식물에 유전자를 도입하는 기본 운반체로서 발현 벡터 pB7WG2D를 사용하였다. 항원단백질 유전자를 형질전환 운반체로 도입하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 ER-태그 서열-E2 유전자-ER-보유 서열의 유전자세트를 한 단위 (도 2 참조)로 묶어 5'-말단 및 3'-말단의 염기서열을 각각 포함하는 서열번호 5의 attB2 프라이머 및 서열번호 6의 attB1 프라이머를 합성하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. 그 결과 상기 attB2-ERT-E2-ERR-attB1 서열 순서로 구성된 유전자 단편을 합성하고, 1% 아가로스 젤에서 전기영동한 다음 해당 유전자 단편을 분리하였다. 이 E2 유전자 세트 단편은 BR 클로나제 (clonase)를 이용하는 반응을 통하여 플라스미드 벡터 pENTR 내에 클로닝하고 이를 클로닝 벡터 E2/pENTR로 명명하였다. 이 클로닝 벡터 E2/pENTR는 LR 클로나제 효소로 소화시키고 다시 식물 형질전환을 위한 기본 운반체인 클로닝 벡터 pB7WG2D에 클로닝하고 발현 벡터 E2/pB7WG2D로 명명하였다. 이 발현 벡터 E2/pB7WG2D의 주요구조는 35S 프로모터와 35S 터미네이터를 포함하는 유전자 세트를 포함하여 식물에 도입되는 요소로서는 식물에서의 형질전환체를 선발하기 위한 선발마커인 bar 유전자, 형질전환된 미생물을 선발하기 위한 스펙트로마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 포함하고 있다.

실시예 3. 돼지 콜레라 피막단백질인 E2 항원 유전자를 포함하는 형질전환된 식물 운반체의 제작

본 발명에서는 돼지 콜레라 피막단백질 E2 항원 유전자를 포함하는 형질전환된 식물 운반체를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제작된 식물 형질전환 발현 벡터 E2/pB7WG2D를 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 형질전환하였고, 항생제 스펙트로마이신 (spectinomycin)을 포함하는 배양 배지에서 형질전환된 클론을 선발하였다. 이 선발된 클론은 PCR 반응과 1% 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 유전자의 크기를 비교하고 그 결과로부터 확인하였다. 상기 PCR은 E2 유전자의 5'-말단 및 3'-말단의 염기서열을 각각 포함하는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머들 및 E2 유전자의 5'-말단으로부터 35S 프로모터의 350bp 크기를 포함하는 서열번호 9의 5'-말단 프라이머 (35S primer)와 서열번호 4의 attB2 프라이머를 사용하여 실시되었다.

그 결과 E2 유전자의 양말단의 염기서열을 포함하는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머들을 사용하여 PCR을 실시하였을 때, 1.0Kb 크기의 밴드의 존재를 확인하여 상기 운반체내 E2 유전자가 존재하는 것을 검증하였다. 또한 35S 프라이머 및attB2 프라이머를 사용하였을 때 1.5Kb 크기의 밴드를 확인하여 E2 유전자가 35S 프로모터 (promoter)에 잘 접합되어 있는 것을 확인하였다 (도 3 참조). 이와 같이 발현 벡터 E2/pB7WG2D를 포함하는 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주를 선별하여 사료작물의 형질전환에 사용하였다.

실시예 4. 돼지 피막 단백질인 E2 항원 유전자를 포함하는 식물 운반체로 형질전환된 알팔파 식물체의 제작

본 발명에서는 상기 E2 유전자를 포함하는 식물 운반체로 형질전환된 알팔파 식물체를 제작하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제작한 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주를 사료작물인 알팔파에 형질전환시켰다. 알팔파 식물체를 만들기 위한 조직배양 배지는 Gamborg B-5 배지를 기본배지로 이용하였다. 구체적으로, 알팔파의 잎을 양면으로 절단하고 상기 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 감염시킨 다음 MS0 배지에서 암상태에서 3일간 공동 배양하였다. 그 다음 1/2MS0 배지로 세척하고 다시 1/2MS0 배지에서 암상태로 4일간 공동 배양한 다음 공동배양이 끝난 식물 조직은 250ppm 카베니실린 (carbenicillin), 5ppm 포스피노트리신 (phosphinothricin), 3ppm제아틴 (zeatin)을 포함하는 선발배지를 사용하여 재분화를 유도하였고, 재분화체가 나오기까지 2주마다 계대하였다. 이로부터 선발된 재분화 식물체는 250ppm 카베니실린, 5ppm 포스피노트리신을 포함하는 MS 배지에서 뿌리를 유도한 후, 멸균된 원예용 상토에서 습도가 조절된 환경에서 순화과정을 거쳤다 (도 4 참조). 여기서 형질전환된 알팔 파는 게놈 DNA (genomic DNA)를 주형으로 실시예 1에서 사용한 35S 프라이머 및 attB2 프라이머 그리고 프라이머 1 및 2를 각 조를 이루어 PCR 반응 후 1% 아가로스 젤에 전기영동하여 유전자 단편의 밴드 크기 (1.5Kb 및 1Kb)를 비교하여 확인할 수 있었다 (도 5 참조).

실시예 5. 형질전환된 알팔파 식물체를 이용한 콜레라 피막단백질인 E2 항원 단백질의 제조

본 발명에서는 상기 형질전환된 알팔파 식물체를 이용하여 콜레라 피막 단백질인 E2 항원을 대량으로 생산하기 위하여, 형질전환된 알팔파 잎을 액체질소 아래서 파쇄하고 잎조직 분말을 마이크로튜브 (microtube)에 0.5ml을 채운 다음 PBST 완충용액 (phosphate-buffered saline+0.025% Tween 20)를 1ml 첨가하였다. 이로부터 얻은 용액은 호모지나이저 (homogenizer)로 약 2분간 3회 균질화시키고 원심분리한 다음 상층액을 이용하여 웨스턴 블럿 (Western blot) 및 샌드위치 엘라이자 (Sandwich ELISA) 분석법을 실시하였다.

상기 웨스턴 분석은 상기 상층액을 10% SDS-PAGE 전기영동하여 반건조 블럿 (semi-dry blot) 시스템을 이용하여 멤브레인 (membrane)에 고정한 다음 5% 스킴 밀크 (skim milk)를 포함하는 블록킹 용액을 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 블록킹시켰다. 그 다음 1차 항체로 돼지 콜레라 양성 항체(수의과학검역원에서 분양받음)를 첨가하여 상온에서 2시간 반응시키고 PBST 용액으로 4회 세척한 다음 항-돼지 IgG-HRP 결합 2차 항체 (anti-swine IgG-HRP conjugated)를 첨가하였다. 이 반 응용액을 상온에서 1시간 동안 다시 반응시키고 PBST 용액으로 멤브레인을 4회 세척한 후 기질용액을 첨가하여 발색시키고 X-선 필름에 감광시켜 항원 단백질의 발현을 확인하였다 (도 5 참조).

또한, 상기 샌드위치 엘라이자 (Sandwich ELISA) 분석은 상기 상층액을 먼저 웰 플레이트 (well plate)에 돼지 콜레라에 대한 양성 항체를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 그 다음 PBST 용액으로 3회 세척하고 단백질 추출물을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 후 PBST 용액으로 4회 세척하였다. 다시 모노클로날 항체 (monoclonal antibody; 국립수의과학검역원으로부터 분양받음)를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고 PBST 완충용액으로 4회 세척한 다음 발색하여 ELISA 리더 (reader)를 이용하여 흡수도를 측정하였다. 그 결과 1, 3, 9, 21, 26, 37번 개체에서 항원 단백질이 강하게 발현되었고 (도 7 참조), 이것은 상기 웨스턴 블럿의 분석 결과와 동일한 것을 확인하였다.

실시예 6. 실험동물에서 형질전환된 알팔파 식물체에서의 콜레라 피막단백질인 E2 항원에 대한 항체유도 조사

본 발명에서는 실험동물에서 형질전환된 알팔파 식물체가 콜레라 피막단백질인 E2 항원에 대한 항체를 유도할 수 있는지를 조사하기 위하여, 총 36개의 알팔파 형질전환체를 선발하고 이로부터 E2 단백질의 발현 (예상크기 : 약 42kDa)을 확인하였다. 또한 ELISA 분석에서 일치되는 3, 9, 10, 26번 알팔파 형질전환체들 중에서 비특이적인 크기의 밴드가 거의 검출되지 않는 10번 개체를 동물실험에 이용하 였다.

먼저 상기 형질전환된 식물의 추출물을 이용하는 경우에는 일주일 간격으로 부스팅 (boosting)을 실시하였으며, 부스팅을 한지 8일째 되는 날에 혈청을 눈을 찔러 얻은 혈액에서 분리하였다. 또한 상기 형질전환된 알팔파 생초를 이용하는 경우에도 10번 개체의 잎을 액체질소로 파쇄하여 얻은 시료를 350mM 제산제에 섞어 5주령 암컷 Balb/c 생쥐에 구강 투여하였다. 이 때 존데 (zonde)를 이용하여 10mg, 50mg씩을 각각 포함하는 최종 부피 100 μl 을 투여하여 혈청내의 IgG 생성 여부 및 생성량을 ELISA 분석법으로 조사하였다.

구체적으로, 형질전환 생초를 50mg, 10mg씩 투여한 그룹, 비형질전환된 생초를 50mg, 10mg씩 투여한 그룹, 형질전환체 추출물을 주사를 통해 50mg, 10mg씩 투여한 그룹으로 나누어 수행하였다. 생쥐 혈청은 처음 면역화 (immunization)를 유도한지 2, 6, 8주째에 채취하였다. IgG ELISA 분석을 통해 생쥐 혈청 내의 E2-특이적 IgG 수준을 측정한 결과, 비형질전환된 생초 및 추출물을 투여한 그룹들보다 E2 유전자 형질전환체 추출물 및 생초를 투여한 그룹에서 IgG가 좀 더 높은 수준인 것을 확인하였다. 따라서, 실험동물에서 항원단백질 E2에 특이적인 면역 반응 (humoral immune response)이 유도되는 것을 확인할 수 있었다 (도 8 참조). 또한 생초를 투여한 실험군의 배설물에서 IgA가 검출되고, 주사로 투여한 실험군의 배설물에서는 IgA가 검출되지 않는 것도 확인하였다 (도 9 참조). 따라서, 실험동물에서 혈청 내의 E2-특이적인 항체는 생초 사료를 투여한 결과로 생성된 것으로 판단되었다.

실시예 7. 콜레라 피막단백질인 E2 항원에 대한 항체가 유도된 실험동물의 항혈청을 이용한 돼지 콜레라 바이러스 중화반응 조사

본 발명에서는 콜레라 피막단백질인 E2 항원에 대한 항체가 유도된 상기 실험동물의 항혈청을 이용하여 돼지 콜레라 바이러스 중화반응을 조사하기 위해, 형질전환된 알팔파를 생초 사료로 투여하고 혈청 내에 E2-특이적인 IgG가 생성되도록 유도하였다. 이와 같이 유도된 IgG가 돼지콜레라 바이러스를 중화시키고 돼지 콜레라 질병을 예방할 수 있는지를 조사하기 위하여, 형질전환된 알팔파 생초 50mg을 투여한 시험군에서 비형질전환된 알팔파 생초를 투여한 대조구 보다 2배 더 높은 중화항체반응을 보이고 중화반응을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다 (도 10 참조).

실시예 8. 실험용 가축에서 형질전환된 알팔파 식물체의 항체유도 및 중화반응 유도 조사

본 발명에서는 상기 실시예 6 및 7의 결과를 참고하고 E2 유전자로 형질전환된 알팔파가 돼지 콜레라 질병 예방용 식용백신으로서의 가능성이 있다고 판단하고, 실험용 가축에서 상기 형질전환된 알팔파 식물체의 항체유도 및 중화반응유도를 다음과 같이 조사하였다. 먼저 실험용 가축으로는 돼지를 선택하여 항체유도 및 중화반응 검정을 수행하였다. 목적동물로서 마이크로돼지를 피더블유제네틱스코리아(주)로부터 구입하였고, 방어력 검정 (Challenge test) 전까지는 당사에서 알팔파 생초 사료를 투여하거나 알팔파 식물 추출물을 주사하면서 사육하였다. 이 때 사용한 식물 추출물은 색소를 제거시키기 위하여 아세톤을 처리하여 원심분리 후 침전물을 80% 에탄올로 2회 세척한 다음 상온에서 건조시키고 PBS 완충용액을 첨가하여 용출되는 것을 주사에 이용하였다. 주사는 2주 간격으로 3회 주사하였고, 3회 주사 바로 전에 1차 채혈하고, 3회 주사 2주 후에 2차 채혈하여 중화반응을 검정하였다. 생초 사료는 100, 150, 200g 수준으로 매주 2회씩 5주 동안 투여하였고, 채혈은 생초 사료 8회와 12회 투여 2일 후에 하였다. 채혈된 혈액으로부터 혈청을 분리하여 아래 참고에서 기술한 방법으로 중화 항체가를 측정하였다.

그 결과, 주사 투여한 실험군에서 중화항체 역가가 낮은 것은 시료 조제시 색소를 제거하기 위하여 아세톤을 처리하였을 때 변성된 단백질이 PBS 완충용액에 충분히 녹아나오지 않아서 전체적으로 항원 농도가 매우 낮아진데서 기인한 것으로 판단되었다. 형질전환된 알팔파 생초를 8회 투여하였을 때 100g, 150g, 200g 투여한 돼지 혈청의 중화항체 역가가 각각 2048, 512, 8인 것으로 측정되었다. 생초 200g 투여한 돼지에서 중화항체 역가가 낮은 것은 구강 내성 (oral tolerance)이 나타나서 낮아진 것으로 판단되었다. 생초 사료를 12회 투여하였을 때 혈청의 중화항체 역가가 각각 512, 512, 16인 것으로 측정되었다. 식용으로 백신 작물을 투여하였을 때 중화항체 역가는 대략 500전후에서 안정적인 수준을 유지하는 것으로 확인되었다 (표 1 참조).

실험용 가축의 항혈청을 이용한 돼지 콜레라 바이러스의 중화반응 조사

그 룹	감 염	SN 타이터
그 룹	감 염	1차	2차
T1	주사(변성 조단백질)	2	32
T2	주사(변성 조단백질)	2	16
T3	주사(변성 조단백질)	8	64
T4	주사(변성 조단백질)	4	32
T5	주사(변성 조단백질)	16	8
T6	구강투여 (생초100g)	2048	514
T7	구강투여 (생초150g)	512	512
T8	구강투여 (생초200g)	8	16

실시예 9. 실험용 가축에서 형질전환된 알팔파 식물체의 이용한 돼지 콜레라의 방어력 검정

본 발명에서는 실험용 가축에서 형질전환된 알팔파 식물체의 이용한 돼지 콜레라의 방어력를 검정하기 위하여, 상기 실시예 8에서 기술한 바와 같이 실험용 돼지를 이용하고 돼지콜레라 바이러스 TCID₅₀ 10⁴ 1ml을 근육주사로 접종하고, 접종 후 3, 5, 8, 10, 15, 22일에 채혈하여 항원 유무 검사, 항체가 검사 및 증상관찰 등을 실시하였다.

그 결과 대조구의 경우 공격접종 3일 후부터 혈액 중 항원 (viremia)가 지속적으로 검출되었고, 중화항체 역가도 아주 낮은 것으로 측정되었다 (표 2 참조). 주사 접종한 경우 혈액 중 항원이 공격접종 8일 후부터 나타나기 시작하여 그 후 지속적으로 나타났다. 그러나 형질전환된 알팔파 생초를 투여한 실험군에서는 모두 혈액 중 항원이 검출되지 않았으며, 항체역가도 약 512 이상으로 유지되어 방어효과가 나타나는 것을 알 수 있었다. 더욱이 공격접종 전에 채혈한 혈청내의 항체역가가 거의 대조구 수준으로 보이던 2, 3, 4, 5, 8, 9번 개체가 폐사할 정도로 기간을 연장했지만 생초투여 돼지의 혈청에서 혈액 중 항원이 검출되고 있지 않아 돼지 콜레라 바이러스 ALD 균주의 피막단백질 E2 항원 유전자로 형질전환된 알팔파가 식용백신으로서 작용하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 형질전환된 사료작물인 알팔파는 돼지콜레라 질병에 대한 확실한 예방효과가 있는 것으로 판단되었다.

실험용 가축을 이용한 생균방어력 확인

개체번호	공격접종전채혈		공격접종후 3일		공격접종 후 5일		공격접종후8일		공격접종후 10일		공격접종후 15일		공격접종 후 22일
	혈액내 항원	항체가	혈액내 항원	항체가	혈액내 항원	항체가	혈액내 항원	항체가	혈액내 항원	항체가	혈액내 항원	항체가	혈액내 항원	항체가
1	-	4	-	2	-	2	+	2	+	2	+	2	+	2
2	-	4	-	2	-	2	+	2	+	2	+	2	폐사
3	-	8	-	4	-	2	+	2	+	2	폐사
4	-	8	-	4	-	2	+	2	+	2	+	2	폐사
5	-	4	-	4	-	2	+	2	+	2	+	2	폐사
6	-	512	-	512	-	512	-	1024	-	1024	-	512	-	512
7	-	512	-	512	-	512	-	256	-	256	-	256	-	256
8	-	4	-	4	+	2	+	2	+	2	+	2	폐사
9 (대조)	-	2	+	2	+	2	+	2	+	2	+	2	폐사

※ 혈액내 항원 : Viremia

실험예. 중화항체가 측정 방법

본 발명에서는 돼지 콜레라 중화 항체가를 다음과 같이 측정하였다. 우선 혈청을 계단 희석하여 배양된 세포에서 바이러스의 증식억제정도를 측정하고 항체 역가를 조사하였다. 먼저 항생제를 포함하는 세포 배양배지 α-MEM (α-Minimum essential medium)을 96-웰 세포배양용 플레이트의 모든 웰에 50 ㎕씩 분주하였다. 또한, 형질전환된 알팔파를 생초와 추출물로 나누어 각각 사료 또는 주사로 투여된 시험동물 쥐 또는 돼지의 혈청을 50 ㎕씩 첫 웰에 분주한 다음 2배 희석비율로 희석하고 각 웰에 바이러스를 50 ㎕식 모든 분주하였다. 이 때 스톡 바이러스 (stock virus)는 200 TCID₅₀/50 ㎕ 되게 희석하여 사용하였다. 이와 같이 얻은 웰 플레이트는 37℃에서 1 시간 동안 반응시키고 10% FBS가 함유된 배양액에 PK-15 세포(2 X 10⁵/mL)를 희석한 후 100 ㎕씩 전체 웰에 첨가하고, 5% CO₂ 배양기에서 72 시간(3 일) 동안 배양하였다. 한편 바이러스 역역가 조사 (back titration)을 동시에 실시하여 중화시험용 바이러스가 정확히 첨가되었는가를 확인하고 중화시험의 유효성 여부를 판정하였다. 구체적으로, 작동 바이러스 (Working virus; 200 TCID₅₀/ 50㎕)를 10 배씩 10^-3까지 희석하여 각 희석 단계별 4 개의 웰에 50 ㎕씩 분주하고 세포를 100 ㎕씩 첨가하여 3 일간 배양한 다음 분석에 이용하였다. 각 웰 플레이트에서 배양 상층액을 버리고, PBS 완충용액으로 1 회 세척한 다음, 80 % 차가운 아세톤을 100 ㎕씩 전 웰에 가하고 -20 ℃에 10 분간 두어 고정하였다. 고정액을 완전히 비우고, PBS 완충용액으로 1 회 세척한 다음 돼지 콜레라 특이-모노클로날 항체 (3B6)를 PBS에 희석 (Hybridoma 상층액은 원액 2배 이하 희석, 복수는 500배 희석)하여 고정한 PK-15 세포와 37℃ 40분 반응시킨 후, PBS로 3 내지 5회 세척하고, 바이오틴이 부착된 항-생쥐 IgG를 희석해서 웰당 100 ㎕씩 분주하고 37℃에서 40분 동안 반응시켰다. 그 다음 PBS 완충용액으로 3 내지 5회 세척하고 AB 용액 (PBS 10 mL + A 용액 2 방울 + B 용액 2 방울)을 웰당 100 ㎕씩 분주하고 37℃에서 40분 동안 반응시킨 다음, PBS 완충용액으로 3 내지 5회 세척하였다. DAB 기질용액 (DAB substrate solution; 10X DAB 1 mL + PBS 9 mL + H₂O₂(1000X) 10㎕)을 분주하고 실온에서 10분 반응시킨 다음, 증류수를 이용해서 3회 씻고 현미경으로 관찰하였다. 혈중 중화항체에 의해 바이러스가 중화된 웰 (항체 양성)은 세포가 염색이 되지 않으나, 돼지 콜레라에 대한 항체가 존재하지 않거나 아주 적은 양이 있어 바이러스를 중화시키지 못하는 경우 (항체 음성)에는 바이러스가 증식하여 진한 갈색으로 염색된 세포를 관찰할 수 있어 판별하였다.

도 1은 본 발명의 돼지 콜레라 피막단백질인 E2 항원 유전자에서 5'-말단에 ER-태그 아미노산 서열과 3'-말단에 ER-보유 아미노산 서열을 포함하는 전체 유전자 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 돼지 콜레라 피막단백질인 E2 항원 유전자를 포함하는 식물형질전환 운반체의 구조를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 식물 형질전환 운반체 내에 E2 유전자가 삽입된 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 식물 형질전환 운반체를 이용하여 E2 항원 유전자를 발현하는 알팔파 식물체를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

도 5는 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 이용하여 E2 유전자로 형질전환된 알팔파 식물체를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 형질전환된 알팔파 식물체에서 발현되는 E2 항원 단백질을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 형질전환된 알팔파 식물체에서 발현되는 E2 항원 단백질을 엘라이자 분석법 (ELISA)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 형질전환된 알팔파를 투여한 실험동물에서 E2 항체 형성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 형질전환된 알팔파를 투여한 실험동물의 배설물에서 E2 항체를 검출한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 형질전환된 알팔파를 투여한 실험동물의 항혈청을 이용하여 돼지 콜레라 바이러스의 중화반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

[서열목록]

[서열번호 1]

ATGGATTGGACTTGGATCTTATTTTTAGTTGCTGCTGCTACTAGAGTTCATTCTCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATAGGGCTACTCGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTCAAAGGAAAGTACAATACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGACGGGTGTTATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGGATTGTGTGACCACAACAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACCAGTGGTCTACACGGGGGGGCTAGTAAAACAATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAAATGAGACAGGTTACAGAATAGTGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAGAGATCGTCTCTAGTGCAGGACCTGTAAGGAAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATATATGCTTAAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTTCGCAGAAAAGGACGAGTTGTAG

[서열번호 2]

MDWTWILFLVAAATRVHSRLACKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDLQLNDGTVKAICVAGSF KVTALNVVSRRYLASLHKEALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGLVKQCRWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEKDEL-

[서열번호 3]

M D W T W I L F L V A A A T R V H S

[서열번호 4]

K D E L

[서열번호 5]

5'-AAAAAGCAGGCTACCTAAACAATGGATTGGACTTGGATCTTAT-3'

[서열번호 6]

5'-AGAAAGCTGGGTCTACAACTCGTCCTTTTCTGCGAAGT-3'

[서열번호 7]

5'-ATGCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-3'

[서열번호 8]

5'-CTATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGGCG-3'

[서열번호 9]

5'-AAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCG-3'

Claims

ER-태그 (ER-tagging)의 염기서열 및 ER-보유 (ER-retention)의 염기 서열을 포함하는 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자.
제 1항에 있어서,

상기 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 E2 항원 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 돼지 콜레라 피막 단백질인 E2 항원 단백질.
제 1항의 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하여 E2 항원을 항상 발현할 수 있는 식물 형질전환 발현 벡터.
제 4항에 있어서,

상기 발현 벡터는 35S 프로모터로부터 E2 항원 단백질의 발현이 조절되는 식물 형질전환 발현 벡터 E2/pB7WG2D (수탁번호: KACC 95087P).
제 1항의 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 포함하는 형질전환된 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물.
제 6항에 있어서,

상기 아그로박테리움 속 미생물은 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)인 것을 특징으로 하는 미생물.
제 6항의 미생물로 형질전환되어 제 1항의 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원을 발현하는 형질전환 식물체.
제 8항에 있어서,

상기 E2 항원 유전자를 발현하는 식물체는 가축사료용 작물을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물체.
제 8항 또는 제 9항에 있어서,

상기 E2 항원 유전자를 발현하는 식물체는 알팔파 작물을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물체.
제 8항의 형질전환된 식물체 또는 이로부터 발현된 상기 E2 항원 단백질을 유효성분으로 하는 돼지 콜레라 백신.
제 8항의 형질전환된 식물체 또는 이로부터 발현된 상기 E2 항원 단백질을 유효성분으로 하여 돼지 콜레라 백신으로 사용될 수 있는 기능성 가축사료.
(1) 식물체의 잎을 절단하고; (2) 제 6항의 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 감염시키고; (3) 암상태에서 공동 배양하고; (4) 선발배지를 사용하여 재분화를 유도하고; (5) 뿌리를 유도하여 순화하고; 및 (6) 유전자의 형질전환을 분석하는; 과정으로 이루어진 제 1항의 돼지 콜레라 피막 단백질의 E2 항원 유전자를 발현하는 식물체의 제조방법.
(1) 제 8항의 형질전환된 식물체의 잎을 파쇄하여 잎조직을 분말화하고; (2) 용액을 첨가하여 균질화하고; (3) 원심분리하여 상층액을 분리하고; 및 (4) 순수 분리 및 정제하는; 과정으로 이루어진 제 3항의 돼지 콜레라의 E2 항원 단백질의 제조방법.