KR102194347B1

KR102194347B1 - 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102194347B1
Application number: KR1020200012261A
Authority: KR
Inventors: 안동준; 차라미; 최세은; 현방훈; 박봉균
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2020-12-22
Also published as: WO2021153873A1

Abstract

본 발명은 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 야생형 돼지유행성설사병바이러스로부터 유래한 복수의 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종하여 확립한 단일 클론 바이러스주인 약독화 생백신주, 이를 함유하는 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법{Live Attenuated Porcine Epidemic Diarrhea Virus Vaccine Strain, Composition Containing Thereof, and Method of Producing Thereof}

본 발명은 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 야생형 돼지유행성설사병바이러스로부터 유래한 복수의 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종(co-inoculaton)하여 확립한 단일 클론 바이러스주인 약독화 생백신주, 이를 함유하는 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

돼지유행성설사병바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus: PEDV)는 코로나바이러스과에 속하는 RNA 바이러스로서 돼지유행성설사(Porcine Epidemic Diarrhea: PED)를 일으키는 원인체(etiologic agent)이다. 일반적으로 돼지유행성설사병바이러스에 감염되는 숙주 범위는 사람, 마우스, 돼지(멧돼지), 개, 소 등 광범위하며 주로 호흡기 감염으로 전파된다.

돼지유행성설사병바이러스 감염 질환은 돼지에서 연령에 관계없이 발생된다. 또, 돼지유행성설사병바이러스 감염 질환은 어린 연령의 돼지, 특히 포유자돈(Suckling piglets)에게 구토와 수양성 설사를 유발시키는 것을 주요 특징으로 하며, 감염 질환이 심할 경우 포유자돈의 폐사를 유발할 수도 있다.

돼지유행성설사병바이러스에 감염된 성돈은 1~2일 정도의 설사를 보이고 스스로 치유된다. 돼지유행성설사병바이러스에 감염된 2주령 미만의 신생자돈은 폐사율이 높은 것으로 알려져 있다.

돼지유행성설사병바이러스는 어린 자돈 소장의 점막 상피세포(mucous epithelial cells)에서 1~2일간의 잠복기를 거쳐 증식하며 설사를 유발한다. 돼지유행성설사병바이러스에 감염된 어린 자돈에서 수양성 설사 진행 시 소장의 점막 상피세포가 탈락되어 어미 돼지의 우유를 섭취하더라도 장내에서 흡수가 잘 되지 아니하고 그대로 설사로 이어진다. 이와 같이 설사가 이어질 경우, 어린 자돈의 소장 내 영양분의 흡수 장애가 생기고 탈수가 이어져 폐사에 이를 수가 있다. 이러한 영양분의 흡수 장애, 탈수 등의 증상을 완화하고 폐사율을 낮추려면 어린 자돈은 어미 돼지의 초유를 통해 어미 돼지로부터 모체이행항체(maternal antibody)를 전달받아야만 한다.

자돈에 대한 바이러스성 장내 질병과 관련된 돼지유행성설사병바이러스의 방어방법은 모돈에 백신을 접종하여 출산 시 생성되는 모돈의 초유로 자돈의 수동 면역을 유도하는 것이 일반적이다. 즉, 모돈의 초유로 자돈의 수동 면역을 유도하여 설사 피해를 최소화 할 수 있다.

현재 양돈농가에서 돼지유행성설사병 발생 시 자주 사용하는 백신 프로그램은 돼지유행성설사병으로 확인된 포유자돈으로부터 수집한 소장을 갈아서 우유에 섞어 임신모돈에 경구 투여하는 인공감염으로 이루어져 있다.

인공감염은 야생형 돼지유행성설사병바이러스(Wild-type Porcine Epidemic Diarrhea Virus)를 임신모돈에 투여하여 면역반응을 유발하는 것인데 이렇게 하면 3~4개월 정도는 설사로 인한 양돈농가 피해가 줄어든다. 그러나 돼지유행성설사병바이러스가 완벽하게 박멸되지 아니하고 양돈농가에 상재(reside)해 있고, 면역력을 획득한 임심모돈으로부터 출산된 어린 자돈의 혈중 항체가(antibody titer)가 저감되었을 때 돼지유행성설사병이 양돈농가에서 재발할 수 있다.

따라서, 양돈농장의 돼지유행성설사병바이러스에 의한 순환 감염 및 지속 감염을 근절시키기 위해, 최근 유행하는 유전형 G2b 타입의 돼지유행성설사병바이러스를 약독화하여 생백신을 제작하는 필요성이 대두되고 있다.

일반적으로 약독화 생백신의 제작을 위해 바이러스의 연속계대배양(Continuously passage cultivation)을 수행하는데, 연속계대배양을 많이 한다고 해서 바이러스의 약독화가 반드시 이루어진다고 할 수 없다. 약독화 생백신은 다년간, 보통 3~4년간 숙주 세포에서 몇백대 계대배양을 수행하여 제작하여야 하고 이와 같은 과정을 거쳐 바이러스의 유전자 염기서열(base sequence[nucleotide sequence])에 변이(결실 등)가 생겼다 하더라도 매번 동물실험을 통해서 약독화가 되어 설사와 같은 병원성 증상을 나타내지 않아야 한다. 즉, 설사 질환(병원성)과 관련이 있는 바이러스의 특이 유전자 염기서열이 변이되었을 때 약독화 생백신이 만들어지는 것이므로 약독화 생백신의 선별은 매우 오랜 시간이 걸린다.

돼지유행성설사병바이러스의 스파이크 단백질(Spike protein)은 S1 도메인(S1 domain) 및 S2 도메인(S2 domain)을 포함하며, 각 도메인은 돼지유행성설사병바이러스의 숙주 세포 내 진입을 매개하는 역할을 한다. 구체적으로, 스파이크 단백질의 S1 도메인은 숙주 세포의 수용체 결합에 관여하고, 스파이크 단백질의 S2 도메인은 숙주 세포와의 융합(fusion)에 관여한다.

한편, 스파이크 단백질은 자연 숙주에서 중화 항체의 유도를 자극하는 역할을 한다. 따라서, 스파이크 단백질은 돼지유행성설사병바이러스에 대항하는 효과적인 백신의 개발을 위한 일차 표적이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 최근 유행하는 돼지유행성설사병바이러스 유전형에 적합한 백신을 개발하고자 예의 노력해 왔다. 그 결과, 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 연속계대배양하여 확립한 2종의 유전자결손 바이러스주를 바이러스 역가 기준으로 특정 비율로 혼합하여 숙주 세포에 공접종시켜 단일 클론 바이러스주(single clone virus strain)인 약독화 생백신주(HSGP주: KCTC14057BP)를 확립할 수 있었다. 상기 약독화 생백신주는 유전자 염기서열의 분석 결과, 스파이크 유전자의 S1 도메인과 S2 도메인 각각을 코딩하는 염기서열의 일부가 선별적으로 결손(결실)되어 생성된 약독화된 유전자형 G2b 바이러스임을 확인할 수 있었다. 또, 상기 약독화 생백신주를 특정 계대수로 연속계대배양하여 최적화된 바이러스 역가로 경구 투여(접종)한 돼지는 돼지유행성설사병바이러스의 증식이 낮고 돼지유행성설사병바이러스의 감염 증상인 설사 및 구토 증세와 같은 병원성이 나타나지 않아 약독화 생백신주로서 적합한 것을 확인하였다. 아울러, 상기 약독화 생백신주를 접종한 돼지에서 혈액 내 중화항체 역가가 현저하게 상승하고 장기간 동안 유지되어 돼지유행성설사병바이러스에 대한 방어 효과가 매우 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

Lin et. al., Vet Microbiol., 201:62-71, 2017 Duarte et al., J Gen Virol.,75(Pt 5):1195-200, 1994 Kim et al., Arch Virol., 160(4):1055-64, 2015 Yang et al., J Vet Sci., 19(1):71-78, 2018 Lee et al., Virus Res., 149(2):175-82, 2010

본 발명의 목적은 기존의 백신주로는 효과적인 방어가 어려운, 현재 우리나라 전역에서 빈번하게 유행하는 야생형 돼지유행성설사병바이러스, 보다 구체적으로 G2b 유전형 돼지유행성설사병바이러스에 대한 효과적인 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주를 포함하는 돼지유행성설사병바이러스 예방용 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규 돼지유행성설사병바이러스 백신주의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 돼지유행성설사병바이러스로부터 유래한 복수의 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종하여 확립한 단일 클론 바이러스주인 약독화 생백신주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 약독화 생백신주를 유효성분으로 포함하는 돼지유행성설사병바이러스의 감염 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법으로서,

(a) 복수의 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 수집하는 단계;

(b) 수집한 복수의 야생형 돼지유행성설사병바이러스 중 하나를 숙주 세포에 접종한 후 연속계대배양하는 단계;

(c) 상기 연속계대배양으로 획득한 돼지유행성설사병바이러스의 숙주 세포에서의 세포변성효과, 스파이크 유전자의 염기서열 변이 및 접종 돼지에서의 감염 증상의 확인을 통해 유전자결손 바이러스주를 확립하는 단계;

(d) 상기 (b) 단계 및 (c) 단계를 반복 수행하여 복수의 유전자결손 바이러스주를 확립하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 확립한 복수의 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종하는 단계; 및

(f) 상기 공접종으로 획득한 단일 클론 바이러스주의 숙주 세포에서의 세포변성효과, 스파이크 유전자의 염기서열 변이 및 접종 돼지에서의 감염 증상의 확인을 통해 약독화 생백신으로 확립하는 단계;를 포함하는 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법으로 제조한 약독화 생백신주, 및 이를 함유하는 백신 조성물은 현재 자돈농가에서 돼지유행성설사병바이러스의 감염 예방을 위해 사용되고 있는 인공감염을 대체 할 수 있어 인공감염으로 인해 자돈농가 내 상재하는 야생형 돼지유행성설사병바이러스의 감염 현상을 현저하게 개선시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 돼지유행성설사병바이러스의 약독화 생백신주(HSGP주)와, 2종의 유전자결손 바이러스주(HS주 및 SGP-M1주)의 유전자 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)를 선별하기 위해 사용한 개략도(schematic diagram)를 나타낸 것이다. 구체적으로, 2종의 유전자결손 바이러스주(HS주 및 SGP-M1주)를 특정 바이러스 역가 비율로 숙주 세포에 공접종한 후 플라크 피킹(plaque picking)을 통해 약독화 생백신주 후보를 클로닝(cloning)하여 선발하는 개략도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)의 게놈 구조(도 3(a))와, 스파이크 단백질의 S1 도메인 및 S2 도메인에 대한 HS주, SGP-M1주 및 HSGP주 각각의 결손된 아미노산 서열(갈색 표기: GE, FEKVHVQ)(도 3(b))과 아미노산 위치를 넘버링(numbering)하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)를 접종한 숙주 세포와, 유전자결손 바이러스주(HS주 및 SGP-M1주)를 접종한 숙주 세포의 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)에 따른 합포체 형성(syncytium formation)으로 형성된 합포체 플라크(syncytial plaque)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)를 접종한 숙주 세포와, 유전자결손 바이러스주(HS주 및 SGP-M1주)를 접종한 숙주 세포의 핵 및 세포질을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)의 계대수에 따른 바이러스 역가를 나타낸 것이다.
도 7의 (A) 및 (B)는 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)를 접종한 자돈(접종 전: PEDV 항체 음성 반응)의 설사 변화 및 체중 변화를 나타낸 것이다.
도 8의 (A) 및 (B)는 본 발명에 따른 약독화 생백신주(HSGP주)를 접종한 자돈(접종 전: PEDV 항체 음성 반응)의 분변(fecal matter) 및 소장 각각의 시료에서 확인한 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수(RNA copy number)를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 야생형 돼지유행성설사병바이러스로부터 유래한 복수의 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종하여 확립한 단일 클론 바이러스주인 약독화 생백신주에 관한 것이다.

본 발명에 따른 "유전자결손 바이러스주(Virus strain with variant genes)"는 야생형 돼지유행성설사병바이러스들 중에서 스파이크 유전자의 염기서열 일부가 변이된 S-INDEL PEDV(Spike-Insertion Deletion PEDV) Strain이다. 상기 유전자결손 바이러스주는 야외로부터 분리한 야생형 돼지유행성설사병바이러스 또는 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 연속계대배양하여 확립될 수 있다. 상기 유전자결손 바이러스주는 세포변성효과를 나타내며, 돼지에서 감염(접종)증상을 나타내는 바이러스주이다.

본 발명에 따른 "약독화 생백신주(Live attenuated virus strain)"는 병원성이 없는 바이러스주이다. 상기 약독화 생백신주는 복수의 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종하여 확립한 바이러스주이다. 상기 약독화 생백신주는 유전자결손 바이러스주와는 상이한 세포변성효과(즉, 숙주 세포 접종 시 상이한 플라크 형태[plaque morphology])를 나타내고, 돼지에서 감염(접종)증상을 나타내지 않는 바이러스주이다.

상기 약독화 생백신주는 숙주 세포에서 1회 이상, 바람직하게는 5회 이상, 더 바람직하게는 10회 이상, 가장 바람직하게는 30회 이상의 연속계대배양을 거쳐 1 X 10^5.6 TCID₅₀/ml이상, 바람직하게는 1 X 10^6.4 TCID₅₀/ml 이상, 더 바람직하게는 1 X 10^6.6 TCID₅₀/ml 이상, 가장 바람직하게는 1 X 10^7.5 TCID₅₀/ml이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 유전자결손 바이러스주는 바이러스 유전자의 염기서열 중 일부가 결손된 야생형 돼지유행성설사병바이러스 또는 임의로 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 숙주 세포에서 10회 이상, 바람직하게는 50회 이상, 더 바람직하게는 80회 이상, 가장 바람직하게는 100회 이상 연속계대배양하여 획득한 것임을 특징으로 할 수 있다.

상기 공접종은 2종 이상의 유전자결손 바이러스주로 접종하는 것임을 특징으로 할 수 있다.

상기 공접종이 2종 이상의 유전자결손 바이러스주로 이루어지는 경우, 2종 이상의 유전자결손 바이러스주 간의 혼합비는 TCID₅₀ 바이러스 역가 기준으로 동일하거나 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 공접종이 2종의 유전자결손 바이러스주로 이루어지는 경우, 2종의 유전자결손 바이러스주 간의 혼합비는 TCID₅₀ 바이러스 역가, 바람직하게는 TCID₅₀/ml 기준으로 1~9 : 9~1, 더 바람직하게는 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7, 1 : 8, 1 : 9, 또는 2 : 1, 2 : 2, 2 : 3, 2 : 4, 2 : 5, 2 : 6, 2 : 7, 2 : 8, 2 : 9, 또는 3 : 1, 3 : 2, 3 : 3, 3 : 4, 3 : 5, 3 : 6, 3 : 7, 3 : 8, 3 : 9, 또는 4 : 1, 4 : 2, 4 : 3, 4 : 4, 4 : 5, 4 : 6, 4 : 7, 4 : 8, 4 : 9, 또는 5 : 1, 5 : 2, 5 : 3, 5 : 4, 5 : 5, 5 : 6, 5 : 7, 5 : 8, 5 : 9, 또는 6 : 1, 6 : 2, 6 : 3, 6 : 4, 6 : 5, 6 : 6, 6 : 7, 6 : 8, 6 : 9, 또는 7 : 1, 7 : 2, 7 : 3, 7 : 4, 7 : 5, 7 : 6, 7 : 7, 7 : 8, 7 : 9, 또는 8 : 1, 8 : 2, 8 : 3, 8 : 4, 8 : 5, 8 : 6, 8 : 7, 8 : 8, 8 : 9, 또는 9 : 1, 9 : 2, 9 : 3, 9 : 4, 9 : 5, 9 : 6, 9 : 7, 9 : 8, 9 : 9일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 공접종은 수탁번호 KCTC14058BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주와 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주로 접종하는 것임을 특징으로 할 수 있다.

상기 약독화 생백신주는 서열번호 1로 표기되는 스파이크 유전자의 S1 도메인의 염기서열과, 서열번호 2로 표기되는 스파이크 유전자의 S2 도메인의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 약독화 생백신주는 서열번호 3으로 표기되는 스파이크 유전자의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 약독화 생백신주는 서열번호 4로 표기되는 스파이크 단백질의 S1 도메인의 아미노산 서열과, 서열번호 5로 표기되는 스파이크 단백질의 S2 도메인의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 약독화 생백신주는 수탁번호 KCTC14057BP로 수탁된 것임을 특징으로 할 수 있다.

상기 숙주 세포는 원숭이 세포 또는 돼지 생식 세포, 바람직하게는 Vero 세포(ATCC^® CCL-81™), MARC-145 세포(ATCC^® CRL-12231) 및 ST 세포(Swine testicular cell, ATCC^® CRL-1746™)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 약독화 생백신주 또는 상기 약독화 생백신주를 불활화한 바이러스 항원(virus antigen)을 유효성분으로 포함하는 돼지유행성설사병바이러스의 감염 예방을 위한 백신 조성물에 관한 것이다.

상기 약독화 생백신주의 불활화는 공지의 불활화 처리 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어 바이러스 불활화에 사용되는 BEI(Binary ethyleneimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제(불활성화제)를 사용하여 불활화(불활성화)할 수 있다.

본 발명의 불활화한 바이러스 항원은 원숭이 신장세포 또는 돼지 생식 세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포, 가장 바람직하게는 Vero 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본원 명세서에서 사용되는 "백신"이라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물과 같은 동물에 투여될 수 있는 형태의 면역원성 조성물을 함유하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.

상기 면역원성 조성물의 "면역원성"은 돼지유행성설사병바이러스, 특히 유전형 G2b 타입 돼지유행성설사병바이러스에 대해 목적 동물(숙주 동물)에서 면역 반응을 유발하는 돼지유행성설사병바이러스의 능력(항원으로서의 작용력)을 의미한다. 면역반응은 주로 세포독성 T-세포에 의해 매개되는 세포성 면역반응, 또는 B-세포를 활성화시켜 항체 생성을 유도하는 보조 T-세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응일 수 있다.

특히, "면역원성"이라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에서 면역반응을 유발하는 돼지유행성설사병바이러스를 구성하는 핵산, 폴리펩티드 등의 물질을 지칭하는 것으로 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들이 이러한 특성을 갖는다.

상기 조성물은 돼지유행성설사병바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료용임을 특징으로 할 수 있다.

상기 조성물은 상기 약독화 생백신주 외에도 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 어쥬번트(adjuvant), 항생제, 면역조절제(예컨대, 사이토카인) 등을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 돼지의 돼지유행성설사병바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 할 수 있다.

상기 "돼지"란 용어는 수컷 돼지, 암컷 돼지, 수자돈, 암자돈, 포유자돈, 임신돼지, 수유중인 암돼지, 임신돼지의 태아 등 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 멧돼지과의 동물이 모두 포함된다.

돼지의 돼지유행성설사병바이러스 감염(접종) 여부는 증상학(Symptomology)에 의해 확인될 수 있다. 돼지유행성설사병바이러스에 감염(접종)된 돼지의 통상적인 증상으로는 수양성 설사, 우울감, 식욕 부진, 탈수 증세 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 수양성 설사일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물에 포함되는 면역반응 유도를 위한 약독화 생백신주의 정확한 용량은 돼지의 면역 반응을 효과적으로 유도해낼 수 있는 용량(유효량)을 의미하며, "효과량(유효량)"이란 용어는 상기 조성물이 투여되는 돼지에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 약독화 생백신주의 용량을 말한다.

상기 면역 반응은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과적인 약독화 생백신주의 용량은 접종 대상인 돼지의 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.

본원 명세서에서, '치료'란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

상기 조성물은 경구, 비강, 피부, 근육, 직장, 질, 복강, 혈관, 림프관, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 "TCID₅₀(Tissue Culture Infective Dose 50%)"는 바이러스의 "감염유발 단위"로, 세포 또는 조직 배양물의 50％를 감염 또는 사멸시키는데 필요한 양으로 정의된다. 상기 TCID₅₀의 계산방법을 간략하게 설명하면, 먼저 바이러스 시료를 연속계단희석(Serial dilution)하고 각 희석된 바이러스 시료를 세포배양용 플레이트(예컨대, 96-well plate)의 각 웰에서 동일한 수로 배양된 숙주 세포들에 첨가하여 감염시킨 다음, 세포병변을 나타내는 웰 수를 확인하여 50%의 웰 수에서 세포병변을 나타내는 희석율의 역수로 최종 바이러스의 TCID₅₀ 값을 계산한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법으로서,

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(f) 상기 공접종으로 획득한 단일 클론 바이러스주의 숙주 세포에서의 세포변성효과, 스파이크 유전자의 염기서열 변이 및 접종 돼지에서의 감염 증상의 확인을 통해 약독화 생백신로 확립하는 단계;를 포함하는 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법에 관한 것이다.

상기 약독화 생백신주를 접종한 숙주 세포는 유전자결손 바이러스주와는 상이한 세포변성효과(즉, 숙주 세포 접종 시 상이한 플라크 형태)를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 약독화 생백신주는 유전자결손 바이러스주와는 다른 독특한 양상의 세포변성효과에 따른 합포체 형성으로 합포체 플라크를 형성할 수 있다. 일 예로서, 본원의 명세서의 도 4에 나타낸 바와 같이, 유전자결손 바이러스주는 길쭉한 모양의 세포들로 구성된 합포체 플라크 또는 구슬 같은 모양의 세포들로 구성된 합포체 플라크를 형성할 수 있고, 약독화 생백신주는 이들과 다른 비정형 합포체(Unstructured syncytium) 플라크를 형성할 수 있다.

상기 복수의 유전자결손 바이러스주는 서로 다른 스파이크 유전자의 염기서열을 갖는 2종 이상의 유전자결손 바이러스주인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[실시예 1]: 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 확립

[1-1]: 최근 유행하는 야생형 돼지유행성설사병바이러스 분리 및 유전자결손 바이러스주의 확립

유전자결손 바이러스주인 HS주의 확립

HS주 확립에 사용한 야생형 돼지유행성설사병바이러스는 돼지유행성설사병이 발생한 2017년 충남 홍성군의 양돈농가에서 돼지유행성설사병을 나타낸 포유자돈의 소장을 유제(mixing)하여 필터하고 트립신 처리 후 Vero 세포(ATCC^® CCL-81™)에 접종하여 분리한 유전형 G2b 타입 주(Genotype G2b type strain)이었다.

구체적으로, 도 3에 나타낸 바와 같이, HS주는 Vero 세포에 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 접종 후 분리할 때부터 스파이크 유전자에 포함되는 S1 도메인의 164~169bp 부위에서 6개의 염기서열(TTGGTG)이 결손(결실)된 것을 확인하였다. 상기 분리한 야생형 돼지유행성설사병바이러스는 기탁에 필요한 충분한 용량의 바이러스를 확보하기 위해 10회 계대한 후 아래와 같이 PEDV HS strain으로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다. 또, 상기 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 100대 연속 계대를 하더라도 상기 염기서열이 결손된 상태로 계속해서 유지되는 것을 확인하였다. 즉, 표준 PEDV Strain USA/Colorado/2013(GenBank number: KF272920.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF272920)의 스파이크 염기서열(서열번호 6)에 따른 아미노산 서열을 기준으로, HS주는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 포함되는 2개의 아미노산, 즉 55번째 아미노산인 글리신(G) 및 56번째 아미노산인 글루탐산(E)이 결손된 것이 특징인 유전형 G2b 타입 분리 주이다. 한편, HS주를 Vero 세포에 접종하여 130대까지 계대하더라도 HS주의 유전자들에 대한 추가적 염기변이는 확인되지 않았다.

상기 유전자결손 바이러스주(HS주)는 'Porcine Epidemic Diarrhea Virus (HS) strain'로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였고, 2019년 12월 3일자로 수리되어 수탁번호 KCTC14058BP로 등재되었다.

아울러, KCTC14058BP로 등재된 HS주의 생존증명서(Viability Statement)도 KCTC로부터 2020년 1월 3일자로 발급받았다.

유전자결손 바이러스주인 SGP-M1주의 확립

SGP-M1주 확립에 사용한 야생형 돼지유행성설사병바이러스는 돼지유행성설사병이 발생한 2018년 경기 김포시의 농장에서 돼지유행성설사병을 나타낸 포유자돈의 소장과 분변에서 분리하고 트립신 처리 후 Vero 세포에 접종하여 분리한 유전형 G2b 타입 주이었다.

구체적으로, 도 3에 나타낸 바와 같이, SGP-M1주는 Vero 세포에 야생형 돼지유행성설사병바이러스를 접종 후 80대 연속 계대하여 확립한 후 아래와 같이 PEDV SGP-M1 strain으로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다. 유전자 염기서열의 분석 결과, 분리된 야생형 돼지유행성설사병바이러스의 스파이크 유전자에 포함되는 S2 도메인의 염기서열과 달리 SGP-M1주는 스파이크 유전자에 포함되는 S2 도메인의 4,136~4,137bp 부위에서 2개의 염기서열(TT)이 결손(결실)된 것을 확인하였다. 즉, 표준 PEDV Strain USA/Colorado/2013(GenBank number: KF272920.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF272920)의 스파이크 염기서열(서열번호 6)에 따른 아미노산 서열을 기준으로 SGP-M1주는 스파이크 단백질의 S2 도메인에 포함되는 7개의 아미노산, 즉 1380번째 아미노산인 페닐알라닌(F), 1381번째 아미노산인 글루탐산(E), 1382번째 아미노산인 리신(K), 1383번째 아미노산인 발린(V), 1384번째 아미노산인 히스티딘(H), 1385번째 아미노산인 발린(V) 및 1386번째 아미노산인 글루타민(Q)이 결손된 것이 특징인 유전형 G2b 타입 분리 주이다. 한편, SGP-M1주를 Vero 세포에 접종하여 140대까지 계대하더라도 SGP-M1주의 유전자들에 대한 추가적 염기변이는 확인되지 않았다.

상기 유전자결손 바이러스주(SGP-M1주)는 'Porcine Epidemic Diarrhea Virus SGP-M1 strain'로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였고, 2019년 12월 3일자로 수리되어 수탁번호 KCTC14056BP로 등재되었다.

아울러, KCTC14056BP로 등재된 SGP-M1주의 생존증명서도 KCTC로부터 2019년 12월 17일자로 발급받았다.

위에서 확립한 HS주와 SGP-M1주가 유전자결손 바이러스주들이라고 판단하게 된 것은 Lin et. al., Vet Microbiol., 201:62-71, 2017의 논문에 근거한 것이다. 상기 논문에 따르면 돼지유행성설사병바이러스의 약독화 생백신 후보주들은 공통적으로 염기서열의 일부가 결실된 스파이크 유전자를 가진다고 기재되어 있다.

위에서 야생형 돼지유행성설사병바이러스의 유전자결손 바이러스주 확립을 위해 사용한 배지는 TPB(Tryptose Phosphate Broth solution, Sigma Cat no. T8159), YES(Yeast Extract Solution, Gibco Cat no. 18180-059) 및 2.5% 트립신(10X Trypsin; Gibco Cat no. 15090-046)를 포함하는 α-MEM(alpha-Minimum Essential Medium, Gibco Cat no. 12561-056)이었다.

[1-2]: 확립한 유전자결손 바이러스주의 세포변성효과 확인

실시예 1의 [1-1]에서 확립한 유전자결손 바이러스주인 HS주와 SGP-M1주 간에 세포변성효과(CPE)의 차이를 확인하기 위해 Vero 세포에 HS주와 SGP-M1주를 각각 1 X 10^5.0TCID₅₀/ml의 바이러스 역가로 접종하고 3일 후 세포변성효과 여부를 광학현미경(EVOS, Thermofisher) 하에서 100X 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HS주는 길쭉한 모양의 세포들로 구성된 합포체 플라크를 형성한 반면 SGP-M1주는 구슬 같은 모양의 세포들로 구성된 합포체 플라크를 형성하는 것으로 나타나 두 유전자결손 바이러스주 간에 세포변성효과의 차이가 있음을 확인하였다.

[1-3]: 약독화 생백신주 선별을 위한 플라크 어세이

약독화 생백신주를 선별하기 위해 실시예 1의 [1-1]에서 확립한 HS주 및 SGP-M1주를 특정 바이러스 역가 비율로 Vero 세포에 공접종한 후 플라크 피킹(plaque picking)을 통해 약독화주를 클로닝(cloning)하여 선별하였다(아래 표 1 및 도 2 참조).

먼저, 플라크 어세이(plaque assay)에 필요한 재료를 아래 (1)~(3)과 같이 준비하였다.

(1) 아가로즈 겔: 2X 배지(50ml)에 아가로스 용액(25ml), 항생-항진균 용액(100X Antibiotic-Antimycotic; Gibco Cat no. 15240-062), MEM NEAAS(MEM Non-Essential Amino Acids Solution; Gibco Cat no. 11140-076) 및 2.5% 트립신(10X Trypsin[10μg/ml]; Gibco Cat no. 15090-046)을 첨가하여 제조하였다.

(2) 아가로즈 용액: 0.75g 아가로스(UltraPure™ LMP Agarose, Invitrogen Cat no. 16520-100)를 25ml 정제수(UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water, Invitrogen Cat no. 10977-015)에 첨가한 후 약 120℃에서 약 15분간 오토클레이브(autoclave)한 후, 45℃의 온도로 조정된 수조(water bath)에서 보관하여 준비하였다.

(3) 2X 배지는 500ml 정제수에 13.4g DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco Cat no. 12100-046) 및 3.75g 탄산수소나트륨(Sodium bicarbonate, Sigma Cat no. S5761)을 용해시킨 후 여과하여 준비하였다.

구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 바이러스 역가(TCID₅₀/ml) 기준으로 HS주 : SGP-M1주 = 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7, 1 : 8, 1 : 9, 또는 2 : 1, 2 : 2, 2 : 3, 2 : 4, 2 : 5, 2 : 6, 2 : 7, 2 : 8, 2 : 9, 또는 3 : 1, 3 : 2, 3 : 3, 3 : 4, 3 : 5, 3 : 6, 3 : 7, 3 : 8, 3 : 9, 또는 4 : 1, 4 : 2, 4 : 3, 4 : 4, 4 : 5, 4 : 6, 4 : 7, 4 : 8, 4 : 9, 또는 5 : 1, 5 : 2, 5 : 3, 5 : 4, 5 : 5, 5 : 6, 5 : 7, 5 : 8, 5 : 9, 또는 6 : 1, 6 : 2, 6 : 3, 6 : 4, 6 : 5, 6 : 6, 6 : 7, 6 : 8, 6 : 9, 또는 7 : 1, 7 : 2, 7 : 3, 7 : 4, 7 : 5, 7 : 6, 7 : 7, 7 : 8, 7 : 9, 또는 8 : 1, 8 : 2, 8 : 3, 8 : 4, 8 : 5, 8 : 6, 8 : 7, 8 : 8, 8 : 9, 또는 9 : 1, 9 : 2, 9 : 3, 9 : 4, 9 : 5, 9 : 6, 9 : 7, 9 : 8, 9 : 9로 각각의 혼합 바이러스 시료들(mixed virus samples)을 준비하였다(아래 표 1은 예시로서, 도 2에 나타낸 상기 HS주 : SGP-M1주의 바이러스 역가 혼합비 중 일부만을 나타낸 것이다). 그다음, 상기 각각의 혼합 바이러스 시료를 6-웰 플레이트(6-well plate)에 시딩(seeding)한 Vero 세포에 공접종하였다. 접종 1시간 후에 혼합 바이러스 시료를 함유하는 상층액을 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline)로 Vero 세포를 1회 세척하였다. 그다음, Vero 세포 위에 아가로즈 겔(agarose gel: 아가로즈 용액, 2X 배지, 항생-항진균 용액, MEM NEAAS 및 2.5% 트립신의 혼합물)을 웰 당 5ml씩 넣어주고 도포하여 상온에서 1시간 동안 굳을 때까지 방치한 다음, 37℃/5% 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 배양 3일 후에 혼합 바이러스 시료로 접종한 Vero 세포에서 세포변성효과(CPE)가 나타나면 플라크 피킹(plaque picking)을 하였다.

HS주 및 SGP-M1주에 대한 바이러스 역가의 혼합비	SGP-M1주의 바이러스 역가(TCID₅₀/ml)	HS주의 바이러스 역가(TCID₅₀/ml)
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 1	1.0 X 10⁵	1.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 2	1.0 X 10⁵	2.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 3	1.0 X 10⁵	3.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 4	1.0 X 10⁵	4.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 5	1.0 X 10⁵	5.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 6	1.0 X 10⁵	6.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 7	1.0 X 10⁵	7.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 8	1.0 X 10⁵	8.0 X 10⁵
HS주 : SGP-M1주 = 1 : 9	1.0 X 10⁵	9.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 1	1.0 X 10⁵	1.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 2	1.0 X 10⁵	2.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 3	1.0 X 10⁵	3.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 4	1.0 X 10⁵	4.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 5	1.0 X 10⁵	5.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 6	1.0 X 10⁵	6.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 7	1.0 X 10⁵	7.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 8	1.0 X 10⁵	8.0 X 10⁵
SGP-M1주 : HS주 = 1 : 9	1.0 X 10⁵	9.0 X 10⁵

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 접종한 혼합 바이러스 시료의 바이러스 역가 혼합비 중에서 SGP-M1주 : HS주를 1 : 9(SGP-M1주: 1 X 10⁵TCID₅₀/ml, HS주: 9 X 10⁵TCID₅₀/ml)로 혼합하여 접종한 Vero 세포에서 여러 유형의 세포변성효과(CPE)가 나타나는 것을 확인하였다. 여러 유형의 세포변성효과 중에서 HS주와 SGP-M1주 각각에서만 특이적으로 나타나는 세포변성효과를 가지는 CPE 플라크는 제외시켰고 그 외 세포변성효과를 가지는 CPE 플라크를 선정하여 1ml 피펫으로 CPE 플라크의 원액을 피킹(원액 수집)하였다. 상기 원액, 및 상기 원액을 10배, 100배, 1,000배로 희석한 용액(희석 용매: DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco Cat no. 12100-046))을 접종액으로 사용하여 접종 1일 전에 6-웰 플레이트에 시딩한 Vero 세포에 접종하였다.

접종 1시간 후에 접종액이 포함된 상층액을 제거하고 아가로즈 겔을 웰 당 5ml씩 넣어주고 도포하여 상온에서 1시간 동안 굳을 때까지 방치한 다음, 37℃/5% 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 배양 3일 후에 다시 CPE 플라크를 피킹하였고 이렇게 피킹-접종을 4~5회 연속하여 실시한 후 최종적인 CPE 플라크(단일 클론[single clone])을 약독화 생백신주로 피킹하였다. 약독화 생백신주로 피킹한 CPE 플라크(단일 클론)에 포함된 세포의 핵을 형광물질인 DAPI(Cat no. ab228549, abcam)로 염색하고, 세포의 세포질을 FA 염색법(FA staining; fluorescent antibody staining)으로 염색한 다음, 100X 배율로 광학현미경(EVOS, Thermofisher) 하에서 세포의 전반적인 모습을 DIC(Differential interference contrast) 모드로 관찰하였고, 형광현미경(Nikon) 하에서 DAPI 및 FA의 두 이미지를 머지(merge)하여 관찰하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 약독화 생백신주(이하 HSGP주라 명명함)는 HS주와 SGP-M1주와는 다른 독특한 양상의 CPE에 따른 합포체 형성으로 길쭉한 모양의 세포들로 구성된 합포체 플라크 또는 구슬 같은 모양의 세포들로 구성된 합포체 플라크가 아닌 비정형 합포체(Unstructure syncytium) 플라크를 형성하는 것으로 확인되었다.

아울러, 유전자 염기서열의 분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 표준 PEDV Strain USA/Colorado/2013(GenBank number: KF272920.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF272920)의 스파이크 염기서열(서열번호 6)을 기준으로 약독화 생백신주인 HSGP주는 HS주와 동일하게 스파이크 유전자에 포함되는 S1 도메인의 164~169bp 부위에서 6개의 염기서열(TTGGTG)이 결손(결실)되어, 결과적으로 스파이크 단백질의 S1 도메인에 포함되는 2개의 아미노산, 즉 55번째 아미노산인 글리신(G) 및 56번째 아미노산인 글루탐산(E)이 결손된 것으로 확인되었다. 또, HSGP주는 SGP-M1주와 동일하게 스파이크 유전자에 포함되는 S2 도메인의 4,136~4,137bp 부위에서 2개의 염기서열(TT)이 결손(결실)되어, 결과적으로 스파이크 단백질의 S2 도메인에 포함되는 7개의 아미노산, 즉 1380번째 아미노산인 페닐알라닌(F), 1381번째 아미노산인 글루탐산(E), 1382번째 아미노산인 리신(K), 1383번째 아미노산인 발린(V), 1384번째 아미노산인 히스티딘(H), 1385번째 아미노산인 발린(V) 및 1386번째 아미노산인 글루타민(Q)이 결손된 것으로 확인되었다.

상기 약독화 생백신주(HSGP)는 'Porcine Epidemic Diarrhea Virus HSGP strain'로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였고, 2019년 12월 3일자로 수리되어 수탁번호 KCTC14057BP로 등재되었다.

아울러, KCTC14057BP로 등재된 HSGP주의 생존증명서도 KCTC로부터 2019년 12월 26일자로 발급받았다.

[실시예 2]: 약독화 생백신에 대한 동물실험 평가

[2-1]: 약독화 생백신주(HSGP주)의 세포 적응성에 따른 상승된 바이러스 역가 확인

실시예 1에서 플라크 피킹을 통해 선별/확립한 약독화 생백신주(HSGP)를 백신 제조용 마스터 시드 바이러스(Master seed virus)로 사용하여 바이러스 계대(약독화 생백신주 접종 후 3~4일 간격으로 계대)에 따른 바이러스 역가(바이러스 함량)의 변화를 계대별로 아래 바이러스 역가 측정법으로 확인하였다.

바이러스 역가 측정법

약독화 생백신주(HSGP주)에 대한 바이러스 역가의 확인은 96-웰 플레이트(96-well plate)에 단층(monolayer)으로 시딩된 Vero 세포를 준비한 다음, 약독화 생백신주(HSGP주)를 10진 희석한 용액 100μl씩을 Vero 세포가 담긴 웰에 넣어 37℃/5% 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 Vero 세포가 접종되도록 하였다. 그다음, 접종된 Vero 세포를 PBS로 2회 세척하고 무혈청 배지(Serum-free DMEM)를 웰 당 100μl씩 첨가한 후 2~3일 경과 후 세포변성효과(CPE)를 관찰하여 바이러스 역가를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 약독화 생백신주(HSGP주)의 계대수가 증가할 수록 바이러스 역가가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 약독화 생백신주(HSGP주)를 1회 계대(1대 계대: 1st passage) 시 1 X 10^5.6 TCID₅₀/ml 의 바이러스 역가를 나타냈었으나, 5회 계대(5대 계대: 5th passage)하였을 때 1 X 10^6.4 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내었고, 10회 계대(10대 계대: 10th passage)하였을 때 1 X 10^6.6 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내었으며, 30회 계대(30대 계대: 30th passage)하였을 때는 1 X 10^7.5 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내는 것으로 확인되었다.

아울러, 5대 계대마다 계대한 약독화 생백신주(HSGP주)의 유전자 염기서열의 분석 결과에 따르면 1~30대에 걸쳐 계대한 약독화 생백신주(HSGP주)의 스파이크 유전자에 포함되는 S1 도메인과 S2 도메인 각 도메인에 포함되는 결손 염기서열이 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.

[2-2]: 포유자돈에 대한 약독화 생백신주(HSGP주)의 병원성 여부 확인

약독화 생백신주(HSGP주)를 5일령 포유자돈(투여 전: PEDV 항체 음성 반응)에 경구 투여하여 병원성 유무를 판단함으로써 약독화 생백신(HSGP주)의 백신 적합성을 검토하였다.

실험군으로는 실시예 2의 [2-1]에서 30회 계대(30대 계대: 30th passage)한 약독화 생백신주(HSGP주)를 사용하였고, 비교군으로는 100대 계대한 HS주 및 100대 계대한 SGP-M1주 각각을 사용하였다. 포유자돈(5일령) 10두를 5그룹(2두/그룹)으로 나누고 이 중 4그룹은 각각 HSGP주(최종 바이러스 항원량: 1 x 10⁶TCID₅₀/dose, 1 x 10⁵TCID₅₀/dose), HS주(최종 바이러스 항원량: 1 X 10⁵TCID₅₀/dose) 및 SGP-M1주(최종 바이러스 항원량: 1 X 10⁵TCID₅₀/dose)를 경구 투여하였고, 나머지 1그룹은 음성 대조군(Negative Control[N.C.]: 바이러스 비투여군)으로 설정하였다(표 2 참조). 경구 투여 후 6일간 경구 투여한 포유자돈을 임상관찰하면서, 포유자돈의 체중을 측정하고 분변을 수집하였으며, 접종 7일후에는 포유자돈을 부검하여 병변을 임상관찰(설사 유무, 체중 변화 유무 및 활동성 변화 유무의 확인)하고 분변 및 소장을 수집하였다.

접종 바이러스주	돼지 두수	접종량 (TCID₅₀/dose)	접종법(접종부피)	관찰기간
HSGP(10⁶)	2	1.0 X 10⁶	경구(3ml)	7일
HSGP(10⁵)	2	1.0 X 10⁵	경구(3ml)	7일
HS	2	1.0 X 10⁵	경구(3ml)	7일
SGP-M1	2	1.0 X 10⁵	경구(3ml)	7일
N.C.	2	1.0 X 10⁵	경구(3ml)	7일

[2-2-1]: 포유자돈에 대한 약독화 생백신주(HSGP주)의 접종 후 설사 유무 확 인

약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 5일령 포유자돈에서 설사 질환이 유발되는지 설사 정도를 점수화하여 확인하였다.

설사 정도의 확인은 0~3점의 설사 점수화(Diarrhea scoring)로 하였다. 여기서, 0점은 정상 분변(설사 부재)을 나타내고, 1점은 약한 정도의 설사 강도를 나타내며, 2점은 중간 정도의 설사 강도를 나타내고, 3점은 강한 정도의 설사 강도(수양성 설사)를 나타낸 것이다.

그 결과, 도 7의 (A)에 나타낸 바와 같이, 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 포유자돈 그룹(1 X 10⁶TCID₅₀/dose, 1.0 X 10⁵TCID₅₀/dose)은 경구 투여 후 5일 동안 설사를 전혀 하지 않는 것(0점)을 확인하였다(음성 대조군(N.C.: 비투여군): 설사 부재[0점]).

반면, HS주를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 경구 투여후 2~4일 간 수양성 설사(3점)를 하는 것을 확인하였다(야생형 돼지유행성설사병바이러스의 설사 질환 유발 형태와 유사함). 또, SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 경구 투여 후 3일까지만 수양성 설사를 하는 것(3점)을 확인하였고, 경구 투여 후 4일째부터는 약한 정도의 설사를 하는 것(1점)을 확인할 수 있어 설사의 정도가 완화되었다.

[2-2-2]: 포유자돈에 대한 약독화 생백신주(HSGP주)의 접종 후 체중 변화 및 활동성 확인

먼저, 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 5일령 포유자돈의 체중 증감 추이를 살펴보았다.

그 결과, 도 7의 (B)에 나타낸 바와 같이, 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 경구 투여 후 6일이 경과된 시점에서 체중 증가율이 20.63%인 것으로 확인되었다(음성 대조군(N.C.: 비투여군)의 체중 증가율 = 19.68%).

반면, HS주를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 경구 투여 후 6일이 경과된 시점에서 체중 감소율이 25.96%이었다. 또, SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 경구 투여 후 6일이 경과된 시점에서 체중 감소율이 20.08%으로 나타났다. 즉, 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 포유자돈 그룹과 달리, HS주를 경구 투여한 포유자돈 그룹과 SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 심각한 체중 감소로 포유자돈의 건강 상태가 악화되는 것을 확인하였다.

다음으로, 약독화 생백신주(HSGP주), HS주 및 SGP-M1주를 경구 투여한 각 포유자돈 그룹의 건강 상태를 식욕과 활동성으로 비교하였다.

그 결과, 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 포유자돈 그룹 및 음성 대조군은 실험기간 동안 왕성한 식욕과 활동성을 보였다. 반면, HS주를 경구 투여한 포유자돈 그룹과 SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹은 경구 투여 후 2~3일 후부터 활동성이 현저히 저하되었고, 급이된 사료도 제대로 섭취하지 못하였으며 돼지유행성설사병바이러스의 전형적인 감염 증상인 설사 및 구토 증세를 나타낸 것으로 확인되었다.

[2-3]: 포유자돈에 대한 약독화 생백신주의 접종 후 수집한 분변 /설사 및 소장 조직 내 포함된 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수(RNA copy number)의 확인

실시예 2의 [2-2]에서 경구 투여한 각 포유자돈 그룹의 시료(분변, 소장)의 돼지유행성설사병바이러스의 유무 또는 증식 정도(proliferation status)를 검출하기 위하여 qRT-PCR(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)를 이용하여 경구 투여한 각 포유자돈 그룹의 분변(swab로 수집) 및 소장에 존재하는 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수를 일수에 따라 확인하였다.

< qRT-PCR 분석방법 >

qRT-PCR 분석방법에 필요한 RNA 추출 키트(RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104), Qiagen Inc., USA), PCR Premix Kit(AccuPower Profi Taq PCR Premix(Cat.No.K-2632), Bioneer Inc. South Korea) 및 cDNA 합성 키트(HelixCript Easy cDNA Synthesis Kit(Cat.No.ECDNA100), Nanohelx Inc., South Korea)를 준비하였다.

먼저, RNA 추출 키트를 이용하여 각 포유자돈 그룹의 분변 또는 소장의 RNA를 분리하고, 상기 분리한 RNA를 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성(RT, Reverse Transcription)하였다. 합성한 cDNA와 돼지유행성설사병바이러스 특이적 프라이머(아래 표 3 참조)를 PCR Premix Tube(시험약에 Taq Polymerase 포함)에 첨가한 후, Thermal Cycler Dice™ Real Time System(TaKaRa, 일본)에서 하기 반응조건으로 PCR을 수행하여 돼지유행성설사병바이러스에 대한 양성/음성반응 및 증식량을 확인하였다.

PCR 반응조건

상기 합성한 cDNA를 이용하여, 50℃에서 30분 1 사이클, 95℃에서 15분 1사이클, 및 95℃에서 10초 및 60℃에서 1분 40사이클로 PCR 반응을 수행하였다. 그다음, 양성 대조군의 표준곡선에 따른 Ct(cycle threshold) 값에 기초하여 돼지유행성설사병바이러스에 대한 양성/음성반응 및 증식량을 확인하였다.

표 3은 돼지유행성설사병바이러스의 스피이크 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.

프라이머 명칭	프라이머 염기서열(5' to 3')	유전자 크기	유전자	서열번호
J1129F	CTTCTGGTTGYTCTTACCAGT	485bp 또는 494bp	Spike	7
J1128R	CATTATCCCATGTTATGCCGAC	485bp 또는 494bp	Spike	8

그 결과, 도 8의 (A)에 나타낸 바와 같이, 포유자돈 그룹에 경구 투여한 약독화 생백신주(HSGP주), HS주 및 SGP-M1주는 경구 투여 후 3일이 경과된 시점에서는 바이러스 쉐딩(viral shedding)으로 인해 모두 비슷한 수준의 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수를 수집한 포유자돈 분변에서 나타내었다. 한편, 포유자돈 그룹에 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여 후 3일을 초과할 경우, 경구 투여한 약독화 생백신주(HSGP주)의 RNA 카피 수는 수집한 포유자돈 분변에서 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 반면, HS주 및 SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹의 수집 분변에는 경구 투여 후 3일을 초과하더라도 HS주 및 SGP-M1주 각각의 RNA 카피 수가 증가하여 지속적으로 돼지유행성설사병바이러스가 포유자돈 그룹에서 증식하는 것을 확인하였다.

다음으로, 실시예 2의 [2-2]에서 약독화 생백신주(HSGP주), HS주 및 SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹을 경구 투여 후 7일째에 부검하여 수집한 소장을 PBS에서 유제(mixing)한 다음, 원심분리하여 수확한 소장 조직의 상층액으로부터 RNA를 추출한 후 돼지유행성설사병바이러스의 바이러스 함량을 RNA 카피 수로 확인하였다.

그 결과, 도 8의 (B)에 나타낸 바와 같이, 약독화 생백신주(HSGP주)를 경구 투여한 포유자돈 그룹으로부터 수집한 소장에서는 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수가 2.71(log10) 및 2.16(log10)인 것으로 확인되었다(음성 대조군: 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 미검출). 반면, HS주를 경구 투여한 포유자돈 그룹으로부터 수집한 소장에서는 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수가 4.56(log10)이었다. 또, SGP-M1주를 경구 투여한 포유자돈 그룹으로부터 수집한 소장에서는 돼지유행성설사병바이러스의 RNA 카피 수가 4.71(log10)으로 나타났다.

결국, HS주 및 SGP-M1주와 달리, 약독화 생백신주(HSGP주)를 돼지에 경구 투여할 경우 돼지유행성설사병바이러스의 증식이 저조하여 감염 증상인 설사 및 구토 증세와 같은 병원성이 나타나지 않았다. 즉, 약독화 생백신주(HSGP주)는 약독화 생백신주로서 적합한 것으로 확인되었다.

[2-4]: 육성돈에서의 약독화 생백신주의 경구 접종 후 면역원성 평가

실시예 1 및 실시예 2의 [2-1]~[2-3]을 통해 확립한 약독화 생백신주인 HSGP주의 면역원성 확인을 위해 8마리의 육성돈(Growing pigs; 약 100일령)을 3개의 그룹으로 나누어 각 그룹의 육성돈을 HSGP주로 경구 접종(Oral inoculation[OI])하였다. 1차 경구 접종 시, 그룹 1(3두)은 HSGP주를 경구로 10ml(사용농도[working concentration]: 1 X 10^7.0TCID₅₀/10ml) 접종하였으며 그룹 2(3두)는 HSGP주를 경구로 10ml(사용농도: 1 X 10^6.0TCID₅₀/10ml) 접종하였고 그룹 3(2두)은 무처치(위접종[Mock]: 바이러스 비투여)한 음성 대조군(Negative Control[N.C.])으로 하였다. 상기와 같은 조건하에서 1차 경구 접종후 2주후에 2차 경구 접종하였다. 경구 접종 전, 1차 경구 접종 2주후, 2차 경구 접종 2주후 각 그룹의 육성돈의 혈액을 채혈하여 수집한 혈청의 중화시험으로 중화 항체가(neutralization antibody titer)를 측정하였다.

표 4는 HSGP주를 육성돈에 경구 접종한 후 채혈한 혈액으로부터 수집한 혈청의 중화항체가 변화(titer change of neutralization antibody of serum collected from blood)를 나타낸 것이다.

그룹	돼지번호	접종방법	최종 백신함량	중화 항체가
그룹	돼지번호	접종방법	최종 백신함량	접종 전	1차 접종 2주후	2차 접종 2주후
그룹 1(HSGP주 접종군)	OI-03	경구 접종	1 X 10^7.0TCID₅₀/10ml	8	32	256
	OI-17	경구 접종	1 X 10^7.0TCID₅₀/10ml	16	32	128
	OI-20	경구 접종	1 X 10^7.0TCID₅₀/10ml	8	32	128
그룹 2(HSGP주 접종군)	OI-21	경구 접종	1 X 10^6.0TCID₅₀/10ml	16	32	64
	OI-25	경구 접종	1 X 10^6.0TCID₅₀/10ml	8	32	64
	OI-29	경구 접종	1 X 10^6.0TCID₅₀/10ml	16	32	128
그룹 3(대조군)	CON-41	위접종(Mock)	-	8	8	4
그룹 3(대조군)	CON-43	위접종(Mock)	-	16	8	8

HSGP주를 육성돈에 경구 투여로 1차 접종후 2차 접종한 다음 2주후에 채혈한 혈액 유래 혈청의 중화항체가를 비교하였다. 그 결과, 그룹 1은 접종 전 대비하여 중화항체가의 수치가 8~32배로 상승하였고, 그룹 2는 접종 전 대비하여 중화항체가의 수치가 4~8배로 상승하여 경구 접종으로 HSGP주 투여 시 육성돈의 항체면역이 높게 형성되는 것을 확인하였다.

[2-5]: 육성돈에서의 약독화 생백신주의 근육 접종 후 면역원성 평가

실시예 1 및 실시예 2의 [2-1]~[2-3]을 통해 확립한 약독화 생백신주인 HSGP주의 면역원성 확인을 위해 8마리의 육성돈(약 100일령)을 3개의 그룹으로 나누어 각 그룹의 육성돈을 HSGP주로 근육 접종(Intramuscular inoculation[IM])하였다. 1차 근육 접종 시, 그룹 1(3두)은 HSGP주를 근육으로 2ml(사용농도: 1 X 10^7.0TCID₅₀/ml) 접종하였으며 그룹 2(3두)는 HSGP주를 근육으로 2ml(사용농도: 1 X 10^6.0TCID₅₀/ml) 접종하였고 그룹 3(2두)은 무처치(위접종: 바이러스 비투여)한 음성 대조군([N.C.])으로 하였다. 상기와 같은 조건하에서 1차 근육 접종후 2주후에 2차 근육 접종하였다. 근육 접종 전, 1차 근육 접종 2주후, 2차 근육 접종 2주후 각 그룹의 육성돈의 혈액을 채혈하여 수집한 혈청의 중화시험으로 중화 항체가를 측정하였다.

표 5는 HSGP주를 육성돈에 근육 접종한 후 채혈한 혈액으로부터 수집한 혈청의 중화항체가 변화를 나타낸 것이다.

그룹	돼지번호	접종방법	최종 백신함량	중화 항체가
그룹	돼지번호	접종방법	최종 백신함량	접종 전	1차 접종 2주후	2차 접종 2주후
그룹 1(HSGP주 접종군)	IM-07	근육 접종	2 X 10^7.0TCID₅₀/2ml	16	32	128
	IM-18	근육 접종	2 X 10^7.0TCID₅₀/2ml	16	64	128
	IM-19	근육 접종	2 X 10^7.0TCID₅₀/2ml	8	32	128
그룹 2(HSGP주 접종군)	IM-24	근육 접종	2 X 10^6.0TCID₅₀/2ml	16	64	128
	IM-28	근육 접종	2 X 10^6.0TCID₅₀/2ml	8	64	128
	IM-31	근육 접종	2 X 10^6.0TCID₅₀/2ml	16	32	128
그룹 3(대조군)	CON-41	위접종(Mock)	-	8	8	4
그룹 3(대조군)	CON-43	위접종(Mock)	-	16	8	8

HSGP주를 육성돈에 근육 접종으로 1차 접종후 2차 접종한 다음, 2주후에 채혈한 혈액 유래 혈청의 중화항체가를 비교하였다. 그 결과, 그룹 1과 그룹 2는 접종 전 대비하여 중화항체가의 수치가 8~16배로 상승하여 근육 접종으로 HSGP주 투여 시 육성돈의 항체면역이 높게 형성되는 것을 확인하였다.

결국, 본 발명에 따른 약독화 생백신주인 HSGP주를 돼지에 경구 접종(경구 투여) 또는 근육 접종(근육 투여)하면 돼지의 중화항체 형성(neutralizing antibody formation)을 증가시켜 돼지유행성설사병바이러스의 감염질환을 효과적으로 예방, 방지, 개선 또는 치료하거나, 돼지유행성설사병바이러스 감염으로 인해 발생되는 감염질환의 증상인 설사증, 구토 증세 등을 완화시킬 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC14056BP

20191203

한국생명공학연구원

KCTC14057BP

20191203

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KCTC14058BP

20191203

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Live Attenuated Porcine Epidemic Diarrhea Virus Vaccine Strain, Composition Containing Thereof, and Method of Producing Thereof <130> YPD202001-0015 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSGP-s1 nt <400> 1 atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60 caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120 gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctaaaaacca gggtgtcaat 180 tcaacttggt actgtgctgg ccaacatcca actgctagtg gcgttcatgg tatctttgtt 240 agccatatta gaggtggtca tggctttgag attggcattt cgcaagagcc ttttgactct 300 agtggttacc agctttattt acataaggct actaacgata acactaatgc tactgcgcga 360 ctgcgcattt gccagtttcc tagcattaaa acattgggcc ccactgctaa taatgatgtt 420 acaacaggtc gtaattgcct atttaacaaa gccatcccag ctcatatgag tgaacatagt 480 gttgtcggca taacatggga taatgatcgt gtcactgtct tttctgacaa gatctattat 540 ttttatttta aaaatgattg gtcccgtgtt gcgacaaagt gttacaacag tggaggttgt 600 gctatgcaat atgtttacga acccacctat tacatgctta atgttactag tgctggtgag 660 gatggtattt cttatcaacc ctgtacagct aattgcattg gttatgctgc caatgtattt 720 gctactgagc ccaatggcca cataccagaa ggttttagtt ttaataattg gtttcttttg 780 tccaatggtt ccactttggt gcatggtaag gtggtttcca accaaccatt gttggtcaat 840 tgtcttttgg ccattcctaa gatttatgga ctaggccaat ttttctcctt taatcaaacg 900 atcgatggtg tttgtaatgg agctgctgtg cagcgtgcac cagaggctct gaggtttaac 960 attaatgaca cctctgtcat tcttgctgaa ggctcaattg tacttcatac tgctttagga 1020 acaaattttt cttttgtttg cagtaattcc tcaaatcctc acttagctac cttcgtcata 1080 cctctgggtg ccacccaagt accttattat tgttttctta aagtggatac ttacaactcc 1140 actgtttata aatttttggc tgttttacct cctaccgtca gggaaattgt catcaccaag 1200 tatggtgatg tttatgtcaa tgggtttgga tacttgcatc tcggtttgtt ggatgctgtt 1260 acaattaatt tcactggtca tggcactgac aatgatgttt ctggtttttg gaccatagca 1320 tcgactaatt ttgttgatgc actcatcgaa gttcaaggaa ccgccattca gcgtattctt 1380 tattgtgatg atcctgttag ccaactcaag tgttctcagg ttgcttttga ccttgacgat 1440 ggtttttacc ctatttcttc tagaaacctt ctgagtcatg aacagccaat ttcttttgtt 1500 actctgccat catttaatga tcattttttt gttaacatta ctgtatctgc ttcctttggt 1560 ggtcatagtg gtgccaacct tattgcatct gacactacta tcaatgggtt tagttctttc 1620 tgtgttgaaa ctagacaatt taccatttca ctgttttata acgttacaaa cagttatggt 1680 tatgtgtcta tatcacagga cagtaattgc cctttcacct tgcaatctgt taatgattac 1740 ctgtctttta gcaaattttg tgtttccacc agccttttgg ctagtgcctg taccatagat 1800 ctttttggtt accctgagtt tggtagtggt gttaagttta cgtcccttta ctttcaattc 1860 acaaagggtg agttgattac tggcacgcct aaaccatttg aaggtgtcac ggacgtttct 1920 tttatgactc tggatgtgtg taccaagtat actatctatg gctttaaagg tgagggtatc 1980 attaccctta caaattctag ctttttggca ggtgtttatt acacatctga gtctggacag 2040 ttgttagcct ttaagaatgt cactagtggt gctgtttatt ctgttacgcc atgttctttt 2100 tcagagcagg ctgcatatgt tgatgatgat atagtgggtg ttatttctag tttgtctagc 2160 tccactttta acagtactag ggagttgcct ggtttcttct accattctaa tgatggctct 2220 aattgtacag agcctgtgtt ggtgtatagt aacataggtg 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ttacagagga gctccaaagt cttatatata atatcaacaa cacactagtt 1560 gaccttgagt ggctcaaccg agttgagaca tatatcaagt ggccgtggtg ggtttggttg 1620 attattttca ttgttctcat ctttgttgtg tcattactag tgttctgctg catttccacg 1680 ggttgttgtg gatgctgcgg ctgctgctgt gcttgtttct caggttgttg taggggtcct 1740 agacttcaac cttacgaagt ttgaaaaggt ccacgtgcag tga 1783 <210> 3 <211> 4153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSGP-S full nt <400> 3 atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60 caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120 gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctaaaaacca gggtgtcaat 180 tcaacttggt actgtgctgg ccaacatcca actgctagtg gcgttcatgg tatctttgtt 240 agccatatta gaggtggtca tggctttgag attggcattt cgcaagagcc ttttgactct 300 agtggttacc agctttattt acataaggct actaacgata acactaatgc tactgcgcga 360 ctgcgcattt gccagtttcc tagcattaaa acattgggcc ccactgctaa taatgatgtt 420 acaacaggtc gtaattgcct atttaacaaa gccatcccag ctcatatgag tgaacatagt 480 gttgtcggca taacatggga taatgatcgt gtcactgtct tttctgacaa gatctattat 540 ttttatttta aaaatgattg gtcccgtgtt gcgacaaagt gttacaacag tggaggttgt 600 gctatgcaat atgtttacga acccacctat tacatgctta atgttactag tgctggtgag 660 gatggtattt cttatcaacc ctgtacagct aattgcattg gttatgctgc caatgtattt 720 gctactgagc ccaatggcca cataccagaa ggttttagtt ttaataattg gtttcttttg 780 tccaatggtt ccactttggt gcatggtaag gtggtttcca accaaccatt gttggtcaat 840 tgtcttttgg ccattcctaa gatttatgga ctaggccaat ttttctcctt taatcaaacg 900 atcgatggtg tttgtaatgg agctgctgtg cagcgtgcac cagaggctct gaggtttaac 960 attaatgaca cctctgtcat tcttgctgaa ggctcaattg tacttcatac tgctttagga 1020 acaaattttt cttttgtttg cagtaattcc tcaaatcctc acttagctac cttcgtcata 1080 cctctgggtg ccacccaagt accttattat tgttttctta aagtggatac ttacaactcc 1140 actgtttata aatttttggc tgttttacct cctaccgtca gggaaattgt catcaccaag 1200 tatggtgatg tttatgtcaa tgggtttgga tacttgcatc tcggtttgtt ggatgctgtt 1260 acaattaatt tcactggtca tggcactgac aatgatgttt ctggtttttg gaccatagca 1320 tcgactaatt ttgttgatgc actcatcgaa gttcaaggaa ccgccattca gcgtattctt 1380 tattgtgatg atcctgttag ccaactcaag tgttctcagg ttgcttttga ccttgacgat 1440 ggtttttacc ctatttcttc tagaaacctt ctgagtcatg aacagccaat ttcttttgtt 1500 actctgccat catttaatga tcattttttt gttaacatta ctgtatctgc ttcctttggt 1560 ggtcatagtg gtgccaacct tattgcatct gacactacta tcaatgggtt tagttctttc 1620 tgtgttgaaa ctagacaatt taccatttca ctgttttata acgttacaaa cagttatggt 1680 tatgtgtcta tatcacagga cagtaattgc cctttcacct tgcaatctgt taatgattac 1740 ctgtctttta gcaaattttg tgtttccacc agccttttgg ctagtgcctg taccatagat 1800 ctttttggtt accctgagtt tggtagtggt gttaagttta cgtcccttta ctttcaattc 1860 acaaagggtg agttgattac tggcacgcct aaaccatttg aaggtgtcac ggacgtttct 1920 tttatgactc tggatgtgtg taccaagtat actatctatg gctttaaagg tgagggtatc 1980 attaccctta caaattctag ctttttggca ggtgtttatt acacatctga gtctggacag 2040 ttgttagcct ttaagaatgt cactagtggt gctgtttatt ctgttacgcc atgttctttt 2100 tcagagcagg ctgcatatgt tgatgatgat atagtgggtg ttatttctag tttgtctagc 2160 tccactttta acagtactag ggagttgcct ggtttcttct accattctaa tgatggctct 2220 aattgtacag agcctgtgtt ggtgtatagt aacataggtg tttgtaaatc tggcagtatt 2280 ggctacgtcc catctcagtc tggccaagtc aagattgcac ccatggttac tgggaatatt 2340 agtattccca ccaactttag tatgagtatt aggacagaat atttacagct ttacaacacg 2400 cctgttagtg ttgattgtgc cacatatgtt tgtaatggta actctcgttg taaacaatta 2460 ctcacccagt acactgcagc atgtaagacc atagagtcag cattacaact cagcgctagg 2520 cttgagtctg ttgaagttaa ctctatgctt actatttctg aagaggctct acagttagct 2580 accattagtt cgtttaatgg tgatggatat aattttacta atgtgctggg tgtttctgtg 2640 tatgatcctg cacgtggcag ggtggtacaa aaaaggtctt ttattgaaga cctgcttttt 2700 aataaagtgg ttactaatgg ccttggtact gttgatgaag actataagcg ctgttctaat 2760 ggtcgttctg tggcagatct agtctgtgca cagtattact ctggtgtcat ggtactacct 2820 ggtgttgttg acgctgagaa gcttcacatg tatagtgcgt ctctcatcgg tggtatggtg 2880 ctaggaggtc ttacttctgc agcggcattg ccttttagct atgctgttca agctagactc 2940 aattatcttg ctctacagac ggatgttcta cagcggaacc agcaattgct tgctgagtct 3000 tttaactctg ctattggtaa tataacttca gcctttgaga gtgttaaaga ggctattagt 3060 caaacttcca ggggtttgaa cactgtggct catgcgctta ctaaggttca agaggttgtt 3120 aactcgcagg gtgcagcttt gactcaactt accgtacagc tgcaacacaa cttccaagcc 3180 atttctagtt ctattgatga catttactct cgactggaca ttctttcagc cgatgttcag 3240 gttgaccgtc tcatcaccgg cagattatca gcacttaatg cttttgttgc tcaaaccctc 3300 actaagtata ctgaggttca ggctagcagg aagttagcac agcaaaaggt taatgagtgc 3360 gttaaatcgc aatctcagcg ttatggtttt tgtggtggtg atggcgagca cattttctct 3420 ctggtacagg cagcacctca gggcctgctg tttttacata cagtacttgt accgagtgat 3480 tttgtagatg ttattgccat cgctggctta tgcgttaacg gtgaaattgc cttgactcta 3540 cgtgagcctg gcttagtctt gtttacgcat gaacttcaaa atcatactgc gacggaatat 3600 tttgtttcat cgcgacgtat gtttgaacct agaaaaccta ccgttagtga ttttgttcaa 3660 attgagagtt gtgtggtcac ctatgtcaat ttgactagag accaactacc agatgtaatc 3720 ccagattaca tcgatgttaa caaaacactt gatgagattt tagcttttct gcccaataga 3780 actggtccaa gtcttccttt agatgttttt aatgccactt atcttaatct cactggtgaa 3840 attgcagatt tagagcagcg ttcagagtct ctccgtaata ttacagagga gctccaaagt 3900 cttatatata atatcaacaa cacactagtt gaccttgagt ggctcaaccg agttgagaca 3960 tatatcaagt ggccgtggtg ggtttggttg attattttca ttgttctcat ctttgttgtg 4020 tcattactag tgttctgctg catttccacg ggttgttgtg gatgctgcgg ctgctgctgt 4080 gcttgtttct caggttgttg taggggtcct agacttcaac cttacgaagt ttgaaaaggt 4140 ccacgtgcag tga 4153 <210> 4 <211> 790 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSGP-s1 aa <400> 4 Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Lys Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr 50 55 60 Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Val 65 70 75 80 Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu 85 90 95 Pro Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn 100 105 110 Asp Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser 115 120 125 Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg 130 135 140 Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser 145 150 155 160 Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp 165 170 175 Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr 180 185 190 Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro 195 200 205 Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser 210 215 220 Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe 225 230 235 240 Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn 245 250 255 Trp Phe Leu Leu Ser Asn Gly Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val 260 265 270 Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile 275 280 285 Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly Val 290 295 300 Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn 305 310 315 320 Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His 325 330 335 Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asn 340 345 350 Pro His Leu Ala Thr Phe Val Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val Pro 355 360 365 Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys 370 375 380 Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys 385 390 395 400 Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu 405 410 415 Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asn Asp 420 425 430 Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu 435 440 445 Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp 450 455 460 Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp 465 470 475 480 Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro 485 490 495 Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Phe Phe Val Asn 500 505 510 Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile 515 520 525 Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Glu Thr 530 535 540 Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly 545 550 555 560 Tyr Val Ser Ile Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser 565 570 575 Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu 580 585 590 Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly 595 600 605 Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu 610 615 620 Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Phe Glu Gly Val Thr Asp Val Ser 625 630 635 640 Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys 645 650 655 Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val 660 665 670 Tyr Tyr Thr Ser Glu Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr 675 680 685 Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala 690 695 700 Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser 705 710 715 720 Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser 725 730 735 Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn 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Glu Lys Leu His Met 145 150 155 160 Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Met Val Leu Gly Gly Leu Thr Ser 165 170 175 Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr 180 185 190 Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala 195 200 205 Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser 210 215 220 Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr Ser Arg Gly Leu Asn Thr Val Ala 225 230 235 240 His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala 245 250 255 Leu Thr Gln Leu Thr Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser 260 265 270 Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp 275 280 285 Val Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala 290 295 300 Phe Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg 305 310 315 320 Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln 325 330 335 Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu Val 340 345 350 Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu Val Pro 355 360 365 Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys Val Asn Gly 370 375 380 Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val Leu Phe Thr His 385 390 395 400 Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe Val Ser Ser Arg Arg 405 410 415 Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser Asp Phe Val Gln Ile Glu 420 425 430 Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp 435 440 445 Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu 450 455 460 Ala Phe Leu Pro Asn Arg Thr Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe 465 470 475 480 Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln 485 490 495 Arg Ser Glu Ser Leu Arg Asn Ile Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile 500 505 510 Tyr Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val 515 520 525 Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile 530 535 540 Val Leu Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr 545 550 555 560 Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys 565 570 575 Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Val 580 585 <210> 6 <211> 4161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spike sequence of Porcine epidemic diarrhea virus strain USA/Colorado/2013 (GenBank: KF272920.1) <400> 6 atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60 caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120 gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180 gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240 tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300 gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360 gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420 gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480 catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540 tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600 ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca tgcttaatgt tactagtgct 660 ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720 gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780 cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840 gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900 caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960 tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020 ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcaa atcctcactt agccaccttc 1080 gccatacctc tgggtgctac ccaagtacct tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140 aactccactg tttataaatt tttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200 accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggatact tgcatctcgg tttgttggat 1260 gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg atgtttctgg tttttggacc 1320 atagcatcga ctaattttgt tgatgcactc atcgaagttc aaggaaccgc cattcagcgt 1380 attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440 gacgatggtt tttaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500 tttgttactc tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta acattactgt atctgcttcc 1560 tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620 tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680 tatggttatg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740 gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800 atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt 1860 caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttgaagg tgtcacggac 1920 gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980 ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattacac atctgattct 2040 ggacagttgt tagcctttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100 tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160 tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220 ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280 agtattggct acgtcccatc tcagtctggc caagtcaaga ttgcacccac ggttactggg 2340 aatattagta ttcccaccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac 2400 aacacgcctg ttagtgttga ttgtgccaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460 caattactca cccagtacac tgcagcatgt aagaccatag agtcagcatt acaactcagc 2520 gctaggcttg agtctgttga agttaactct atgcttacta tttctgaaga ggctctacag 2580 ttagctacca ttagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640 tctgtgtatg atcctgcaag tggcagggtg gtacaaaaaa ggtcttttat tgaagacctg 2700 ctttttaata aagtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760 tctaatggtc gctctgtggc agatctagtc tgtgcacagt attactctgg tgtcatggta 2820 ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880 atggtgctag gaggttttac ttctgcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagct 2940 agactcaatt atcttgctct acagacggat gttctacagc ggaaccagca attgcttgct 3000 gagtctttta actctgctat tggtaatata acttcagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060 attagtcaaa cttccaaggg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120 gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180 caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactctcgac tggacattct ttcagccgat 3240 gttcaggttg accgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300 accctcacta agtatactga ggttcaggct agcaggaagt tagcacagca aaaggttaat 3360 gagtgcgtta aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatt 3420 ttctctctgg tacaggcagc acctcagggc ctgctgtttt tacatacagt acttgtaccg 3480 agtgattttg tagatgttat tgccatcgct ggcttatgcg ttaacgatga aattgccttg 3540 actctacgtg agcctggctt agtcttgttt acgcatgaac ttcaaaatca tactgcgacg 3600 gaatattttg tttcatcgcg acgtatgttt gaacctagaa aacctaccgt tagtgatttt 3660 gttcaaattg agagttgtgt ggtcacctat gtcaatttga ctagagacca actaccagat 3720 gtaatcccag attacatcga tgttaacaaa acacttgatg agattttagc ttctctgccc 3780 aatagaactg gtccaagtct tcctttagat gtttttaatg ccacttatct taatctcact 3840 ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatactac agaggagctc 3900 caaagtctta tatataatat caacaacaca ctagttgacc ttgagtggct caaccgagtt 3960 gagacatata tcaagtggcc gtggtgggtt tggttgatta ttttcattgt tctcatcttt 4020 gttgtgtcat tactagtgtt ctgctgcatt tccacgggtt gttgtggatg ctgcggctgc 4080 tgctgtgctt gtttctcagg ttgttgtagg ggtcctagac ttcaacctta cgaagttttt 4140 gaaaaggtcc acgtgcagtg a 4161 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1129F <400> 7 cttctggttg ytcttaccag t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1128R <400> 8 cattatccca tgttatgccg ac 22

Claims

수탁번호 KCTC14057BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제1항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주와 수탁번호 KCTC14058BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주를 숙주 세포에 공접종(co-inoculaton)하여 확립한 것임을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제1항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 숙주 세포에서 1 X 10^5.6 TCID₅₀/ml 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제3항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 숙주 세포에서 1 X 10^5.6 ~ 1 X 10^7.5 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제1항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 서열번호 3으로 표기되는 스파이크 유전자의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제1항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 서열번호 1로 표기되는 스파이크 유전자의 S1 도메인의 염기서열과, 서열번호 2로 표기되는 스파이크 유전자의 S2 도메인의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제1항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 서열번호 4로 표기되는 스파이크 단백질의 S1 도메인의 아미노산 서열과, 서열번호 5로 표기되는 스파이크 단백질의 S2 도메인의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 원숭이 세포 또는 돼지 생식 세포인 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주를 유효성분으로 포함하는 돼지유행성설사병바이러스의 감염 예방을 위한 백신 조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 인간을 제외한 포유동물의 돼지유행성설사병바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 경구, 비강, 피부, 근육, 직장, 질, 복강, 혈관, 림프관, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법으로서,
(a) 돼지에서 감염 증상을 유발하는 돼지유행성설사병바이러스들 중에서 스파이크 단백질의 S1 도메인을 코딩하는 염기서열에 염기변이가 있는 수탁번호 KCTC14058BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주와 스파이크 단백질의 S2 도메인을 코딩하는 염기서열에 염기변이가 있는 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주를 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가 기준으로 1~9 : 9~1으로 혼합한 다음, 숙주 세포에 공접종(co-inoculation)하는 단계; 및
(b) 상기 공접종 후 플라크 피킹(plaque picking)으로 획득한 바이러스주들 중에서 상기 수탁번호 KCTC14058BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주에 있는 스파이크 단백질의 S1 도메인을 코딩하는 염기서열의 염기변이 및 수탁번호 KCTC14056BP로 수탁된 유전자결손 바이러스주에 있는 스파이크 단백질의 S2 도메인을 코딩하는 염기서열의 염기변이를 모두 가지고, 숙주 세포에서 1 X 10^5.6 ~ 1 X 10^7.5 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내며, 접종 돼지에서의 중화 항체가가 접종 전과 대비하여 4 ~ 32배 향상되며, 접종 돼지에서의 바이러스 증식이 억제되고, 접종 돼지에서 감염 증상을 유발하지 않는 바이러스주를 약독화 생백신으로 확립하는 단계;를 포함하고,
상기 감염 증상은 수양성 설사, 구토, 우울감, 식욕 부진 및 탈수 증세로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고,
상기 약독화 생백신주는 수탁번호 KCTC14057BP로 수탁된 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주인 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 서열번호 3으로 표기되는 스파이크 유전자의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 서열번호 1로 표기되는 스파이크 유전자의 S1 도메인의 염기서열과, 서열번호 2로 표기되는 스파이크 유전자의 S2 도메인의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 약독화 생백신주는 서열번호 4로 표기되는 스파이크 단백질의 S1 도메인의 아미노산 서열과, 서열번호 5로 표기되는 스파이크 단백질의 S2 도메인의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 원숭이 세포 또는 돼지 생식 세포인 것을 특징으로 하는, 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주의 제조방법.
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