KR20190008508A - 신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents
신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190008508A KR20190008508A KR1020170090082A KR20170090082A KR20190008508A KR 20190008508 A KR20190008508 A KR 20190008508A KR 1020170090082 A KR1020170090082 A KR 1020170090082A KR 20170090082 A KR20170090082 A KR 20170090082A KR 20190008508 A KR20190008508 A KR 20190008508A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- orf3
- virus
- vaccine composition
- pedv
- knu
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명자들은 4개의 구별되는 DEL 균주를 시험관 내 연속계대 과정에서 수득하였으며, ORF3 내에 커다란 결실을 지닌 세포-적응된 바이러스의 생체 내 병독성 상실 및 세포-적응된 균주의 돼지에서의 강력한 면역원성 보유를 입증하였다. 유전적 인자가 PEDV의 표현형 특성에 관련되고, 따라서 ORF3가 병원성 특징을 결정하는 중요한 바이러스 성분일 수 있다. 본 발명에 따르면, 세포-적응된 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 바이러스에 의한 생체 내 감염은 약독화 결과를 나타냈으며, 본 발명은 약독화 된 돼지유행성설사병 바이러스 (PEDV) 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 약독화 된 PED 바이러스는 베로세포를 사용하여 연속계대배양 하여 제조하였다. 본 발명에서 약독화된 PEDV는 우수한 항체가를 보이고, 바람직한 혈중 바이러스 함량을 유지하며, 심각한 조직병변을 유발하지 않는 등 생독백신으로서 이용될 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 약독화 돼지유행성설사바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 균주, 약독화 방법, 약독화와 연관된 유전자 및 약독화 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약독화와 연관된 유전자를 포함하는 PEDV 균주를 포함하는 백신 및 이를 이용한 면역화 방법에 관한 것이다.
돼지유행성설사바이러스 (PED)는 치명적이고 전염성이 높은 돼지 장 질환으로서, 급성 설사/구토 및 탈수를 특징으로 하며, 신생 자돈에서 높은 치사율을 초래한다 (Lee, 2015; Saif et al., 2012). 상기 질병은 1971년 영국에서 최초 보고되었고, 유럽 전역으로 급속히 퍼져 나갔으며, 1980년대에 아시아 대륙으로 건너온 것으로 추정된다 (Oldham, 1972; Takahashi et al., 1983). 1978년에 초기에 CV777로 명명된 코로나바이러스-유사체를 벨기에에서 원인 병원체로서 동정한 바 있다 (Pensaert and Debouck, 1978).
PED의 병인체인 PED 바이러스는 크고, 외피를 지니며, 단일-가닥의 양성센스 RNA바이러스로서, Nidovirales목, Coronaviridae과, Alphacoronavirus속에 속한다 (Pensaert and Debouck, 1978; Lee, 2015). PEDV 유전체는 약 28 kb 길이에 5' 캡 및 3' 폴리아데닐화 된 테일 (tail)을 가지며, 5'-비번역영역 (5'-untranslated region, UTR), ORF1a, ORF1b 및 ORFs 2 내지 6로 지정된 7개 이상의 오픈리딩프레임 (ORFs), 및 3'-UTR을 포함한다 (Pensaert and Debouck, 1978; Kocherhans et al., 2001; Saif et al., 2012). 처음 2개의 커다란 ORFs, 즉 ORF1a 및 1b는 유전체의 5'-프록시멀 2/3에 해당하며, 비구조단백질 (nps)을 엔코딩 한다. ORF1a 번역은 레플리카제 다단백질 (replicase polyprotein, pp) la를 생성하는 반면에, ORF1b는 1 리보솜프레임시프트 (ribosomal frame shift, RFS)에 의해 발현되고, 이는 C-말단에서 다단백질 1a를 다단백질 1ab로 연장한다. 이들 다단백질은 바이러스 프로테아제에 의한 자가단백질분해 과정을 거쳐 적어도 16개의 프로세싱 최종 생성물 (nsp16)을 생산한다. 유전체의 3'-프록시멀 부분 내의 ORFs 중 나머지 부분은, 코로나바이러스의 4개 정형화된 구조단백질 및 ORF3의 단일 악세서리 유전자를 코딩하고, 이것은 서브게노믹 (subgenomic) (sg) mRNAs의 3'-공말단 (co-terminal) 네스티드 세트 (nested set)로부터 독립적으로 발현된다. 상기에서, 전자는 스파이크 (S), 멤브레인 (M), 외피 (E), 및 뉴클레오캡시드 (N) 단백질을 포함한다 (Duarte et al., 1994; Lai et al., 2007; Lee, 2015). 이들 중, S 유전자의 코딩영역은 PEDV 단리체의 유전적 연관성과 분자적 역학을 조사하기 위한 서열분석에 적합한 바이러스 좌위 (loci)로 간주되었다 (Chen et al., 2014; Gerber et al., 2014; Lee et al., 2010; Lee and Lee, 2014; Oh et al., 2014). S 유전자의 계통유전학적 분석에 기초할 때, PEDV는 2개의 유전형, 즉 유전자군 I (G1; 표준적인 균주 또는 재조합이고, 저병원성) 및 유전자군 II (G2; 야생 유행성 또는 광범위 유행성이고, 고병원성)로 지정되며, 이들은 유전적 및 항원성에서 상이하다. 각 유전자군은 2개의 서브그룹, 즉 1a와 1b, 및 2a와 2b를 각각 포함한다 (Lee, 2015; Lee et al., 2010; Lee and Lee, 2014; Oh et al., 2014).
최근 대한민국, 일본 및 대만에서 대규모의 심각한 PED 발병이 있었으며, 북미형 프로토타입-유사 G2b PEDV (US prototype-like G2b PEDV)가 이들 국가에서 PED 발병의 주요 원인이었던 것으로 확인되었다 (Lee and Lee, 2014; Lin et al., 2014; Suzuki et al., 2015). 또한, 유럽 서부 및 중부 전역에 걸쳐 PEDV가 재발병 하였다 (Boniotti et al., 2016; Hanke et al., 2015; Grasland et al., 2015; Mesquita et al., 2015; Steinrigl et al., 2015; Theuns et al., 2015). 특히, 이들 재발병 된 PEDV는 유전적으로 서로 거의 동일하였으며, 계통유전학적으로 중국에서 최초 발견된 이후 미국, 대한민국 및 일본에서 발견된 저병원성 G1b 변이체와 가장 밀접하게 연관되었다 (Lee et al., 2014b; Li et al., 2012; Suzuki et al., 2015; Wang et al., 2014). 이와 같이, PED는 세계 전역에서 발병하거나 재발병하는 돼지바이러스 질환으로서, 세계적으로 막대한 재정적인 손실을 초래하여, 양돈산업이 집중된 국가에서 경제적으로 가장 심각한 질환의 하나로 여겨진다. 대한민국에서는 모두 4개의 다른 PEDV 유전형이 보고되었고, 이는 백신균주 (G1a), 새로운 변이체 (G1b), 과거 유행성 균주 (G2a), 및 현재 널리 퍼진 유행성 균주 (G2b)를 포함한다 (Lee, 2015; Lee et al., 2010; Lee et al., 2014b; Lee and Lee, 2014). 현재 제한된 수의 PEDV 백신, 즉 변형된 생백신 또는 비활성화 사멸된 백신이 국내에서 시판 중이다. 이들 백신은 단일 G1a 표준적인 균주 (한국형 SM98-1, DR-13 또는 일본형 83P-5 균주)를 포함하며, 대부분 유전적으로 상이한 야생주를 완전히 방어하지 못하는 것으로 보인다. 이와 같이, 시판 중인 PEDV 백신의 불완전한 효능은 백신의 주요 S 글리코단백질과 야생의 유행성 균주 간의 항원성, 유전적 및 계통유전학적 변이에서 기인하는 것일 수 있다 (Kim et al., 2015; Lee, 2015; Lee et al., 2010; Lee and Lee, 2014; Lee et al., 2014a; Oh et al., 2014). 따라서, 현재 야생에 널리 퍼져 있는 G2b 유행성 균주 또는 관련 균주에 대한 새로운 백신의 개발이 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 한국형 야생의 G2b 균주를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 변이주를 동정하고, 이것의 생체 내 항체 형성 여부 및 면역원성을 분석하여 본 발명을 완성하였다.
Boniotti, M.B., Papetti, A., Lavazza, A., Alborali, G., Sozzi, E., Chiapponi, C., Faccini, S., Bonilauri, P., Cordioli, P., Marthaler, D., 2016. Porcine epidemic diarrhea virus and discovery of a recombinant swine enteric coronavirus, Italy. Emerg. Infect. Dis. 22, 8387.
Chen, Q., Li, G., Stasko, J., Thomas, J.T., Stensland, W.R., Pillatzki, A.E., Gauger, P.C., Schwartz, K.J., Madson, D., Yoon, K.J., Stevenson, G.W., Burrough, E.R., Harmon, K.M., Main, R.G., Zhang, J., 2014. Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States. J. Clin. Microbiol. 52, 234243.
Duarte, M., Laude, H., 1994. Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus. J. Gen. Virol. 75, 11951200.
Gerber, P.F., Gong, Q., Huang, Y.W., Wang, C., Holtkamp, D., Opriessnig, T., 2014. Detection of antibodies against porcine epidemic diarrhea virus in serum and colostrum by indirect ELISA. Vet. J. 202, 3336.
Grasland, B., Bigault, L., Bernard, C., Quenault, H., Toulouse, O., Fablet, C., Rose, N., Touzain, F., Blanchard, Y., 2015. Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea S gene indel strain isolated in France in December 2014. Genome Announc. 3, e00535-15.
Hanke, D., Jenckel, M., Petrov, A., Ritzmann, M., Stadler, J., Akimkin, V., Blome, S., Pohlmann, A., Schirrmeier, H., Beer, M., Hoper, D., 2015. Comparison of porcine epidemic diarrhea viruses from Germany and the United States, 2014. Emerg. Infect. Dis. 21, 493496.
Kim, S.H., Lee, J.M., Jung, J., Kim, I.J., Hyun, B.H., Kim, H.I., Park, C.K., Oem, J.K., Kim, Y.H., Lee, M.H., Lee, K.K., 2015. Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Korea from 1998 to 2013. Arch. Virol. 160, 10551064.
Kocherhans, R., Bridgen, A., Ackermann, M., Tobler, K., 2001. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence. Virus Genes 23, 137144.
Kweon, C.H., Kwon, B.J., Jung, T.S., Kee, Y.J., Hur, D.H., Hwang, E.K., Rhee, J.C., An, S.H., 1993. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Korea. Korean J. Vet. Res. 33, 249254.
Lai, M.M., Perlman, S., Anderson L.J., 2007. Coronaviridae. In: Knipe, D.M., Howley, P.M., Griffin, D.E., Martin, M.A., Lamb, R.A., Roizman, B., Straus, S.E. (Eds.), Fields Virology. 5th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA, pp. 13061336.
Lee, C., 2015. Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging epizootic swine virus. Virol. J. 12, 193.
Lee, D.K., Park, C.K., Kim, S.H., Lee, C., 2010. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea. Virus Res. 149, 175182.
Lee, S., Kim, Y., Lee, C., 2015. Isolation and characterization of a Korean porcine epidemic diarrhea virus strain KNU-141112. Virus Res. 208, 215224.
Lee, S., Ko, D.H., Kwak, W.K., Lim, C.H., Moon, S.U., Lee, D.S., Lee, C., 2014a. Reemergence of porcine epidemic diarrhea virus on Jeju Island. Korean J. Vet. Res. 54, 185188.
Lee, S., Lee, C., 2014. Outbreak-related porcine epidemic diarrhea virus strains similar to US strains, South Korea, 2013. Emerg. Infect. Dis. 20, 12231226.
Lee, S., Lee, C., 2015. Phenotypic and genotypic characterization associated with cell adaptation of porcine epidemic diarrhea virus. In: Proceedings of the 2015 North American PRRS Symposium, pp. 62.
Lee, S., Park, G.S., Shin, J.H., Lee, C., 2014b. Full-genome sequence analysis of a variant strain of porcine epidemic diarrhea virus in South Korea. Genome Announc. 2, e01116-14.
Lee, Y.N., Lee, C., 2013. Complete genome sequence of a novel porcine parainfluenza virus 5 isolate in Korea. Arch. Virol. 158, 17651772.
Li, W., Li, H., Liu, Y., Pan, Y., Deng, F., Song, Y., Tang, X., He, Q., 2012. New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg. Infect. Dis. 8, 13501353.
Lin, C.N., Chung, W.B., Chang, S.W., Wen, C.C., Liu, H., Chien, C.H., Chiou, M.T., 2014. US-like strain of porcine epidemic diarrhea virus outbreaks in Taiwan, 20132014. J. Vet. Med. Sci. 76, 12971299.
Mesquita, J.R., Hakze-van der Honing, R., Almeida, A., Lourenco, M., van der Poel, W.H., Nascimento, M.S., 2015. Outbreak of porcine epidemic diarrhea virus in Portugal, 2015. Transbound. Emerg. Dis. 62, 586588.
Mole, B., 2013. Deadly pig virus slips through US borders. Nature 499, 388.
Oh, J., Lee, K.W., Choi, H.W., Lee, C., 2014. Immunogenicity and protective efficacy of recombinant S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein. Arch. Virol. 159, 29772987.
Oldham, J., 1972. Letter to the editor. Pig Farming 10, 7273.
Park, C.K., Lee, C., 2009. Clinical examination and control measures in a commercial pig farm persistently infected with porcine epidemic diarrhea virus. J. Vet. Clin. 26, 463466.
Park, C.K., Lee, K.K., Lee, C., 2011. PED past, present, and future. In: Proceedings of the 5th Asian Pig Veterinary Society Congress, Pattaya, Thailand, pp. S1920.
Pensaert, M.B., Debouck, P., 1978. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch. Virol. 58, 243247.
Saif, L.J., Pensaert, M.B., Sestak, K., Yeo, S.G., Jung, K., 2012. Coronaviruses. In: Zimmerman, J.J., Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J., Stevenson, G.W. (Eds.), Diseases of Swine, 10th ed. Wiley-Blackwell, Ames, IA, USA, pp. 501524.
Steinrigl, A., Fernandez, S.R., Stoiber, F., Pikalo, J., Sattler, T., Schmoll, F., 2015. First detection, clinical presentation and phylogenetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Austria. BMC Vet. Res. 11, 310.
Stevenson, G.W., Hoang, H., Schwartz, K.J., Burrough, E.R., Sun, D., Madson, D., Cooper, V.L., Pillatzki, A., Gauger, P., Schmitt, B.J., Koster, L.G., Killian, M.L., Yoon, K.J., 2013. Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences. J. Vet. Diagn. Invest. 25, 649654.
Suzuki, T., Murakami, S., Takahashi, O., Kodera, A., Masuda, T., Itoh, S., Miyazaki, A., Ohashi, S., Tsutsui, T., 2015. Molecular characterization of pig epidemic diarrhoea viruses isolated in Japan from 2013 to 2014. Infect. Genet. Evol. 36, 363368.
Theuns, S., Conceicao-Neto, N., Christiaens, I., Zeller, M., Desmarets, L.M., Roukaerts, I.D., Acar, D.D., Heylen, E., Matthijnssens, J., Nauwynck, H.J., 2015. Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus from a novel outbreak in Belgium, January 2015. Genome Announc. 3, e00506-15.
Vanhee, M., Delputte, P.L., Delrue, I., Geldhof, M.F., Nauwynck, H.J., 2009. Development of an experimental inactivated PRRSV vaccine that induces virus-neutralizing antibodies. Vet. Res. 40, 63.
Vlasova, A.N., Marthaler, D., Wang, Q., Culhane, M.R., Rossow, K.D., Rovira, A., Collins, J., Saif, L.J., 2014. Distinct characteristics and complex evolution of PEDV strains, North America, May 2013February 2014. Emerg. Infect. Dis. 20, 16201628.
Wang, L., Byrum, B., Zhang, Y., 2014. New variant of porcine epidemic diarrhea virus, United States, 2014. Emerg. Infect. Dis. 20, 917919.
본 발명은 신규 약독화 PEDV 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 PEDV 균주를 포함하는 약독화 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PEDV 균주를 불활화시킨 것을 포함하는, 불활화 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 불활화 백신 및 면역강화제를 추가로 포함하는, PED 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 돼지에서 PED에 대한 면역반응을 유도하는 방법으로서, 상기 약독화 또는 불활화 백신의 면역 유효량을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 면역반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 돼지유행성설사병 (porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 (parental virus) (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 시킨 변이주로서, 상기 변이주는 S (spike) 글리코단백질 유전자 N-말단 영역 중 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부의 결실을 포함하고, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC13201BP, KCTC13202BP, KCTC13203BP 또는 KCTC13204BP로 기탁된 것인, 돼지유행성설사병 바이러스 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주를 유효성분으로 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물을 제공하며, 상기 백신조성물은 약리학적으로 허용가능 한 담체, 희석제, 보존제 및 면역보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 2종 이상과 선택적으로 종래 백신주를 하나 이상 포함하는 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 혼합백신 조성물을 제공하며, 상기 백신조성물은 약리학적으로 허용가능 한 담체, 희석제, 보존제 및 면역보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신조성물을 투여하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공하며, 상기 백신조성물을 백신조성물을 돼지에 투여하여 PED를 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지유행성설사병 바이러스 (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 하고, 상기 바이러스의 S 단백질 유전자 N-말단 영역 중 전체 유전체를 기준으로 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부가 결실된 변이주를 수득하여, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC13201BP, KCTC13202BP, KCTC13203BP 또는 KCTC13204BP로 기탁된 돼지유행성설사병 바이러스 변이주를 제조하는 것을 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지유행성설사병 바이러스 PED 바이러스 (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 시킨 변이주로서, 상기 변이주는 S 글리코단백질 유전자의 N-말단 영역 중 바이러스 전체 유전자를 기준으로 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부가 결실되고, S 글리코단백질 유전자와 ORF 유전자의 접합부 중 바이러스 전체 유전체 기준으로 제 24,771째 내지 제 24,816째 염기서열이 결실된 것을 포함하는 것인, 돼지유행성설사병 바이러스 변이주를 제공한다. 상기 변이주는, ORF3 N-말단 영역에 바이러스 전체 유전체를 기준으로 제 24,794째 내지 제 24,863째 염기서열이 결실된 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 변이주를 유효성분으로 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물을 제공하며, 상기 백신조성물이 약리학적으로 허용가능 한 담체, 희석제, 보존제 및 면역보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함 할 수 있다.
또한, 본 발명은 돼지유행성설사병 바이러스 (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 하여, S (spike) 글리코단백질 유전자 N-말단 영역의 N-말단 영역 중 바이러스 전체 유전자를 기준으로 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부가 결실되고, S 글리코단백질 유전자 및 ORF 유전자의 접합부 중 바이러스 전체 유전체 기준으로 제 24,771째 내지 제 24,816째 염기서열이 결실된 것인, 돼지유행성설사병 바이러스 변이주를 제조하는 것을 포함하여, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 변이주는 ORF3 N-말단 영역에 바이러스 전체 유전체를 기준으로 제 24,794째 내지 제 24,863째 염기서열이 더 결실된 것인 변이주 일 수 있다.
본 발명의 신규 약독화된 PED 바이러스 균주는 국내에서 분리된 한국형 균주를 연속 계대하여 약독화 시켜 제조한 것이다. 본 발명의 약독화된 PEDV는 혈청 내 높은 항체 형성가를 형성하고, 혈중 바이러스 함량이 바람직하게 유지되며, 조직 내에서 심각한 병변을 유발하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 신규 약독화 PED 바이러스 균주는 돼지유행성설사병의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 생(독)백신의 제조에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1 은 병독성 PEDV 단리체 KNU-141112 및 이를 사용하여 감염시킨 베로세포에서 세포-적응된 DEL 균주의 세포병리학 및 IFA를 나타낸다.
도 2는 베로세포에서 모바이러스 및 세포-적응된 균주의 성장동력학 및 플라크 형태학을 나타낸다.
도 3은 KNU-141112-P5과 이것의 세포-적응된 DEL 유도체 사이의 아미노산 차이를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 PEDV G1a 참조 균주, 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주 중, S 글리코단백질 유전자의 5'-말단 또는 N-말단 영역 뉴클레오티드 (A) 및 추정 아미노산 (B) 서열의 정렬을 나타낸 것이다. 연속 박스는 추정 시그널 펩타이드를 나타낸다. 단속선 (-)는 결실된 서열을 나타낸다.
도 5는 PEDV G1a 참조 균주, 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주 중, S 및 전체 ORF3 유전자의 3'-말단 영역의 뉴클레오티드 서열 정렬을 나타낸다. 연속 박스는 PEDV ORF3의 전사조절서열 (TRS)을 나타낸다. 단속선 (-)은 결실된 서열을 나타낸다. S 유전자에 대한 본래의 (blue) 및 변경된 (red)'TGA' 종결 코돈은 볼드체로 표시되었고, ORF3 유전자에 대한 진정한 (black) 및 예측된 (red) 'ATG' 개시 코돈은 볼드체 밑줄로 표시되었다. DEL2/ORF3 균주에서 'GCT' 에서 'TGA' 종결자로의 뉴클레오티드 치환은 볼드체로 음영표시 하였다.
도 6은 PEDV G1a 참조 균주, 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주 중, S 단백질 (A) 및 전체 ORF3 단백질의 C-말단 영역의 아미노산 서열정렬을 나타낸 것이다. 단속선 (-)은 결실 서열을 나타낸다.
도 7은 PEDV 균주의 스파이크 유전자 (A) 및 전장 게놈 (B)의 뉴클레오티드 염기서열에 기초한 계통유전학적 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 4개 그룹의 자돈에서 임상적 중요도 스코어 (A) 및 바이러스 쉐딩 (B)을 나타낸다. (A) CSS를 재료 및 방법에 기술한 것과 같이 측정하였다. (B) 각 시점에서 직장 면봉 샘플에서의 PEDV 역가를 정량 실시간 RT-PCR로 측정하였다. 각 도에서 나타낸 Ct 값은 PCR-양성 돼지의 평균 Ct 값이다. 바이러스 역가 (Log10 TCID50/ml)는 모든 돼지의 평균 바이러스 역가이다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다. P 값은 모바이러스 및 세포-적응된 DEL 바이러스 접종된 그룹을 스튜던트 t 테스트를 사용하고 비교하여 계산하였다. *, P = 0.001 to 0.05; **, P < 0.001.
도 9는 모바이러스 및 세포-적응된 DEL 균주를 접종한 자돈의 장을 육안 관찰한 결과를 나타낸다. S DEL2/ORF3 (패널 A 및 B), S DEL5/ORF3 (패널 C 및 D), 및 KNU-141112-P5 (패널 E), 및 음성대조 동물 (F)로 접종한 대표적인 돼지의 소장을 육안 조사하였다. 모바이러스로 접종한 자돈에서만 얇고 투명한 장벽 및 변질된 우유로 채워진 확장된 위장을 나타냈다 (E).
도 10은 모바이러스 및 세포-적응된 DEL 균주로 접종된 자돈 소장의 조직병리학을 나타낸다. (패널 A-F) 바이러스 접종된 음성 대조군 돼지로부터의 공장 (jejunum)의 헤마톡실린 및 에오신-염색된 조직 절편 (100x 배율). 병독성 KNU-141112-P5-접종한 자돈의 공장은 표면 상피세포에 공액을 지닌 급성의 확산되고 심각한 위축성 장염을 보였다 (E). KNU-141112-S DEL2/ORF3 (A 및 B) 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (C 및 D), 및 가-접종된 (F) 자돈에서는 정상적인 공장 융모 상피가 관찰되었다. (패널 G-L) 바이러스-접종 및 음성 대조군 돼지로부터의 공장 조직 절편의 IHC 분석에 의한 PEDV 감염 검출 (200x 배율). PEDV 항원 시그널을 브라운색으로 나타내었으며 PEDV KNU-141112-P5-접종된 자돈의 공장 내의 전체 상피세포에서 검출하였다 (K). KNU-141112-S DEL2/ORF3 (G 및 H) 및 S DEL5/ORF3 (I 및 J)로 접종된 자돈, 및 가-접종된 자돈 (L)의 공장에서는 PEDV가 겁출되지 않았다.
도 2는 베로세포에서 모바이러스 및 세포-적응된 균주의 성장동력학 및 플라크 형태학을 나타낸다.
도 3은 KNU-141112-P5과 이것의 세포-적응된 DEL 유도체 사이의 아미노산 차이를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 PEDV G1a 참조 균주, 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주 중, S 글리코단백질 유전자의 5'-말단 또는 N-말단 영역 뉴클레오티드 (A) 및 추정 아미노산 (B) 서열의 정렬을 나타낸 것이다. 연속 박스는 추정 시그널 펩타이드를 나타낸다. 단속선 (-)는 결실된 서열을 나타낸다.
도 5는 PEDV G1a 참조 균주, 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주 중, S 및 전체 ORF3 유전자의 3'-말단 영역의 뉴클레오티드 서열 정렬을 나타낸다. 연속 박스는 PEDV ORF3의 전사조절서열 (TRS)을 나타낸다. 단속선 (-)은 결실된 서열을 나타낸다. S 유전자에 대한 본래의 (blue) 및 변경된 (red)'TGA' 종결 코돈은 볼드체로 표시되었고, ORF3 유전자에 대한 진정한 (black) 및 예측된 (red) 'ATG' 개시 코돈은 볼드체 밑줄로 표시되었다. DEL2/ORF3 균주에서 'GCT' 에서 'TGA' 종결자로의 뉴클레오티드 치환은 볼드체로 음영표시 하였다.
도 6은 PEDV G1a 참조 균주, 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주 중, S 단백질 (A) 및 전체 ORF3 단백질의 C-말단 영역의 아미노산 서열정렬을 나타낸 것이다. 단속선 (-)은 결실 서열을 나타낸다.
도 7은 PEDV 균주의 스파이크 유전자 (A) 및 전장 게놈 (B)의 뉴클레오티드 염기서열에 기초한 계통유전학적 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 4개 그룹의 자돈에서 임상적 중요도 스코어 (A) 및 바이러스 쉐딩 (B)을 나타낸다. (A) CSS를 재료 및 방법에 기술한 것과 같이 측정하였다. (B) 각 시점에서 직장 면봉 샘플에서의 PEDV 역가를 정량 실시간 RT-PCR로 측정하였다. 각 도에서 나타낸 Ct 값은 PCR-양성 돼지의 평균 Ct 값이다. 바이러스 역가 (Log10 TCID50/ml)는 모든 돼지의 평균 바이러스 역가이다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다. P 값은 모바이러스 및 세포-적응된 DEL 바이러스 접종된 그룹을 스튜던트 t 테스트를 사용하고 비교하여 계산하였다. *, P = 0.001 to 0.05; **, P < 0.001.
도 9는 모바이러스 및 세포-적응된 DEL 균주를 접종한 자돈의 장을 육안 관찰한 결과를 나타낸다. S DEL2/ORF3 (패널 A 및 B), S DEL5/ORF3 (패널 C 및 D), 및 KNU-141112-P5 (패널 E), 및 음성대조 동물 (F)로 접종한 대표적인 돼지의 소장을 육안 조사하였다. 모바이러스로 접종한 자돈에서만 얇고 투명한 장벽 및 변질된 우유로 채워진 확장된 위장을 나타냈다 (E).
도 10은 모바이러스 및 세포-적응된 DEL 균주로 접종된 자돈 소장의 조직병리학을 나타낸다. (패널 A-F) 바이러스 접종된 음성 대조군 돼지로부터의 공장 (jejunum)의 헤마톡실린 및 에오신-염색된 조직 절편 (100x 배율). 병독성 KNU-141112-P5-접종한 자돈의 공장은 표면 상피세포에 공액을 지닌 급성의 확산되고 심각한 위축성 장염을 보였다 (E). KNU-141112-S DEL2/ORF3 (A 및 B) 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (C 및 D), 및 가-접종된 (F) 자돈에서는 정상적인 공장 융모 상피가 관찰되었다. (패널 G-L) 바이러스-접종 및 음성 대조군 돼지로부터의 공장 조직 절편의 IHC 분석에 의한 PEDV 감염 검출 (200x 배율). PEDV 항원 시그널을 브라운색으로 나타내었으며 PEDV KNU-141112-P5-접종된 자돈의 공장 내의 전체 상피세포에서 검출하였다 (K). KNU-141112-S DEL2/ORF3 (G 및 H) 및 S DEL5/ORF3 (I 및 J)로 접종된 자돈, 및 가-접종된 자돈 (L)의 공장에서는 PEDV가 겁출되지 않았다.
본 발명자들은 국내 대규모 PED 발병의 병원성 단리체가 최근 아시아 및 아메리카에서 전세계적인 발병의 원인이 되었던 G2b 그룹에 속하는 신생 북미형 균주와 밀접하게 연관됨을 입증한 바 있다 (Lee and Lee, 2014; Lin et al., 2014; Suzuki et al., 2015). 계통유전학적 분석은, 대한민국에서 상업적인 백신 시드 (seed)인 2개의 PEDV 백신 균주, SM98-1 및 DR-13가 표준적인 (classic) G1a 유전자군 임을 나타냈다. 또한, 본 발명자들은 S1 도메인 내에서 10%를 넘는 아미노산의 차이를 가져오는, 백신과 야생 균주 간의 항원성 및 유전적인 변이를 입증하였다 (Lee et al., 2010; Lee and Lee, 2014; Lee, 2015; Oh et al., 2014). 이러한 변이가 현재 대한민국에서 사용되는 백신의 불완전한 효과의 원인으로 보이며, 이는 야생의 유행병 균주를 사용하여 새로운 안전하고 효과적인 백신을 연구하는 것이 보다 더 필요함을 제시한다. 본 발명자들은 최근 세계적인 야생 (field) G2b 균주와 유전자형에서 동일한 한국의 높은 장-병원성 PEDV 균주를 베로세포에서 성공적으로 단리하고 증식하였다 (Lee et al., 2015).
본 발명자들은 병독성이 높은 한국형 G2b 균주 KOR/KNU-141112/2014를 베로세포에서 100 계대하여 PEDV 백신 후보를 수득하였으며, 이것의 세포적응 과정과 관련된 유전적 및 병독성 특성을 규명하였다. 베로세포에서 계대배양을 통한 세포-적응 과정 중, 본 발명자들은 4개의 결실 (DEL) 변이체를 수득하고, 이들의 특성을 확인한 결과, 이들이 S 또는 S 및 ORF3 내에 독특한 결실 특징을 독립적으로 포함하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 생거법 (Sanger method)에 의한 초기 시퀀싱 분석으로, S의 N-말단 부에 작은 DEL 패턴을 함유하거나 (S DEL2 및 S DEL5), 또는 S 및 ORF3의 유전자간 접합부 내 S DEL 및 커다란 DEL 특징의 조합 (S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3)을 개별적으로 포함하는 4개의 세포-적응된 유도체를 동정하였다.
본 발명의 일 예에서. 베로세포에서 연속계대에 의해 생성된 DEL 균주의 바이러스학적 특성을 결정하였다. 세포-적응된 DEL 바이러스는 배양된 세포 중 모 바이러스와 비교하여 높은 역가로 보다 더 빠르게 증식하였으며, 보다 더 큰 플라크를 형성하였다. 상기 모바이러스 KNU-141112-P5는 동종의 매우 작은 크기 (pinpoint-size)의 가장 작은 플라크를 생성한 반면, DEL 균주는 작은 것에서 큰 것에 이르는 다양한 크기의 이종 (적어도 2개 이상의 크기가 혼재) 플라크를 독립적으로 생성하였다 (도 1 C). 흥미롭게도, S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주가 적은 수의 작은 크기의 플라크와 함께 유사한 가장 큰 플라크 형태를 우세하게 나타냈다. 이는 세포-적응된 DEL 균주가 배양된 세포에서 우수한 바이러스 피트니스 (fitness)를 가지며, DEL 패턴은 시험관 내 바이러스 성장에 긍정적인 영향을 주었음을 제시한다.
본 발명의 다른 일 예에서, 본 발명자들은 DEL 균주의 전체 유전체를 시퀀싱하여 세포배양 적응 과정 중에 나타나는 정확한 DEL 패턴 및 유전적 변이를 확인하였다. DEL 균주의 유전체 크기는 이들 자체의 결실된 뉴클레오티드의 수에 의존하였다. 본 발명자들은 총 최소 19개 및 최대 27개의 무작위 뉴클레오티드 치환을 각 DEL 균주 전체에 걸쳐서 확인하였다. 비록, DEL 균주가 3' UTR에 1개 또는 2개의 변이를 가졌으나, KNU-141112의 UTRs는 세포 계대 과정에서 완벽하게 유지되었다. 또한, 3' UTR 내의 모든 치환이 모든 DEL 균주에서 발견되지는 않았다. 따라서, 본 발명자들은 UTRs가 PEDV 유전체 복제에서 이들이 갖는 중요성에도 불구하고, PEDV의 병독성에 경미한 역할을 할 것으로 추정하였다. 나머지는 ORFs 1 내지 4 내에 위치하는 12 또는 14개의 상이한 (non-synonymous) 변이를 포함하였으며, 이들 중 6개 아미노산 치환은 모든 DEL 균주의 비구조 바이러스 프로테아제 nsp3, nsp5, 구조 S 및 E에 공통적으로 존재하였고, 이는 이들 변화의 일부가 배양된 세포 시스템에서 바이러스 적응에 관련될 수 있음을 제시한다. PEDV 감염은 베로세포에서 감염된 세포의 융합 (syncytium 또는 polykaryon 형성)을 특징으로 하는 뚜렷한 CPE를 생성한다. 그러나, 세포-적응된 균주가 보다 더 심한 합포체세포 (syncytia)를 형성하고, 공액화 된 영역의 증가를 초래하였으며, 이는 플라크 크기에 비례하였다. 모든 DEL 균주가 2개의 G888R 및 E1287 변이를 S2 융합 도메인 내의 동일한 위치에 포함하였으며, 이는 이들 유전적 변이가 시험관 내 표현형 변화와 관련될 수 있음을 제시한다. PEDV의 S 단백질은 타입 I 막 글리코단백질이며, 병독성 G2b KNU-141112 균주는 21개의 예측된 N-글리코실화 위치를 가진다. 세포-적응된 DEL 균주 모두는 모바이러스 S 단백질의 위치 381 내지 383에서 N-S-T 시퀀스 내에 N381K 또는 T383N 변이를 갖는 것이 확인되었다. 또한, S DEL2/ORF3 균주는 균주 특이적 T516I 변화를 포함하는 것에 의해 하나 이상의 잠재적 시퀀스 (S의 514 내지 516 위치에서의 NIT)를 결실하였다. 결론적으로, 각각 1 또는 2개의 잠재적 모티프의 미싱 (missing)에 의해, DEL 균주 내에서 20 또는 19 N-글리코실화 위치가 예측되었다. 이러한 발견은 선행연구와 일치하였으나, 밀접한 인접 위치 또는 구별되는 위치에서의 새로운 모티프가 생성되어, 다른 세포-약독화 균주에서 하나의 손실을 보상하며 그 결과로 동일한 수의 N-글리코실화 위치를 가져오는 점에서는 상이하다 (Park et al., 2007; Sato et al., 2011). 1개 또는 2개의 글리칸 모티프에서의 변화가 세포-적응된 DEL 균주의 병독원성에 영향을 주는 것으로 보이며, 반면에 다른 N-글리코실화 위치의 보존은 단백질 확인 및 기능에서 S 단백질 내 N 연결된 글리코실화의 중요성을 암시하였다.
본 발명에서, 가장 흥미로운 유전체 변화는 4개의 다른 마이너 (minor) 및/또는 메이저 (major) DEL 특징의 발생이었다. 제 1의 S N-DEL2 또는 S N-DEL5, 및 제 4의 ORF3 C-DEL1은, 단순하고 직접적으로 S 또는 ORF3 내 상응하는 각 위치에서의 뉴클레오티드의 결실 숫자에 따라 마이너 DEL 패턴으로 분류되었다. 표준적인 (classic) G1a 프로토타입 CV777 및 세포-적응된 백신 균주는, 세포적응 된 G2b DEL 균주의 제 1 DEL 풋프린트와 거의 일치하는 위치에 4개 aa 결실 (S N-DEL4)을 가졌다. 또한, 표준적인 G1a 및 병원성 야생 G2 바이러스 간의 재조합에 의한 것으로 보이는 신규한 G1b 유행성 변이체는, G1a 표준 균주와 동일한 S N-DEL4를 포함하였다 (Lee et al., 2014, Lee, 2015). 실제로, G2 그룹 내의 PEDV 야생 단리체의 S 유전자는, 프로토타입 CV777 균주와 비교하여, S의 N-말단 고가변영역 내 55/56 및 135/136 위치에서 비연속적인 2개의 4-aa 삽입, 및 160 및 161 위치에서 1개의 2-aa 결실로 구성된, 특이적인 유전자 특징을 포함하였다 (Lee et al., 2010, Lee et al., 2014, Lee and Lee, 2014, Lee, 2015). 표준적인 및 세포-적응된 G1a 균주가 55/56위치에서 4-aa 결실을 포함하고, 반대로 G2 유행성 균주는 G2 유행성 균주는 4-aa 삽입을 가지므로, DEL 크기 변화에도 불구하고 제 1 DEL 패턴이 시험관 내 계대 배양 중 유사한 위치에서 발생할 수 있을 것으로 예측할 수 있다. 제 4 ORF3 C-DEL1는 리딩프레임 내 변화를 수반하였으나, 모바이러스의 ORF3 내 164 위치에서 발린 잔기의 자발적인 제거를 포함하였고, 이는 이전 연구에서 예측할 수 없었던 것이다. 제 2 패턴은 S 및 ORF3 사이의 접합부를 스패닝 하는 유전체 위치 24,771 내지 24,816에서의 대규모 46개 뉴클레오티드 결실에 기인한 메이저 DEL 특징이다. 이것은 S 및 ORF3 단백질의 발현을 동시에 수정하였다. S 단백질에 있어서, 5-aa 잘려진 세포기질 도메인과 함께 절단된 S 생성물이 생성될 수 있다 (S C-DEL5). ORF3에 있어서, 번역 개시를 위한 ATG 코돈이 넉아웃되어 ORF3 발현이 없거나, 제 2 ATG 개시자가 ORF3 발현을 위해 대체되는 경우 광범위한 N-말단 70-aa 절단된 ORF3 형태 (ORF3 N-DEL70)가 생성될 수 있다. 흥미롭게도, 이러한 메이저 DEL 특징은 세포-적응된 한국 백신균주 SM98-1 (Genbank accession no. GU937797)에 거의 동등하게 존재하며, 이것은 유사한 위치에 광범위한 52개 뉴클레오티드 결실을 포함한다 (도 1 및 도 6B). 따라서, SM98-1는 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주 보다 2 아미노산이 짧은, 7-aa 결실된 세포질 도메인을 지닌 변이 S 단백질을 엔코딩할 것으로 예측되며, 이것과 동일한 ORF3 또는 N-DEL70 절단된 ORF3가 본 발명에서는 확인되지 않았다. 또한, 다른 한국 백신 균주 DR-13 또한 커다한 17-aa 결실 영역을 ORF3 내의 82 ~ 98 위치에서 가졌으며, 이는 상응하는 위치에서의 계속적인 뉴클레오티드 결실에 따라 자발적으로 발생된 것이었다 (Park et al., 2008). 끝으로, 나머지 DEL 특징은 알라닌을 코딩하는 트리플릿 'GCT'이 종료 코돈인 'TGA'로 변이되고, 이어서 조기 종료되어 ORF3의 C 말단에서 광범위한 88-aa 결실 (ORF3 C-DEL88)을 일으키는 간접적 변이에 기인하는, 비정상적인 메이저 결실로 분류되었다. 유사하게, 왕 등 (Wang et al. (2012))은 약독화-타입 PEDV가 야생형 바이러스의 224개 아미노산과 비교하여 91개 아미노산의 C-말단 절단된 ORF3 단백질을 엔코딩 하는 것을 보고하였다. 그러나, 본 발명자들의 발견은 선행 연구에서 약독화 바이러스의 ORF3 유전자가 49개 뉴클레오티드 결실을 가진다는 점에서 상이하며, 이는 리딩프레임시프트 및 ORF3 C-DEL88보다 훨씬 상류인 ORF3의 274째 뉴클레오티드에서의 'TAG' 종결자를 갖도록 한다. 더욱 놀랍게도, KNU-141112-S DEL2를 제외하고, 대부분의 세포-적응된 DEL 균주가 개별적으로 다음을 포함하는 비연속적인 DEL 특징을 포함하였다: i) S N-DEL5 및 ORF3 C-DEL1, ii) S N-DEL2, S C-DEL5와 ORF3 N-DEL70 콤비네이션, 및 ORF3 C-DEL88, 및 iii) S N-DEL5, S C-DEL5와 ORF3 N-DEL70의 콤비네이션, 및 ORF3 C-DEL1. 상기와 같이, 수개의 세포-약독화 백신 균주가 개별적으로 커다란 결실 영역을 이들의 절단된 ORF3 변이체를 엔코딩하는 ORF3 내에 유지하였으며, 이는 이러한 유전자형 특징이 PEDV의 병독성 상실과 관련됨을 시사한다. 흥미로운 것은, 2개의 세포-적응된 DEL 균주, KNU-141112-S DEL2/ORF3 (서열번호: 1) 및 KNU-141112S DEL5/ORF3 (서열번호: 2)가 모바이러스의 224개 아미노산과 비교하여, 각각 66개 및 153개 아미노산의 균주-특이적 광범위 절단된 ORF3를 엔코딩 할 것으로 예측된다는 것이다.
본 발명의 다른 일 예에서, 이들 2개 DEL 균주를 이용하는 동물 챌린지 (challenge) 실험을 수행하여, 시험관 내 바이러스 연속계대와 관련된 병독성 KNU-141112 균주의 생체 내 표현형 변화를 분석하였다. 모바이러스 KNU-141112-P5 및 이것의 세포-계대 유도체, KNU-141112-S DEL2/ORF3 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3를 돼지에서 특성확인하고, 이것의 병원성을 비교하였다. KNU-141112-P5 감염에 의한 무기력 및 물설사를 포함하는 임상징후가 1 DPI와 같이 조기에 발견되었고, 이후 임상적 징후의 심각성 및 PEDV의 분변 쉐딩 (shedding)이 뚜렷하게 증가하였다. KNU-141112-P5로 접종된 그룹 1의 모든 동물이 시간경과에 따라 악화되는, 보다 더 심각한 물설사 및 탈수를 계속하여 경험하였으며, 5 DPI에 이르는 기간에 모두 사망하였다. 이러한 질병 경과는 PEDV G2b 균주에 의해 자연적 또는 실험적으로 감염된 돼지에서 전형적인 것이다 (Debouck et al., 1981; Jung et al., 2014; Lee et al., 2015; Madson et al., 2014; Stevenson et al, 2013). 이와 반대로, 본 발명자들은 그룹 2 및 그룹 3의 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3로 챌린지 된 모든 돼지에서 전형적인 임상 징후 및 PEDV-관련된 사망을 전혀 관찰할 수 없었다: 이들은 전체적으로 비-감염된 대조군과 유사한 임상스코어를 보였다. 3 DPI에 이르는 기간 동안 그룹 2 및 3의 접종된 돼지 100%에서 PEDV 유전체가 직장 면봉 샘플로부터 검출되었으나, KNU-141112-P5 그룹과 비교할 때 바이러스 양이 현저하게 감소 (2-log 보다 더 감소) 하였으며, 이는 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주에 대한 제한된 바이러스 쉐딩을 제시한다. 부검 시에, 얇고 투명한 장벽을 지닌 육안에 의한 소장 병변이 모바이러스 감염된 돼지에서 관찰되었나, S DEL2/ORF3- 및 S DEL5/ORF3 감염된 그룹 내 소장 조직은 정상이며 음성대조군과 유사하게 관찰되었다. 마찬가지로, 소장에서의 조직병리학적 병변이 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 S DEL2/ORF3 또는 S DEL5/ORF3 바이러스 사이에 구별되게 나타났다. KNU-141112-P5 그룹의 모든 자돈이 일반적인 두드러진 융모위축을 지닌 급성 바이러스성 장염을 가졌다. 이와 반대로, 세포-적응된 DEL 균주로 감염된 2개 그룹은 소장의 모든 분절에서 두드러진 육안병변을 보이지 않았으며, 이는 음성대조군 돼지와 유사하였다.
본 발명의 다른 일 예에서, 본 발명자들은 돼지를 각 세포-적응된 균주로 2회 면역화하고 동물이 체액성 면역을 보유하게 되었는지를 SN 테스트로 분석하였다. 놀랍게도, 돼지 혈청은 높은 수준의 중성화 항체를 유사하게 포함하였으며, 이는 본 발명의 세포-약독화 바이러스가 면역반응을 유도하였음을 뒷받침 한다. 본 발명의 KNU-141112-S DEL2/ORF3 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 둘 모두가 PEDV에 대한 효과적인 방어를 포함하여 생체 내에서 바이러스학적으로 및 임상적으로 약독화 되고, 자연 숙주에서 현저하게 면역원성임을 확인 하였다.
이와 같이, 선행연구 및 본 발명의 결과에 따르면, 특히 S 유전자 내에서 다른 변이 및 결실에 의한 기여를 명백하게 제외할 수는 없더라도, 세포배양 적응으로부터 유래 된 ORF3 내에서의 메이저 유전적 변화가 병독성 PEDV 균주의 약화 된 병원성과 관련될 수 있다. 그러나, PEDV ORF3 단백질의 정확한 기능은 현재 밝혀지지 않은 상태이다. PEDV ORF3는 4개의 막단백질 (TM) 도메인을 포함하고 4량체 어셈블리를 형성하는 것으로 알려졌다 (Wang et al., 2012). PEDV ORF3가 이온채널 단백질을 엔코딩 하는 것이 밝혀졌으며, ORF3의 151 내지 172 아미노산 위치의 TM4가 칼륨채널 활성에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다 (Wang et al., 2012). 보다 흥미롭게도, TM3 및 TM4 도메인이 없는 절단된 ORF3를 엔코딩 하는 약독화 PEDV는 이온채널 활성을 갖지 않는 것으로 알려졌다 (Wang et al., 2012). 그러나, 약독화 균주의 하나인 KNU-141112-S DEL5/ORF3은 TM2 내지 TM4 도메인을 포함하고, 이에 따라 이온채널 활성을 유지할 것으로 예측되는 절단된 153 aa를 포함한다. 따라서, ORF3 생성물의 이온채널 활성은 PEDV의 병독성과 무관할 수 있다. PEDV 감염 세포에서 siRNA에 의한 ORF3의 특이적 넉다운은 세포로부터 바이러스 입자의 수를 감소시켰으며, 이는 ORF3가 바이러스 생산을 조절함을 지시한다 (Wang et al., 2012). 이러한 선행연구와 불일치하게, 본 발명자들은 ORF3에 커다란 결실 영역을 지닌 세포-적응된 DEL 균주가 세포배양에서 효율적으로 성장하는 것을 밝혔다. 또한 최근의 연구는 PEDV ORF3 단백질이 배양된 세포에서 바이러스 복제에 불필요함을 밝힌 바 있다 (Li et al., 2013). 이러한 결과에 따르면, 몇몇 결과는 악세서리 ORF3 유전자가 시험관 내 PEDV 복제에 불필요함을 제시한다. 시험관 내 바이러스 증식에서의 무시할 수 있는 기능에도 불구하고, 야생의 PEDV 단리체에서의 완전한 ORF3의 보존은 ORF3 단백질이 동물숙주에서의 자연적 감염에 중요한 역할을 함을 제시한다.
결론적으로, 본 발명자들은 4개의 구별되는 DEL 균주를 시험관 내 연속계대 과정에서 수득하였으며, ORF3 내에 커다란 결실을 지닌 세포-적응된 바이러스의 생체 내 병독성 상실 및 세포-적응된 균주의 돼지에서의 강력한 면역원성 보유를 입증하였다. 유전적 인자가 PEDV의 표현형 특성에 관련되고, 따라서 ORF3가 병원성 특징을 결정하는 중요한 바이러스 성분일 수 있다. 본 발명에 따르면, 세포-적응된 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 바이러스에 의한 생체 내 감염은 약독화 결과를 나타냈으며, 이는 광범위한 결실에서 기인하는 ORF3의 기능 결함이 자연 숙주에서 변경된 PEDV 병원성에 기여함을 제시한다. 본 발명은 PEDV에서 병독성 홀마크와 관련된 유전자 변화가 ORF3 유전자와 관련될 수 있음을 밝혔다. 그러나, 약독화된 DEL 바이러스에서 확인된 다른 유전자 변이가 PEDV의 병독성에 관련될 가능성은 여전히 존재한다.
본 발명의 약독화 된 바이러스를 포함하는 백신조성물은 일반적으로 103 ~ 1010의 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 백신조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보존제 또는 면역억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용될 수 있는 담체는 생리학적 염 용액이다. 애주번트, Tween, 및 Span와 같은 하나 이상의 유화제가 본 발명에 따른 생독백신과 함께 사용될 수 있다. 적합한 애주번트는, 예를 들어 비타민-E 아세테이트 용해제, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 또는 산화알루미늄, 오일유제, 및 사포닌 등이 포함된다. 본 발명에 따른 백신은 동결건조 형태로 제조될 수 있으며, 이 경우 안정화제를 약독화 된 바이러스에 첨가하는 것이 바람직하다. 적절한 안정화제로는, 예를 들어, SPGA (Bovarnik et al., J.Bacteriology 59, 509, 1950), 탄수화물 (솔비톨, 만니톨, 트레할로즈, 전분, 슈크로즈, 덱스트란 또는 글루코즈등), 단백질 (알부민 또는 카제인등), 또는 이들의 분해산물, 및 완충액 (알칼리 금속 포스페이트)이 포함된다.
본 발명에 따른 백신조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해, 또는 비강내, 기관내, 경구, 피부, 경피/내피 또는 피내 투여에 의해 투여될 수 있다. 생리학적 염 용액은 피내 또는 근육내 투여를 위한 간단하고 적절한 담체이다. 본 발명에 따른 백신은 생후 10일령 이상의 건강한 돼지에 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 생독백신 PRRS 바이러스와 함께 다른 약독 백신 또는 불활성화된 병원균 또는 다른 병원균으로부터의 항원성 물질을 포함한다. 그러한 병원균은 예를 들어 박테리아 또는 기생체일 수 있으며, 바이러스원일 수도 있다. 대개, 무관한 병원균 또는 항원성 물질은 돼지 병원균일 것이다. 항원성물질은 면역 반응을 유도할 수 있는 물질로 이해되며, 단백질, 다당류 및 지다당류를 포함한다.
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 기술한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
재료 및 방법
세포, 바이러스 및 항체
베로세포 (ATCC CCL-81)를 5% 우태아혈청 (FBS; Invitrogen) 및 항균 및 항진균 용액 (100x; Invitrogen)을 함유하는 α-최소필수배지 (α-MEM; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하고, 37 ℃ 습도조절된 5% CO2 인큐베이터에 두었다. 병독성 한국형 PEDV 균주, KOR/KNU-141112/2014는 선행문헌 (Lee et al., 2015, page 216)(논문 중 관련내용이 기재된 page 부탁드립니다)에 따라 동정하고 베로세포에서 증식했다. 세포배양 (KNU-141112-P5)에서 5번째 계대의 바이러스를 스톡으로 제조하고 이를 본 발명을 위한 모바이러스 (parental virus) (GenBank accession no. KR873434)로 사용하였다. PEDV N 단백질-특이적 단클론항체 (MAb)를 중앙백신연구소 (CAVAC; Daejeon, South Korea)로부터 입수하였다.
바이러스의 연속 계대
PEDV 균주 KNU-141112-P5를 베로세포에서 2회 플라크 정제하고, 상기 정제된 바이러스를 선행문헌 (Lee et al., 2015, page 216)에 기술된 방법에 따라 베로세포에서 연속 계대하였다. 지름 100 ㎜의 조직배양 디쉬에서 배양된 컨플루언트 베로세포를 PBS로 세척하고, 트립신 (USB, Cleveland, OH)을 함유하는 10배 희석된 PEDV KNU-141112, 1 ㎖를 접종하였다. 37 ℃에서 1시간 배양 후 바이러스성장배지 [항균-항진균 용액이 첨가된 α-MEM, 0.3% 티로신인산염배지 (tryptose phosphate broth) (TPB; Sigma, St. Louis, MO), 0.02% 효모추출물 (yeast extract) (Difco, Detroit, MI), 10 mM HEPES (Invitrogen), 및 트립신 5 ㎍/㎖]를 가하였다. 상기 접종된 세포를 5% CO2 조건에서 37 ℃에 두고, 세포변성효과 (cytopathic effects, CPE)를 매일 모니터링 하였다. 70% CPE가 나타났을 때, 접종된 세포에 대해 3차례의 동결 및 해동 과정을 수행하였다. 다음 배양 상등액을 10분 동안 400 x g 에서 원심분리 (Hanil Centrifuge FLETA5, Incheon, South Korea) 하고, 0.45 ㎛ 구멍 크기의 필터 (Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 필터링하였다. 상기 필터링한 상등액을 분액하고 다음 실험을 위한 바이러스 스톡으로서 80°C에서 보관하였다. 같은 방법으로, 베로세포에서 100 연속계대를 수행하였다. 세포배양의 70번째 계대에서, 바이러스를 매 10 계대마다 플라크 클로닝 하였다. 단일 플라크를 선택하고 뉴클레오티드 서열분석으로 S 유전자의 변이를 확인하였으며, 선택된 바이러스를 추가로 계대하였다.
면역형광분석 (
Immunofluorescence assay, IFA)
6-웰 조직배양 플레이트에 놓인 현미경 커버슬립상에 배양된 베로세포를 0.1의 감염다중도 (multiplicity of infection, MOI)로 PEDV로 감염시켰다. 다음, 상기 바이러스 감염된 세포를 24 hpi까지 증식시켰다. 실온 (RT)에서 10분간 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정하고, PBS에서 0.2% 트리톤 X-100으로 실온에서 10분간 투과화 시켰다. 상기 세포를 30분간 실온에서 PBS 중 1% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)으로 블로킹한 다음, N-특이적 MAb로 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS에서 5회 세척한 후, 상기 세포를 Alexa Fluor 488 (Invitrogen)에 컨쥬게이션된 염소 안티-마우스 2차 항체와 실온에서 1시간동안 인큐베이션하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma))로 대비염색하였다. 상기 커버슬립을 마운팅 완충액 내의 현미경 글래스슬라이드에 올리고, Leica DM IL LED 현미경 (Leica, Wetzlar, Germany)으로 세포염색을 관찰하였다.
바이러스 역가
상기한 것과 같이, 트립신 하에서 베로세포를 각 KNU-141112 바이러스 스톡으로 감염시켰다. 감염 후 70% CPE가 공통적으로 발생한 감염 후 24시간 또는 48시간에 배양 상등액을 수거하였다. 성장역학실험 (growth kinetics experiments)을 위해, 상기 상등액을 각 바이러스 균주로 감염시킨 세포로부터 다른 시점 (6, 12, 24, 36, 및 48 hpi)에 수거하고, 80 ℃에서 보관하였다. 바이러스 역가는 베로세포를 사용하는 플라크 어세이로 중복 측정하고, ㎖당 플라크-형성 유닛 (plaque-forming units, PFU)을 정하였다. 즉, 트립신을 함유하는 연속적으로 10배 희석된 바이러스 현탁액을 각 웰당 200 ㎕ 사용하여, 6-웰 플레이트에서 증식된 베로세포를 접종하고 37 ℃에서 1시간 동안 흡착시켰다. 접종된 세포에 미리 혼합한 바이러스성장배지 2 ㎖ 및 1.5% Bacto 아가 (Difco)를 가하고, 37 ℃에서 2일간 인큐베이션하였다. 접종 48시간 후 (48 hpi), 플라크 형태를 에탄올 중 1% 크리스털 바이올렛으로 염색하여 분석하였다.
뉴클리오티드 서열분석
세포적응된 KNU-141112 DEL 균주의 전장유전체 서열을 NGS (next-generation sequencing)로 분석하였다. 베로세포에서 연속계대 된 바이러스 스톡으로부터 전체 RNA를 제조사 지시에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하고, cDNA 단편 증폭을 위한 주형으로 사용하였다 (Lee and Lee, 2014; Lee et al., 2014b; Lee et al., 2015). 각 샘플의 전체 유전체를 포괄하기 위해 10개의 오버랩핑 된 cDNA를 제작하고 Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) Sequencer System (Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 316 v2 sequencing chip (Life Technologies)을 사용하여 NGS를 수행하였다 (Lee and Lee, 2014, page 1223; Rothberg et al.,2011, page 350). 단일염기변이 (SNPs)를 CLC Genomic Workbench version 7.0 (CLC Bio, Cambridge, MA)로 분석하고, 개별 NGS 판독 내용을 PRRSV 참조 균주 KNU-141112-P5 (Genbank accession no. KR873434)의 완전한 유전체를 사용하여 어셈블리하였다. 세포적응된 KNU-141112 유전체의 5' 및 3' 말단을 cDNA 말단 신속증폭 (rapid amplification of cDNA ends (RACE))으로 분석하였다 (Lee and Lee, 2013, page 1766). 높은 계대의 KNU-141112 DEL 유도체 (KNU-141112-S DEL2, KNU-141112-S DEL2/ORF3 (서열번호: 1), KNU-141112-S DEL5, 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (서열번호: 2) 전장유전체 뉴클레오티드 서열을 각각 KY825240 내지 KY825243로 GenBank 데이터베이스에 기탁하였다 (Genebank, 2017년 3월 27일). 또한, S 및/또는 ORF3에서 확인된 독특한 뉴클레오티드 결실을 전통적인 생거법 (Sanger method)으로 검증하였다. 각 균주의 전체 S 및 ORF3 유전자에 대응하는 코딩 영역을 스패닝하는 2 또는 3개의 오버랩핑된 cDNA 단편을 RT-PCR로 증폭하였다 (Lee et al., 2010). 개별 cDNA 증폭산물을 겔 정제하고 pGEM-T easy (Promega, Madison, WI)에 클로닝 한 후, 2개의 상용 벡터-특이적 T7와 SP6 프라이머 및 바이러스 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 양방향으로 시퀀싱하였다.
| 프라이머 명칭 | Nucleotide sequence (5′-3′) | Purpose | 프라이머 위치 (nt*) |
| S-Fwd-1 | ACGTAAACAAATGAGGTCTTT | PCR | 2062420644 |
| S-Rev-1 | ATACACCAACACAGGCTCTGT | RT and PCR | 2286622886 |
| S-Fwd-2 | GGTTTCTTCTACCATTCTAATGACG | PCR | 2283022854 |
| S-Rev-2 | GTATTGAAAAAGTCCAAGAAACA | RT and PCR | 2479524817 |
| S-Fwd-808 | GTGGTTTCCAACCAACCC | sequencing | 2145021467 |
| S-Fwd-2991 | TGAGTCTTTTAACTCTGC | sequencing | 2363323650 |
| S-ORF3-Fwd | ACTGGTGAAATTGCAGA | PCR | 2447024487 |
| S-ORF3-Rev | CCACGTATAGCTAGATACAAGTCGATGCTACTAACA | RT and PCR | 2528225317 |
*숫자는 KNU-141112 유전체 내의 위치와 동일함.
계통유전학적 분석
PEDV 단리체의 완전하게 서열분석 된 S 유전자 36개 서열 및 30개의 완성된 유전체의 서열을 독립적으로 사용하여 서열정렬 및 계통유전학적 분석을 수행하였다. ClustalX 2.0 프로그램 (Thompson et al., 1997)으로 다중-시퀀싱 정렬을 생성하고, 뉴클레오티드 서열 차이의 퍼센트를 동일한 소프트웨어 프로그램으로 평가하였다. 인접-결합 방법 (neighbor-joining method)을 이용하여 정렬된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 계통유전학적 트리를 구성하고, 이어서 1,000개 리플리케이트로 부츠트랩 분석을 수행하여 상기 트리의 각 인터널노드 (internal node)의 신뢰도 (%)를 결정하였다 (Saitou and Nei, 1987). Mega 4.0 software (Tamura et al., 2007)를 사용하여 트리를 생성하였다.
돼지 감염 실험
본 발명에서 생체 내 돼지 연구는 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드라인에 따라 중앙백신연구소에서 수행하였다. 총 14마리의 3일령 이유자돈을 위생관리가 잘되어 있고 PEDV 발병 또는 백신화가 수행된 바 없는 상업적인 번식야생에서 교배종 암퇘지 (Great Yorkshire x Dutch Landrace)로부터 확보 하였다. 실험에 사용된 동물의 직장 면봉을 이용한 바이러스-특이적 PCRs을 수행하여, PEDV, 돼지전염성위장염바이러스 (transmissible gastroenteritis virus, TGEV), 돼지델타코로나바이러스 (porcine deltacoronavirus) 및 돼지로타바이러스 (porcine rotaviruses)에 대해 모든 동물이 음성임을 확인하고, PEDV, TGEV 및 PRRSV에 대한 항체가 없음을 확인하였다. 돼지는 무작위로 4개 실험군으로 나누었다: 모바이러스 KNU-141112-P5-접종군 (n = 3), KNU-141112-S DEL2/ORF3-접종군 (n = 4), KNU-141112-S DEL5/ORF3-접종군 (n = 4), 및 가-접종대조군 (sham-inoculated control) (n = 3). 실험동물에 대해 시판 중인 우유 대용물을 자주 공급하고 (1일 3 내지 4회), 실험기간 (8일) 동안 자유롭게 물을 먹을 수 있도록 하였다. 2일의 적응기간 경과 후, 바이러스 접종군의 자돈 (5일령)에 각 바이러스를 105.0 TCID50/㎖ (equivalent to 100 median lethal doses LD50 of KNU-141112) 1 ㎖ 복용량으로 경구투여하였다 (Baek et al., 2016; Lee et al., 2015; Lee and Lee, 2015). 가접종 돼지에 대해서는 플라시보로서 세포배양배지를 투여하였다. 임상적 징후로서, 구토, 설사 및 사망을 실험기간 중 매일 모니터링 하였다. 접종에 앞서 16인치 면봉으로 모든 실험군으로부터 변 샘플을 수집하고 i-TGE/PED Detection Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, South Korea)을 사용한 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR을 수행하여 PEDV 쉐딩 유무를 확인하였다. 접종 후 7일 (DPI) 동안 육안검사에 기초하고 다음 점수기준에 따른 임상징후점수 (Clinical significance score, CSS)를 결정하였다: 정상 및 설사 없음 (평군 Ct 값 > 45); +, 경미에서 심하지 않은 무른 변 (mild to moderate fluidic feces); ++, 심하지 않은 설사 (moderate watery diarrhea); +++, 심각하고 폭발적인 설사 (severe watery and projectile diarrhea) (평균 Ct 값 < 20). 실험 중 챌린지 후 사망한 자돈은 부검하였으며, 모든 생존한 돼지와 대조군 돼지는 사후분석실험을 위해 챌린지 후 7일째에 안락사시켰다.
면역원성 평가를 위해, 총 11마리의 3주령 돼지를 상기와 같이 입수하고 실험하였다. 돼지를 무작위로 그룹화 하였다: 모바이러스 접종군 KNU-141112-P5 (n= 3), KNU-141112-S DEL2/ORF3 접종군 (n = 3), KNU-141112-S DEL5/ORF3 접종군 (n = 3), 및 가접종 대조군 (n = 2). 2일간 순응시킨 후, 9마리의 돼지 (24일령)에 대해 각 바이러스 1 ㎖를 경구투여하여 면역화시키고 2주 간격으로 상응하는 바이러스로 부스팅하였다. 2마리의 가접종 돼지에 대해서는 세포배양배지를 투여하고 이것으로 부스팅하였다. 면역 전 혈정을 면역화 시작 전에 수집하고, 최종 부스팅 후 2주째에 항혈청을 수집하였다. 혈청 샘플에 대해 바이러스 중성화 반응으로 PEDV 항체를 테스트 하였다.
정량적 실시간 RT-PCR
i-TGE/PED Detection Kit를 제조자의 지시에 따라 사용하여, 상기 제작한 변 샘플로부터 바이러스 RNA를 추출하였다. One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa, Otsu, Japan) 및 프라이머 (전위프라이머 5′-ACGTCCCTTTACTTTCAATTCACA-3′(서열번호: 3), 역위 프라이머 5′-TATACTTGGTACACACATCCAGAGTCA-3′(서열번호: 4) 및 프로브 (5-FAM-TGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCAC-BHQ1-3′(서열번호: 5)를 선행문헌의 기술내용 (Kim et al., 2007; Sagong and Lee, 2011)에 따라 사용하여 정량실시간 RT-PCR을 수행하였다. Thermal Cycler Dice Real Time System (TaKaRa)을 제조사의 프로토콜에 따라 다음 조건 하에서 수행하여 반응시켰다: 45 ℃에서 30분 1 사이클, 95 ℃에서 10분 1사이클, 및 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 1분 40사이클. 소프트웨어로 결과를 분석하였다 (Sagong and Lee, 2011). 각 PCT 플레이트에서 표준곡선을 생성하기 위해, 알려진 감염역가를 지닌 PEDV 단리체를 10배 연속 희석하였다. 표준곡선에 따라 실험된 샘플의 바이러스 농도 (TCID50/㎖)를 계산하였다. 평균 Ct (cycle threshold) 값을 PCR 양성 샘플에 기초하여 계산하고, 평균 바이러스 역가를 그룹 내 모든 돼지에 기반하여 계산하였다.
소장의 조직병리학 및 면역조직화학
부검 시, 표준실험실매뉴얼에 따라 각 자돈으로부터 소장 조직검체 (< 3 ㎜ 두께)를 수집하고, 24시간 동안 실온에서 10% 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀에 침지하였다. 포르말린으로 고정하고 파라핀에 침지한 조직을 마이크로톰 (Leica) 상에서 5 ~ 8 ㎛ 두께로 자르고 글래스 슬라이드상으로 옮겼다. 다음, 자일렌 (xylene)에서 5분 동안 상기 조직으로부터 파라핀을 제거하고, 에탄올 농도 (100%, 95%, 90%, 80%, 및 70%)를 낮춰가면서 각 농도에서 3분간 세척하였다. 상기 파라핀이 제거된 조직단편을 조직병리학을 위해 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin) (Sigma)으로 염색하거나, 선행문헌 (Lee et al., 2015)에 기술된 내용에 따라 PEDV N-특이적 MAb를 사용하여 면역조직화학 (immunohistochemistry, IHC)을 수행하였다. 요약하면, 상기 파라핀-침지된 조직단편으로부터 파라핀을 제거하고, 전자오븐 (microwave oven)에서 5분간 0.01 M 시트레이트 완충액 (citrate buffer) (pH6.0)으로 처리하고, 실온에서 20분간 온도를 낮춘 후, 증류수 (DW)에서 20분간 0.3% 과산화수소로 인큐베이션하여 내재하는 페록시다아제를 블로킹하였다. PBS에서 3회 세척 후, 상기 조직절편을 정상의 말 혈청 (VECTASTAIN ABC Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 블로킹하고, 실온에서 1시간 동안 N-특이적 MAb와 함께 인큐베이션 하였다. PBS에서 세척한 다음, 상기 샘플을 실온에서 45분간 말 안티-마우스 2차 항체 (VECTASTAIN ABC Kit)와 반응시키고, 애비딘-비오틴 페록시다아제 (avidin-biotin peroxidase) 복합물로 인큐베이션한 후, DAB substrate Kit (Vector Laboratories)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 현상하였다. 다음, 상기 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조염색, 탈수, 자일렌으로 세척하며, 마운팅 완충액 내에서 현미경 글래스 상에 올린 후. 현미경으로 조직염색을 육안관찰 하였다.
혈청 중성화
PEDV 단리체 KNU-141112를 사용하며 96-웰 미량정량플레이트 (microtiter plate) 내 혈청중성화 (SN) 테스트를 이용하여, 모든 실험군 돼지로부터 수집한 혈청 샘플에서 PEDV-특이적 중성화 항체의 존재여부를 결정하였다. 요약하면, 베로세포를 96-웰 조직배양 플레이트에서 1일 동안 2 x 104/well로 증식시켰다. 상기 KNU-141112-P5 바이러스 스톡을 무혈청 α-MEM에 희석하여 50 ㎕의 200 TCIP를 제조하였다. 다음, 96-웰에서 상기 희석된 바이러스를 개개의 2배 연속 희석시킨 불활성화 혈청 50 ㎕와 혼합하고, 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 하였다. 상기 혼합물을 베로세포에 접종하고 37 ℃에서 1시간 인큐베이션 하였다. 상기 혼합물을 제거한 후, 상기 세포를 PBS로 5회 철저하게 세척한 다음, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2일 동안 바이러스증식배지 내에 두었다. 모든 중복 테스트된 웰에서 바이러스-특이적 CPE를 저해하는 가장 높은 혈청희석액에 상응하여 중성화 역가를 계산하였다.
통계분석
스튜던트 t 테스트 (Student′s t test)를 모든 통계분석에 이용하였으며, 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예
실시예 1: 연속계대 NU-141112 DEL 균주의 표현형 특성확인
본 발명자들은 최근 대한민국에서의 대규모 PEDV 유행병의 원인이었던 병독성 G2b 균주 KOR/KNU-141112/2014를 단리 한 바 있다 (Lee et al., 2015). 본 발명에서, 본 발명자들은 먼저 시험관 내 연속증식 및 특정 계대에서 플라크클로닝을 수행하였다. KNU-141112, KNU-141112-P80 및 KNU-141112P90 (각각 KNU-141112의 80번째 및 90번째 계대)의 높은 계대 유도체 플라크 정제에서, 단일 플라크를 선정하고 전장 S 유전자의 뉴클레티드 서열을 개별 분석하였다. 예비적 뉴클레오티드 (nt) 서열분석으로 4개 상이한 결실 패턴을 확인하였다: S1 (S DEL2)의 N-말단에서 6-nt (2 아미노산) DEL, S1 (S DEL2)의 N-말단에서 15-nt (5 아미노산), S의 C-말단 및 ORF3 (S DEL2/ORF3)의 N-말단에서부터 위치하는 유전자간-연결 영역의 S DEL2 플러스 대규모 46-nt 결실; 및 S DEL5 플러스 상기 동일한 (S DEL5/ORF3). 상기 개별적인 DEL 패턴을 갖는 플라크 클로닝된 바이러스를 추가로 100계대까지 증식시키고 KNU-141112-S DEL2, KNU-141112-S DEL5, KNU-141112-S DEL2/ORF3 (서열번호: 1) 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (서열번호: 2)로 지정된 바이러스 스톡을 제조하였다.
모바이러스와 같이, 모든 세포-적응된 DEL 균주가, 감염된 베로세포에서 PEDV 감염에 전형적인 뚜렷한 CPEs, 예컨대, 세포융합, 다핵세포형성 (multi-nucleated cell formation, syncytium), 및 분리와 같은 CPEs (세포병변효과)를 생성할 수 있었다. CPE의 발생 시기는 12 hpi였으며, 이에 따라 모바이러스 및 세포-적응된 바이러스에서 24 hpi 이내에 현저한 CPE가 관찰되었다. 바이러스 증식을 PEDV N 단백질-특이적 MAb를 사용하는 IFA에 의한 PEDV 항원검출로 확인하였다. 전형적인 합포체세포 (syncytial cells)의 세포질 내에 뚜렷한 염색이 분포하였다 (도 1). 베로세포를 PEDV KNU-141112-P5 및 세포적응 된 DEL바이러스로 감염시켰다. PEDV-특이적 CPEs을 매일 관찰하고 200 배율 역상현미경을 사용하여 24 hpi에서 촬영하였다 (도 1, 제 1 패널). 면역염색을 위해, 감염된 세포를 24 hpi에서 고정하고, N 단백질에 대한 MAb와 인큐베이션 하였으며, 이어서 Alexa 그린-컨쥬게이션 된 염소-안티 마우스 2차 항체로 처리하였다 (도 1, 제 2 패널). 다음, 상기 세포를 DAPI로 대조염색하고 (도 1, 제 3 패널), 200 배율의 형광현미경으로 관찰하였다. 도 1에서 화살표는 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주로 감염된 베로세포에서 뚜렷한 공액을 나타낸다. 흥미롭게도, DEL 균주는 다핵성 거대세포로 인한 다핵체 (syncytia)와 함께 공포형성을 보여주는 두드러진 FA 및 CPE를 가져왔으며, 이는 KNU-141112-S DEL2/ORF3 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3로 감염된 세포에서 보다 더 크고 우세하였다 (도 1 화살표 참조).
연속계대 DEL 균주의 시험관 내 표현형 특징을 조사하기 위해, 각 바이러스에 대한 감염력 수준을 바이러스 역가로 평가하였다. 모바이러스 KNU-141112-P5의 감염 역가는 106.20 PFU/㎖ (글자가 깨져 있습니다)인 반면에, 세포-적응된 바이러스의 역가는 106.92 내지 107.47 PFU/㎖ (도 2A) 였다. 도 2A는 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주의 바이러스 역가를 나타낸 것으로서, 24 또는 48 hpi에서, 바이러스 상등액을 수거하고, 바이러스 역가를 플라크 어세이로 분석하였다. 도 2B는 KNU-141112 균주에 대한 원-스톱 성장곡선을 나타내며, 지시된 감염 후 시점에서 배양 상등액을 회수하고, 바이러스 역가를 플라크 어세이로 측정한 결과이다. 결과는 중복하는 2회의 독립적인 실험의 평균값으로 나타냈으며, 에러 바 (error bars)는 표준편차를 나타낸다. 원스톱 성장동력학 (One-step growth kinetics)은 모바이러스의 성장곡선이 점차 증가하여 접종 후 48 hpi에서 최고점에 이른 것을 나타냈다 (도 2B). 이와 대조적으로, 세포-계대 DEL 균주의 성장동력학은 모균주와 비교하여 보다 더 빨랐으며, 24 또는 36 hpi에 이르기까지 보다 더 높은 역가를 나타냈다. 또한, 모든 세포-계대 DEL 균주는 24 hpi에서 가장 높은 역가를 보였으며, 이후 역가의 감소폭이 증가하였다. 도 2C는 모바이러스 및 세포-적응된 바이러스의 플라크 형태학에 관한 결과이다. 6-웰 플레이트에서 성장한 베로세포의 단일 층을 각 바이러스로 감염시켰다. 각 세포를 0.75% 아가로스에 놓고 2일간 인큐베이션 하였다. 48 hpi에서 플라크를 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 촬영하였다. 다음, 본 발명자들은 KNU-141112의 플라크 형태를 관찰하였다. 도 2C에 제시한 것과 같이, 모바이러스와 비교하여 세포-적응된 DEL 균주에서 플라크의 크기가 증가하였고, 이들 중 KNU-141112-S DEL2/ORF3 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3가 가장 큰 플라크를 형성하였다. 이러한 결과는, 세포적응과정에서 나타나는 각 DEL 특징 (signature)이 바이러스 피트니스 (viral fitness)에 독립적으로 기여함을 제시한다.
실시예 2: 100-계대 KNU-141112 DEL 균주의 완성된 유전체 특성확인
베로세포의 시험관 내 연속계대 과정에서 확인한 바이러스 피트니스에 관련될 수 있는 유전체 변화를 조사하기 위해, 세포배양-계대 DEL 균주의 전장 뉴클레오티드 서열을 NGS 분석하였다. 각 NGS에 대해 완전한 KNU-141112-P5 유전체 (GenBank accession no. KR873434)를 초기 참조로 사용하였으며, 개별적인 전체 유전체 시퀀스는 각 NGS 판독결과를 결합하여 성공적으로 확인하였다. 또한 이들 유전체의 5' 및 3' 말단을 RACE로 시퀀싱한 결과, 모든 세포-적응된 DEL 바이러스의 5' 및 3' UTRs의 길이가 각각 292-nt 및 334-nt로서 모바이러스와 동일한 것으로 나타났다. 각 균주의 S 및/또는 ORF3에서의 독자적인 DEL 패턴을 제외하고, 세포배양 계대에서 전체 유전체에 걸쳐 어떠한 추가의 삽입 또는 결실 변이를 확인할 수 없었다. 따라서, S DEL2, S DEL5, S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주의 유전체 크기는, 이들의 전체 DEL 숫자로 인해 628,038-nt 길이의 모바이러스 유전체와 비교하여 각각 6-nt, 53-nt, 18-nt 및 64-nt 짧은 것으로 나타났다. KNU-141112-P5의 유전체는 뉴클레오티드 수준에서 이것의 세포-적응된 DEL 균주와 높은 수준의 유사도 (99.7 ~ 99.9%)를 가졌다. 모균주와 비교하여 결실을 제외한 뉴클레오티드/아미노산 치환체의 숫자를 표 1에 요약하였다. 표 1은 모바이러스 KNU-141112-P5와 세포-적응된 DEL 바이러스 사이의 뉴클레오티드 및 아미노산의 변화 개수를 나타낸 것이다.
| UTRs/ORFs | Encoded protein | No. of nucleotide/amino acid changes | ||||
| P5 | DEL2 | DEL2/ORF3 | DEL5 | DEL5/ORF3 | ||
| 5′-UTR | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| ORF1a | nsp1 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 |
| nsp2 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/1 | 0/0 | |
| nsp3 | 0/0 | 4/3 | 3/3 | 1/1 | 1/1 | |
| nsp4 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| nsp5 | 0/0 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | |
| nsp6 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |
| nsp7 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| nsp8 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| nsp9 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |
| nsp10 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| nsp11 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| ORF1b | nsp12 | 0/0 | 1/1 | 0/0 | 0/0 | 1/0 |
| nsp13 | 0/0 | 1/1 | 0/0 | 2/2 | 2/2 | |
| nsp14 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| nsp15 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| nsp16 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | |
| ORF2 | S | 0/0 | 7/5 | 8/8 | 4/4 | 4/6 |
| ORF3 | ORF3 | 0/0 | 6/2 | 12/1 | 5/2 | 5/1 |
| ORF4 | E | 0/0 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |
| ORF5 | M | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 |
| ORF6 | N | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 |
| 3′-UTR | 0/0 | 0/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | |
| Total number | 22/14 | 28/14 | 19/12 | 19/12 | ||
S DEL2 및 S DEL2/ORF3 균주는 KNU-141112-P5와 비교하여 각각 총 22-nt 및 28-nt 변이를 지닌 반면에, S DEL5 및 S DEL5/ORF3는 동일하게 19-nt 변이를 포함하였다. 흥미롭게도, 모든 DEL 균주의 5'-UTRs은 변하지 않고 남아있는 반면에, 3' UTR은 단지 S DEL2에서만 완전하게 보존되었다. 나머지 다른 균주들은 3' UTR내 6 위치에서 G가 T로 치환되거나 (S DEL5 및 S DEL5/ORF3), 3' UTR 내 135 및 193 위치에서 각각 A가 T, G가 A로 치환되었다 (S DEL2/ORF3). 3' UTR에서의 이들 변이는 GenBank에서 입수할 수 있는 다른 단리체의 상응하는 위치에 자연적으로 존재하는 것은 아닌 것으로 보이며, 이는 RNA 복제 및 전사에서 중요한 역할을 하는 이 영역 내의 시스-액팅 요소 (cis-acting elements)와 관련된다.
S DEL2의 100번째 계대에서의 22-nt 치환은 코딩영역 내에 존재하고, 이들 변이의 14개는 상이 (non-synonymous) 하며 7개 바이러스 단백질 (4 비구조, 2 구조 및 1 악세서리)을 엔코딩하는 ORFs 1a, 1b, 2, 3, 및 4 내에 무작위로 분포하는 아미노산 변화를 초래한다 (표 2). 표 2는 시험관 내 연속계대 중에 모바이러스 KNU-141112-P5 및 DEL 유도체 바이러스 중 아미노산 변이를 나타낸 것이다.
| ORF |
Encoding protein (aa length) | aa positiona | Mutation at indicated no. of passages | ||||
| P5 | DEL2 | DEL2/ORF3 | DEL5 | DEL5/ORF3 | |||
| ORF1a | nsp2 | 192 | T | T | T | I | T |
| nsp3 | 1564 | S | F | F | F | F | |
| 2178 | I | L | L | I | I | ||
| 2182 | C | F | F | C | C | ||
| nsp5 | 3186 | T | I | I | I | I | |
| ORF1b | nsp12 | 142 | K | N | K | K | K |
| nsp13 | 1025 | T | I | T | I | I | |
| 1165 | A | A | A | S | S | ||
| ORF2 | S | 272 | K | T | T | T | T |
| 381 | N | N | K | N | N | ||
| 383 | T | N | T | N | N | ||
| 516 | T | T | I | T | T | ||
| 888 | G | R | R | R | R | ||
| 1287 | E | Q | Q | Q | Q | ||
| 1380 | F | F | H | F | H | ||
| 1381 | E | E | D | E | D | ||
| ORF3 | ORF3 | 26 | D | Y | b | Y | |
| 135 | K | K | S | K | K | ||
| 166 | N | S | S | S | |||
| ORF4 | E | 70 | P | S | S | S | S |
a는 Amino acid position numbering is based on the sequence of KNU-141112-P5 균주의 서열에 기초한 아미노산 위치를 나타낸다.
S DEL2/ORF3 균주에서 25-nt 변화는 코딩영역 내에 있으며, S DEL2와 같은 수의 치환은 넌-사일런트 (non-silent)로서 5개 바이러스 단백질 (2 비구조, 2 구조 및 1 악세서리)을 엔코딩하는 ORFs 1a, 2, 3 및 4 내에 위치하는 아미노산 (aa) 변이를 유도한다. S DEL5 및 S DEL5/ORF3의 코딩영역 내에 위치한 18-nt 치환은, 각각 7개 바이러스 단백질 (4 비구조, 2 구조 및 1 악세서리)을 엔코딩 하는 ORFs 1a, 1b, 2, 3과 4, 및 6개 바이러스 단백질 (3 비구조, 2 구조 및 1 악세서리)를 엔코딩하는 ORFs 1a, 1b, 2, 및 4에 분포되는 12-aa 변이를 동일하게 유도하였다. 전체적으로, 12 또는 14개 넌-사일런트 변이의 28.6% 내지 42.9% (4 ~ 6 변화)가 nsps 내에서 나타나는 반면에, 57.1% 내지 71.4% (7 ~ 10 변화)는 구조 S 및 E 및 악세서리 ORF3 단백질 내에서 발생하였다 (도 3). 도 3에서 유전체 서열을 표 2에 기술한 것과 같이 결정하였다. 약 28 kb의 KNU-141112 유전체 조직을 위에 나타냈다. ORFs 1a 및 1b 내의 각 nsp의 코딩영역 및 각 구조단백질을 위한 코딩영역을 표시하였다. 아래 패널은 KNU-141112-P5 및 이것의 시험관 내 계대한 DEL 유도체의 유전체를 나타내며, 여기서 수직인 선은 KNU-141112-P5의 예측되는 aa 서열에 관한 1 aa 치환을 나타낸다. 도 3에서, 수직 점선은 마이너 DEL 특징 (S N-DEL2, S N-DEL5, 및 ORF3 C-DEL5)을 나타내는 반면, 갭 (gap)은 메이저 DEL 패턴 (S C-DEL5 플러스 ORF3 N-DEL70 및 ORF3 C-DEL88)을 나타낸다. S, ORF3 및 E에 대한 코딩영역 내의 변이 중, 대부분의 변화 (57.1 ~ 80.0%)가 주요 구조적 S 유전자 내에서 현저하게 나타났다. Nsp1, nsp4, nsp611, nsp1416, M 및 N 단백질은 고도로 보존적이며, 세포계대를 통해 변하지 않고 남아 있었다. 또한, 지시된 DEL 균주에서 아미노산 치환을 스패닝하는 KNU-141112의 각 유전체 영역은, 전통적인 시퀀싱 방법으로 개별적으로 시퀀싱되었다. 상응하는 DEL 바이러스의 변이된 시퀀스는 NGS에 의해 결정된 것들과 동일하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명은 비구조적 단백질과 S 글리코단백질이 KNU-141112 균주의 약독화에 기여할 수 있음을 제시한다.
PEDV의 2개의 오버랩핑된 ORF1a 및 ORF1b는 각각 4,117 및 2,681-아미노산 다단백질을 엔코딩하며, 이는 단백질분해에 의해 기능적 16 nsps로 잘라졌다. KNU-141112-S DEL2 내 총 6개 아미노산 변화가 nsp3, nsp5, nsp12, 및 nsp13를 포함하는 4개 nsp에 분포하였으며, 이는 KNU-141112-P5와 비교할 때 각각 개별적으로 3, 1, 1, 및 1 변이를 포함하였다. 모바이러스와 비교하여, KNU-141112-S DEL2/ORF3는 3개 및 1개 아미노산 변이를 nsp3 및 nsp5 내에 포함하였으며, 이는 S DEL2에 균등하게 존재하였다. KNU-141112-S DEL5 내에 5개 아미노산 치환이 nsp2, nsp3, nsp5 및 nsp13를 포함하는 4개 nsp에 분포하였으며, 이들은 각각 1, 1, 1, 및 2 변이를 포함하였다. 흥미롭게도, S DEL5/ORF3의 nsps 내 변이 패턴은 nsp2 내 한 개의 변이 (T1921)이 없는 것을 제외하고는 S DEL5 균주와 거의 동일하였다. PEDV는 ORF1a 내의 2개의 바이러스 프로테아제, 즉 ORF1a의 N-말단부를 프로세싱하는 파파인-유사 시스테인 프로테아제 (papain-like cysteine protease) PLpro (nsp3) 및 nsp4에서 nsp16의 절단에 관여하는 키모트립신-유사 프로테아제 (chymotrypsin-like protease) 3CLpro (nsp5)를 엔코딩한다 (Lee, 2015). 모든 4개의 세포-적응된 DEL 균주가 nsp3 (S1564F) 및 nsp5 (T3186I) 둘 모두 내에 공통적으로 1개의 변이를 포함하였다. 그러나, 나머지 2개의 변이 (I2178L 및 C2182F) nsp3는 S DEL2 및 S DEL2/ORF3 균주에서만 나타났다. PEDV ORF1b는 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 (RdRp; nsp12) 및 다기능성 헬리케이즈 단백질 (nsp13)을 포함하는 뉴클리에이즈 및 리플리케이스를 엔코딩하는 것으로 예측된다. 상기 nsp 변이의 나머지는 바이러스 RdRp nsp12 및 상기 헬리케이스 nsp13 내에서 종종 발견된다. 상기 S DEL2 균주는 독립적으로 각 nsp12 (K142N) 및 nsp13 (T1025I) 내에 1개의 변이를 포함하였으며, 이는 S DEL2/ORF3 내에는 존재하지 않았다. 이와 달리, S DEL5 및 S DEL5/ORF3 균주 모두 nsp13 내에 2개의 변이 (T1025I 및 A1165S)를 가졌다. 또한, pp 1ab를 생성하는 번역 과정에서 잠재적인 RFS 시그널인, PEDV 유전체 내의 ORF1a 및 ORF1b 접합부의 슬리퍼리 헵타머 시퀀스 (slippery heptamer sequence) (TTTAAAC) 및 후속하는 스템-루프 구조는 세포적 과정에서 완전하게 유지되었다. 이러한 결과를 고려할 때, 본 발명은 바이러스 프로테아제 및/또는 헬리케이스 내 아미노산의 변화가 KNU-141112의 병독성에 역할을 함을 제시한다.
KNU-141112-P5 모균주와 비교하여, 세포-적응된 DEL 균주에 의존하는 총 7, 8, 또는 10개 아미노산 변이를, 각각 구조 S, 악세서리 ORF3 및 구조 E 단백질을 엔코딩 하는 ORF2 내지 ORF4에서 각각 확인하였다 (표 2). 예상한 것과 같이, S는 구조 및 악세서리 단백질 중에서 가장 높은 변이율 (4 내지 8개 변화)을 나타냈다. 상기 S 단백질은 4개의 구조 도메인으로 구분될 수 있다: 추가로 2개의 서브도메인으로 분리되는 커다란 외부 도메인인 시그널 펩타이드, S1 및 S2, 막단백질 도메인, 및 짧은 카르복실말단 세포기질/바이러스-인터널 엔도도메인 (carboxylterminal cytosolic/virus-internal endodomain)으로 구분될 수 있다 (Lai et al., 2007). S 내에서의 아미노산 치환의 대부분은 토폴로지 도메인의 S1 및 S2 엑토도메인 내에 축적되었다. S DEL2 및 S DEL2/ORF3 균주는 S1 내에 각각 3 (I55K, K272T, 및 T383N) 및 4 (I55K, K272T, N381K, 및 T516I) 변이를 포함하였으며, 나머지 DEL 균주는 S1 내에 동일한 변이 (K272T 및 T383N)를 포함하였다. 흥미롭게도, 모든 세포-적응된 DEL 균주가 S2 영역 내에 2개의 (G888R 및 E1287) 변이만을 포함하였다. 스파이크의 스톡 (Stalk)을 구성하는 S2 서열이 S1 보다 더 보존적이기 때문에 (Lai et al., 2007; Lee et al., 2010), S2에서 확인된 이들 변이는 독특한 것이다. 또한, S 단백질은 바이러스 외피와 숙주세포막의 융합을 유도하고, 상기 막 융합 활성은 S2 단백질 내에 내재하는 소수성 시퀀스에 의해 부여되는 것으로 여겨진다 (Lai et al., 2007; Lee, 2015).
따라서, 세포배양적응 중에 발생하는 S2 내 아미노산 치환은 PEDV-특이적 CPE 형성을 포함하는 세포병리학에 기여할 수 있을 것이다. S의 세포질 도메인 내 2개의 추가적인 변이가 존재하였으며, 이는 단지 S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주에서만 공통적으로 발생하였다. PEDV의 S 단백질 내에서, 2개의 중성화 에피토프가 748 ~ 755 및 764 ~ 771의 아미노산 위치에서 확인되었다 (Sun et al., 2008). 이들 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기는 세포 계대 과정에서 변하지 않고 남아있었다. 상기 PEDV S 단백질은 심하게 글리코실화되고, 모바이러스 KNU-141112-P5 균주는 N-X-S/T로 정의되는 21개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 포함한다. 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. KNU-14111-P5의 S 단백질 내 예측된 N-글리코실화 부위는, 모든 DEL 균주에서 발견되는 N381K 또는 T383N가 원인이 되는 모바이러스 내 381 ~ 383 위치에서 N-글리코실화 시퀀스 N-S-T의 공통된 결실, 및 S DEL2-ORF3 균주 내에서 발견되는 T516I 변이가 원인이 되는 모바이러스 S 단백질 내 514 ~ 516 위치에서 시퀀스 N-I-T의 특정 결실을 제외하고, 세포-적응된 DEL 균주에서 거의 완전하게 보존되었다. PEDV ORF3는 이온채널단백질을 엔코딩 하는 것을 제시하였으며, ORF3 내의 170위치에서의 티로신 잔기는 이것의 칼륨 채널 활성에 중요하다 (Wang et al., 2012). 세포-적응된 DEL 균주는 동일한 위치에 변이가 없는 대신에 다른 위치에 1 또는 2개의 변화가 있었다: S DEL2 및S DEL5 균주는 ORF3 내 26 및 166 위치에 2개 변이 (D26Y 및N166S)를 포함하는 반면에, S DEL2/ORF3 및 S DEL5/ORF3 균주는 ORF3 내의 다른 위치에 단지 1개의 변이 (각각 K135S 또는 N166S)를 포함하였다. 마지막 상이한 (non-synonymous) 변화가 E 단백질 내에 존재하였으며, 모든 DEL 균주는 E 단백질 내에 P70S 치환을 포함하였다. M 및 N 단백질 코딩영역 내에서 어떠한 변이도 없었다.
베로세포 내에서 KNU-141112의 연속계대로부터 비롯된 뉴클레오티드의 변화의 가장 두드러진 특징은, 높은 계대 (최소 70 계대 이후) 바이러스에서 비정상적으로 작은 및/또는 큰 결실이 나타난 것이다. DEL 패턴의 제 1 모드는 S 유전자-코딩 영역에서의 짧은 6-nt 또는 15-nt 결실로서, S의 N-말단 내 각각 56 ~ 57 및 56 ~ 60 위치에 2-aa (S N-DEL2) 또는 이것의 연장된 5-aa (S N-DEL5) 결실을 초래하였다. 표준적인 G1a 균주와 비교하여, KNU-141112를 포함하는 G2 유행병 야생 균주의 S 유전자는, 구별되는 유전적 특징, 즉 각각 55/56 및 135/136 위치의 2개의 주목할 만한 4-aa 및 1-aa 삽입, 및 S의 160 및 161 위치에서의 2-aa 결실로 구성된, 삽입-결실 (S INDELs)로 인하여 9-nt (3-aa) 보다 더 길다 (Lee et al., 2010; Lee, 2015). 상기 S N-DEL2 및 S N-DEL5는 G2 야생 균주의 제 1 삽입 풋프린트에서 나타났고, 따라서 세포-적응된 균주의 S N-DEL 특징은 그 자체의 길이를 제외하고는 표준적인 G1a와 유사하였다. 두 번째는 S 및 ORF3의 유전자간 위치 (유전체 수준에서 24,771 ~ 24,8l6 위치)에서 커다란 46-nt 결실에 의한 콤비네이션 패턴이며, 이는 진정한 종결, 및 S와 ORF3의 개시에서의 오기능을 유도한다 (도 5). 그 결과, S의 대안적인 TGA 종결이 결실의 개시 직전에 마지막 T 시퀀스로부터 하류의 7째에서 발생하고, 이는 모바이러스와 비교하여 S의 2개 위치에서 2-aa 변이 (F1380H 및 E1381D)를 포함하는 5-aa 짧은 세포기질 도메인을 생성한다 (도 6A). 또한, ORF3에 대한 제 1 개시코돈의 손상으로 인해, 2가지 잠재적인 사건 중 어느 하나가 발생할 것으로 예상될 수 있었다: ORF3 발현의 훼손 또는 ORF3 발현을 위한 이것의 제 2 개시 코돈의 탐색. 전자의 경우는 그 결과로서 대응하는 단백질의 생성이 없을 것인 반면에, 후자의 경우는 결실된 영역으로부터 188 nt 하류에 존재하는 제 2 ATG 개시자의 사용을 촉진하여 70-aa 결실을 지닌 잠재적인 N-말단 절단된 ORF3 형태 (ORF3 N-DEL70)의 생산을 유도할 것이다 (도 6B). 제 3 타입은 ORF3 내 409 ~ 411 위치에서 GCT 뉴클레오티드를 TGC 종결 시퀀스로 치환하는 것인 일반적이지 않은 DEL이다 (유전체 레벨에서 25,202 ~ 25,204) (도 5). 이와 같은 변화가 예측된 종결 위치로부터 264 nt 상류에서의 미성숙한 종결을 초래하였으며, 이는 ORF3의 C-말단 내 88개 아미노산 잔기를 간접적으로 제거하였다 (ORF3 C-DEL88) (도 6B). 제 4 특징은 ORF3의 C-말단부 내 163 및 164 위치에서, 페닐알라닌 및 발린의 2개 잔기에 대한 유전자 코돈에 해당하는 마이너 3-nt 'TCG' 결실이다. 처음의 2개 문자는 페닐알리닌에 해당하는 'TTC '의 마지막 2개 밑줄친 부분에 위치하였으며, 마지막 문자는 발린에 대한 'GTT' 코돈의 처음 밑줄 친 부분에 관련된다. 이러한 변이가 리딩프레임시프트를 가져왔으나, 각각 페닐알라닌 및 발린에 대한 트리플릿의 남아있는 처음의 'T' 및 마지막 'TT'는 페닐알라닌에 대한 새로운 'TTT' 트리플릿을 생성하였고, 이는 ORF3의 164 위치의 다음 발린 잔기의 단일 손실과 이어서 추가의 변이를 일으키지 않는 변경된 프레임 시프트의 회복 (ORF3 C-DEL1)을 가져왔다 (도 5 및 6B). 끝으로, 본 발명의 전체 유전체 시퀀싱 데이터는 각 세포-적응된 균주의 정확한 DEL 패턴을 완전하게 확인하였다: KNU-141112-S DEL2 (단일 S N-DEL2), KNU-141112-S DEL5 (S N-DEL5 및 ORF3C-DEL1), KNU-141112-S DEL2/ORF3 (S N-DEL2, S C-DEL5/ORF3 N-DEL70 콤비네이션, 및 ORF3 C-DEL88), 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (S N-DEL5, S C-DEL5/ORF3 N-DEL70 콤비네이션, 및 ORF3 C-DEL1). 이들 자체의 DEL 패턴에 따르면, 상기 세포-적응된 DEL 균주들은 개별적으로 모바이러스 (S, 1386-aa; ORF3, 224-aa) 보다 다양한 형태의 짧은 길이를 갖는 S 및 ORF3 단백질을 엔코딩 할 것으로 예측되었다: KNU-141112-S DEL2 (S, 1384-aa; ORF3, 224-aa), KNU-141112-S DEL5 (S, 1381-aa; ORF3, 223-aa), KNU-141112-S DEL2/ORF3 (S, 1379-aa; ORF3, 66-aa), 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (S, 1376-aa; ORF3, 153-aa).
선행 결과 (Lee et al., 2010; Lee and Lee, 2014; Lee et al., 2014a,b; Lee et al., 2015; Lee, 2015)와 일치하여, 완전한 S 단백질-기초 계통유전학 트리는 PEDV 균주가 2개의 구별되는 유전형그룹 클러스터, G1 및 G2로 명확하게 구분 됨을 나타냈으며, 상기 클러스터는 1a, 1b, 2a 및 2b의 하위그룹으로 추가로 분류될 수 있었다 (도 7A). 도 7에서, TGEV의 완전한 게놈서열과 스파이크 단백질과 추정되는 유사한 영역이 각 패널 내에 외집단으로서 포함되었다. 다중-시퀀싱 정렬 ClustalX 프로그램으로 수행하고 계통유전학적인 트리를 정렬된 뉴클레오티드 서열로부터 근린결합법 (neighbor-joining method)으로 완성하였다. 각 가지의 숫자는 1,000 복제의 50% 보다 큰 부트스트랩 값을 나타낸다. 본 발명에서 제시된 균주명, 국가 및 동정 연도, GenBank accession 넘버, 및 유전자그룹 및 서브그룹을 표시하였다. 본 발명에서 확인된 모바이러스 KNU-141112-P5 및 세포-적응된 DEL 균주를 연속 원으로 표시하였다. 스케일 바는 뉴클레오티드 치환을 나타낸다. 모든 100 계대를 통해 세포-적응된 DEL 균주는, 모바이러스 및 최근 국내 야생 단리체와 함께 여전히 하위 그룹 G2b에 속하였으며, 이는 동일한 하위그룹을 지닌 인접한 클레이드 내의 신생의 북미형 균주와 함께 가장 밀접하게 클러스터링 되었다. S1 영역에 대한 후속하는 계통유전학적 분석은, S 유전자-기초 트리와 그룹핑 구조가 동일함을 나타냈다 (데이터를 제시하지 않음). 또한, 전체 유전체 시퀀스에 대한 계통유전학적인 분석은 KNU-141112 DEL 바이러스가 세계적으로 유행성인 균주와 동일한 클러스터 내로 그룹화 됨을 입증하였다 (도 7B).
실시예 3: 자돈의 실험 감염
PEDV의 높은 계대 유도체가 돼지에서 실험적으로 감소된 병원성을 보였으며, 약독화 또는 생백신에서 ORF3 영역 내에 커다란 결실이 존재하였고 (Park et al., 2008; Wang et al., 2012), 본 발명에서 확인된 제 2 및 제 3의 DEL 패턴 (ORF3 N-DEL70 및 ORF3 C-DEL88)(Park et al., 2008; Wang et al., 2012)이 KNU-141112의 병독성과 가장 밀접하게 관련되는 것으로 여겨졌다. 따라서, 세포-적응된 KNU-141112-S DEL2/ORF3 및 KNU-141112-S DEL5/ORF3 균주를 후속하는 동물실험에 사용하였다. 병독성 KNU-141112-P5 및 이것의 선택된 세포-적응된 균주의 자연 숙주에 대한 생체 내 효과의 평가 및 비교를 위해, 돼지 접종 실험을 수행하였다. 14마리의 자돈을 3 또는 4마리를 포함하는 4개 그룹으로 나누고, 모바이러스 KNU-141112-P5 (그룹 1), KNU-141112-S DEL2/ORF3 (그룹 2), 또는 KNU-141112-S DEL5/ORF3 (그룹 3)를 경구로 챌린징 하였으며, 나머지 3마리는 대조군으로서 세포배양배지를 접종하였다. 실험 수행 동안 임상징후를 매일 기록하고, 챌린지 이전 및 이후에 변 면봉을 수거하였다. 순응기간 중에, 모든 자돈은 활동적이었고, 정상적인 변 농도와 함께 어떠한 임상 징후도 없었으며, PEDV-특이적 RT-PCR에서 어떠한 자돈의 변 샘플에서도 PEDV 유전 물질이 검출되지 않았다. 챌린지 이후, 음성 대조군은 병원성 연구 전체에 걸쳐 전형적인 임상 징후를 보이지 않았으며, KNU-141112-P5-챌린지 자돈 (그룹 1)은 접종 1일 후 (DPI) 무기력 및 무른 변 (mean CSS of 0.33) (글자가 깨져 있습니다)의 임상 징후를 나타내고, 심각하게 수분이 많은 설사 및 이어지는 구토증세를 보였다 (mean CSS of > 3.0) (글자가 깨져 있습니다)(도 8A). 그룹 1의 접종 동물 모두 4 또는 5 DPI에서 PEDV-관련 사망이 있었다. 놀랍게도, 그룹 2 및 그룹 3의 세포-적응된 DEL 바이러스-접종된 자돈은 실험과정에서 PEDV-특이적 임상 징후 및 사망이 없었으며, 이는 대조군에 비견될 만 하였다. 그룹 1의 모든 접종된 자돈은 1 DPI에서 RT-PCR로 분석한 결과 29.88 (equivalent to 102.25 TCID50/㎖)의 평균 Ct 값으로 PEDV에 대해 양성이었으며, 사망 시까지 8.49 ~ 12.02 (105.17~105.74 TCID50/ml)의 Ct 범위의 증가하는 다량의 PEDV를 변에 쉐딩하였다 (도 8B). 비록 PEDV 변 쉐딩이 그룹 2 및 그룹 3의 모든 자돈에서도 2 DPI까지 각각 21.96 (103.54 TCID50/㎖) 및 30.11 (102.21 TCID50/㎖)로 기록되었으나, 이는 유사하게 4 DPI에서 최고점에 도달하고 이후 점차 감소하였으며, 전체 바이러스 쉐딩은 그룹 1의 동물과 비교할 때 현저하게 감소하여 실험 종료시까지 2개 그룹 각각에서 28.67 ~ 17.58 (102.45~104.26 TCID50/㎖) 및 31.77 ~ 21.33 (101.94~103.64 TCID50/㎖)의 광범위한 Ct 값 범위를 보였다. 음성대조군 돼지는 전체 실험기간 동안 정상 변과 함께 활동적이었으며 변에서 PEDV 쉐딩이 검출되지 않았다.
모바이러스 KNU-141112-P5-감염군의 모든 돼지를, 4 또는 5 DPI에서 사망 후 부검하였다. 다른 그룹의 전체 동물을 사후분석을 위해 실험 종료 시에 안락사 시켰다. 음성대조군 돼지에서는 육안 또는 현미경 관찰로 장 병변을 관찰 할 수 없었다. 병독성 KNU-141112-P5 균주로 접종한 모든 돼지가 전형적인 PED-유사 육안 병변을 보였다. 융모퇴화에 의해 소장이 확장되고 노란색의 유체가 축적되어 있었으며, 소장벽이 얇아지고 투명해졌다 (도 9). 위장이 부풀어 오르고, 응고되고 소화되지 않은 우유로 차있는 반면에, 다른 장기관은 육안으로는 정상으로 보였다. 이와 반대로, 그룹 2 및 그룹 3의 세포-적응된 KNU-141112-S DEL2-ORF3 또는 KNU-141112-S DEL5-ORF3로 감염시킨 모든 돼지는 음성대조군과 유사하게 위장기관에 어떠한 육안으로 눈에 띌만한 병리학적 병변을 갖고 있지 않았다. 그룹 1의 모든 사망한 자돈의 소장은 표면 상피세포의 공액을 지닌 소장 융모의 짧아짐 및 융합을 포함하여 급성 바이러스성 장염의 일반적인 특징을 나타냈다. 또한, IHC 염색으로 바이러스 항원이 소장의 모든 분절 내의 위축된 융모상의 상피세포의 세포질 내에서 현저하게 검출되었다 (도 10). 그러나, 그룹 2 및 그룹 3의 세포-적응된 바이러스 접종 돼지는 음성대조군과 유사한 정상의 조직병리학적 장 관찰결과를 제시하였다. 그룹 2 및 그룹 3 동물의 소장에는 바이러스가 매우 적거나 검출되지 않았다. 본 발명에 따르면, 두 개의 세포-적응된 KNU-141112-S DEL2-ORF3 및 KNU-141112-S DEL5-ORF3 균주가 실험적으로 접종된 자돈에서 약독화 된 표현형을 지닌 현저하게 약화된 병독성을 갖는 것으로 나타났다.
다음, 본 발명자들은 이들 약독화된 균주의 자연 숙주에서의 면역원성을 평가하였다. 돼지 항혈청을 면역화 이전 (pre-immune)에 수집하고, 각 바이러스를 사용한 최종 부스팅 후 2주째에 단리된 KNU-141112에 대한 이들의 중성화 활성을 테스트 하였다. 세포-적응된 KNU-141112-S DEL2-ORF3 또는 KNU-141112-S DEL5-ORF3 균주로 면역화한 돼지에서 수득한 혈청샘플은, 각각 1:64 및 1:128 보다 큰 평균 중성화 항체역가를 지녀 KNU-141112-P5 감염을 저해하는데 매우 효과적이었으며, 이는 모바이러스에 대한 돼지 항혈청에 견줄 만 하였다. 이와 반대로, 프리-이뮨 및 면역화 하지 않은 혈청 둘 모두 PEDV에 대한 중성화 활성을 보이지 않았다. 이 결과로부터, 본 발명은 세포-적응된 KNU-141112-S DEL2-ORF3 및 KNU-141112-S DEL5-ORF3 균주가 면역화된 동물에서 강력한 항체반응을 유도하고, 그 결과 PEDV 감염에 대해 강력한 방어적 면역력을 제공함을 제시한다.
본 발명의 약독화 된 균주는 돼지유행성설사바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)에 의한 돼지 감염을 예방, 치료 또는 예방 및 치료하기 위한 백신 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Choong Ang Vaccine Lab.
<120> A novel attenuated PEDV strain and a vaccine composition
comprising thereof
<130> CVA17P-0007-KR
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 27985
<212> DNA
<213> porcine epidemic diarrhea virus
<400> 1
acttaaagag attttctatc tacggatagt tagctctttt tctagactct tgtctactca 60
attcaactaa acgaaatttt gtccttccgg ccgcatgtcc atgctgctgg aagctgacgt 120
ggaatttcat taggtttgct taagtagcca tcgcaagtgc tgtgctgtcc tctagttcct 180
ggttggcgtt ccgtcgcctt ctacatacta gacaaacagc cttcctccgg ttccgtctgg 240
gggttgtgtg gataactagt tccgtctagt ttgaaaccag taactgtcgg ctatggctag 300
caaccatgtt acattggctt ttgccaatga tgcagaaatt tcagcttttg gcttttgcac 360
tgctagtgaa gccgtctcat actattctga ggccgccgct agtggattta tgcaatgccg 420
tttcgtgtcc ttcgatctcg ctgacactgt tgagggattg cttcccgaag actatgtcat 480
ggtggtggtc ggcactacca agcttagtgc gtatgtggac acttttggta gccgccccaa 540
aaacatttgt ggttggctgt tattttctaa ctgtaattac ttcctcgaag agttagagct 600
tacttttggt cgtcgtggtg gtaacatcgt gccagttgac caatacatgt gtggcgctga 660
cggtaaacct gttcttcagg aatccgaatg ggagtataca gatttctttg ctgactccga 720
agacggtcaa ctcaacattg ctggtatcac ttatgtgaag gcctggattg tagagcgatc 780
ggatgtctct tatgcgagtc agaatttaac atctattaag tctattactt actgttcaac 840
ctatgagcat acttttcctg atggtactgc catgaaggtt gcacgtactc caaagattaa 900
gaagactgtt gtcttgtctg agccacttgc tactatctac agggaaattg gttctccttt 960
tgtggataat gggagcgatg ctcgttctat cattaagaga ccagtgttcc tccacgcttt 1020
tgttaagtgt aagtgtggta gttatcattg gactgttggt gattggactt cctatgtctc 1080
cacttgctgt ggctttaagt gtaagccagt ccttgtggct tcatgctctg ctacgcctgg 1140
ttctgttgtg gttacgcgcg ctggtgctgg cactggtgtt aagtattaca acaacatgtt 1200
cctgcgccat gtggcagaca ttgatgggtt ggcattctgg cgaattctca aggtgcagtc 1260
caaagacgac ctcgcttgct ctggtaaatt ccttgaacac catgaggaag gtttcacaga 1320
tccttgctac tttttgaatg actcgagcat tgctactaag ctcaagtttg acatccttag 1380
tggcaagttt tctgatgaag tcaaacaagc tatctttgct ggtcatgttg ttgttggcag 1440
cgcgctcgtt gacattgttg acgatgcact gggacagcct tggtttatac gtaagcttgg 1500
tgaccttgca agtgcagctt gggagcagct taaggctgtc gttagaggcc ttaacctcct 1560
gtctgatgag gtcgtgctct ttggcaaaag acttagctgt gccactctta gtatcgttaa 1620
cggtgttttt gagttcatcg ccgaagtgcc tgagaagttg gctgcggctg ttacagtttt 1680
tgtcaacttc ttgaatgagc tttttgagtc tgcctgtgac tgcttaaagg tcggaggtaa 1740
aacctttaac aaggttggct cttatgttct ttttgacaac gcattggtta agcttgtcaa 1800
ggcaaaagtt cgcggcccac gacaggcagg tgtttgtgaa gttcgttaca caagccttgt 1860
tattgggagt actaccaagg tggtttccaa gcgcgttgaa aatgccaatg tgaatctcgt 1920
cgtcgttgac gaggatgtga ccctcaacac cactggtcgt acagttgttg ttgacggact 1980
tgcattcttc gagagtgacg ggttttacag acatcttgct gatgctgacg ttgtcattga 2040
acatcctgtt tataagtctg cttgtgagct caagccagtt tttgagtgtg acccaatacc 2100
tgattttcct atgcctgtgg ccgctagtgt tgcagagctt tgtgtgcaaa ctgatctgtt 2160
gcttaaaaat tacaacactc cttataaaac ttacagctgc gttgtgagag gtgataagtg 2220
ttgcatcact tgcaccttac atatcacagc accaagttat atggaggatg ctgctaattt 2280
tgtagacctc tgtaccaaga acattggtac tgctggtttt catgagtttt acattacggc 2340
ccatgaacaa caggatctgc aagggttcgt aaccacttgt tgcacgatgt caggttttga 2400
gtgttttatg cctataatcc cacagtgtcc agcagtgctt gaagagattg atggtggtag 2460
catctggcgg tcttttatca ctggtcttaa tacaatgtgg gatttttgca agcatcttaa 2520
agtcagcttt ggactagatg gcattgttgt cactgtagca cgcaaattta aacgacttgg 2580
tgctctcttg gcagaaatgt ataacactta cctttcaact gtggtggaaa acttggtact 2640
ggccggtgtt agcttcaagt attatgccac cagtgtccca aaaattgttt tgggctgttg 2700
ttttcacagt gttaaaagtg ttcttgcaag tgccttccag attcctgtcc aggcaggcat 2760
tgagaagttt aaagtcttcc ttaactgtgt tcaccctgtt gtaccacgcg tcattgaaac 2820
ttcttttgtg gaattagaag agacgacatt taaaccacca gcactcaatg gtagtattgc 2880
tattgttgat ggctttgctt tctattatga tggaacacta tactatccaa ccgatggtaa 2940
tagtgttgtg cctatttgtt ttaagaagaa gggtggtggt gatgtcaaat tctctgatga 3000
agtctctgtt agaaccattg acccagttta taaggtctcc cttgaatttg agttcgagtc 3060
tgagactatt atggctgtgc ttaataaggc tgttggtaat cgtatcaagg ttacaggtgg 3120
ttgggacgat gttgttgagt atatcaacgt tgccattgag gttcttaaag atcatatcga 3180
tgtgcctaag tactacatct atgatgagga aggtggcacc gatcctaatc ttcccgtaat 3240
ggtttctcag tggccgttga atgatgacac gatctcacag gatctgcttg atgtggaagt 3300
tgttactgat gcaccaattg atttcgaggg tgatgaagta gactcctctg accctgataa 3360
ggtggcagat gtggctaact ctgagcctga ggatgatggt cctaatgtag ctcctgaaac 3420
aaatgtagag tctgaagttg aggaagttgc cgcaaccttg tcttttatta aagatacacc 3480
ttccacagtt actaaggatc cttttgcttt tgactttgca agctatggag gacttaaggt 3540
tttaagacaa tctcataaca actgctgggt tacttctacc ttggtgcagc tacaattgct 3600
tggcatcgtt gatgaccctg caatggagct ttttagtgct ggtagagttg gtccaatggt 3660
tcgcaaatgc tatgagtcac aaaaggctat cttgggatct ttgggtgatg tgtcggcttg 3720
cctagagtct ctgactaagg acctacacac acttaagatt acctgttctg tagtctgtgg 3780
ttgtggtact ggtgaacgta tctatgaggg ttgtgctttt cgtatgacgc caactttgga 3840
accgttccca tatggtgctt gtgctcagtg tgctcaagtt ttgatgcaca cttttaaaag 3900
tattgttggc accggcatct tttgtcgaga tactactgct ctctccttgg attctttggt 3960
tgtaaaacct ctttgtgcgg ctgcttttat aggcaaggac agtggtcatt atgtcactaa 4020
cttttatgat gctgctatgg ctattgatgg ttatggtcgt catcagataa agtatgacac 4080
actgaacact atttgtgtta aagacgttaa ttggacagca ccttttgtcc cagacgttga 4140
gcctgtattg gagcctgttg tcaaaccgtt ctattcttat aagaatgttg atttttacca 4200
aggagatttt agtgaccttg ttaaacttcc atgtgacttt gttgttaatg ctgcaaatga 4260
gaatttgtct cacggtggcg gcatagcaaa ggccattgat gtttatacca agggcatgtt 4320
gcagaagtgc tcgaatgatt acattaaagc acacggtccc attaaagttg gacgtggtgt 4380
catgttggag gcattaggtc ttaaggtctt taatgttgtt ggtccacgta agggtaagca 4440
tgcacctgag cttcttgtta aggcttataa gtccgttttt gctaattcag gtgttgctct 4500
tacacctttg attagtgttg gaatttttag tgttcctttg gaagaatctt tatctgcttt 4560
tcttgcatgt gttggtgatc gccactgtaa gtgcttttgt tatagtgaca aagagcgcga 4620
ggcgatcatt aattacatgg atggcttggt agatgctatt ttcaaagatg cacttgttga 4680
tactactcct gtccaggaag atgttcaaca agtttcacaa aaaccagttt tgcctaattt 4740
tgaacctttc aggattgaag gtgctcatgc tttctatgag tgcaaccctg aaggtttgat 4800
gtcattaggt gctgacaagc tggtgttgtt tacaaattcc aatttggatt tttgtagcgt 4860
tggtaagtgt cttaacaatg tgactggcgg tgcattgctt gaagccataa atgtatttaa 4920
aaagagtaac aaaacagtgc ctgctggcaa ctgtgttact tttgagtgtg cagatatgat 4980
ttttattact atggtagtat tgccatctga cggtgatgct aattatgaca aaaattatgc 5040
acgcgccgtc gtcaaggtat ctaagcttaa aggcaagtta ttgcttgctg ttggtgatgc 5100
catgttgtat tccaagttgt cccacctcag cgtgttaggt ttcgtatcca cacctgatga 5160
tgtggagcgt ttctacgcaa ataagagtgt ggttattaaa gttactgagg atacacgtag 5220
tgttaagact gttaaagtag aatccactgt tacttatgga caacaaattg gaccttgtct 5280
tgttaatgac accgttgtca cagacaacaa acctgttgtt gctgatgttg tagctaaggt 5340
tgtaccaagt gctaattggg attcacatta tggttttgat aaggctggtg agttccacat 5400
gctagaccat actgggtttg cctttcctag tgaagttgtt aacggtaggc gtgtgcttaa 5460
aaccacagat aataactgtt gggttaatgt tacatgttta caattacagt ttgctagatt 5520
taggttcaag tcagcaggtc tacaggctat gtgggagtcc tattgtactg gtgatgttgc 5580
tatgtttgtg cattggttgt actggcttac tggtgttgac aaaggtcagc ctagtgattc 5640
agaaaatgca cttaacatgt tgtctaagta cattgttcct gctggttctg tcactattga 5700
acgtgtcacg catgacggtt gttgttgtag taagcgtgtt gtcactgcac cagttgtgaa 5760
tgctagcgtg ttgaagcttg gcgtcgagga tggtctttgt ccacatggtc ttaactacat 5820
tgacaaagtt gttgtagtta aaggtactac aattgttgtc aatgttggaa aacctgtagt 5880
ggcaccatcg cacctctttc ttaagggtgt ttcctacaca acattcctag ataatggtaa 5940
cggtgttgcc ggccattata ctgtttttga tcatgacact ggtatggtgc atgatggaga 6000
tgtttttgta ccaggtgatc tcaatgtgtc tcctgttaca aatgttgtcg tctcagagca 6060
gacggctgtt gtgattaaag accctgtgaa gaaagtagag ttagacgcta caaagctgtt 6120
agacactatg aattatgcat cggaaagatt cttttccttt ggtgatttta tgtcacgtaa 6180
tttaattaca gtgtttttgt acatccttag tattttgggt ctctgtttta gggcctttcg 6240
taagagggat gttaaagttc tagctggtgt accccaacgt actggtatta tattgcgtaa 6300
aagtgtgcgc tataatgcaa aggctttggg tgtcttcttc aagctaaaac tttattggtt 6360
caaagttctt ggtaagttta gtttgggtat ttatgcattg tatgcattac tattcatgac 6420
aatacgcttt acacctatag gtggccctgt ttgtgatgat gttgttgctg gttatgctaa 6480
ttctagtttt gacaagaatg agtattgcaa cagtgttatt tgtaaggtct gtctctatgg 6540
gtaccaggaa ctttcggact tctctcacac acaggtagta tggcaacacc ttagagaccc 6600
attaattggt aatgtgatgc ctttctttta tttggcattt ctggcaattt ttgggggtgt 6660
ttatgtaaag gctattactc tctattttat tttccagtat cttaacatac ttggtgtgtt 6720
tttgggccta caacagtcca tttggttttt gcagcttgtg ccttttgatg tctttggtga 6780
cgagatcgtc gtctttttca tcgttacacg cgtattgatg ttccttaagc atgttttcct 6840
tggctgcgat aaggcatctt gtgtggcttg ctctaagagt gctcgcctta agcgcgttcc 6900
tgtccagact atttttcagg gtactagcaa atccttctac gtacatgcca atggtggttc 6960
taagttctgt aagaagcaca atttcttttg tttaaattgt gattcttatg gtccaggctg 7020
cacttttatt aatgacgtca ttgcaactga agttggtaat gttgtcaaac ttaatgtgca 7080
accgacaggt cctgccacta ttcttattga caaggttgaa ttcagtaatg gtttttacta 7140
tctttatagt ggtgacacat tttggaagta caactttgac ataacagata acaaatacac 7200
ttgcaaagag tcacttaaaa attgtagcat aatcacagac tttattgttt ttaacaataa 7260
tggttccaat gtaaatcagg ttaagaatgc atgtgtgtat ttttcacaga tgctttgtaa 7320
acctgttaag ttagtggact cagcgttgtt ggccagtttg tctgttgatt ttggtgcaag 7380
cttacatagt gcttttgtta gtgtgttgtc gaatagtttt ggcaaagacc tgtcaagttg 7440
taatgacatg caggattgca agagcacatt gggttttgat gatgtaccat tggatacctt 7500
taatgctgct gttgctgagg ctcatcgtta cgatgtcctc ttgactgaca tgtcgttcaa 7560
caattttacc accagttatg caaaaccaga ggaaaaactt cccgtccatg acattgccac 7620
gtgtatgcgt gtaggtgcca agattgttaa tcataacgtt cttgtcaagg atagtatacc 7680
tgtggtgtgg cttgtacgtg atttcattgt cctttctgaa gaaactagga agtacattat 7740
tcgtacgact aaagttaagg gtataacctt catgttgacc tttaatgatt gtcgtatgca 7800
tactaccata cctactgttt gcattgcaaa taagaagggt gcaggtcttc ctagtttttc 7860
aaaggttaag aaattcttct ggtttttgtg tctgttcata gttgctgttt tctttgcact 7920
aagctttttt gattttagta ctcaggttag cagtgatagt gattatgact tcaagtatat 7980
tgagagtggc cagttgaaga cttttgacaa tccacttagt tgtgtgcata atgtctttag 8040
taacttcgac cagtggcatg atgccaagtt tggtttcacc cccgtcaaca atcctagttg 8100
tcctatagtc gttggtgtat cagacgaagc gcgcactgtt ccaggtatcc cagcaggtgt 8160
ttatttagct ggtaaaacac ttgtttttgc tattaacacc atttttggta catctggttt 8220
gtgctttgat gctagtggcg ttgctgataa gggcgcttgc atttttaatt cggcttgcac 8280
cacattatct ggtttgggtg gaactgctgt ctactgttat aagaatggtc tagttgaagg 8340
tgctaaactt tatagtgagt tggcacctca tagctactat aaaatggtag atggtaatgc 8400
tgtgtcttta cctgaaatta tctcacgcgg ctttggcatc cgtactatcc gtacaaaggc 8460
tatgacctac tgtcgcgttg gccagtgtgt gcaatctgca gaaggtgttt gttttggcgc 8520
cgatagattc tttgtctata atgcagaatc tggttctgac tttgtttgtg gcacagggct 8580
ctttacattg ttgatgaacg ttattagtgt tttttccaag acagtaccag taactgtgtt 8640
gtctggtcaa atacttttta attgcattat tgcttttgct gctgttgcgg tgtgtttctt 8700
atttacaaag tttaagcgca tgttcggtga tatgtctgtt ggcgttttca ctgtcggtgc 8760
ttgtactttg ttgaacaatg tttcctacat tgtaacacag aacacacttg gcatgttggg 8820
ctatgcaact ttgtactttt tgtgcactaa aggtgttaga tatatgtgga tttggcattt 8880
gggatttttg atctcatata tacttattgc accatggtgg gttttgatgg tttatgcctt 8940
ttcagccatt tttgagttta tgcctaacct ttttaagctt aaggtttcaa cacaactttt 9000
tgagggtgac aagttcgtag gctcttttga aaatgctgca gcaggtacat ttgtgcttga 9060
tatgcatgcc tatgagagac ttgccaactc tatctcaact gaaaaactgc gtcagtatgc 9120
tagtacttac aataagtaca agtattattc aggcagtgct tcagaggctg attacaggct 9180
tgcttgtttt gcccatttgg ccaaggctat gatggattat gcttctaatc acaacgacac 9240
gttatacaca ccacccactg tgagttacaa ttcaactcta caggctggct tgcgtaagat 9300
ggcacaacca tctggtgttg ttgagaagtg catagttcgt gtttgctatg gtaatatggc 9360
tcttaatggc ctatggcttg gtgatactgt tatctgccca cgccatgtta tagcgtctag 9420
tactactagc actatagatt atgactatgc cctttctgtt ttacgcctcc acaacttctc 9480
catttcatct ggtaatgttt tcctaggtgt tgtgggtgta accatgcgag gtgctttgtt 9540
gcagataaag gttaatcaaa acaatgtcca cacgcctaag tacacctatc gcacagttag 9600
accgggtgaa tcttttaata tcttggcgtg ctatgatggt tctgcagctg gtgtttacgg 9660
cgttaacatg cgctctaatt acactattag aggctcgttc attaatggcg cttgtggttc 9720
acctggttat aacattaaca atggtaccgt tgagttttgc tatttacacc agcttgaact 9780
tggttcaggc tgtcatgttg gtagcgactt agatggtgtt atgtatggtg gttatgagga 9840
ccaacctatt ttgcaagttg aaggcgctag tagtctgttt acagagaatg tgttggcatt 9900
tctttatgca gcactcatta atggttctac ctggtggctt agttcttcta ggattgctgt 9960
agacaggttt aatgagtggg ctgttcataa tggtatgaca acagtagtta atactgattg 10020
cttttctatt cttgctgcta agactggtgt tgatgtacaa cgtttgttgg cctcaatcca 10080
gtctctgcat aagaattttg gtggaaagca aattcttggc tatacctcgt tgacagatga 10140
gtttactaca ggtgaagtta tacgtcaaat gtatggcgtt aatcttcaga gtggttatgt 10200
ttcacgcgcc tgtagaaatg tcttgctggt tggttctttt ctgactttct tttggtcaga 10260
attagtttcc tacactaagt tcttttgggt aaatcctggt tatgtcacac ctatgtttgc 10320
gtgtttgtca ttgctgtcct cacttttgat gttcacactc aagcataaga cattgttttt 10380
ccaggtcttt ctaatacctg ctctgattgt tacatcttgc attaatttgg catttgatgt 10440
tgaagtctac aactatttgg cagagcattt tgattaccat gtttctctca tgggttttaa 10500
tgcacaaggt cttgttaaca tctttgtctg ctttgttgtt accattttac acggcacata 10560
cacatggcgc ttttttaaca cacctgtgag ttctgtcact tatgtggtag ctttgctgac 10620
tgcggcatat aactattttt acgctagtga cattcttagt tgtgctatga cactatttgc 10680
tagtgtgact ggcaactggt tcgttggtgc tgtttgttat aaagctgctg tttatatggc 10740
cttgagattt cctacttttg tggctatttt tggtgatatt aagagtgtta tgttctgtta 10800
ccttgtgttg ggttatttta cctgttgctt ctacggtatt ctctactggt tcaacaggtt 10860
ttttaaggtt agtgtaggtg tctatgacta tactgttagt gctgctgagt ttaagtatat 10920
ggttgctaac ggcctacgtg caccaactgg aacacttgat tcactacttc tgtctgccaa 10980
attgattggt attggtggtg agcggaatat taagatttct tccgttcagt ctaaactgac 11040
tgatattaag tgtagtaacg ttgtgctttt aggctgtctc tctagcatga atgtctcagc 11100
aaattcaaca gaatgggcct attgtgttga cttgcataac aagatcaact tgtgtaatga 11160
cccagaaaaa gcgcaggaaa tgctacttgc tttgttggca tttttcctta gtaagaatag 11220
tgcttttggt ttagatgact tattggaatc ctattttaat gacaatagta tgttgcagag 11280
tgttgcatct acttatgtcg gtttgccttc ttatgtcatt tatgaaaatg cacgccaaca 11340
gtatgaagat gctgttaata atggttctcc acctcagttg gttaagcaat tgcgccatgc 11400
catgaatgta gcaaagagcg aatttgaccg tgaggcttct actcagcgta agcttgatag 11460
aatggcggaa caggctgcag cacagatgta caaagaggca cgagcagtta ataggaagtc 11520
caaagttgta agtgctatgc attcactgct ttttggtatg ttgagacgtt tggacatgtc 11580
ttctgtagac accattctca acttggcaaa ggatggggtt gtacctctgt ctgtcatacc 11640
ggcagtcagt gctactaagc ttaacattgt tacttctgat atcgattctt ataatcgtat 11700
ccagcgtgag ggatgtgtcc actacgctgg taccatttgg aatataattg atatcaagga 11760
caatgatggc aaggtggtac acgttaagga ggtaaccgca cagaatgctg agtccctgtc 11820
atggcccctg gtccttgggt gtgagcgtat tgtcaagctc cagaataatg aaattattcc 11880
tggtaagctg aagcagcgct ccattaaggc agaaggagat ggcatagttg gagaaggtaa 11940
ggcactttac aataatgagg gtggacgtac ttttatgtat gctttcatct cggacaaacc 12000
ggacctgcgt gtagtcaagt gggagttcga tggtggttgt aacactattg agctagaacc 12060
accacgtaag ttcttggtgg attctcctaa tggtgcacag atcaagtatc tctactttgt 12120
tcgtaacctt aacacgttac gtaggggtgc tgttctcggc tacataggtg ccactgtacg 12180
cttgcaggct ggtaaacaaa cagaacaggc tattaactct tcattgttga cactttgcgc 12240
tttcgctgtg gatcctgcta agacctacat cgatgctgtc aaaagtggtc acaaaccagt 12300
aggtaactgt gttaagatgt tggccaatgg ttctggtaat ggacaagctg ttactaatgg 12360
tgtggaggct agtactaacc aggattcata cggtggtgcg tccgtgtgtc tatattgtag 12420
agcacatgtt gagcatccat ctatggatgg tttttgcaga ctgaaaggca agtacgtaca 12480
ggttccacta ggtacagtgg atcctatacg ttttgtactt gagaatgacg tttgcaaggt 12540
ttgtggttgt tggctggcta atggctgcac ttgtgacaga tccattatgc aaagcactga 12600
tatggcttat ttaaacgagt acggggctct agtgcagctc gactagagcc ctgtaacggt 12660
actgatacac aacatgtgta tcgtgctttt gacatctaca acaaggatgt tgcttgtcta 12720
ggtaaattcc tcaaggtgaa ctgtgttcgc ctgaagaatt tggataagca tgatgcattc 12780
tatgttgtca aaagatgtac caagtctgcg atggaacacg agcaatccat ctatagcaga 12840
cttgaaaagt gtggagccgt agccgaacac gatttcttca cttggaagga tggtcgtgcc 12900
atctatggta acgtttgtag aaaggatctt accgagtata ctatgatgga tttgtgttac 12960
gctttacgta actttgatga aaacaattgc gatgttctta agagcatttt aattaaggta 13020
ggcgcttgtg aggagtccta cttcaataat aaagtctggt ttgaccctgt tgaaaatgaa 13080
gacattcatc gtgtctatgc attgttaggt accattgttt cacgtgctat gcttaaatgc 13140
gttaagttct gtgatgcaat ggttgaacaa ggtatagttg gtgttgtcac attagataat 13200
caggatctta atggtgattt ttatgatttt ggtgatttta cttgtagcat caagggaatg 13260
ggtataccca tttgcacatc atattactct tatatgatgc ctgttatggg tatgactaat 13320
tgccttgcta gtgagtgttt tgttaagagt gatatatttg gtgaggattt caagtcatat 13380
gacctgctgg aatatgattt cacggagcat aagacagcac tcttcaacaa gtatttcaag 13440
tattggggac tgcaatacca ccctaactgt gtggactgca gtgatgagca gtgcatagtt 13500
cactgtgcca acttcaatac gttgttttcc actactatac ctattacggc atttggacct 13560
ttgtgtcgca agtgttggat tgatggtgtt ccactggtaa ctacagctgg ttatcatttt 13620
aaacagttag gtatagtttg gaacaatgac ctcaacttac actctagcag gctctctatt 13680
aacgaattac tccagttttg tagtgatcct gcattgctta tagcatcatc accagccctt 13740
gttgatcagc gtactgtttg cttttcagtt gcagcgctag gtacaggtat gactaaccag 13800
actgttaaac ctggccattt caataaggag ttttatgact tcttacttga gcaaggtttc 13860
ttttctgagg gctctgagct tactttaaag cacttcttct ttgcacagaa gggtgatgca 13920
gctgttaagg attttgacta ctataggtat aatagaccta ctgttctgga catttgccaa 13980
gctcgcgtcg tgtatcaaat agtgcaacgc tattttgata tttacgaagg tggttgtatc 14040
actgctaaag aggtggttgt tacaaacctt aacaagagcg caggttatcc tttgaacaag 14100
tttggtaaag ctggtcttta ctatgagtct ttatcctatg aggaacagga tgaactttat 14160
gcttatacta agcgtaacat cctgcccact atgacacagc tcaaccttaa atatgctata 14220
agtggcaaag aacgtgcacg cacagtgggt ggtgtttcgc ttttgtcaac catgactact 14280
cggcagtatc atcagaaaca ccttaagtcc atagttaata ctaggggcgc ttcggttgtt 14340
attggtacta ctaagtttta tggtggttgg gacaatatgc ttaagaacct tattgatggt 14400
gttgaaaatc cgtgtcttat gggttgggac tacccaaagt gcgacagagc actgcccaat 14460
atgatacgta tgatttcagc catgatttta ggctctaagc acaccacatg ctgcagttcc 14520
actgaccgct ttttcaggtt gtgcaatgaa ttggctcaag tccttactga ggttgtttat 14580
tctaatggag gtttttattt gaagccaggt ggtactacct ctggtgatgc aaccaccgca 14640
tatgcaaact cagtttttaa tatcttccaa gcagtaagtg ccaatgttaa caaacttctt 14700
agtgttgaca gcaatgtctg tcataattta gaagttaagc aattgcagcg taagctttat 14760
gagtgctgtt atagatcaac taccgtcgat gaccagttcg tcgttgagta ttatggttac 14820
ttgcgtaaac atttttcaat gatgattctt tctgatgatg gcgttgtttg ttataacaat 14880
gactatgcat cacttggtta tgtcgctgat cttaacgcat tcaaggctgt tttgtattac 14940
cagaacaatg tcttcatgag cgcctctaaa tgttggatcg agcctgacat taataaaggt 15000
cctcatgaat tttgctcgca gcatactatg cagattgtcg ataaagatgg tacttattac 15060
cttccttacc ctgatccttc aagaattctc tctgcaggtg tgtttgttga tgacgttgtt 15120
aaaactgatg cagttgtatt gcttgaacgt tatgtgtcat tggctataga tgcctacccg 15180
ttatctaagc atgaaaaccc tgaatataag aaggtgtttt atgtgctttt ggattgggtt 15240
aagcatctgt acaaaactct taatgctggt gtgttagagt ctttttctgt cacacttttg 15300
gaagattcta ctgctaaatt ctgggatgag agcttttatg ccaacatgta tgagaaatct 15360
gcagttttac aatctgcagg gctttgtgtt gtttgtggct ctcaaactgt tttacgttgt 15420
ggtgattgtt tacggcgtcc tatgctttgt actaagtgtg cttatgatca tgtcattgga 15480
acaactcaca agttcatttt ggccatcact ccatatgtgt gttgtgcttc agattgtggt 15540
gtcaatgatg taactaagct ctacttaggt ggtcttagtt attggtgtca tgaccacaag 15600
ccacgtcttg cattcccgtt gtgctctgct ggtaatgttt ttggcttgta caaaaattct 15660
gctaccggct cacccgatgt tgaagacttt aatcgcattg ctacatccga ttggactgat 15720
gtttctgact acaggttggc aaatgatgtc aaggactcat tgcgtctgtt tgcagcggaa 15780
actatcaagg ccaaggagga gagcgttaag tcatcctatg cttgtgcaac actacatgag 15840
gttgtaggac ctaaagagtt gttgctcaaa tgggaagtcg gcagacccaa accacccctt 15900
aatagaaatt cggttttcac ttgttatcat ataacgaaga acaccaaatt tcaaatcggt 15960
gagtttgtgt ttgagaaggc agaatatgat aatgatgctg taacatataa aactaccgcc 16020
acaacaaaac ttgttcctgg catggttttt gtgcttacct cacataatgt tcagccattg 16080
cgcgcaccga ccattgctaa tcaagaacgt tattccacta tacataagtt gcatcctgct 16140
tttaacatac ctgaagctta ttctagctta gtgccctatt accaattgat tggtaagcag 16200
aagattacaa ctattcaggg acctcccggt agtggtaaat ctcactgtgt tatagggcta 16260
ggtttgtact atccaggtgc acgtatagtg tttacagctt gttctcatgc agcggtcgat 16320
tcactttgtg tgaaagcttc cactgcttat agcaatgaca aatgttcacg catcatacca 16380
cagcgcgctc gtgttgagtg ttatgatggt ttcaagtcta ataatactag tgctcagtac 16440
cttttctcta ctgtcaatgc tttgccagag tgcaatgcgg acattgttgt ggtggatgag 16500
gtctctatgt gcactaatta tgacttgtct gtcataaatc agcgcatcag ctataggcat 16560
gtagtctatg ttggtgaccc tcaacagctg cctgcaccac gtgttatgat ttcacgtggt 16620
actttggaac caaaggacta caacgttgtc actcaacgca tgtgtgccct taagcctgat 16680
gttttcttgc acaagtgtta tcgctgtcct gctgagatag tgcgtactgt gtctgagatg 16740
gtctatgaaa accaattcat tcctgtgcac ccagatagca agcagtgttt taaaatcttt 16800
tgcaagggta atgttcaggt tgataatggt tcaagcatta atcgcaggca attggatgtt 16860
gtgcgtatgt ttttggctaa aaatcctagg tggtcaaagg ctgtttttat ttctccttat 16920
aacagccaga attatgttgc cagccgcatg ctaggtctac aaattcagac agttgactca 16980
tcccagggta gtgagtatga ctatgtcatt tacacacaaa cttcagatac tgcccatgcc 17040
tgtaatgtta acaggtttaa tgttgccatc acaagggcca agaaaggcat attatgtata 17100
atgtgcgata ggtccctttt tgatgtgctt aaattctttg agcttaaatt gtctgatttg 17160
caggctaatg agggttgtgg tctttttaaa gactgtagca gaggtgatga tctgttgcca 17220
ccatctcacg ctaacacctt catgtcttta gcggacaatt ttaagactga tcaagatctt 17280
gctgttcaaa taggtgttaa tggacccatt aaatatgagc atgttatctc gtttatgggt 17340
ttccgttttg atatcaacat acccaaccat catactctct tttgcacacg cgactttgcc 17400
atgcgcaatg ttagaggttg gttaggcttt gacgttgaag gagcacatgt tgttggctct 17460
aacgtcggta caaatgtccc attgcaatta gggttttcta acggtgttga ttttgttgtc 17520
agacctgaag gttgcgttgt aacagagtct ggtgactaca ttaaacccgt cagagctcgt 17580
gctccaccag gggaacaatt cgcacacctt ttgcctttac ttaaacgcgg ccaaccatgg 17640
gatgttgtcc gcaaacgtat agtgcagatg tgtagtgact acctggccaa cctatcagac 17700
atactaattt ttgtgttgtg ggctggtggt ttggagttga caactatgcg ttattttgtc 17760
aagattggac caagtaagag ttgtgattgt ggtaaggttg ctacttgtta caatagtgcg 17820
ctgcatacgt actgttgttt caaacatgcc cttggttgtg attatctgta taacccatac 17880
tgtattgata tacagcagtg gggatacaag ggatcactta gccttaacca ccatgagcat 17940
tgtaatgtac atagaaacga gcatgtggct tctggtgatg ccataatgac tcgctgtctg 18000
gccatacatg attgctttgt caagaacgtt gactggtcca tcacataccc atttattggt 18060
aatgaggctg ttattaataa gagcggccga attgtgcaat cacacactat gcggtcagtt 18120
cttaagttat acaatccgaa agccatatat gatattggca atcctaaggg cattagatgt 18180
gccgtaacgg atgctaagtg gttttgcttt gacaagaatc ctactaattc taatgtcaag 18240
acattggagt atgactatat aacacatggc caatttgatg ggttgtgctt gttttggaat 18300
tgcaatgtag acatgtatcc agaattttct gtggtctgtc gttttgatac tcgctgtagg 18360
tcaccactca acttggaggg ttgtaatggt ggttcactgt atgttaataa tcatgcattc 18420
catacaccgg cttttgacaa gcgtgctttt gctaagttga agccaatgcc atttttcttt 18480
tatgatgata ctgagtgtga caagttacag gactccataa actatgttcc tcttagggct 18540
agtaactgca ttactaaatg taatgttggt ggtgctgtct gtagtaagca ttgtgctatg 18600
tatcatagct atgttaatgc ttacaacact tttacgtcgg cgggctttac tatttgggtg 18660
cctacttcgt ttgacaccta taatctgtgg cagacattta gtaacaattt gcaaggtctt 18720
gagaacattg ctttcaatgt cgtaaagaaa ggatcttttg ttggtgccga aggtgaactt 18780
cctgtagctg tggttaatga caaagtgctc gttagagatg gtactgttga tactcttgtt 18840
tttacaaaca agacatcact acccactaac gtagcttttg agttgtatgc caagcgtaag 18900
gtaggactca ccccacccat tacgatccta cgtaacttgg gtgtagtttg tacatctaag 18960
tgtgtcattt gggactatga agccgaacgt ccacttacta cttttacaaa ggatgtttgt 19020
aaatataccg actttgaggg tgacgtctgt acactctttg ataacagcat tgttggttca 19080
ttagagcgat tctccatgac ccaaaatgct gtgcttatgt cacttacagc tgttaaaaag 19140
cttactggca taaagttaac ttatggttat cttaatggtg tcccagttaa cacacatgaa 19200
gataaacctt ttacttggta tatttacact aggaagaacg gcaagttcga ggaccatcct 19260
gatggctatt ttacccaagg tagaacaacc gctgatttta gccctcgtag cgacatggaa 19320
aaggacttcc taagtatgga tatgggtctg tttattaaca agtacggact tgaagattac 19380
ggctttgagc acgttgtgta tggtgatgtt tcaaaaacca cccttggtgg tttgcatcta 19440
ctaatttcgc aggtgcgtct ggcctgtatg ggtgtgctca aaatagacga gtttgtgtct 19500
agtaatgata gcacgttaaa gtcttgtact gttacatatg ctgataaccc tagtagtaag 19560
atggtttgta cgtatatgga tctcctgctt gacgattttg tcagcattct taaatctttg 19620
gatttgggcg ttgtatctaa agttcatgaa gttatggtcg attgtaaaat gtggaggtgg 19680
atgttgtggt gtaaggatca taaactccag acattttatc cgcaacttca ggccagtgaa 19740
tggaagtgtg gttattccat gccttctatt tacaagatac aacgtatgtg tttagaacct 19800
tgcaatctct acaactatgg tgctggtatt aagttacctg atggcattat gtttaacgta 19860
gttaaataca cacagctttg tcaatatctc aatagcacca caatgtgtgt accccatcac 19920
atgcgtgtgc tacatcttgg tgctggctcc gacaagggtg ttgcacctgg cacggctgtc 19980
ttacgacgtt ggttgccact ggatgccatt atagttgaca atgatagtgt ggattacgtt 20040
agcgatgctg attatagtgt tacaggagat tgctctacct tatacctgtc agataagttt 20100
gatttagtta tatctgatat gtatgatggt aagattaaaa gttgtgatgg ggagaacgtg 20160
tctaaagaag gcttctttcc ctatattaat ggtgtcatca ccgaaaagtt ggcacttggt 20220
ggtactgtag ctattaaggt gacggagttt agttggaata agaagttgta tgaactcatt 20280
cagaggtttg agtattggac aatgttctgt accagtgtta acacgtcatc gtcagaggca 20340
ttcttaattg gtgttcacta tttaggtgat tttgcaagtg gcgctgtgat tgacggcaac 20400
actatgcatg ccaattatat cttctggcgt aattccacaa ttatgactat gtcttacaat 20460
agtgtacttg atttaagcaa gttcaattgt aagcataagg ctacagttgt cattaattta 20520
aaagattcat ccattagtga tgttgtgtta ggtttgttga agaatggtaa gttgctagtg 20580
cgtaataatg acgccatttg tggtttttct aatcatttgg tcaacgtaaa caaatgaagt 20640
ctttaaccta cttctggttg ttcttaccag tactttcaac acttagccta ccacaagatg 20700
tcaccaggtg ctcagctaac actaatttta ggcggttctt ttcaaaattt aatgttcagg 20760
cgcctgcagt tgttgtactg ggcggttatc tacctaaaaa ccagggtgtc aattcaactt 20820
ggtactgtgc tggccaacat ccaactgcta gtggcgttca tggtatcttt gttagccata 20880
ttagaggtgg tcatggcttt gagattggca tttcgcaaga gccttttgac cctagtggtt 20940
accagcttta tttacataag gctactaacg gtaacactaa tgctactgcg cgactgcgca 21000
tttgccagtt tcctagcatt aaaacattgg gccccactgc taataatgat gttacaacag 21060
gtcgtaattg cctatttaac aaagccatcc cagctcatat gagtgaacat agtgttgtcg 21120
gcataacatg ggataatgat cgtgtcactg tcttttctga caagatctat tatttttatt 21180
ttaaaaatga ttggtcccgt gttgcgacaa agtgttacaa cagtggaggt tgtgctatgc 21240
aatatgttta cgaacccacc tattacatgc ttaatgttac tagtgctggt gaggatggta 21300
tttcttatca accctgtaca gctaattgca ttggttatgc tgccaatgta tttgctactg 21360
agcccaatgg ccacatacca gaaggtttta gttttaataa ttggtttctt ttgtccaatg 21420
attccacttt ggtgcatggt acggtggttt ccaaccaacc attgttggtc aattgtcttt 21480
tggccattcc taagatttat ggactaggcc aatttttctc ctttaatcaa acgatcgatg 21540
gtgtttgtaa tggagctgct gtgcagcgtg caccagaggc tctgaggttt aatattaatg 21600
acacctctgt cattcttgct gaaggctcaa ttgtacttca tactgcttta ggaacaaatt 21660
tttcttttgt ttgcagtaat tcctcaaatc ctcacttagc caccttcgcc atacctttgg 21720
gtgctaccca agtaccctat tattgttttt ttaaagtgga tacttacaaa tccactgttt 21780
ataaattctt ggctgtttta cctccaaccg tcagggaaat tgtcatcacc aagtatggtg 21840
atgtttatgt caatgggttt ggatacttgc atctcggttt gttggatgct gtcacaatta 21900
atttcactgg tcatggcact gacgatgatg tttctggttt ttggaccata gcatcgacta 21960
attttgttga tgcactcatc gaagttcaag gaaccgccat tcagcgtatt ctttattgtg 22020
atgatcctgt tagccaactc aagtgttctc aggttgcttt tgaccttgac gatggttttt 22080
accctatttc ttctagaaac cttctgagtc atgaacagcc aatttctttt gttactctgc 22140
catcatttaa tgatcattct tttgttaaca ttattgtatc tgcttccttt ggtggtcata 22200
gtggtgccaa ccttattgca tctgacacta ctatcaatgg gtttagttct ttctgtgttg 22260
acactagaca atttaccatt tcactgtttt ataacgttac aaacagttat ggttatgtgt 22320
ctaaatcaca ggacagtaat tgccctttca ccttgcaatc tgttaatgat tacctgtctt 22380
ttagcaaatt ttgtgtttcc accagccttt tggctagtgc ctgtaccata gatctttttg 22440
gttaccctga gtttggtagt ggtgttaagt ttacgtccct ttactttcaa ttcacaaagg 22500
gtgagttgat tactggcacg cctaaaccac ttgaaggtgt cacggacgtt tcttttatga 22560
ctctggatgt gtgtaccaag tatactatct atggctttaa aggtgagggt atccttaccc 22620
ttacaaattc tagctttttg gcaggtgttt attacacatc tgattctgga cagttgttag 22680
cctttaagaa tgtcactagt ggtgctgttt attctgttac gccatgttct ttttcagagc 22740
aggctgcata tgttgatgat gatatagtgg gtgttatttc tagtttgtct agctccactt 22800
ttaacagtac tagggagttg cctggtttct tctaccattc taatgatggc tctaattgta 22860
cagagcctgt gttggtgtat agtaacatag gtgtttgtaa atctggcagt attggctacg 22920
tcccatctca gtctggccaa gtcaagattg cacccacggt tactgggaat attagtattc 22980
ccaccaactt tagtatgagt attaggacag aatatttaca gctttacaac acgcctgtta 23040
gtgttgattg tgccacatat gtttgtaatg gtaactctcg ttgtaaacaa ttactcaccc 23100
agtacactgc agcatgtaag accatagagt cagcattaca actcagcgct aggcttgagt 23160
ctgttgaagt taactctatg cttactattt ctgaagaggc tctacagtta gctaccatta 23220
gttcgtttaa tggtgatgga tataatttta ctaatgtgct gggtgtttct gtgtatgatc 23280
ctgcaagtcg cagggtggta caaaaaaggt cttttattga agacctgctt tttaataaag 23340
tggttactaa tggccttggt actgttgatg aagactataa gcgctgttct aatggtcgct 23400
ctgtggcaga tctagtctgt gcacagtatt actctggtgt catggtacta cctggtgttg 23460
ttgacgctga gaagcttcac atgtatagtg cgtctctcat cggtggtatg gtgctaggag 23520
gttttacttc tgcagcggca ttgcctttta gctatgctgt tcaagctaga ctcaattatc 23580
ttgctctaca gacggatgtt ctacagcgga accagcaatt gcttgctgag tcttttaact 23640
ctgctattgg taatataact tcagcctttg agagtgttaa agaggctatt agtcaaactt 23700
ccaagggttt gaacactgtg gctcatgcgc ttactaaggt tcaagaggtt gttaactcgc 23760
agggtgcagc tttgactcaa cttaccgtac agctgcaaca caacttccaa gccatttcta 23820
gttctattga tgacatttac tctcgactgg acattctttc agccgatgtt caggttgacc 23880
gtctcatcac cggcagatta tcagcactta atgcttttgt tgctcaaacc ctcactaagt 23940
atactgaggt tcaggctagc aggaagttag cacagcaaaa ggttaatgag tgcgttaaat 24000
cgcaatctca gcgttatggt ttttgtggtg gtgatggcga gcacattttc tctctggtac 24060
aggcagcacc tcagggcctg ctgtttttac atacagtact tgtaccgagt gattttgtag 24120
atgttattgc catcgctggc ttatgcgtta acgatgaaat tgccttgact ctacgtgagc 24180
ctggcttagt cttgtttacg catgaacttc aaaatcatac tgcgatggaa tattttgttt 24240
catcgcgacg tatgtttgaa cctagaaaac ctaccgttag tgattttgtt caaattgaga 24300
gttgtgtggt cacctatgtc aatttgacta gagaccaact accagatgta atcccagatt 24360
acatcgatgt taacaaaaca cttgatgaga ttttagcttc tctgcccaat agaactggtc 24420
caagtcttcc tttagatgtt tttaatgcca cttatcttaa tctcactggt gaaattgcag 24480
atttacagca gcgttcagag tctctccgta atactacaga ggagctccaa agtcttatat 24540
ataatatcaa caacacacta gttgaccttg agtggctcaa ccgagttgag acatatatca 24600
agtggccgtg gtgggtttgg ttgattattt tcattgttct catctttgtt gtgtcattac 24660
tagtgttctg ctgcatttcc acgggttgtt gtggatgctg cggctgctgc tgtgcttgtt 24720
tctcaggttg ttgtaggggt cctagacttc aaccttacga agttcacgat tgacacagtt 24780
gtcaaagatg tctcaaagtc tgctaacttg tctttgtatg ctgtccaaga gttggagctc 24840
aatgtagttc caattagaca agcttcaaat gtgacgggtt ttcttttcac cagtgttttt 24900
atctacttct ttgcactgtt taaagcgtct tctttgaggc gcaattatat tatgttggca 24960
gcgcgttttg ctgtcattgt tctttattgc ccacttttat attattgtgg tgcattttta 25020
gatgcaacta ttatttgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactcc 25080
tggcgctata aaaatgcgct ctttattatt tttaatacta cgacactttc tttcctcaat 25140
ggtagtgctt gatatatgac ggcaaatcca ttgtgatttt agaaggtggt gaccattaca 25200
tcacttttgg caactctttt gttgcttttg ttagtagcat cgacttgtat ctagctatac 25260
gtgggcggca agaagctgac ctacagctgt tgcgaactgt tgagcttctt gatggcaaga 25320
agctttatgt cttttcgcaa catcaaattg ttggcattac taatgctgca tttgactcaa 25380
ttcaactaga cgagtatgct acaattagtg aatgataatg gtctagtagt taatgttata 25440
ctttggcttt tcgtactctt tttcctgctt attataagca ttactttcgt ccaattggtt 25500
aatctgtgct tcacttgtca ccggttgtgt aatagcgcag tttacacacc tatagggcgt 25560
ttgtatagag tttataagtc ttacatgcaa atagaccccc tctctagtac tgttattgac 25620
gtataaacga aatatgtcta acggttctat tcccgttgat gaggtgattc aacaccttag 25680
aaactggaat ttcacatgga atatcatact gacgatacta cttgtagtgc ttcagtatgg 25740
ccattacaag tactctgcgt tcttgtatgg tgtcaagatg gctattctat ggatactttg 25800
gcctcttgtg ttagcactgt cactttttga tgcatgggct agctttcagg tcaattgggt 25860
cttttttgct ttcagcatcc ttatggcttg catcactctt atgctgtgga taatgtactt 25920
tgtcaatagc attcggttgt ggcgcaggac acattcttgg tggtctttca atcctgaaac 25980
agacgcgctt ctcactactt ctgtgatggg ccgacaggtc tgcattccag tgcttggagc 26040
accaactggt gtaacgctaa cactccttag tggtacattg cttgtagagg gctataaggt 26100
tgctactggc gtacaggtaa gtcaattacc taatttcgtc acagtcgcca aggccactac 26160
aacaattgtc tacggacgtg ttggtcgttc agtcaatgct tcatctggca ctggttgggc 26220
tttctatgtc cggtccaaac acggcgacta ctcagctgtg agtaatccga gttcggttct 26280
cacagatagt gagaaagtgc ttcatttagt ctaaacagaa actttatggc ttctgtcagt 26340
tttcaggatc gtggccgcaa acgggtgcca ttatccctct atgcccctct tagggttact 26400
aatgacaaac ccctttctaa ggtacttgca aataatgctg tacccactaa taaaggaaat 26460
aaggaccagc aaattggata ctggaatgag caaattcgct ggcgcatgcg ccgtggtgag 26520
cgaattgaac aaccttccaa ttggcatttc tactacctcg gaacaggacc tcacgccgac 26580
ctccgctata ggactcgtac tgagggtgtt ttctgggttg ctaaagaagg cgcaaagact 26640
gaacccacta acctgggtgt cagaaaggcg tctgaaaagc caattattcc aaatttctct 26700
caacagcttc ccagcgtagt tgagattgtt gaacctaaca cacctcctac ttcacgtgca 26760
aattcacgta gcaggagtcg tggtaatggc aacaacaggt ccagatctcc aagtaacaac 26820
agaggcaata accagtcccg cggtaattca cagaatcgtg gaaataacca gggtcgtgga 26880
gcttctcaga acagaggagg caataataat aacaataaca agtctcgtaa ccagtccaag 26940
aacagaaacc agtcaaatga ccgtggtggt gtaacatcac gcgatgatct ggtggctgct 27000
gtcaaggatg cccttaaatc tttgggtatt ggcgaaaacc ctgacaagct taagcaacag 27060
cagaagccca aacaggaaag gtctgacagc agcggcaaaa atacacctaa gaagaacaaa 27120
tccagagcca cttcgaaaga acgtgacctc aaagacatcc cagagtggag gagaattccc 27180
aagggcgaaa atagcgtagc agcttgcttc ggacccaggg gaggcttcaa aaattttgga 27240
gatgcggaat ttgtcgaaaa aggtgttgat gcctcaggct atgctcagat cgccagttta 27300
gcaccaaatg ttgcagcatt gctctttggt ggtaatgtgg ctgttcgtga gctagcggac 27360
tcttacgaga ttacatataa ttataaaatg actgtgccaa agtctgatcc aaatgtagag 27420
cttcttgttt cacaggtgga tgcatttaaa actgggaatg caaaacccca gagaaagaag 27480
gaaaagaaga acaagcgtga aaccacgcag cagctgaatg aagaggccat ctacgatgat 27540
gtgggtgtgc catctgatgt gactcatgcc aatttggaat gggacacagc tgttgatggt 27600
ggtgacacgg ccgttgaaat tatcaacgag atcttcgaca caggaaatta aacaatgttt 27660
gactggctta tcctggctat gtcccagggt agtgccatta cactgttatt actgagtgtt 27720
tttctagcga cttggctgct gggctatggc tttgccctct aactagcggt cttggtcttg 27780
cacactacgg taagccagtg gtaatgtcag tgcaagaagg atattaccat agcactgtca 27840
tgaagggaac gcagtacctt ttcatctaaa cctttgcacg agtaatcaaa gatccgcttg 27900
acgagcctat atggaagagc gtgccaggta tttgactcaa ggactgttag taactgaaga 27960
cctgacggtg ttgatatgga tacac 27985
<210> 2
<211> 27974
<212> DNA
<213> porcine epidemic diarrhea virus
<400> 2
acttaaagag attttctatc tacggatagt tagctctttt tctagactct tgtctactca 60
attcaactaa acgaaatttt gtccttccgg ccgcatgtcc atgctgctgg aagctgacgt 120
ggaatttcat taggtttgct taagtagcca tcgcaagtgc tgtgctgtcc tctagttcct 180
ggttggcgtt ccgtcgcctt ctacatacta gacaaacagc cttcctccgg ttccgtctgg 240
gggttgtgtg gataactagt tccgtctagt ttgaaaccag taactgtcgg ctatggctag 300
caaccatgtt acattggctt ttgccaatga tgcagaaatt tcagcttttg gcttttgcac 360
tgctagtgaa gccgtctcat actattctga ggccgccgct agtggattta tgcaatgccg 420
tttcgtgtcc ttcgatctcg ctgacactgt tgagggattg cttcccgaag actatgtcat 480
ggtggtggtc ggcactacca agcttagtgc gtatgtggac acttttggta gccgccccaa 540
aaacatttgt ggttggctgt tattttctaa ctgtaattac ttcctcgaag agttagagct 600
tacttttggt cgtcgtggtg gtaacatcgt gccagttgac caatacatgt gtggcgctga 660
cggtaaacct gttcttcagg aatccgaatg ggagtataca gatttctttg ctgactccga 720
agacggtcaa ctcaacattg ctggtatcac ttatgtgaag gcctggattg tagagcgatc 780
ggatgtctct tatgcgagtc agaatttaac atctattaag tctattactt actgttcaac 840
ctatgagcat acttttcctg atggtactgc catgaaggtt gcacgtactc caaagattaa 900
gaagactgtt gtcttgtctg agccacttgc tactatctac agggaaattg gttctccttt 960
tgtggataat gggagcgatg ctcgttctat cattaagaga ccagtgttcc tccacgcttt 1020
tgttaagtgt aagtgtggta gttatcattg gactgttggt gattggactt cctatgtctc 1080
cacttgctgt ggctttaagt gtaagccagt ccttgtggct tcatgctctg ctacgcctgg 1140
ttctgttgtg gttacgcgcg ctggtgctgg cactggtgtt aagtattaca acaacatgtt 1200
cctgcgccat gtggcagaca ttgatgggtt ggcattctgg cgaattctca aggtgcagtc 1260
caaagacgac ctcgcttgct ctggtaaatt ccttgaacac catgaggaag gtttcacaga 1320
tccttgctac tttttgaatg actcgagcat tgctactaag ctcaagtttg acatccttag 1380
tggcaagttt tctgatgaag tcaaacaagc tatctttgct ggtcatgttg ttgttggcag 1440
cgcgctcgtt gacattgttg acgatgcact gggacagcct tggtttatac gtaagcttgg 1500
tgaccttgca agtgcagctt gggagcagct taaggctgtc gttagaggcc ttaacctcct 1560
gtctgatgag gtcgtgctct ttggcaaaag acttagctgt gccactctta gtatcgttaa 1620
cggtgttttt gagttcatcg ccgaagtgcc tgagaagttg gctgcggctg ttacagtttt 1680
tgtcaacttc ttgaatgagc tttttgagtc tgcctgtgac tgcttaaagg tcggaggtaa 1740
aacctttaac aaggttggct cttatgttct ttttgacaac gcattggtta agcttgtcaa 1800
ggcaaaagtt cgcggcccac gacaggcagg tgtttgtgaa gttcgttaca caagccttgt 1860
tattgggagt actaccaagg tggtttccaa gcgcgttgaa aatgccaatg tgaatctcgt 1920
cgtcgttgac gaggatgtga ccctcaacac cactggtcgt acagttgttg ttgacggact 1980
tgcattcttc gagagtgacg ggttttacag acatcttgct gatgctgacg ttgtcattga 2040
acatcctgtt tataagtctg cttgtgagct caagccagtt tttgagtgtg acccaatacc 2100
tgattttcct atgcctgtgg ccgctagtgt tgcagagctt tgtgtgcaaa ctgatctgtt 2160
gcttaaaaat tacaacactc cttataaaac ttacagctgc gttgtgagag gtgataagtg 2220
ttgcatcact tgcaccttac atatcacagc accaagttat atggaggatg ctgctaattt 2280
tgtagacctc tgtaccaaga acattggtac tgctggtttt catgagtttt acattacggc 2340
ccatgaacaa caggatctgc aagggttcgt aaccacttgt tgcacgatgt caggttttga 2400
gtgttttatg cctataatcc cacagtgtcc agcagtgctt gaagagattg atggtggtag 2460
catctggcgg tcttttatca ctggtcttaa tacaatgtgg gatttttgca agcatcttaa 2520
agtcagcttt ggactagatg gcattgttgt cactgtagca cgcaaattta aacgacttgg 2580
tgctctcttg gcagaaatgt ataacactta cctttcaact gtggtggaaa acttggtact 2640
ggccggtgtt agcttcaagt attatgccac cagtgtccca aaaattgttt tgggctgttg 2700
ttttcacagt gttaaaagtg ttcttgcaag tgccttccag attcctgtcc aggcaggcat 2760
tgagaagttt aaagtcttcc ttaactgtgt tcaccctgtt gtaccacgcg tcattgaaac 2820
ttcttttgtg gaattagaag agacgacatt taaaccacca gcactcaatg gtagtattgc 2880
tattgttgat ggctttgctt tctattatga tggaacacta tactatccca ccgatggtaa 2940
tagtgttgtg cctatttgtt ttaagaagaa gggtggtggt gatgtcaaat tctctgatga 3000
agtctctgtt agaaccattg acccagttta taaggtctcc cttgaatttg agttcgagtc 3060
tgagactatt atggctgtgc ttaataaggc tgttggtaat cgtatcaagg ttacaggtgg 3120
ttgggacgat gttgttgagt atatcaacgt tgccattgag gttcttaaag atcatatcga 3180
tgtgcctaag tactacatct atgatgagga aggtggcacc gatcctaatc ttcccgtaat 3240
ggtttctcag tggccgttga atgatgacac gatctcacag gatctgcttg atgtggaagt 3300
tgttactgat gcaccaattg atttcgaggg tgatgaagta gactcctctg accctgataa 3360
ggtggcagat gtggctaact ctgagcctga ggatgatggt cctaatgtag ctcctgaaac 3420
aaatgtagag tctgaagttg aggaagttgc cgcaaccttg tcttttatta aagatacacc 3480
ttccacagtt actaaggatc cttttgcttt tgactttgca agctatggag gacttaaggt 3540
tttaagacaa tctcataaca actgctgggt tacttctacc ttggtgcagc tacaattgct 3600
tggcatcgtt gatgaccctg caatggagct ttttagtgct ggtagagttg gtccaatggt 3660
tcgcaaatgc tatgagtcac aaaaggctat cttgggatct ttgggtgatg tgtcggcttg 3720
cctagagtct ctgactaagg acctacacac acttaagatt acctgttctg tagtctgtgg 3780
ttgtggtact ggtgaacgta tctatgaggg ttgtgctttt cgtatgacgc caactttgga 3840
accgttccca tatggtgctt gtgctcagtg tgctcaagtt ttgatgcaca cttttaaaag 3900
tattgttggc accggcatct tttgtcgaga tactactgct ctctccttgg attctttggt 3960
tgtaaaacct ctttgtgcgg ctgcttttat aggcaaggac agtggtcatt atgtcactaa 4020
cttttatgat gctgctatgg ctattgatgg ttatggtcgt catcagataa agtatgacac 4080
actgaacact atttgtgtta aagacgttaa ttggacagca ccttttgtcc cagacgttga 4140
gcctgtattg gagcctgttg tcaaaccgtt ctattcttat aagaatgttg atttttacca 4200
aggagatttt agtgaccttg ttaaacttcc atgtgacttt gttgttaatg ctgcaaatga 4260
gaatttgtct cacggtggcg gcatagcaaa ggccattgat gtttatacca agggcatgtt 4320
gcagaagtgc tcgaatgatt acattaaagc acacggtccc attaaagttg gacgtggtgt 4380
catgttggag gcattaggtc ttaaggtctt taatgttgtt ggtccacgta agggtaagca 4440
tgcacctgag cttcttgtta aggcttataa gtccgttttt gctaattcag gtgttgctct 4500
tacacctttg attagtgttg gaatttttag tgttcctttg gaagaatctt tatctgcttt 4560
tcttgcatgt gttggtgatc gccactgtaa gtgcttttgt tatagtgaca aagagcgcga 4620
ggcgatcatt aattacatgg atggcttggt agatgctatt ttcaaagatg cacttgttga 4680
tactactcct gtccaggaag atgttcaaca agtttcacaa aaaccagttt tgcctaattt 4740
tgaacctttc aggattgaag gtgctcatgc tttctatgag tgcaaccctg aaggtttgat 4800
gtcattaggt gctgacaagc tggtgttgtt tacaaattcc aatttggatt tttgtagcgt 4860
tggtaagtgt cttaacaatg tgactggcgg tgcattgctt gaagccataa atgtatttaa 4920
aaagagtaac aaaacagtgc ctgctggcaa ctgtgttact tttgagtgtg cagatatgat 4980
ttttattact atggtagtat tgccatctga cggtgatgct aattatgaca aaaattatgc 5040
acgcgccgtc gtcaaggtat ctaagcttaa aggcaagtta ttgcttgctg ttggtgatgc 5100
catgttgtat tccaagttgt cccacctcag cgtgttaggt ttcgtatcca cacctgatga 5160
tgtggagcgt ttctacgcaa ataagagtgt ggttattaaa gttactgagg atacacgtag 5220
tgttaagact gttaaagtag aatccactgt tacttatgga caacaaattg gaccttgtct 5280
tgttaatgac accgttgtca cagacaacaa acctgttgtt gctgatgttg tagctaaggt 5340
tgtaccaagt gctaattggg attcacatta tggttttgat aaggctggtg agttccacat 5400
gctagaccat actgggtttg cctttcctag tgaagttgtt aacggtaggc gtgtgcttaa 5460
aaccacagat aataactgtt gggttaatgt tacatgttta caattacagt ttgctagatt 5520
taggttcaag tcagcaggtc tacaggctat gtgggagtcc tattgtactg gtgatgttgc 5580
tatgtttgtg cattggttgt actggcttac tggtgttgac aaaggtcagc ctagtgattc 5640
agaaaatgca cttaacatgt tgtctaagta cattgttcct gctggttctg tcactattga 5700
acgtgtcacg catgacggtt gttgttgtag taagcgtgtt gtcactgcac cagttgtgaa 5760
tgctagcgtg ttgaagcttg gcgtcgagga tggtctttgt ccacatggtc ttaactacat 5820
tgacaaagtt gttgtagtta aaggtactac aattgttgtc aatgttggaa aacctgtagt 5880
ggcaccatcg cacctctttc ttaagggtgt ttcctacaca acattcctag ataatggtaa 5940
cggtgttgcc ggccattata ctgtttttga tcatgacact ggtatggtgc atgatggaga 6000
tgtttttgta ccaggtgatc tcaatgtgtc tcctgttaca aatgttgtcg tctcagagca 6060
gacggctgtt gtgattaaag accctgtgaa gaaagtagag ttagacgcta caaagctgtt 6120
agacactatg aattatgcat cggaaagatt cttttccttt ggtgatttta tgtcacgtaa 6180
tttaattaca gtgtttttgt acatccttag tattttgggt ctctgtttta gggcctttcg 6240
taagagggat gttaaagttc tagctggtgt accccaacgt actggtatta tattgcgtaa 6300
aagtgtgcgc tataatgcaa aggctttggg tgtcttcttc aagctaaaac tttattggtt 6360
caaagttctt ggtaagttta gtttgggtat ttatgcattg tatgcattac tattcatgac 6420
aatacgcttt acacctatag gtggccctgt ttgtgatgat gttgttgctg gttatgctaa 6480
ttctagtttt gacaagaatg agtattgcaa cagtgttatt tgtaaggtct gtctctatgg 6540
gtaccaggaa ctttcggact tctctcacac acaggtagta tggcaacacc ttagagaccc 6600
attaattggt aatgtgatgc ctttctttta tttggcattt ctggcaattt ttgggggtgt 6660
ttatgtaaag gctattactc tctattttat tttccagtat cttaacatac ttggtgtgtt 6720
tttgggccta caacagtcca tttggttttt gcagcttgtg ccttttgatg tctttggtga 6780
cgagatcgtc gtctttttca tcgttacacg cgtattgatg ttcattaagc atgtttgcct 6840
tggctgcgat aaggcatctt gtgtggcttg ctctaagagt gctcgcctta agcgcgttcc 6900
tgtccagact atttttcagg gtactagcaa atccttctac gtacatgcca atggtggttc 6960
taagttctgt aagaagcaca atttcttttg tttaaattgt gattcttatg gtccaggctg 7020
cacttttatt aatgacgtca ttgcaactga agttggtaat gttgtcaaac ttaatgtgca 7080
accgacaggt cctgccacta ttcttattga caaggttgaa ttcagtaatg gtttttacta 7140
tctttatagt ggtgacacat tttggaagta caactttgac ataacagata acaaatacac 7200
ttgcaaagag tcacttaaaa attgtagcat aatcacagac tttattgttt ttaacaataa 7260
tggttccaat gtaaatcagg ttaagaatgc atgtgtgtat ttttcacaga tgctttgtaa 7320
acctgttaag ttagtggact cagcgttgtt ggccagtttg tctgttgatt ttggtgcaag 7380
cttacatagt gcttttgtta gtgtgttgtc gaatagtttt ggcaaagacc tgtcaagttg 7440
taatgacatg caggattgca agagcacatt gggttttgat gatgtaccat tggatacctt 7500
taatgctgct gttgctgagg ctcatcgtta cgatgtcctc ttgactgaca tgtcgttcaa 7560
caattttacc accagttatg caaaaccaga ggaaaaactt cccgtccatg acattgccac 7620
gtgtatgcgt gtaggtgcca agattgttaa tcataacgtt cttgtcaagg atagtatacc 7680
tgtggtgtgg cttgtacgtg atttcattgt cctttctgaa gaaactagga agtacattat 7740
tcgtacgact aaagttaagg gtataacctt catgttgacc tttaatgatt gtcgtatgca 7800
tactaccata cctactgttt gcattgcaaa taagaagggt gcaggtcttc ctagtttttc 7860
aaaggttaag aaattcttct ggtttttgtg tctgttcata gttgctgttt tctttgcact 7920
aagctttttt gattttagta ctcaggttag cagtgatagt gattatgact tcaagtatat 7980
tgagagtggc cagttgaaga cttttgacaa tccacttagt tgtgtgcata atgtctttag 8040
taacttcgac cagtggcatg atgccaagtt tggtttcacc cccgtcaaca atcctagttg 8100
tcctatagtc gttggtgtat cagacgaagc gcgcactgtt ccaggtatcc cagcaggtgt 8160
ttatttagct ggtaaaacac ttgtttttgc tattaacacc atttttggta catctggttt 8220
gtgctttgat gctagtggcg ttgctgataa gggcgcttgc atttttaatt cggcttgcac 8280
cacattatct ggtttgggtg gaactgctgt ctactgttat aagaatggtc tagttgaagg 8340
tgctaaactt tatagtgagt tggcacctca tagctactat aaaatggtag atggtaatgc 8400
tgtgtcttta cctgaaatta tctcacgcgg ctttggcatc cgtactatcc gtacaaaggc 8460
tatgacctac tgtcgcgttg gccagtgtgt gcaatctgca gaaggtgttt gttttggcgc 8520
cgatagattc tttgtctata atgcagaatc tggttctgac tttgtttgtg gcacagggct 8580
ctttacattg ttgatgaacg ttattagtgt tttttccaag acagtaccag taactgtgtt 8640
gtctggtcaa atacttttta attgcattat tgcttttgct gctgttgcgg tgtgtttctt 8700
atttacaaag tttaagcgca tgttcggtga tatgtctgtt ggcgttttca ctgtcggtgc 8760
ttgtactttg ttgaacaatg tttcctacat tgtaacacag aacacacttg gcatgttggg 8820
ctatgcaact ttgtactttt tgtgcactaa aggtgttaga tatatgtgga tttggcattt 8880
gggatttttg atctcatata tacttattgc accatggtgg gttttgatgg tttatgcctt 8940
ttcagccatt tttgagttta tgcctaacct ttttaagctt aaggtttcaa cacaactttt 9000
tgagggtgac aagttcgtag gctcttttga aaatgctgca gcaggtacat ttgtgcttga 9060
tatgcatgcc tatgagagac ttgccaactc tatctcaact gaaaaactgc gtcagtatgc 9120
tagtacttac aataagtaca agtattattc aggcagtgct tcagaggctg attacaggct 9180
tgcttgtttt gcccatttgg ccaaggctat gatggattat gcttctaatc acaacgacac 9240
gttatacaca ccacccactg tgagttacaa ttcaactcta caggctggct tgcgtaagat 9300
ggcacaacca tctggtgttg ttgagaagtg catagttcgt gtttgctatg gtaatatggc 9360
tcttaatggc ctatggcttg gtgatactgt tatctgccca cgccatgtta tagcgtctag 9420
tactactagc actatagatt atgactatgc cctttctgtt ttacgcctcc acaacttctc 9480
catttcatct ggtaatgttt tcctaggtgt tgtgggtgta accatgcgag gtgctttgtt 9540
gcagataaag gttaatcaaa acaatgtcca cacgcctaag tacacctatc gcacagttag 9600
accgggtgaa tcttttaata tcttggcgtg ctatgatggt tctgcagctg gtgtttacgg 9660
cgttaacatg cgctctaatt acactattag aggctcgttc attaatggcg cttgtggttc 9720
acctggttat aacattaaca atggtaccgt tgagttttgc tatttacacc agcttgaact 9780
tggttcaggc tgtcatgttg gtagcgactt agatggtgtt atgtatggtg gttatgagga 9840
ccaacctatt ttgcaagttg aaggcgctag tagtctgttt acagagaatg tgttggcatt 9900
tctttatgca gcactcatta atggttctac ctggtggctt agttcttcta ggattgctgt 9960
agacaggttt aatgagtggg ctgttcataa tggtatgaca acagtagtta atactgattg 10020
cttttctatt cttgctgcta agactggtgt tgatgtacaa cgtttgttgg cctcaatcca 10080
gtctctgcat aagaattttg gtggaaagca aattcttggc tatacctcgt tgacagatga 10140
gtttactaca ggtgaagtta tacgtcaaat gtatggcgtt aatcttcaga gtggttatgt 10200
ttcacgcgcc tgtagaaatg tcttgctggt tggttctttt ctgactttct tttggtcaga 10260
attagtttcc tacactaagt tcttttgggt aaatcctggt tatgtcacac ctatgtttgc 10320
gtgtttgtca ttgctgtcct cacttttgat gttcacactc aagcataaga cattgttttt 10380
ccaggtcttt ctaatacctg ctctgattgt tacatcttgc attaatttgg catttgatgt 10440
tgaagtctac aactatttgg cagagcattt tgattaccat gtttctctca tgggttttaa 10500
tgcacaaggt cttgttaaca tctttgtctg ctttgttgtt accattttac acggcacata 10560
cacatggcgc ttttttaaca cacctgtgag ttctgtcact tatgtggtag ctttgctgac 10620
tgcggcatat aactattttt acgctagtga cattcttagt tgtgctatga cactatttgc 10680
tagtgtgact ggcaactggt tcgttggtgc tgtttgttat aaagctgctg tttatatggc 10740
cttgagattt cctacttttg tggctatttt tggtgatatt aagagtgtta tgttctgtta 10800
ccttgtgttg ggttatttta cctgttgctt ttacggtatt ctctactggt tcaacaggtt 10860
ttttaaggtt agtgtaggtg tctatgacta tactgttagt gctgctgagt ttaagtatat 10920
ggttgctaac ggcctacgtg caccaactgg aacacttgat tcactacttc tgtctgccaa 10980
attgattggt attggtggtg agcggaatat taagatttct tccgttcagt ctaaactgac 11040
tgatattaag tgtagtaacg ttgtgctttt aggctgtctc tctagcatga atgtctcagc 11100
aaattcaaca gaatgggcct attgtgttga cttgcataac aagatcaact tgtgtaatga 11160
cccagaaaaa gcgcaggaaa tgctacttgc tttgttggca tttttcctta gtaagaatag 11220
tgcttttggt ttagatgact tattggaatc ctattttaat gacaatagta tgttgcagag 11280
tgttgcatct acttatgtcg gtttgccttc ttatgtcatt tatgaaaatg cacgccaaca 11340
gtatgaagat gctgttaata atggttctcc acctcagttg gttaagcaat tgcgccatgc 11400
catgaatgta gcaaagagcg aatttgaccg tgaggcttct actcagcgta agcttgatag 11460
aatggcggaa caggctgcag cacagatgta caaagaggca cgagcagtta ataggaagtc 11520
caaagttgta agtgctatgc attcactgct ttttggtatg ttgagacgtt tggacatgtc 11580
ttctgtagac accattctca acttggcaaa ggatggggtt gtacctctgt ctgtcatacc 11640
ggcagtcagt gctactaagc ttaacattgt tacttctgat atcgattctt ataatcgtat 11700
ccagcgtgag ggatgtgtcc actacgctgg taccatttgg aatataattg atatcaagga 11760
caatgatggc aaggtggtac acgttaagga ggtaaccgca cagaatgctg agtccctgtc 11820
atggcccctg gtccttgggt gtgagcgtat tgtcaagctc cagaataatg aaattattcc 11880
tggtaagctg aagcagcgct ccattaaggc agaaggagat ggcatagttg gagaaggtaa 11940
ggcactttac aataatgagg gtggacgtac ttttatgtat gctttcatct cggacaaacc 12000
ggacctgcgt gtagtcaagt gggagttcga tggtggttgt aacactattg agctagaacc 12060
accacgtaag tttttggtgg attctcctaa tggtgcacag atcaagtatc tctactttgt 12120
tcgtaacctt aacacgttac gtaggggtgc tgttctcggc tacataggtg ccactgtacg 12180
cttgcaggct ggtaaacaaa cagaacaggc tattaactct tcattgttga cactttgcgc 12240
tttcgctgtg gatcctgcta agacctacat cgatgctgtc aaaagtggtc acaaaccagt 12300
aggtaactgt gttaagatgt tggccaatgg ttctggtaat ggacaagctg ttactaatgg 12360
tgtggaggct agtactaacc aggattcata cggtggtgcg tccgtgtgtc tatattgtag 12420
agcacatgtt gagcatccat ctatggatgg tttttgcaga ctgaaaggca agtacgtaca 12480
ggttccacta ggtacagtgg atcctatacg ttttgtactt gagaatgacg tttgcaaggt 12540
ttgtggttgt tggctggcta atggctgcac ttgtgacaga tccattatgc aaagcactga 12600
tatggcttat ttaaacgagt acggggctct agtgcagctc gactagagcc ctgtaacggt 12660
actgatacac aacatgtgta tcgtgctttt gacatctaca acaaggatgt tgcttgtcta 12720
ggtaaattcc tcaaggtgaa ctgtgttcgc ctgaagaatt tggataagca tgatgcattc 12780
tatgttgtca aaagatgtac caagtctgcg atggaacacg agcaatccat ctatagcaga 12840
cttgaaaagt gtggagccgt agccgaacac gatttcttca cttggaagga tggtcgtgcc 12900
atctatggta acgtttgtag aaaggatctt accgagtata ctatgatgga tttgtgttac 12960
gctttacgta actttgatga aaacaattgc gatgttctta agagcatttt aattaaggta 13020
ggcgcttgtg aggagtccta cttcaataat aaagtctggt ttgaccctgt tgaaaatgaa 13080
gacattcatc gtgtctatgc attgttaggt accattgttt cacgtgctat gcttaaatgc 13140
gttaagttct gtgatgcaat ggttgaacaa ggtatagttg gtgttgtcac attagataat 13200
caggatctta atggtgattt ttatgatttt ggtgatttta cttgtagcat caagggaatg 13260
ggtataccca tttgcacatc atattactct tatatgatgc ctgttatggg tatgactaat 13320
tgccttgcta gtgagtgttt tgttaagagt gatatatttg gtgaggattt caagtcatat 13380
gacctgctgg aatatgattt cacggagcat aagacagcac tcttcaacaa gtatttcaag 13440
tattggggac tgcaatacca ccctaactgt gtggactgca gtgatgagca gtgcatagtt 13500
cactgtgcca acttcaatac gttgttttcc actactatac ctattacggc atttggacct 13560
ttgtgtcgca agtgttggat tgatggtgtt ccactggtaa ctacagctgg ttatcatttt 13620
aaacagttag gtatagtttg gaacaatgac ctcaacttac actctagcag gctctctatt 13680
aacgaattac tccagttttg tagtgatcct gcattgctta tagcatcatc accagccctt 13740
gttgatcagc gtactgtttg cttttcagtt gcagcgctag gtacaggtat gactaaccag 13800
actgttaaac ctggccattt caataaggag ttttatgact tcttacttga gcaaggtttc 13860
ttttctgagg gctctgagct tactttaaag cacttcttct ttgcacagaa gggtgatgca 13920
gctgttaagg attttgacta ctataggtat aatagaccta ctgttctgga catttgccaa 13980
gctcgcgtcg tgtatcaaat agtgcaacgc tattttgata tttacgaagg tggttgtatc 14040
actgctaaag aggtggttgt tacaaacctt aacaagagcg caggttatcc tttgaacaag 14100
tttggtaaag ctggtcttta ctatgagtct ttatcttatg aggaacagga tgaactttat 14160
gcttatacta agcgtaacat cctgcccact atgacacagc tcaaccttaa atatgctata 14220
agtggcaaag aacgtgcacg cacagtgggt ggtgtttcgc ttttgtcaac catgactact 14280
cggcagtatc atcagaaaca ccttaagtcc atagttaata ctaggggcgc ttcggttgtt 14340
attggtacta ctaagtttta tggtggttgg gacaatatgc ttaagaacct tattgatggt 14400
gttgaaaatc cgtgtcttat gggttgggac tacccaaagt gcgacagagc actgcccaat 14460
atgatacgta tgatttcagc catgatttta ggctctaagc acaccacatg ctgcagttcc 14520
actgaccgct ttttcaggtt gtgcaatgaa ttggctcaag tccttactga ggttgtttat 14580
tctaatggag gtttttattt gaagccaggt ggtactacct ctggtgatgc aaccaccgca 14640
tatgcaaact cagtttttaa tatcttccaa gcagtaagtg ccaatgttaa caaacttctt 14700
agtgttgaca gcaatgtctg tcataattta gaagttaagc aattgcagcg taagctttat 14760
gagtgctgtt atagatcaac taccgtcgat gaccagttcg tcgttgagta ttatggttac 14820
ttgcgtaaac atttttcaat gatgattctt tctgatgatg gcgttgtttg ttataacaat 14880
gactatgcat cacttggtta tgtcgctgat cttaacgcat tcaaggctgt tttgtattac 14940
cagaacaatg tcttcatgag cgcctctaaa tgttggatcg agcctgacat taataaaggt 15000
cctcatgaat tttgctcgca gcatactatg cagattgtcg ataaagatgg tacttattac 15060
cttccttacc ctgatccttc aagaattctc tctgcaggtg tgtttgttga tgacgttgtt 15120
aaaactgatg cagttgtatt gcttgaacgt tatgtgtcat tggctataga tgcctacccg 15180
ttatctaagc atgaaaaccc tgaatataag aaggtgtttt atgtgctttt ggattgggtt 15240
aagcatctgt acaaaactct taatgctggt gtgttagagt ctttttctgt cacacttttg 15300
gaagattcta ctgctaaatt ctgggatgag agcttttatg ccaacatgta tgagaaatct 15360
gcagttttac aatctgcagg gctttgtgtt gtttgtggct ctcaaactgt tttacgttgt 15420
ggtgattgtt tacggcgtcc tatgctttgt actaagtgtg cttatgatca tgtcattgga 15480
acaactcaca agttcatttt ggccatcact ccatatgtgt gttgtgcttc agattgtggt 15540
gtcaatgatg taactaagct ctacttaggt ggtcttagtt attggtgtca tgaccacaag 15600
ccacgtcttg cattcccgtt gtgctctgct ggtaatgttt ttggcttgta caaaaattct 15660
gctatcggct cacccgatgt tgaagacttt aatcgcattg ctacatccga ttggactgat 15720
gtttctgact acaggttggc aaatgatgtc aaggactcat tgcgtctgtt tgcagcggaa 15780
actatcaagg ccaaggagga gagcgttaag tcatcctatg cttgtgcaac actacatgag 15840
gttgtaggac ctaaagagtt gttgctcaaa tgggaagtcg gcagacccaa accacccctt 15900
aatagaaatt cggttttcac ttgttatcat ataacgaaga acaccaaatt tcaaatcggt 15960
gagtttgtgt ttgagaaggc agaatatgat aatgatgctg taacatataa aactaccgcc 16020
acaacaaaac ttgttcctgg catggttttt gtgcttacct cacataatgt tcagccattg 16080
cgctcaccga ccattgctaa tcaagaacgt tattccacta tacataagtt gcatcctgct 16140
tttaacatac ctgaagctta ttctagctta gtgccctatt accaattgat tggtaagcag 16200
aagattacaa ctattcaggg acctcccggt agtggtaaat ctcactgtgt tatagggcta 16260
ggtttgtact atccaggtgc acgtatagtg tttacagctt gttctcatgc agcggtcgat 16320
tcactttgtg tgaaagcttc cactgcttat agcaatgaca aatgttcacg catcatacca 16380
cagcgcgctc gtgttgagtg ttatgatggt ttcaagtcta ataatactag tgctcagtac 16440
cttttctcta ctgtcaatgc tttgccagag tgcaatgcgg acattgttgt ggtggatgag 16500
gtctctatgt gcactaatta tgacttgtct gtcataaatc agcgcatcag ctataggcat 16560
gtagtctatg ttggtgaccc tcaacagctg cctgcaccac gtgttatgat ttcacgtggt 16620
actttggaac caaaggacta caacgttgtc actcaacgca tgtgtgccct taagcctgat 16680
gttttcttgc acaagtgtta tcgctgtcct gctgagatag tgcgtactgt gtctgagatg 16740
gtctatgaaa accaattcat tcctgtgcac ccagatagca agcagtgttt taaaatcttt 16800
tgcaagggta atgttcaggt tgataatggt tcaagcatta atcgcaggca attggatgtt 16860
gtgcgtatgt ttttggctaa aaatcctagg tggtcaaagg ctgtttttat ttctccttat 16920
aacagccaga attatgttgc cagccgcatg ctaggtctac aaattcagac agttgactca 16980
tcccagggta gtgagtatga ctatgtcatt tacacacaaa cttcagatac tgcccatgcc 17040
tgtaatgtta acaggtttaa tgttgccatc acaagggcca agaaaggcat attatgtata 17100
atgtgcgata ggtccctttt tgatgtgctt aaattctttg agcttaaatt gtctgatttg 17160
caggctaatg agggttgtgg tctttttaaa gactgtagca gaggtgatga tctgttgcca 17220
ccatctcacg ctaacacctt catgtcttta gcggacaatt ttaagactga tcaagatctt 17280
gctgttcaaa taggtgttaa tggacccatt aaatatgagc atgttatctc gtttatgggt 17340
ttccgttttg atatcaacat acccaaccat catactctct tttgcacacg cgactttgcc 17400
atgcgcaatg ttagaggttg gttaggcttt gacgttgaag gagcacatgt tgttggctct 17460
aacgtcggta caaatgtccc attgcaatta gggttttcta acggtgttga ttttgttgtc 17520
agacctgaag gttgcgttgt aacagagtct ggtgactaca ttaaacccgt cagagctcgt 17580
gctccaccag gggaacaatt cgcacacctt ttgcctttac ttaaacgcgg ccaaccatgg 17640
gatgttgtcc gcaaacgtat agtgcagatg tgtagtgact acctggccaa cctatcagac 17700
atactaattt ttgtgttgtg ggctggtggt ttggagttga caactatgcg ttattttgtc 17760
aagattggac caagtaagag ttgtgattgt ggtaaggttg ctacttgtta caatagtgcg 17820
ctgcatacgt actgttgttt caaacatgcc cttggttgtg attatctgta taacccatac 17880
tgtattgata tacagcagtg gggatacaag ggatcactta gccttaacca ccatgagcat 17940
tgtaatgtac atagaaacga gcatgtggct tctggtgatg ccataatgac tcgctgtctg 18000
gccatacatg attgctttgt caagaacgtt gactggtcca tcacataccc atttattggt 18060
aatgaggctg ttattaataa gagcggccga attgtgcaat cacacactat gcggtcagtt 18120
cttaagttat acaatccgaa agccatatat gatattggca atcctaaggg cattagatgt 18180
gccgtaacgg atgctaagtg gttttgcttt gacaagaatc ctactaattc taatgtcaag 18240
acattggagt atgactatat aacacatggc caatttgatg ggttgtgctt gttttggaat 18300
tgcaatgtag acatgtatcc agaattttct gtggtctgtc gttttgatac tcgctgtagg 18360
tcaccactca acttggaggg ttgtaatggt ggttcactgt atgttaataa tcatgcattc 18420
catacaccgg cttttgacaa gcgtgctttt gctaagttga agccaatgcc atttttcttt 18480
tatgatgata ctgagtgtga caagttacag gactccataa actatgttcc tcttagggct 18540
agtaactgca ttactaaatg taatgttggt ggtgctgtct gtagtaagca ttgtgctatg 18600
tatcatagct atgttaatgc ttacaacact tttacgtcgg cgggctttac tatttgggtg 18660
cctacttcgt ttgacaccta taatctgtgg cagacattta gtaacaattt gcaaggtctt 18720
gagaacattg ctttcaatgt cgtaaagaaa ggatcttttg ttggtgccga aggtgaactt 18780
cctgtagctg tggttaatga caaagtgctc gttagagatg gtactgttga tactcttgtt 18840
tttacaaaca agacatcact acccactaac gtagcttttg agttgtatgc caagcgtaag 18900
gtaggactca ccccacccat tacgatccta cgtaacttgg gtgtagtttg tacatctaag 18960
tgtgtcattt gggactatga agccgaacgt ccacttacta cttttacaaa ggatgtttgt 19020
aaatataccg actttgaggg tgacgtctgt acactctttg ataacagcat tgttggttca 19080
ttagagcgat tctccatgac ccaaaatgct gtgcttatgt cacttacagc tgttaaaaag 19140
cttactggca taaagttaac ttatggttat cttaatggtg tcccagttaa cacacatgaa 19200
gataaacctt ttacttggta tatttacact aggaagaacg gcaagttcga ggaccatcct 19260
gatggctatt ttacccaagg tagaacaacc gctgatttta gccctcgtag cgacatggaa 19320
aaggacttcc taagtatgga tatgggtctg tttattaaca agtacggact tgaagattac 19380
ggctttgagc acgttgtgta tggtgatgtt tcaaaaacca cccttggtgg tttgcatcta 19440
ctaatttcgc aggtgcgtct ggcctgtatg ggtgtgctca aaatagacga gtttgtgtct 19500
agtaatgata gcacgttaaa gtcttgtact gttacatatg ctgataaccc tagtagtaag 19560
atggtttgta cgtatatgga tctcctgctt gacgattttg tcagcattct taaatctttg 19620
gatttgggcg ttgtatctaa agttcatgaa gttatggtcg attgtaaaat gtggaggtgg 19680
atgttgtggt gtaaggatca taaactccag acattttatc cgcaacttca ggccagtgaa 19740
tggaagtgtg gttattccat gccttctatt tacaagatac aacgtatgtg tttagaacct 19800
tgcaatctct acaactatgg tgctggtatt aagttacctg atggcattat gtttaacgta 19860
gttaaataca cacagctttg tcaatatctc aatagcacca caatgtgtgt accccatcac 19920
atgcgtgtgc tacatcttgg tgctggctcc gacaagggtg ttgcacctgg cacggctgtc 19980
ttacgacgtt ggttgccact ggatgccatt atagttgaca atgatagtgt ggattacgtt 20040
agcgatgctg attatagtgt tacaggagat tgctctacct tatacctgtc agataagttt 20100
gatttagtta tatctgatat gtatgatggt aagattaaaa gttgtgatgg ggagaacgtg 20160
tctaaagaag gcttctttcc ctatattaat ggtgtcatca ccgaaaagtt ggcacttggt 20220
ggtactgtag ctattaaggt gacggagttt agttggaata agaagttgta tgaactcatt 20280
cagaggtttg agtattggac aatgttctgt accagtgtta acacgtcatc gtcagaggca 20340
ttcttaattg gtgttcacta tttaggtgat tttgcaagtg gcgctgtgat tgacggcaac 20400
actatgcatg ccaattatat cttctggcgt aattccacaa ttatgactat gtcttacaat 20460
agtgtacttg atttaagcaa gttcaattgt aagcataagg ctacagttgt cattaattta 20520
aaagattcat ccattagtga tgttgtgtta ggtttgttga agaatggtaa gttgctagtg 20580
cgtaataatg acgccatttg tggtttttct aatcatttgg tcaacgtaaa caaatgaagt 20640
ctttaaccta cttctggttg ttcttaccag tactttcaac acttagccta ccacaagatg 20700
tcaccaggtg ctcagctaac actaatttta ggcggttctt ttcaaaattt aatgttcagg 20760
cgcctgcagt tgttgtactg ggcggttatc tacctattgt caattcaact tggtactgtg 20820
ctggccaaca tccaactgct agtggcgttc atggtatctt tgttagccat attagaggtg 20880
gtcatggctt tgagattggc atttcgcaag agccttttga ccctagtggt taccagcttt 20940
atttacataa ggctactaac ggtaacacta atgctactgc gcgactgcgc atttgccagt 21000
ttcctagcat taaaacattg ggccccactg ctaataatga tgttacaaca ggtcgtaatt 21060
gcctatttaa caaagccatc ccagctcata tgagtgaaca tagtgttgtc ggcataacat 21120
gggataatga tcgtgtcact gtcttttctg acaagatcta ttatttttat tttaaaaatg 21180
attggtcccg tgttgcgaca aagtgttaca acagtggagg ttgtgctatg caatatgttt 21240
acgaacccac ctattacatg cttaatgtta ctagtgctgg tgaggatggt atttcttatc 21300
aaccctgtac agctaattgc attggttatg ctgccaatgt atttgctact gagcccaatg 21360
gccacatacc agaaggtttt agttttaata attggtttct tttgtccaat gattccactt 21420
tggtgcatgg tacggtggtt tccaaccaac cattgttggt caattgtctt ttggccattc 21480
ctaagattta tggactaggc caatttttct cctttaatca aacgatcgat ggtgtttgta 21540
atggagctgc tgtgcagcgt gcaccagagg ctctgaggtt taatattaat gacacctctg 21600
tcattcttgc tgaaggctca attgtacttc atactgcttt aggaacaaat ttttcttttg 21660
tttgcagtaa ttcctcaaat cctcacttag ccaccttcgc catacctttg ggtgctaccc 21720
aagtacccta ttattgtttt tttaaagtgg atacttacaa ctccaatgtt tataaattct 21780
tggctgtttt acctccaacc gtcagggaaa ttgtcatcac caagtatggt gatgtttatg 21840
tcaatgggtt tggatacttg catctcggtt tgttggatgc tgtcacaatt aatttcactg 21900
gtcatggcac tgacgatgat gtttctggtt tttggaccat agcatcgact aattttgttg 21960
atgcactcat cgaagttcaa ggaaccgcca ttcagcgtat tctttattgt gatgatcctg 22020
ttagccaact caagtgttct caggttgctt ttgaccttga cgatggtttt taccctattt 22080
cttctagaaa ccttctgagt catgaacagc caatttcttt tgttactctg ccatcattta 22140
atgatcattc ttttgttaac attactgtat ctgcttcctt tggtggtcat agtggtgcca 22200
accttattgc atctgacact actatcaatg ggtttagttc tttctgtgtt gacactagac 22260
aatttaccat ttcactgttt tataacgtta caaacagtta tggttatgtg tctaaatcac 22320
aggacagtaa ttgccctttc accttgcaat ctgttaatga ttacctgtct tttagcaaat 22380
tttgtgtttc caccagcctt ttggctagtg cctgtaccat agatcttttt ggttaccctg 22440
agtttggtag tggtgttaag tttacgtccc tttactttca attcacaaag ggtgagttga 22500
ttactggcac gcctaaacca cttgaaggtg tcacggacgt ttcttttatg actctggatg 22560
tgtgtaccaa gtatactatc tatggcttta aaggtgaggg tatccttacc cttacaaatt 22620
ctagcttttt ggcaggtgtt tattacacat ctgattctgg acagttgtta gcctttaaga 22680
atgtcactag tggtgctgtt tattctgtta cgccatgttc tttttcagag caggctgcat 22740
atgttgatga tgatatagtg ggtgttattt ctagtttgtc tagctccact tttaacagta 22800
ctagggagtt gcctggtttc ttctaccatt ctaatgatgg ctctaattgt acagagcctg 22860
tgttggtgta tagtaacata ggtgtttgta aatctggcag tattggctac gtcccatctc 22920
agtctggcca agtcaagatt gcacccacgg ttactgggaa tattagtatt cccaccaact 22980
ttagtatgag tattaggaca gaatatttac agctttacaa cacgcctgtt agtgttgatt 23040
gtgccacata tgtttgtaat ggtaactctc gttgtaaaca attactcacc cagtacactg 23100
cagcatgtaa gaccatagag tcagcattac aactcagcgc taggcttgag tctgttgaag 23160
ttaactctat gcttactatt tctgaagagg ctctacagtt agctaccatt agttcgttta 23220
atggtgatgg atataatttt actaatgtgc tgggtgtttc tgtgtatgat cctgcaagtc 23280
gcagggtggt acaaaaaagg tcttttattg aagacctgct ttttaataaa gtggttacta 23340
atggccttgg tactgttgat gaagactata agcgctgttc taatggtcgc tctgtggcag 23400
atctagtctg tgcacagtat tactctggtg tcatggtact acctggtgtt gttgacgctg 23460
agaagcttca catgtatagt gcgtctctca tcggtggtat ggtgctagga ggttttactt 23520
ctgcagcggc attgcctttt agctatgctg ttcaagctag actcaattat cttgctctac 23580
agacggatgt tctacagcgg aaccagcaat tgcttgctga gtcttttaac tctgctattg 23640
gtaatataac ttcagccttt gagagtgtta aagaggctat tagtcaaact tccaagggtt 23700
tgaacactgt ggctcatgcg cttactaagg ttcaagaggt tgttaactcg cagggtgcag 23760
ctttgactca acttaccgta cagctgcaac acaacttcca agccatttct agttctattg 23820
atgacattta ctctcgactg gacattcttt cagccgatgt tcaggttgac cgtctcatca 23880
ccggcagatt atcagcactt aatgcttttg ttgctcaaac cctcactaag tatactgagg 23940
ttcaggctag caggaagtta gcacagcaaa aggttaatga gtgcgttaaa tcgcaatctc 24000
agcgttatgg tttttgtggt ggtgatggcg agcacatttt ctctctggta caggcagcac 24060
ctcagggcct gctgttttta catacagtac ttgtaccgag tgattttgta gatgttattg 24120
ccatcgctgg cttatgcgtt aacgatgaaa ttgccttgac tctacgtgag cctggcttag 24180
tcttgtttac gcatgaactt caaaatcata ctgcgatgga atattttgtt tcatcgcgac 24240
gtatgtttga acctagaaaa cctaccgtta gtgattttgt tcaaattgag agttgtgtgg 24300
tcacctatgt caatttgact agagaccaac taccagatgt aatcccagat tacatcgatg 24360
ttaacaaaac acttgatgag attttagctt ctctgcccaa tagaactggt ccaagtcttc 24420
ctttagatgt ttttaatgcc acttatctta atctcactgg tgaaattgca gatttacagc 24480
agcgttcaga gtctctccgt aatactacag aggagctcca aagtcttata tataatatca 24540
acaacacact agttgacctt gagtggctca accgagttga gacatatatc aagtggccgt 24600
ggtgggtttg gttgattatt ttcattgttc tcatctttgt tgtgtcatta ctagtgttct 24660
gctgcatttc cacgggttgt tgtggatgct gcggctgctg ctgtgcttgt ttctcaggtt 24720
gttgtagggg tcctagactt caaccttacg aagttcacga ttgacacagt tgtcaaagat 24780
gtctcaaagt ctgctaactt gtctttgtat gctgtccaag agttggagct caatgtagtt 24840
ccaattagac aagcttcaaa tgtgacgggt tttcttttca ccagtgtttt tatctacttc 24900
tttgcactgt ttaaagcgtc ttctttgagg cgcaattata ttatgttggc agcgcgtttt 24960
gctgtcattg ttctttattg cccactttta tattattgtg gtgcattttt agatgcaact 25020
attatttgtt gcacacttat tggcaggctt tgtttagtct gcttttactc ctggcgctat 25080
aaaaatgcgc tctttattat ttttaatact acgacacttt ctttcctcaa tggtaaagca 25140
gcttattatg acggcaaatc cattgtgatt ttagaaggtg gtgaccatta catcactttt 25200
ggcaactctt ttgttgcttt tagtagcatc gacttgtatc tagctatacg tgggcggcaa 25260
gaagctgacc tacagctgtt gcgaactgtt gagcttcttg atggcaagaa gctttatgtc 25320
ttttcgcaac atcaaattgt tggcattact aatgctgcat ttgactcaat tcaactagac 25380
gagtatgcta caattagtga atgataatgg tctagtagtt aatgttatac tttggctttt 25440
cgtactcttt ttcctgctta ttataagcat tactttcgtc caattggtta atctgtgctt 25500
cacttgtcac cggttgtgta atagcgcagt ttacacacct atagggcgtt tgtatagagt 25560
ttataagtct tacatgcaaa tagaccccct ctctagtact gttattgacg tataaacgaa 25620
atatgtctaa cggttctatt cccgttgatg aggtgattca acaccttaga aactggaatt 25680
tcacatggaa tatcatactg acgatactac ttgtagtgct tcagtatggc cattacaagt 25740
actctgcgtt cttgtatggt gtcaagatgg ctattctatg gatactttgg cctcttgtgt 25800
tagcactgtc actttttgat gcatgggcta gctttcaggt caattgggtc ttttttgctt 25860
tcagcatcct tatggcttgc atcactctta tgctgtggat aatgtacttt gtcaatagca 25920
ttcggttgtg gcgcaggaca cattcttggt ggtctttcaa tcctgaaaca gacgcgcttc 25980
tcacaacttc tgtgatgggc cgacaggtct gcattccagt gcttggagca ccaactggtg 26040
taacgctaac actccttagt ggtacattgc ttgtagaggg ctataaggtt gctactggcg 26100
tacaggtaag tcaattacct aatttcgtca cagtcgccaa ggccactaca acaattgtct 26160
acggacgtgt tggtcgttca gtcaatgctt catctggcac tggttgggct ttctatgtcc 26220
ggtccaaaca cggcgactac tcagctgtga gtaatccgag ttcggttctc acagatagtg 26280
agaaagtgct tcatttagtc taaacagaaa ctttatggct tctgtcagtt ttcaggatcg 26340
tggccgcaaa cgggtgccat tatccctcta tgcccctctt agggttacta atgacaaacc 26400
cctttctaag gtacttgcaa ataatgctgt acccactaat aaaggaaata aggaccagca 26460
aattggatac tggaatgagc aaattcgctg gcgcatgcgc cgtggtgagc gaattgaaca 26520
accttccaat tggcatttct actacctcgg aacaggacct cacgccgacc tccgctatag 26580
gactcgtact gagggtgttt tctgggttgc taaagaaggc gcaaagactg aacccactaa 26640
cctgggtgtc agaaaggcgt ctgaaaagcc aattattcca aatttctctc aacagcttcc 26700
cagcgtagtt gagattgttg aacctaacac acctcctact tcacgtgcaa attcacgtag 26760
caggagtcgt ggtaatggca acaacaggtc cagatctcca agtaacaaca gaggcaataa 26820
ccagtcccgc ggtaattcac agaatcgtgg aaataaccag ggtcgtggag cttctcagaa 26880
cagaggaggc aataataata acaataacaa gtctcgtaac cagtccaaga acagaaacca 26940
gtcaaatgac cgtggtggtg taacatcacg cgatgatctg gtggctgctg tcaaggatgc 27000
ccttaaatct ttgggtattg gcgaaaaccc tgacaagctt aagcaacagc agaagcccaa 27060
acaggaaagg tctgacagca gcggcaaaaa tacacctaag aagaacaaat ccagagccac 27120
ttcgaaagaa cgtgacctca aagacatccc agagtggagg agaattccca agggcgaaaa 27180
tagcgtagca gcttgcttcg gacccagggg aggcttcaaa aattttggag atgcggaatt 27240
tgtcgaaaaa ggtgttgatg cctcaggcta tgctcagatc gccagtttag caccaaatgt 27300
tgcagcattg ctctttggtg gtaatgtggc tgttcgtgag ctagcggact cttacgagat 27360
tacatataat tataaaatga ctgtgccaaa gtctgatcca aatgtagagc ttcttgtttc 27420
acaggtggat gcatttaaaa ctgggaatgc aaaaccccag agaaagaagg aaaagaagaa 27480
caagcgtgaa accacgcagc agctgaatga agaggccatc tacgatgatg tgggtgtgcc 27540
atctgatgtg actcatgcca atttggaatg ggacacagct gttgatggtg gtgacacggc 27600
cgttgaaatt atcaacgaga tcttcgacac aggaaattaa acaatttttg actggcttat 27660
cctggctatg tcccagggta gtgccattac actgttatta ctgagtgttt ttctagcgac 27720
ttggctgctg ggctatggct ttgccctcta actagcggtc ttggtcttgc acacaacggt 27780
aagccagtgg taatgtcagt gcaagaagga tattaccata gcactgtcat gaggggaacg 27840
cagtaccttt tcatctaaac ctttgcacga gtaatcaaag atccgcttga cgagcctata 27900
tggaagagcg tgccaggtat ttgactcaag gactgttagt aactgaagac ctgacggtgt 27960
tgatatggat acac 27974
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 3
acgtcccttt actttcaatt caca 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
tatacttggt acacacatcc agagtca 27
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 5
tgagttgatt actggcacgc ctaaaccac 29
Claims (15)
- 돼지유행성설사병 (porcine epidemic diarrhea, PED) 바이러스 (parental virus) (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 시킨 변이주로서, 상기 변이주는 S (spike) 글리코단백질 유전자 N-말단 영역 중 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부의 결실을 포함하고, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC13201BP, KCTC13202BP, KCTC13203BP 또는 KCTC13204BP로 기탁된 것인, 돼지유행성설사병 바이러스 변이주.
- 제 1항의 변이주를 유효성분으로 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 백신조성물이 약리학적으로 허용가능 한 담체, 희석제, 보존제 및 면역보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 돼지유행성설사병의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물.
- 제 1항 또는 제 2항의 백신조성물을 투여하여 돼지를 면역화 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항의 백신조성물을 돼지에 투여하여 PED를 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하는 방법.
- 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC13201BP, KCTC13202BP, KCTC13203BP 및 KCTC 13204BP로 기탁된 군에서 선택된 2개 이상의 변이주를 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 혼합백신 조성물.
- 돼지유행성설사병 바이러스 (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 하고, 상기 바이러스의 S (spike) 단백질 유전자 N-말단 영역 중 전체 유전체를 기준으로 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부가 결실된 변이주를 수득하여, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC13201BP, KCTC13202BP, KCTC13203BP 또는 KCTC13204BP로 기탁된 돼지유행성설사병 바이러스 변이주를 제조하는 것을 포함하는,
돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물의 제조방법. - 돼지유행성설사병 바이러스 (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 시킨 변이주로서,
상기 변이주는 S (spike) 글리코단백질 유전자 N-말단 영역 중 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부가 결실되고,
S 글리코단백질 유전자와 ORF 유전자의 접합부 중 전체 유전체 기준으로 제 24,771째 내지 제 24,816째 염기서열이 결실된 것을 포함하는 것인,
돼지유행성설사병 바이러스 변이주. - 제 8항에 있어서, 상기 변이주는, ORF3 N-말단 영역에 전체 유전체를 기준으로 제 24,794째 내지 제 24,863째 염기서열이 결실된 것을 더 포함하는 것인, 돼지유행성설사병 바이러스 변이주.
- 제 8항 또는 제 9항의 변이주를 유효성분으로 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 백신조성물이 약리학적으로 허용가능 한 담체, 희석제, 보존제 및 면역보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 돼지유행성설사병의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물.
- 제 8항 또는 제 9항의 백신조성물을 투여하여 돼지를 면역화 하는 방법.
- 제 8항 또는 제 9항의 백신조성물을 돼지에 투여하여 PED를 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하는 방법.
- 돼지유행성설사병 바이러스 (Genebank accession no. KR873434)를 베로세포에서 연속하여 100 계대 배양하여 약독화 하여,
S (spike) 글리코단백질 유전자 N-말단 영역 전체 유전체를 기준으로 N-말단 영역의 제56째 내지 제60째 염기서열의 전부 또는 일부가 결실되고,
S 글리코단백질 유전자와 ORF 유전자의 접합부 중 전체 유전체 기준으로 제 24,771째 내지 제 24,816째 염기서열이 결실된 것인,
돼지유행성설사병 바이러스 변이주를 제조하는 것을 포함하여,
돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물의 제조방법. - 제 14항에 있어서, 상기 변이주의 ORF3 N-말단 영역 중 전체 유전체를 기준으로 제 24,794째 내지 제 24,863째 염기서열이 더 결실된 것인 변이주를 제조하는 것을 포함하는, 돼지유행성설사병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 백신조성물의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170090082A KR102049147B1 (ko) | 2017-07-16 | 2017-07-16 | 신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170090082A KR102049147B1 (ko) | 2017-07-16 | 2017-07-16 | 신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190008508A true KR20190008508A (ko) | 2019-01-24 |
| KR102049147B1 KR102049147B1 (ko) | 2019-11-26 |
Family
ID=65277378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170090082A KR102049147B1 (ko) | 2017-07-16 | 2017-07-16 | 신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102049147B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102194347B1 (ko) * | 2020-01-31 | 2020-12-22 | 대한민국 | 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법 |
| CN114317815A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-04-12 | 江苏蓬祥畜禽生态养殖有限公司 | 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法 |
| CN117143207A (zh) * | 2023-09-05 | 2023-12-01 | 湖南派智生物科技有限公司 | 一种重组表位蛋白、编码基因、重组质粒、制备方法、工程菌及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040092760A (ko) * | 2003-04-29 | 2004-11-04 | 박봉균 | 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 상기 바이러스를 검출하는 방법 |
| KR100773141B1 (ko) * | 2006-10-26 | 2007-11-02 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 돼지 유행성 설사 바이러스 ｏｒｆ3 폴리펩티드 변이체,그를 코딩하는 핵산, ｏｒｆ3 변이체 및 변이 유전자를이용하여 야생형과 약독화형 ｐｅｄｖ를 구별하는 방법 및야생형과 약독화형 ｐｅｄｖ를 구별하기 위한 키트 |
| KR20160075378A (ko) * | 2014-12-19 | 2016-06-29 | 경북대학교 산학협력단 | 신규한 돼지 유행성설사 바이러스 및 그의 이용 |
-
2017
- 2017-07-16 KR KR1020170090082A patent/KR102049147B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040092760A (ko) * | 2003-04-29 | 2004-11-04 | 박봉균 | 약독화된 돼지 유행성설사병 바이러스, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 상기 바이러스를 검출하는 방법 |
| KR100773141B1 (ko) * | 2006-10-26 | 2007-11-02 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 돼지 유행성 설사 바이러스 ｏｒｆ3 폴리펩티드 변이체,그를 코딩하는 핵산, ｏｒｆ3 변이체 및 변이 유전자를이용하여 야생형과 약독화형 ｐｅｄｖ를 구별하는 방법 및야생형과 약독화형 ｐｅｄｖ를 구별하기 위한 키트 |
| KR20160075378A (ko) * | 2014-12-19 | 2016-06-29 | 경북대학교 산학협력단 | 신규한 돼지 유행성설사 바이러스 및 그의 이용 |
Non-Patent Citations (35)
| Title |
|---|
| Boniotti, M.B., Papetti, A., Lavazza, A., Alborali, G., Sozzi, E., Chiapponi, C., Faccini, S., Bonilauri, P., Cordioli, P., Marthaler, D., 2016. Porcine epidemic diarrhea virus and discovery of a recombinant swine enteric coronavirus, Italy. Emerg. Infect. Dis. 22, 8387. |
| Chen, Q., Li, G., Stasko, J., Thomas, J.T., Stensland, W.R., Pillatzki, A.E., Gauger, P.C., Schwartz, K.J., Madson, D., Yoon, K.J., Stevenson, G.W., Burrough, E.R., Harmon, K.M., Main, R.G., Zhang, J., 2014. Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States. J. Clin. Microbiol. 52, 234243. |
| Duarte, M., Laude, H., 1994. Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus. J. Gen. Virol. 75, 11951200. |
| Gerber, P.F., Gong, Q., Huang, Y.W., Wang, C., Holtkamp, D., Opriessnig, T., 2014. Detection of antibodies against porcine epidemic diarrhea virus in serum and colostrum by indirect ELISA. Vet. J. 202, 3336. |
| Grasland, B., Bigault, L., Bernard, C., Quenault, H., Toulouse, O., Fablet, C., Rose, N., Touzain, F., Blanchard, Y., 2015. Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea S gene indel strain isolated in France in December 2014. Genome Announc. 3, e00535-15. |
| Hanke, D., Jenckel, M., Petrov, A., Ritzmann, M., Stadler, J., Akimkin, V., Blome, S., Pohlmann, A., Schirrmeier, H., Beer, M., Hoper, D., 2015. Comparison of porcine epidemic diarrhea viruses from Germany and the United States, 2014. Emerg. Infect. Dis. 21, 493496. |
| Kim, S.H., Lee, J.M., Jung, J., Kim, I.J., Hyun, B.H., Kim, H.I., Park, C.K., Oem, J.K., Kim, Y.H., Lee, M.H., Lee, K.K., 2015. Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Korea from 1998 to 2013. Arch. Virol. 160, 10551064. |
| Kocherhans, R., Bridgen, A., Ackermann, M., Tobler, K., 2001. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence. Virus Genes 23, 137144. |
| Kweon, C.H., Kwon, B.J., Jung, T.S., Kee, Y.J., Hur, D.H., Hwang, E.K., Rhee, J.C., An, S.H., 1993. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Korea. Korean J. Vet. Res. 33, 249254. |
| Lai, M.M., Perlman, S., Anderson L.J., 2007. Coronaviridae. In: Knipe, D.M., Howley, P.M., Griffin, D.E., Martin, M.A., Lamb, R.A., Roizman, B., Straus, S.E. (Eds.), Fields Virology. 5th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA, pp. 13061336. |
| Lee, C., 2015. Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging epizootic swine virus. Virol. J. 12, 193. |
| Lee, D.K., Park, C.K., Kim, S.H., Lee, C., 2010. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea. Virus Res. 149, 175182. |
| Lee, S., Kim, Y., Lee, C., 2015. Isolation and characterization of a Korean porcine epidemic diarrhea virus strain KNU-141112. Virus Res. 208, 215224. |
| Lee, S., Ko, D.H., Kwak, W.K., Lim, C.H., Moon, S.U., Lee, D.S., Lee, C., 2014a. Reemergence of porcine epidemic diarrhea virus on Jeju Island. Korean J. Vet. Res. 54, 185188. |
| Lee, S., Lee, C., 2014. Outbreak-related porcine epidemic diarrhea virus strains similar to US strains, South Korea, 2013. Emerg. Infect. Dis. 20, 12231226. |
| Lee, S., Lee, C., 2015. Phenotypic and genotypic characterization associated with cell adaptation of porcine epidemic diarrhea virus. In: Proceedings of the 2015 North American PRRS Symposium, pp. 62. |
| Lee, S., Park, G.S., Shin, J.H., Lee, C., 2014b. Full-genome sequence analysis of a variant strain of porcine epidemic diarrhea virus in South Korea. Genome Announc. 2, e01116-14. |
| Lee, Y.N., Lee, C., 2013. Complete genome sequence of a novel porcine parainfluenza virus 5 isolate in Korea. Arch. Virol. 158, 17651772. |
| Li, W., Li, H., Liu, Y., Pan, Y., Deng, F., Song, Y., Tang, X., He, Q., 2012. New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg. Infect. Dis. 8, 13501353. |
| Lin, C.N., Chung, W.B., Chang, S.W., Wen, C.C., Liu, H., Chien, C.H., Chiou, M.T., 2014. US-like strain of porcine epidemic diarrhea virus outbreaks in Taiwan, 20132014. J. Vet. Med. Sci. 76, 12971299. |
| Mesquita, J.R., Hakze-van der Honing, R., Almeida, A., Lourenco, M., van der Poel, W.H., Nascimento, M.S., 2015. Outbreak of porcine epidemic diarrhea virus in Portugal, 2015. Transbound. Emerg. Dis. 62, 586588. |
| Mole, B., 2013. Deadly pig virus slips through US borders. Nature 499, 388. |
| Oh, J., Lee, K.W., Choi, H.W., Lee, C., 2014. Immunogenicity and protective efficacy of recombinant S1 domain of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein. Arch. Virol. 159, 29772987. |
| Oldham, J., 1972. Letter to the editor. Pig Farming 10, 7273. |
| Park, C.K., Lee, C., 2009. Clinical examination and control measures in a commercial pig farm persistently infected with porcine epidemic diarrhea virus. J. Vet. Clin. 26, 463466. |
| Park, C.K., Lee, K.K., Lee, C., 2011. PED past, present, and future. In: Proceedings of the 5th Asian Pig Veterinary Society Congress, Pattaya, Thailand, pp. S1920. |
| Pensaert, M.B., Debouck, P., 1978. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch. Virol. 58, 243247. |
| Saif, L.J., Pensaert, M.B., Sestak, K., Yeo, S.G., Jung, K., 2012. Coronaviruses. In: Zimmerman, J.J., Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J., Stevenson, G.W. (Eds.), Diseases of Swine, 10th ed. Wiley-Blackwell, Ames, IA, USA, pp. 501524. |
| Steinrigl, A., Fernandez, S.R., Stoiber, F., Pikalo, J., Sattler, T., Schmoll, F., 2015. First detection, clinical presentation and phylogenetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Austria. BMC Vet. Res. 11, 310. |
| Stevenson, G.W., Hoang, H., Schwartz, K.J., Burrough, E.R., Sun, D., Madson, D., Cooper, V.L., Pillatzki, A., Gauger, P., Schmitt, B.J., Koster, L.G., Killian, M.L., Yoon, K.J., 2013. Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences. J. Vet. Diagn. Invest. 25, 649654. |
| Suzuki, T., Murakami, S., Takahashi, O., Kodera, A., Masuda, T., Itoh, S., Miyazaki, A., Ohashi, S., Tsutsui, T., 2015. Molecular characterization of pig epidemic diarrhoea viruses isolated in Japan from 2013 to 2014. Infect. Genet. Evol. 36, 363368. |
| Theuns, S., Conceicao-Neto, N., Christiaens, I., Zeller, M., Desmarets, L.M., Roukaerts, I.D., Acar, D.D., Heylen, E., Matthijnssens, J., Nauwynck, H.J., 2015. Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus from a novel outbreak in Belgium, January 2015. Genome Announc. 3, e00506-15. |
| Vanhee, M., Delputte, P.L., Delrue, I., Geldhof, M.F., Nauwynck, H.J., 2009. Development of an experimental inactivated PRRSV vaccine that induces virus-neutralizing antibodies. Vet. Res. 40, 63. |
| Vlasova, A.N., Marthaler, D., Wang, Q., Culhane, M.R., Rossow, K.D., Rovira, A., Collins, J., Saif, L.J., 2014. Distinct characteristics and complex evolution of PEDV strains, North America, May 2013February 2014. Emerg. Infect. Dis. 20, 16201628. |
| Wang, L., Byrum, B., Zhang, Y., 2014. New variant of porcine epidemic diarrhea virus, United States, 2014. Emerg. Infect. Dis. 20, 917919. |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102194347B1 (ko) * | 2020-01-31 | 2020-12-22 | 대한민국 | 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법 |
| WO2021153873A1 (ko) * | 2020-01-31 | 2021-08-05 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지유행성설사병바이러스 약독화 생백신주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법 |
| CN114317815A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-04-12 | 江苏蓬祥畜禽生态养殖有限公司 | 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法 |
| CN114317815B (zh) * | 2021-09-30 | 2023-10-20 | 江苏蓬祥畜禽生态养殖有限公司 | 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法 |
| CN117143207A (zh) * | 2023-09-05 | 2023-12-01 | 湖南派智生物科技有限公司 | 一种重组表位蛋白、编码基因、重组质粒、制备方法、工程菌及应用 |
| CN117143207B (zh) * | 2023-09-05 | 2024-03-12 | 湖南派智生物科技有限公司 | 一种重组表位蛋白、编码基因、重组质粒、制备方法、工程菌及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102049147B1 (ko) | 2019-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Novel genotype of infectious bronchitis virus isolated in China | |
| RU2561595C2 (ru) | Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs) | |
| Lee et al. | Genetic characteristics, pathogenicity, and immunogenicity associated with cell adaptation of a virulent genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus | |
| KR102389908B1 (ko) | 백신 내의 뎅기 바이러스 키메라 구조체를 위한 조성물 및 방법 | |
| US9187731B2 (en) | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells | |
| IL226253A (en) | Canine / Miami / 05/05 influenza virus capable of infecting canine animals and methods used | |
| Liu et al. | Comparative analysis of four Massachusetts type infectious bronchitis coronavirus genomes reveals a novel Massachusetts type strain and evidence of natural recombination in the genome | |
| WO2013017570A1 (en) | Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells | |
| KR102049147B1 (ko) | 신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 | |
| Xu et al. | Genetic and biological characteristics of four novel recombinant avian infectious bronchitis viruses isolated in China | |
| Lee et al. | Molecular characteristics and pathogenic assessment of porcine epidemic diarrhoea virus isolates from the 2018 endemic outbreaks on Jeju Island, South Korea | |
| Wang et al. | Pathogenicity and immunogenicity of a new strain of porcine epidemic diarrhea virus containing a novel deletion in the N gene | |
| Han et al. | Genetics, antigenicity and virulence properties of three infectious bronchitis viruses isolated from a single tracheal sample in a chicken with respiratory problems | |
| Won et al. | Generation and protective efficacy of a cold-adapted attenuated genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus | |
| US20160008457A1 (en) | Inactivated Vaccine for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) | |
| Jang et al. | Deletion of pentad residues in the N-terminal domain of spike protein attenuates porcine epidemic diarrhea virus in piglets | |
| KR101757331B1 (ko) | 신규한 돼지 유행성설사 바이러스 및 그의 이용 | |
| KR20170002393A (ko) | 비자연적으로 발생하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 및 사용방법 | |
| TW201319083A (zh) | 於易感細胞內誘發第ｉ型干擾素之新穎ｐｒｒｓ病毒 | |
| Niu et al. | Characterization and pathogenicity of the porcine epidemic diarrhea virus isolated in China | |
| US9382518B2 (en) | Pneumovirus compositions and methods for using the same | |
| DEL AISLADO | Antigenic, biological and molecular characterization of the Cuban CSFV isolate “Margarita” | |
| EP4155393A1 (en) | Attenuated variant of the rift valley fever virus, composition comprising same, and uses thereof | |
| KR20200126029A (ko) | 감소된 병독성을 갖는 신규한 돼지유행성설사바이러스 및 이의 용도 | |
| KR101885375B1 (ko) | 신규한 약독화 prrs 바이러스 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |