KR101428843B1

KR101428843B1 - 로타바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR101428843B1
Application number: KR1020110132835A
Authority: KR
Inventors: 김종범; 노경희; 김현욱; 이경렬; 이연희; 이학선; 이은영; 김순희; 정인식; 김원용; 손동화
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 한국식품연구원
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2014-08-13
Also published as: KR20130066128A

Abstract

본 발명은 로타바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 VP7 항원 유전자를 식물 등에 도입하여 제조되는 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산하는 형질전환체; 상기 형질전환체를 제조하기 위한 발현벡터; 상기 형질전환체로부터 분리한 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질; 상기 단백질 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 로타바이러스 질병 치료 및 예방용 백신에 관한 것이다.
본 발명의 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산하는 형질전환체는 백신으로 사용하여 인체 내에 로타바이러스에 대한 항체 형성을 유도할 수 있어 로타바이러스 질병 발생을 예방할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질의 생산 및 백신의 제조는 저렴한 비용으로 대량 생산이 가능하며, 쉽게 보관, 유지 및 이동을 할 수 있을 뿐만 아니라 경구로 투여할 수 있어 주사접종의 불편함 및 비용을 절감할 수 있으며 장관 면역반응의 유도에 있어 뛰어난 효과를 갖는다.

Description

로타바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물 {The transformant for using vaccination against rotavirus and vaccine composition comprising the same}

본 발명은 로타바이러스에 대한 백신효과를 유도하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명의 실시예들은 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 VP7 항원 유전자를 식물 등에 도입하여 제조되는 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산하는 형질전환체; 상기 형질전환체를 제조하기 위한 발현벡터; 상기 형질전환체로부터 분리한 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질; 상기 단백질 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 로타바이러스 질병 치료 및 예방용 백신과 관련된다.

로타바이러스는 영유아에서 설사를 유발하는 주요 바이러스로서 영유아 장염 유발 원인 중 90%이상을 차지하는 가장 중요한 원인체이다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 추산에 의하면 전 세계 5세 이하 어린이 중 연간 1억 2,500만명이 감염되어 50-60만 명의 사망을 초래한다고 알려져 있다.

로타바이러스는 일반적으로 구형이며, 이들의 이름은 이들의 독특한 안과 밖 또는 이중-껍질의 캡시드 구조체로부터 유래하였다. 전형적으로, 로타바이러스의 이중-껍질의 캡시드 구조체는 내부 단백질 껍질 또는 지놈을 함유하는 코어를 에워싸고 있다. 로타바이러스의 지놈은 11개 이상의 구별되는 바이러스 단백질을 인코딩하는 이중가닥 RNA의 11개 절편으로 구성되어 있다. 이들 바이러스 단백질 중 VP4 및 VP7으로 표기되는 두 개는 이중 껍질 캡시드 구조체의 외부에 정렬되어 있다. 로타바이러스의 내부 캡시드에는 하나의 단백질이 존재하는데, 이는 VP6로 표기되는 로타바이러스 단백질이다. 로타바이러스 감염에 뒤따르는 면역 반응을 일으키는데 있어서 이들 세가지 특정 로타바이러스 단백질의 상대적인 중요성은 아직 명확하지 않다. 그럼에도 불구하고, VP6 단백질은 그룹 및 서브그룹 항원을 결정짓고, VP4 및 VP7 단백질은 혈청형 특이성의 결정인자이다.

VP7 단백질은 균주에 따라, 지놈 절편 7, 8 또는 9의 번역 생성물인 38,000 MW 당단백질(글리코실화되지 않은 경우 34,000 MW)이다. 상기 단백질은 로타바이러스 감염에 뒤따르는 주요 중화 항체의 형성을 자극한다. VP7 단백질이 중화 항체에 대한 바이러스 단백질이기 때문에, 이는 로타바이러스 질병에 대한 보호를 가능하게 해주는, 로타바이러스 백신의 개발을 위해 중요한 후보물질로 예상된다.

사람 로타바이러스 감염증에 대한 각종 백신은 1985년경부터 개발이 시도되어 왔다. 그 주류는 항원성이 유사한 비인간 유래의 희석된 바이러스를 백신으로 대용하는 소위 제너방식(Jenerian Approach)에 의한 생백신(live vaccine)의 개발이다. 그러나, 이들 생백신에 관한 임상 시험 테이터가 축적됨에 따라 예방효과가 충분하지 않으며 또한 위장염과 같은 부작용으로 인하여 판매가 금지된 상태이다.

현재 약독화 생백신인 글락소 스미스클라인의 로타릭스와 MSD의 로타텍이 개발되어 있으나 고가로서 접종에 30만원이 소요되므로 경쟁력에 문제가 있다.

식물체를 숙주로 하여 원하는 바이러스를 대량 생산할 경우 바이러스 백신을 개발함에 있어서 비용을 줄일 뿐만 아니라 비교적 안정성이 높은 주사용 백신 또는 직접적인 경구용 백신으로 이용될 수 있다.

이외에도 새로운 백신을 생산하는 소득 작물의 보급으로 농가소득에 기여할 수 있다.

KR 2007-0092290

본 발명의 실시예들은 새로운 로타바이러스 백신을 제공함으로써 로타바이러스 질병을 효과적으로 치료 및 예방하고자 한다.

본 발명의 일 실시예는 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 VP7 항원 유전자를 포함하는 형질전환 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 실시예는 상기 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 실시예는 상기 아그로박테리움 속 미생물로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 실시예는 상기 형질전환체로부터 발현된 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 실시예는 상기 형질전환체의 로타바이러스 질병 치료용 또는 예방용 백신으로서의 용도를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 VP7 항원 유전자를 포함하는 형질전환 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아그로박테리움 속 미생물로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체로부터 발현된 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 유효성분으로 하는 로타바이러스 질병 치료 및 예방을 위한 경구투여용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산하는 형질전환체는 백신으로 사용하여 인체 내에 로타바이러스에 대한 항체 형성을 유도할 수 있어 로타바이러스 질병 발생을 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질의 생산 및 백신의 제조는 저렴한 비용으로 대량 생산이 가능하며, 쉽게 보관, 유지 및 이동을 할 수 있을 뿐만 아니라 경구로 투여할 수 있어 주사접종의 불편함 및 비용을 절감할 수 있으며 장관 면역반응의 유도에 있어 뛰어난 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 로타바이러스 VP7 피막 단백질의 VP7 항원 유전자에서 5'-말단에 ER-태그 (tagging) 아미노산 서열과 3'-말단에 ER-보유 (retention) 아미노산 서열을 포함하는 전체 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 로타바이러스 VP7 항원 유전자를 식물 형질전환 운반체 pB7WG2D로 삽입하는 것을 나타낸 구조도이다.
도 3은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 VP7 유전자가 삽입된 클로닝벡터 VP/pENTR 및 발현벡터 VP7/pB7WG2D 를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 로타바이러스 VP7 항원 유전자로 형질전환된 알팔파 식물체를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 VP7 유전자로 형질전환된 알팔파 식물체를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 형질전환된 알팔파 식물체에서 발현되는 VP7 항원 단백질을 웨스턴 블럿 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 형질전환된 알팔파 식물체를 투여한 실험동물에서 소장 중 전체 IgA 항체 형성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 형질전환된 알팔파 식물체를 투여한 실험동물에서 소장 중 VP7에 특이적인 IgA 항체 형성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 형질전환된 알팔파 식물체를 투여한 실험동물에서 혈중 전체 IgG 항체 형성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 일 실시예에서 서열번호 1의 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 VP7 항원 유전자로 형질전환된 발현벡터 및 형질전환체를 제조하였으며, 이를 이용한 경구 백신 조성물을 개발하였다.

본 발명의 발현벡터는 서열번호 1의 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 것으로, 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현가능하도록 제작된 것이다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 유전자를 발현하는 발현벡터는 도 2에 개시된 개열 지도를 갖는 VP7/pB7WG2D 벡터일 수 있다. VP7/pB7WG2D 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함하고 발현하고자 하는 로타바이러스 VP7 항원 유전자를 그 다음에 포함하고 이 후에 35S 터미네이터를 포함하여 식물에서 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산한다.

그러나 본 발명의 발현벡터는 이에 한정되지 않고, 식물의 형질전환에 유용한 임의의 공지된 벡터를 이용할 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환 시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 예를 들면 CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소 등에서 입수 가능하다. 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측 경계 부위에 형질전환체 선별 마커, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 "벡터(vector)"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "발현벡터"는 목적한 DNA 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 DNA 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산서열은, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호 등을 포함할 수 있다.

또한 상기 발현벡터는 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 운반체를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 형질전환 운반체는 아그로박테리움속 미생물(Agrobacterium sp.)일 수 있으며 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다. 그러나 본 발명의 형질전환 운반체는 이에 한정되지 않고, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며 아그로박테리움속 미생물(Agrobacterium sp.), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteusmirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 세포, 진균 (예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모 (예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포 등을 포함하는 고등 진핵 생물 유래의 세포를 사용할 수 있다.

상기 형질전환 운반체의 제조는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 당업계에 공지된 임의의 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al. Science 227:1229-1231, 1985).

또한, 본 발명은 상기 형질전환 운반체로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 형질전환체는 식물, 아그로박테리움 및 대장균 등의 원핵생물 또는 진핵생물 모두 가능하나, 식물, 식물세포 또는 식물조직일 수 있다.

상기 식물은 모든 종류의 식물이 바람직하나, 구체적으로는 담배, 상추, 배추, 감자, 토마토, 애기장대, 알팔파, 당근을 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 옥수수 등의 단자엽 식물 모두를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알팔파를 포함하는 쌍자엽 식물일 수 있다. 또한 형질전환방법이 잘 알려져 있고 식용이 가능한 클로렐라와 같은 엽록체를 가진 단세포 식물류 또는 조류(algae)도 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 로타바이러스 VP7 항원 유전자를 식물에 도입한 후 발현여부를 알아보기 위하여 단백질 함량이 많고 저장성이 높아 백신으로서 이용 가능성이 높은 알팔파를 사용하였으며, 경구투여용 백신으로서의 이용가능성을 탐색하였다.

얻어진 형질전환체로부터 뿌리를 유도한 후 멸균된 원예용 상토에서 습도가 조절된 환경으로 옮겨 성장시켰다. 얻어진 형질전환체가 실제 도입된 로타바이러스 VP7 항원 유전자를 갖고 있는지를 알아보기 위하여 공지의 방법에 따라 식물체의 게놈 DNA를 분리한 후 PCR을 수행하여 도입된 유전자가 식물세포 게놈 내에 위치함을 확인하였다. 또한 도입된 유전자가 단백질로 정상적으로 발현하는 지 알아보기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 시행하였다. 상기 단백질이 경구투여용 백신으로 사용할 수 있는지는 실험동물에 경구 투여하여 혈중 및 소장 내의 항체 형성능을 검사하였다.

본 발명의 일 예로 제조한 형질전환 알팔파는 로타바이러스 VP7 항원 유전자를 발현하여 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산하였고, 상기 단백질은 면역원성을 가져 혈청과 소장 내에서 항체를 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체로부터 발현된 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 제공한다. 상기 단백질을 통상적인 실험동물에 주입함으로써 로타바이러스 VP7 항원에 대한 항혈청 및 항체를 제조할 수 있다. 상기 로타바이러스 VP7 항원에 대한 항혈청 및 항체는 로타바이러스 VP7 감염을 예방하기 위한 용도로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 바람직한 백신 조성물은 본 발명의 형질전환체로부터 생산된 재조합 로타바이러스 VP7 항원 단백질, 형질전환체로부터 추출된 단백질 추출물, 또는 형질전환체 자체를 포함하는 백신이다. 본 발명의 백신은 경구용 또는 비경구용으로 적용할 수 있으며, 경구투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 식물 형질전환체를 분쇄하여 경구로 투여할 수 있으며 상기 투여로 인해 장관면역반응 및 전신면역반응을 유도할 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 로타바이러스 VP7 피막 단백질의 VP7 항원 유전자의 제조

본 발명에서는 로타바이러스 VP7 피막단백질의 VP7 항원 유전자를 얻기 위하여, 5'-말단에 ER-태그 (tagging) 아미노산 서열과 3'-말단에 ER-보유 (retention) 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 VP7 항원 유전자를 제작하였다.

구체적으로 상기 로타바이러스 VP7 피막단백질은 당단백질이다. 당단백질의 당화는 먼저 세포질에 있는 리보좀에 의하여 단백질이 만들어진 다음 특정 아미노산 서열(leader sequence)의 인도로 ER로 이동하여 ER 내부에서 특정한 아미노산 잔기에 당이 공유결합하는 과정을 거치며 이루어진다. 따라서 당화가 일어나는 ER에 태그시켜야 하므로 이를 위하여 로타바이러스 VP7단백질 자체에 포함되어 있는 VP7 단백질의 아미노말단의 서열번호 3의 ER-태그 아미노산 서열(MYGIEYTTILIFLISIILLNYILKSVTRIMDYIIYRFLLITVALFALTRA)을 이용하였고, 세포 내에 고농도로 집적시키기 위하여 카복시 말단에 서열번호 4의 ER-보유 서열(KDEL)을 접합시켰다(도 1 참조).

실시예 2: VP7 항원 유전자 발현 식물형질전환 운반체 제작

본 발명에서는 로타바이러스 피막단백질 VP7 항원을 발현하는 형질전환된 식물 운반체를 제작하기 위하여, 먼저 식물에 유전자를 도입하기 위한 기본운반체로서 pB7WG2D를 이용하였다. 항원단백질 유전자의 형질전환운반체로의 도입은 실시예 1에서 사용한 ER-태그 서열-VP7 유전자-ER-보유 서열의 유전자세트를 한 단위(도 2 참조)로 5'- 및 3'-말단의 염기서열을 각각 포함하는 서열번호 5의 attB2 프라이머 및 서열번호 6의 attB1 프라이머를 합성하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 이 중합연쇄반응에는 Takara사의 Ex Taq polymerase와 Applied Biosystem사의 GeneAmp PCR system 9700을 사용하였다. 그 결과 attB2-ERT-VP7-ERR-attB1을 포함하는 유전자 단편을 합성하고, 1% 아가로스 젤에서 전기 영동한 다음 단편을 분리하였다. 이 유전자 세트 단편은 BP 클로나제(clonase)(Gateway BP ClonaseII Enzyme Mix, Invitrogen사) 를 이용하는 반응을 통하여 VP7 유전자세트를 pENTR 플라스미드에 클로닝하고 이를 VP7/pENTR로 명명하였다. 이 클로닝벡터 VP7/pENTR는 LR 클로나제(clonase)(Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix, Invitrogen사)의 효소작용으로 식물형질전환을 위한 기본운반체인 pB7WG2D에 클로닝되었고 이를 VP7/pB7WG2D로 명명하였다. 이 발현벡터 VP7/pB7WG2D의 주요구조는 35S 프로모터와 35S 터미네이터를 포함하는 유전자세트로 이외에 식물에 도입되는 요소로서는 식물에서의 형질전환체를 선발하기 위한 선별 마커인 bar 유전자, 형질전환된 미생물을 선발하기 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 포함하고 있다. 상기 과정을 거친 발현벡터 VP7/pB7WG2D를 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 형질전환 하였고, 스펙티노마이신(spectinomycin)을 포함하는 배지에서 형질전환된 클론을 선발하였고, 이 선발된 클론을 PCR 반응과 1% 아가로스 젤 전기영동을 하여 크기를 비교하므로 확인하였다. 상기 PCR은 VP7 유전자의 5'- 및 3'-말단의 염기서열을 각각 포함하는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머들(프라이머 1, 프라이머 2)과 VP7 유전자의 5'-말단으로부터 35S 프로모터의 350bp 크기를 포함하는 서열번호 9의 5'-말단 프라이머(35S 프라이머)와 서열번호 5의 attB2 프라이머를 이용하였다. 그 결과 VP7 유전자의 양말단의 염기서열을 포함하는 프라이머 1과 프라이머 2를 사용하여 PCR을 하였을 때, 1.0Kb 크기의 밴드를 확인함으로 운반체 내 VP7 유전자가 존재함이 확인되었다. 또한 35S 프라이머와 attB2 프라이머를 사용하였을 때 1.4Kb 크기의 밴드를 확인함으로 VP7 유전자가 35S 프로모터에 잘 접합되어 있음을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 이렇게 확인된 발현벡터 VP7/pB7WG2D를 포함하고 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)을 알팔파 형질전환에 이용하였다.

실시예 3: VP7 항원 유전자로 형질전환된 알팔파 식물체의 제작 및 확인

본 발명에서는 로타바이러스 VP7 항원 유전자로 형질전환된 알팔파 식물체를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제작된 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)을 이용하여 알팔파를 형질전환하였다. 조직배양 배지는 감보그(Gamborg) B-5배지를 기본배지로 이용하였다. 구체적으로, 알팔파의 잎을 양면으로 절단 한 다음 상기 아그로박테리움으로 감염시키고 MS0 배지에서 암상태에서 3일간 공동배양한 후 1/2MS0 배지로 세척한 다음 다시 1/2MS0 배지에서 암상태로 4일간 공동배양하였다. 공동배양이 끝난 식물 조직은 250ppm 카르베니실린 (carbenicillin), 5ppm 포스피노트리신 (phosphinothricin), 3ppm의 제아틴 (zeatin)을 포함하는 선발배지에서 재분화를 유도하였고, 재분화체가 나오기까지 2주 마다 계대하였다. 선발된 재분화체는 250ppm 카르베니실린, 5ppm 포스피노트리신를 포함하는 MS배지에서 뿌리를 유도한 후, 멸균된 원예용 상토에서 습도가 조절된 환경에서 순화과정을 거쳤다(도 4 참조). 형질전환 알팔파는 게놈 DNA (genomic DNA)를 주형으로 실시예 2에서 사용한 attB1 프라이머 및 attB2 프라이머를 이용하여 PCR반응 후 1% 아가로스 젤 전기영동하여 밴드 크기(1.0Kb)를 비교하므로 확인할 수 있었다(도 5 참조).

실시예 4: 형질전환 알팔파에서 로타바이러스 VP7 항원 단백질 생성 확인

본 발명에서는 상기 형질전환된 알팔파 식물체를 이용하여 로타바이러스 VP7 항원 단백질을 생산하기 위하여, 형질전환 알팔파 잎을 액체질소 아래서 파쇄한 다음 잎조직 분말을 마이크로튜브 (microtube)에 0.5ml을 채우고, PBST 완충용액 (phosphate-buffered saline+0.025% Tween 20)를 1ml 첨가하여 균질기로 약 2분간 3회 균질화시켰다. 원심분리후 상층액을 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 하였다.

상기 웨스턴 블럿 분석은 10% SDS-PAGE 전기영동 후 반건조 블럿 (semi-dry blot) 시스템을 이용하여 멤브레인 (membrane)에 고정한 다음 5% 탈지유를 포함하는 차단 용액을 가하여 4℃에서 하룻밤 동안 차단시켰다. 그 다음 rabbitd에서 조제된 1차 항체(중앙대학교 김원용교수로부터 분양 받음) 를 가하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 PBST 용액으로 4회 세척한 다음 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP-conjugated 를 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음 PBST 용액으로 멤브레인을 4회 세척한 후 기질용액을 가하여 발색시키고 X-선 필름에 감광시켜 항원 단백질의 발현을 확인하였다(도 6 참조). 그 결과 33, 35, 55, 67, 85, 87, 75, 83, 86, 87, 98, 99번 개체에서 강한 발현을 보였다.

실시예 5: 실험동물을 이용한 형질전환 알팔파의 로타바이러스 VP7 항원에 대한 항체유도 검정

본 발명에서는 실험동물에서 형질전환된 알팔파 식물체가 로타바이러스 VP7 항원에 대한 항체를 유도할 수 있는 지를 조사하였다. 구체적으로 로타바이러스 VP7으로 형질전환한 알팔파의 물 추출물을 동결건조하고 이를 생쥐 1마리당 40 mg씩 CT 10 ug과 함께 매일 존데로 7 주령의 C3H/He 생쥐에 경구투여하였다. 이때 비형질전환 알팔파(대조군)도 같은 방법으로 처리하였고, 정상처리군에는 생리식염수만 투여하였다. 1회 투여용량은 150uL로 하여 3주간 경구투여하고 그 1주일 후에 채혈하여 혈중 IgG 항체를 분석하고, 소장 상부 10cm를 적출하여 소장추출물 중 IgA 항체를 ELISA 분석하였다.

그 결과, 소장 중 전체 IgA 항체 농도는 VP7을 발현시킨 알팔파 추출물을 경구투여한 군에서는 27 ng/ml로 정상군과 대조군의 수치 (각각, 17 ng/ml 및 11 ng/ml)에 비하면 월등하게 높은 수치를 보였다(도 7 참조). 또한, 소장 중 VP7에 특이적인 IgA 항체 농도는 VP7을 발현시킨 알팔파 추출물을 경구투여한 군에서는 ELISA 평균수치가 0.4로서 정상군과 대조군의 수치 (각각, 0.285 및 0.295)에 비하면 유의적으로 높은 수치를 보였다(도 8 참조). 그러므로, VP7을 발현시킨 알팔파 추출물을 3 주간 경구투여한 경우에는 비형질전환 알팔파 추출물(대조군)을 투여한 경우에 비하여 소장에서 특이항체의 생산이 명확하게 확인되었다. 그리고, 혈중 전체 IgG 항체의 생산량은 정상군 및 대조군 (비형질전환 알팔파 처리군)에서 각기 그 평균치가 170 ng/ml 가량으로서 비슷하였으나, VP7을 발현시킨 알팔파 추출물을 경구투여한 군에서는 200 ng/ml 정도로 유의적으로 높은 수치를 보였다(도 9 참조).

본 연구에서 생쥐에 경구투여한 형질전환 알팔파의 조추출물 1회 투여량 (40 mg) 중에는 로타바이러스 VP7이 약 8 ug 발현되어 있었는데, 이는 ELISA에 의하여 조추출물 중 VP7의 발현율이 0.02%이었던 점을 반영한 것이다. 이처럼 VP7의 투여량이 높지 않았음에도 불구하고 경구투여함으로써 특이항체의 생산이 가능하였던 점에서, 최소 가공한 식물체를 반복 섭취하면 소장에서의 항원특이적인 면역응답이 유도될 수 있음이 밝혀졌다.

결론적으로, 로타바이러스 VP7으로 형질전환 알팔파를 경구 투여하면 장관에서 면역응답이 활발하게 일어나 특이 IgA 항체가 생산됨으로써, 로타바이러스의 주감염 부위인 소장에서 바이러스의 감염을 효과적으로 억제할 수 있음이 시사되었다.

<110> Rural development administration, Korea food research institute <120> The transformant for using vaccination against rotavirus and vaccine composition comprising the same <130> P111143 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 981 <212> DNA <213> rotavirus VP7 <400> 1 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttttga tatcaatcat tctactcaac 60 tatatattaa aatcagtgac tcgaataatg gactacatta tatatagatt tttgttgatt 120 actgtagcat tatttgcttt gacaagagct cagaattatg gacttaactt accaataaca 180 ggatcaatgg acgctgtata tactaactct actcaagaag aagtgtttct aacttctacg 240 ttatgtctgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatca atgatggtga ctggaaagac 300 tcattgtcgc aaatgtttct tacaaagggt tggccaacag gatctgttta ctttaaagag 360 tactcaaata ttgttgattt ttctgttgac ccacagctgt attgtgacta taatttagta 420 cttatgaaat atgaccaaag tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg 480 aatgaatggt tatgtaaccc aatggatgta acattatact attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcgat gggatcatca tgtaccgtga aagtgtgtcc gctaaataca 600 caaacgttag ggataggttg tcaaacaaca aacgtagact catttgaaat gattgctgag 660 aatgagaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttaaca 720 actacgacat gtactattcg aaattgtaag aaattaggtc caagagaaaa tgtagctgta 780 atacaagttg gtggttctaa tgtgttagac ataacagcag atccaacaac taatccacaa 840 actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aagtggtggc aagtatttta tactatagta 900 gattatatta atcaaattgt acaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtata g 981 <210> 2 <211> 993 <212> DNA <213> rotavirus VP7 <400> 2 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttttga tatcaatcat tctactcaac 60 tatatattaa aatcagtgac tcgaataatg gactacatta tatatagatt tttgttgatt 120 actgtagcat tatttgcttt gacaagagct cagaattatg gacttaactt accaataaca 180 ggatcaatgg acgctgtata tactaactct actcaagaag aagtgtttct aacttctacg 240 ttatgtctgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatca atgatggtga ctggaaagac 300 tcattgtcgc aaatgtttct tacaaagggt tggccaacag gatctgttta ctttaaagag 360 tactcaaata ttgttgattt ttctgttgac ccacagctgt attgtgacta taatttagta 420 cttatgaaat atgaccaaag tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg 480 aatgaatggt tatgtaaccc aatggatgta acattatact attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcgat gggatcatca tgtaccgtga aagtgtgtcc gctaaataca 600 caaacgttag ggataggttg tcaaacaaca aacgtagact catttgaaat gattgctgag 660 aatgagaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttaaca 720 actacgacat gtactattcg aaattgtaag aaattaggtc caagagaaaa tgtagctgta 780 atacaagttg gtggttctaa tgtgttagac ataacagcag atccaacaac taatccacaa 840 actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aagtggtggc aagtatttta tactatagta 900 gattatatta atcaaattgt acaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtaaa ggacgagttg tag 993 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> rotavirus VP7 <400> 3 atgtatggta ttgaatatac cacaa 25 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> rotavirus VP7 <400> 4 caactcgtcc tttactctat aataaaaagc tgcagaa 37 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> attB2 primer <400> 5 tacaaaaaag caggcttcat gtatggtatt gaatatacca caa 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> attB1 primer <400> 6 gtacaagaaa gctgggtcct acaactcgtc ctttactcta taat 44 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> primer 1 <400> 7 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta 30 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> primer 2 <400> 8 caactcgtcc tttactctat aataaaaagc tgcagaa 37 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> 35S primer <400> 9 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 30

Claims

서열번호 1의 로타바이러스 VP7 피막 단백질을 암호화하는 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 VP7 항원 유전자를 포함하는 VP7/pB7WG2D 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물로 형질전환된 형질전환 알팔파 또는 상기 형질전환 알팔파 추출물을 포함하는 경구용 백신 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 아그로박테리움 속 미생물은 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)인 것을 특징으로 하는 경구용 백신 조성물.
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