KR101783677B1 - 식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산하는 방법 - Google Patents

식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 바이러스 유래 RNA 중합효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 5' 프로벡터, cED Ⅲ 또는 cEDIII-Co1 유전자를 포함하는 3' 프로벡터 및 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 제3의 벡터로 동시에 형질전환시킨 아그로박테리움을 식물체에 침윤하여 식물체 내에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 대량으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 식물 바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산할 수 있으므로, 저생산 비용으로, 안전하게 뎅기 바이러스에 대한 면역효과를 갖는 백신을 대규모로 생산하는데 매우 유용하다.

Description

식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산하는 방법{Method for mass producing dengue virus vaccine using plant viral expression system}
본 발명은 식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
뎅기(dengue)는 열대와 아열대 지역에서 가장 주요하게 발생하는 모기 매개 바이러스성 질병 중 하나이다. 주로 아열대 지역에서 발생하지만, 이 병은 전 세계적으로 매년 약 5천만~1억 명의 사람들을 감염시킨다. 최근에 뎅기는 지리적 경계를 초월하여, 세계 인구의 약 50%에 대해 감염 위험성을 갖는 심각한 공중보건 문제가 되고 있다. 이 질병의 잠재성 및 상당한 경제적 부담 때문에 뎅기에 효과적인 백신을 생산하기 위한 집중적인 연구가 필요하다.
뎅기 바이러스는 뎅기열의 원인이 되며, 4개의 항원성이 다른 혈청형(serotype, DEN 1 ~ 4)으로 구성된다. 비-중화 항체(non-neutralizing antibody)를 갖는 이들 혈청형 중 하나에 감염되었던 사람은 두 번째의 이형 뎅기 바이러스 감염 동안 항체-의존적 강화(antibody-dependent enhancement, ADE)로 언급되는 뎅기 출혈열(DHF) 또는 뎅기 쇼크 신드롬(DSS) 발병에 대한 가장 큰 위험을 갖는다. 따라서, 백신은 뎅기 바이러스의 네 가지 타입 모두에 대해 방어할 수 있어야 하고, 비용이 효율적이어야 한다. 약독화 생백신을 포함하는 4가(tetravalent, 4종의 혈청형) 뎅기 백신, 약독화 뎅기 바이러스 또는 황열 17D 기반의 키메릭(chimeric) 백신 및 재조합 DNA 백신이 뎅기 바이러스의 모든 혈청형 감염에 대해 방어하기 위한 백신 후보물질로서 개발되었다(Swaminathan 등, Expert. Opin. Ther. Pat. 20(2010) 819-835). 이들 중, 컨센서스 뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 III(consensus envelop domain III, cEDIII)는 뎅기 바이러스의 4 가지 혈청형의 다른 분리주(isolate)로부터의 아미노산 서열 정렬에 의해 얻어졌으며, 재조합 cEDIII로 면역화된 쥐가 뎅기 바이러스의 모든 혈청형을 인식하는 중화 항체를 생성하는 것을 보여주었다(Chiang 등, 2011, PLoS One, 11:e23319). 그러나 현재까지 인간에게 사용할 수 있는 효과적인 뎅기 백신이 아직까지 허가되지 않고 있다(Murrell 등, 2011, Biotechnol Adv 29:239-247).
항원("경구 백신")을 발현하는 식물체 기반 발현 시스템은 안전하고, 저생산 비용, 대량 생산의 용이함 및 동물 또는 인간 병원균 및 독소 오염의 최소 위험과 같은 기존의 백신보다 나은 몇 가지 장점을 갖는다. 항원 단백질을 발현하는 형질전환 식물체에서 식용 가능한 부분 또는 정제된 단백질은 경구로 투여될 수 있기 때문에, 식물체 기반 발현 시스템은 가장 기대되는 경구 백신 시스템이며, 점막 면역 시스템에 항원을 전달할 수 있는 능력을 갖는다. 그러나 식물체의 낮은 항원 단백질 생산 수준은 경구 면역 관용 및 낮은 면역 반응을 초래하여 식물체를 이용한 경구 백신 접종 방법에 걸림돌이 된다.
식물에서 항원 단백질을 고수율로 얻기 위해, 형질전환 식물체에서 항원 단백질의 높은 발현 수준 획득에 초점을 맞추어 왔고, 식물 최적화 코돈 선호도(codon usage), 강한 프로모터, 강한 5' 및 3' 비번역 서열, 세포 소기관 표적 신호, 안정한 운반체와의 융합, 색소체 형질전환 및 식물 바이러스 발현 시스템과 함께 유전자 변형을 포함하는 몇 가지 분자 및 유전적 접근이 평가되어 왔다(S.J. Streatfield, Methods 38 (2006) 150-157). 또한 점막 면역 세포에서 항원 흡수를 향상시키기 위한 전략으로 점막 면역 시스템에서 융합된 항원 단백질의 흡수를 증진시킬 수 잇는 능력을 갖는 리간드와 항원 단백질이 융합된 항원융합단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 생산하였다. 그러나 아직까지 식물체를 이용하여 고수율의 뎅기 백신을 생산하지 못하고 있다.
한편, 한국공개특허 제2013-0041574호에는 '식물을 이용한 재조합 댕기 바이러스 백신의 제조 방법 및 그에 따른 댕기 바이러스 백신'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0103677호에는 '뎅기 바이러스 다중 서브타입에 대항하는 신규한 백신'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신의 대량 생산하는 방법'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 바이러스 유래 RNA 중합효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 5' 프로벡터, cED Ⅲ 또는 cEDIII-Co1 유전자를 포함하는 3' 프로벡터 및 파지 인테그라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 제3의 벡터로 동시에 형질전환시킨 아그로박테리움을 식물체에 침윤하여 식물체 내에서 cEDⅢ 및 cEDIII-Co1 단백질을 대량으로 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
(1) 5'에서 3' 방향으로 식물 유래 프로모터, RNA 바이러스 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터를 제조하는 단계;
(2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain III) 또는 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDIII 융합단백질 cEDIII-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터를 제조하는 단계;
(3) 단계 (1)의 5' 프로벡터, 단계 (2)의 3' 프로벡터 및 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하는 단계;
(4) 단계 (3)에서 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 침윤시키는 단계; 및
(5) 침윤된 식물체에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 식물체 소포체에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 5'에서 3' 방향으로 식물 유래 프로모터, RNA 바이러스 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터;
(2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain III) 또는 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDIII 융합단백질 cEDIII-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터; 및
(3) 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 침윤되어 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 생산하는 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 5'에서 3' 방향으로 식물 유래 프로모터, RNA 바이러스 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터;
(2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain III) 또는 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDIII 융합단백질 cEDIII-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터; 및
(3) 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 식물체 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질 대량생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 식물 바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산할 수 있으므로, 저생산 비용으로, 안전하게 뎅기 바이러스에 대한 면역효과를 갖는 백신을 대규모로 생산하는데 매우 유용하다.
도 1은 담배 내 식물 발현 벡터 구축물을 나타낸다. 각기 다른 5' 프로벡터(세포질 타겟을 위한 pICH20111, ER 타겟을 위한 pICH20155 또는 엽록체 타겟을 위한 pICH20030)가 cEDIII 또는 cEDIII-Co1을 포함하는 3' 프로벡터(pMYV817 또는 pMYV818)와 결합될 수 있으며, 5' 프로벡터, 3' 프로벡터 및 pICH14011(PhiC31, integrase)을 포함하는 아그로박테리움을 담배 잎에 침윤하였다. TMV 폴리머라제는 애기장대 액틴 2 프로모터 조절하에 작용하였다. LB;좌경계, RB;우경계, NPT;네오마이신 포스포트란스퍼라제(neomycin phosphotransferase) 유전자, AttB 및 AttP; 스트렙토마이세스 파지 PhiC31 재조합효소 부착 사이트(Streptomyces phage PhiC31 recombinase attachment sites), Tnos; 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결자(terminator). PhiC31은 Hsp81.1 프로모터와 NLS(nuclear targeting signal)의 조절하에 있다.
도 2는 침윤 잎 조직에서 cEDIII 단백질의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. 5' 프로벡터(세포질(Cyt) 타겟을 위한 pICH20111, 소포체(ER) 타겟을 위한 pICH20155 또는 엽록체(Chl) 타겟을 위한 pICH20030), 3' 프로벡터(pMYV817 또는 pMYV818) 및 pICH14011(PhiC31, integrase)을 포함하는 아그로박테리움을 담배 잎에 침윤하고 5일 후 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질을 검출하였다. 레인 SM; 단백질 마커(Fermentas, 미국), 레인 PC; 대장균에서 정제된 재조합 EDIII2 단백질(양성 대조구), 레인 NC; 비침윤 잎의 단백질 추출물(음성 대조구).
도 3은 침윤 잎 조직에서 cEDIII-Co1 융합 단백질의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. pMYV718, pICH20155 및 pICH14011을 포함하는 아그로박테리움을 담배 잎에 침윤하고 3일과 5일 후 cEDIII-Co1 단백질을 검출하였다. 레인 M; 단백질 마커(Fermentas, 미국), 레인 PC; 대장균에서 정제된 재조합 EDIII2 단백질(양성 대조구), 레인 NC; 비침윤 잎의 단백질 추출물(음성 대조구). 레인 3 및 5은 침윤 후 각각 3일 및 5일 경과 후 단백질 추출물을 나타낸다.
도 4는 cEDIII 단백질의 웨스턴 블럿 분석 및 정량을 나타낸다. 아그로박테리움을 담배 잎에 침윤하고 5일 경과 후 추출한 총 수용성 단백질(TSP, total soluble protein) 1㎍ 또는 4㎍을 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질을 분리하거나(A), 일차 항체로 항-뎅기 바이러스 단일 클론 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석하였다(B). cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질 발현량은 식물 유래 단백질과 알려진 대장균에서 정제된 EDIII 단백질(bEDIII) 밴드의 농도를 비교하여 계산하였다(C). 레인 SM; 단백질 마커(Fermentas, 미국), 레인 bEDIII; 대장균에서 정제된 재조합 EDIII2 단백질(0.1㎍, 0.25㎍ 및 0.5㎍), 레인 NC; 비침윤 잎의 단백질 추출물(음성 대조구).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 5'에서 3' 방향으로 식물 유래 프로모터, RNA 바이러스 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터를 제조하는 단계;
(2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain III) 또는 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDIII 융합단백질 cEDIII-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터를 제조하는 단계;
(3) 단계 (1)의 5' 프로벡터, 단계 (2)의 3' 프로벡터 및 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하는 단계;
(4) 단계 (3)에서 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 침윤시키는 단계; 및
(5) 침윤된 식물체에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 식물체에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
상기 RNA 바이러스는 식물에 감염하여 증식할 수 있는 식물 바이러스이며 TMV(tobacco mosaic virus), 감자바이러스 X(potato virus X) 등 일 수 있으며, 바람직하게는 TMV(tobacco mosaic virus)일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
상기 신호 서열은 벼 알파-아밀라아제, 담배 칼레티뮬린 등으로부터 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 벼 알파-아밀라아제로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 '소포체 보유 신호'는 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질과 연결될 때 식물 세포 내에 존재하는 소포체 또는 소포체로부터 유래하는 저장 구획에 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 격리시킬 수 있는 임의의 폴리펩티드를 말한다. SEKDEL, KDEL, HDEL, DDEL, ADEL, SDEL 등일 수 있으며, 바람직하게는 SEKDEL일 수 있다.
본 발명에 따른 cEDⅢ 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 뎅기 바이러스 백신 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 cEDⅢ 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
또한 본 발명의 cEDⅢ-Col 단백질의 범위는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 뎅기 바이러스 백신 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 cEDⅢ-Col 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
상기 cED Ⅲ 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 cED Ⅲ- Col 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있으며, 상동체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)는 박테리아 또는 단세포 효모로부터 유래된 리콤비나제 군을 의미한다. 이는 티로신 리콤비나제 및 레솔바제/인버타제 또는 세린 리콤비나제 패밀리(예컨대, 파지 인테그라제, 예컨대 파지 phiC31, R4, 및 TP-901로부터의 인테그라제), 둘 다를 포함한다. 티로신 리콤비나제는 티로신 인테그라제(예컨대, λ, HK022, P22, HP1 및 L5로부터의 인테그라제) 및 다른 티로신 리콤비나제(예컨대, Cre 및 Flp)를 포함한다. 세린 리콤비나제의 예로는 세린 인테그라제(예컨대, phiC-31, R4, TP901로부터의 인테그라제) 및 다른 세린 리콤비나제 (예컨대, γδ, Tn3, 파지 Mu 리콤비나제)를 포함한다.
바람직하게, 부위-특이적 리콤비나제는 상이한 두 DNA 인식 서열인 파지 부착 부위인 attP 및 박테리아 부착부위인 attB 사이의 단방향 부위-특이적 재조합을 매개하는 인테그라제(특히, 파지 인테그라제)를 포함할 수 있다. 티로신 패밀리의 인테그라제, 예컨대 람다 인테그라제는 촉매성 티로신을 이용하여 가닥 절단을 매개하고, 보다 긴 attP 서열을 인식하는 경향이 있으며, 파지 또는 숙주 박테리아에 의해 코딩되는 다른 단백질을 필요로 한다. 세린 패밀리로부터의 파지 인테그라제 (예컨대, phiC31 파지 인테그라제)는 크기가 더 크며, 가닥 절단을 위해 촉매성 세린을 사용하여 보다 짧은 attP 서열을 인식하고, 숙주 보조인자는 필요로 하지 않는다. attB 및 attP 부위는 상이한 서열이기 때문에, 재조합을 통해 attB 서열도 attP 서열도 아니며, 관련 인테그라제 효소에 대한 재조합 부위로서 기능적으로 인식되지 못하는 핵산 스트레치(좌측인 경우, attL, 또는 우측인 경우, attR로 불린다)가 생성될 것이며, 효소가 제1 재조합을 역전시킬 수 있는 제2 재조합을 촉매화시킬 수 있는 가능성을 제거한다. 이로써 단방향 부위-특이적 통합 이벤트가 이루어질 것이다.
PhiC31 인테그라제는 포유동물 세포에서 게놈 재조합을 고효율로 긴밀한 서열 특이성으로 촉매화시킬 수 있는 파지 인테그라제를 의미한다. 상기 효소의 기능에 관한 특징 규명은 예컨대, 문헌 [Kuhstoss 및 Rao, J. Mol. Biol. 222, 897-908(1991)]; [Rausch 및 Lehmann, Nucleic Acids Research 19, 5187- 5189(1991)]; 및 [Groth 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000(2000)]과 같이 당업계에 기술되어 있다.
상기 부위 특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제에 의해 인식되는 인식 서열이다. 본 발명의 일구현예에서 부위 특이적 재조합 서열은 5' 프로벡터와 3' 프로벡터 내에서 각각 attP와 attB를 포함한다. 상기 재조합 서열은 phiC31 인테그라제에 의해 인식되어진다.
상기 5' 프로벡터는 바람직하게는 도 1에 개시된 pICH20155 벡터일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 3' 프로벡터는 바람직하게는 도 1에 개시된 pMYV817 또는 pMYV818 벡터일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 바람직하게는 도 1에 개시된 pICH14011 벡터일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
"T DNA 경계(좌경계(LB) 및 우경계(RB))"는 아그로박테리움 튜머파시엔스 같은 아그로박테리움 균주의 독성 유전자, 또는 그것의 변형형 또는 돌연변이형에 의해 인식될 수 있고, 그리고 링크된 DNA 서열의 진핵 세포, 바람직하기는 식물 세포로의 이동에 충분한, 약 25 뉴클레오티드 길이 서열을 포함하는 DNA 단편을 말한다. 이 정의는 야생형 Ti 플라스미드로부터 자연발생하는 모든 T-DNA 경계뿐 아니라 그것의 어느 기능적 유도체를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니며, 화학적으로 합성된 T-DNA 경계를 포함한다. 본 발명에 따른 벡터의 암호화 서열과 발현 조절서열은 2개의 T-DNA 경계들(좌경계 및 우경계) 사이에 위치한다.
본 발명의 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 방법은 상기 5' 프로벡터, 3' 프로벡터 및 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 침윤하는 단계; 및 침윤된 식물체에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질의 발현을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 재조합 벡터를 식물 조직에 도입하는 방법은 목적 유전자가 삽입된 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 이용한 아그로박테리움 침윤(agro-infiltration) 방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움을 통한 유전자 전이방법은 [Moloney 등., Plant Cell Reports 8:238(1989)] 등과 같은 다수의 문헌에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용되는 '아그로박테리움 침윤(Agro-infiltration)'이라는 용어는 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미한다. 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 바늘이 없는 주사기를 사용해서 압력을 줌으로써 식물의 잎에 주입하여 식물체 세포로 원하는 유전자를 이동시키는 방법이다. 이는 전통적인 식물 형질전환과 비교하면 신속하고 편리하다는 장점이 있다.
본 발명의 일구현예에서, 형질전환된 아그로박테리움 세포가 식물체, 즉 전체 식물 또는 식물 기관, 식물 조직을 포함하는 식물의 일부에 침윤할 수 있다.
상기 식물 세포에서 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 발현하도록 식물 또는 식물 조직을 적합한 조건하에서 배양한 후, 단백질이 식물 또는 식물 기관 또는 식물 조직과 같은 식물 일부에서 또는 그들의 세포에서 검출되고 정량화될 수 있다. 수확 후, 단백질의 단리를 당업계의 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 생물량의 적어도 일부를 균질화하고, 재조합 단백질을 추출하고 추가로 정제한다. 추출은 균질물을 적절한 용매에 적시거나 담그는 것을 포함한다. 정제법은 면역친화 정제법 및 펩티드, 단백질 또는 단백질 착물의 구체적 크기, 전기영동 이동도, 생물학적 활성, 및/또는 단리되어질 펩티드 또는 단백질의 순 전하를 기준으로, 또는 단백질 중 태그 분자의 존재를 기준으로 하는 정제과정을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 단리된 단백질의 특성화는 면역분석 또는 본 분야에 공지된 기타 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 단백질은 웨스턴 블로팅에 의한 SDS-PAGE 겔 상에서, 또는 단백질이 실질적으로 순수한 경우 코마시 블루 염색에 의해 분석될 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 5'에서 3' 방향으로 식물 유래 프로모터, RNA 바이러스 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터;
(2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain III) 또는 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDIII 융합단백질 cEDIII-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터; 및
(3) 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;로 형질전환된 아그로박테리움을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 침윤되어 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 생산하는 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 5'에서 3' 방향으로 식물 유래 프로모터, RNA 바이러스 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터;
(2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain III) 또는 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDIII 융합단백질 cEDIII-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터; 및
(3) 부위 특이적 리콤비나제(recombinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 식물체 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질 대량생산용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 상기 3가지 벡터로 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 침윤시킴으로써 cEDⅢ 또는 cEDIII-Co1 단백질을 대량생산할 수 있는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
재료 및 방법
1. 식물 발현 벡터의 구축
본 발명자는 이전 연구에서 식물 최적화 코돈 선호도(codon usage)를 기반으로 cEDIII를 암호화하는 DNA를 합성하였고, cEDIII 유전자를 pMYV657 벡터에 삽입하였다(Kim 등, 2012, Plant Cell Tissue Organ Cult 109:509-515). 상기 연구에서 제조된 cEDIII 유전자가 삽입된 pMYV657 벡터를 주형으로 하여 정방향 프라이머 Icon scED-F(5'-TTT TGG TCT CAA GGT ATG AAG GGC ATG TCC-3', 서열번호 5)와 역방향 프라이머 Icon scED-R(5'-TTT TGG TCT CAA AGC TTA AAG TTC ATC CTT TTC GGA -3', 서열번호 6)를 사용한 PCR 반응을 통하여 cEDIII 유전자를 증폭하였다. 또한 이전 연구에서 제조된 cEDIII-Co1이 삽입된 pMYV685 벡터(Kim 등, 2013, Mol Biotechnol 54:880-887)를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 cEDIII-Co1를 증폭하였다. 상기 프라이머는 BsaI 제한효소 사이트를 포함하며 역방향 프라이머는 ER 보유 신호인 SEKDEL(서열번호 6의 밑줄친 부분)을 포함하였다. 증폭된 산물은 pGEM-T easy vector(Promega, 미국)에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. cEDIII 또는 cEDIII-Co1 유전자를 BsaI로 절단된 TMV-기반 3' 프로벡터 모듈인 pICH31070(독일, Icon Genetics의 Y. Gleba 박사로부터 제공받음)에 클로닝하여, cEDIII 및 cEDIII-Co1 유전자를 포함하는 식물 바이러스 벡터를 각각 pMYV817 및 pMYV818로 명명하였다(도 1). 상기 벡터는 전기천공법에 의해 아그로벡테리움 투메파시엔스 GV3101에 삽입되었다. 상기 형질전환된 아그로벡테리움 세포는 제한효소 절단과 전기영동을 통하여 DNA 삽입을 확인하였다.
5' 프로벡터(pICH20111, pICH20155와 pICH20030) 및 pICH14011 벡터는 Icon Gentics(독일)의 Y. Gleba 박사로부터 제공받았다.
2. 침윤( Agroinfiltration ) 과정
프로벡터 부분(5' 및 3') 또는 pICH14011(integrase)를 포함하는 아그로벡테리움 투메파시엔스 GV3101를 전배양하여, 10mM MES(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 5.5), 10mM MgCl2, 20uM 아세토시린곤(acetosyringone), 50㎍/mL 카나마이신(kanamycin) 및 100㎍/mL 리팜피신(rifampicin)이 들어간 YEP(yeast extract peptone) 액체 배지에서 28℃로 배양하였다. 200㎕ 배양액을 5000×g에서 15분간 원심분리하여 10mM MES(pH 5.6), 10 mM MgCl2 및 200uM 아세토시린곤이 포함된 MS 기본 배지에 희석하였다. 아그로박테리움 용액은 최종 OD600가 1.0이 되도록 조정한 후 침윤 전에 상온에서 2~3시간 배양시켰다. 아그로박테리움 배양액은 바늘 없는 1mL 주사기를 이용하여 잎 조직에 침윤(Agroinfiltration)하였다.
3. 웨스턴 블럿 분석
침윤된 잎 조직은 냉각된 막자 및 막자사발을 이용하여 미세한 분말로 분쇄하였고, 총 가용성 단백질은 미세하게 분쇄된 분말에 추출 완충액(200mM TrisCl, pH 8.0, 100mM NaCl, 400mM 수크로스, 10mM EDTA, 14mM 2-머캅토에탄올, 1mM PMSF 및 0.05% Tween 20)를 조금씩 첨가하여 최종 샘플 중량에 동일한 부피를 넣어 추출하였다. Bradford protein assay(Bio-Rad, Inc., Hercules, USA)로 결정된, 총 수용성 단백질(total soluble protein, TSP) 30㎍은 5분 동안 비등한 후에 트리스-글리신 완충액(25 mM Tris-Cl, 250 mM glycine, pH 8.3, 및 0.1% SDS)에서 120 V로 2~2.5시간 동안 15% SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리되었다. 분리된 단백질 밴드는 150mA에서 2시간 동안 mini-transblot apparatus(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 젤에서 Hybond C 막(Amersham Pharmacia Biotech RPN303C)으로 옮겨졌다. 비특이적인 항체 결합은 5% 탈지분유가 포함된 TBS 완충액(20mM Tris-Cl, pH 7.5 및 500mM NaCl)에서 반응시켜 블록킹했고, 그 후에 5분 동안 TBS 완충액으로 세척하였다. 막은 TBST 항체 희석액(0.05% Tween 20 및 2% 탈지분유가 포함된 TBS)에 마우스 항-뎅기 E 단일클론 항체(AbD Serotech, 영국)를 1:2,500으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰고, 그 후에 TBST 완충액로 3회 세척하였다. 막은 그 후에 알칼라인 포스파타아제가 결합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 1:5,000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음 막을 TBST 완충액로 2번, TMN 완충액(100mM Tris-Cl, pH 9.5, 5mM MgCl2 및 100mM NaCl)로 1번 세척한 후, BCIP/NBT 용액(Sigma-Aldrich, 미국)으로 발색시켰다.
4. cEDIII 단백질의 정량
침윤된 잎 조직에서 생산된 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질의 양은 웨스턴 블럿 분석으로 결정되었다. 1㎍ 및 4㎍의 TSP을 5분간 끊인 후 SDS-PAGE에 로딩하였다. 비침윤 잎 조직을 음성 대조구로 사용하였으며, 표준 단백질로 대장균에서 정제된 알려진 양의 박테리아 EDIII2 단백질(혈청형 II)(100ng, 250 ng 및 500ng) 및 잎 조직의 단백질 추출물(TSP의 1㎍ 및 4㎍)은 SDS-PAGE로 분리되었고, 그 후 박테리아 EDIII 및 식물 생산 cEDIII 단백질은 항-EDIII 단일클론 항체를 사용하여 검출되었다. 식물 단백질 추출물에서의 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질의 양은 식물 생산 cEDIII 및 알려진 양의 박테리아 EDIII2 단백질의 밴드 농도의 비교에 의해 결정되었다. 웨스턴 블럿에서 검출된 밴드의 농도는 농도 계측 분석(densitometry)을 사용하여 정량되었다.
실시예 1. 식물 발현 벡터의 구축
뎅기 바이러스의 4 가지 혈청형에 대한 교차-중화 활성을 가지는 cEDIII을 코딩하는 유전자가 앞선 연구에서 제시되었다(Kim 등, 2012, Plant Cell Tissue Organ Cult 109:509-515). 본 발명에서 cEDIII 및 cEDIII-Co1 융합 유전자가 PCR에 의해 증폭되었으며 서열 확인하였다. 상기 cEDIII 및 cEDIII-Co1 융합 유전자는 TMV 기반의 MP 프로모터 조절하에 있는 식물 바이러스 벡터에 삽입되어 각각 pMYV817 및 pMYV818으로 명명하였다(도 1).
실시예 2. 담배( N. benthamiana ) 잎에서 cEDIII 단백질의 일시적 발현 확인
cEDIII 또는 cEDIII-Co1 융합 유전자를 포함하는 식물 바이러스 벡터를 전기천공을 통하여 아그로박테리움에 형질전환시켰다. pMYV817 또는 pMYV818가 삽입된 아그로박테리움은 5' 프로벡터(세포질 타겟을 위한 pICH20111, 소포체 타겟을 위한 pICH20155 및 엽록체 타겟을 위한 pICH20030) 및 pICH14011(PhiC31, integrase)과 함께 담배 잎에 침윤하였다. 웨스턴 블랏 분석을 통하여 침윤 5일 후 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질의 발현은 pICH20155(ER 타겟)와 침윤된 경우가 pICH20111(세포질 타겟) 또는 pICH20030(엽록체 타겟)와 침윤한 경우보다 더 높음을 확인하였다(도 2). 비침윤 잎의 단백질 추출물에서는 단백질 밴드가 관찰되지 않았다. 또한 cEDIII-Co1 단백질 발현은 침윤 3일째보다 5일째에서 더 높음을 확인하였다(도 3).
실시예 3. cEDIII 단백질의 정량 확인
침윤 5일 후 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질의 발현은 웨스턴 블럿 분석 및 농도 계측기 분석으로 측정하였다. 알려진 양의 정제된 박테리아 EDIII2 단백질은 표준 곡선을 구축하기 위해 사용되었다. cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질의 양은 알려진 양의 박테리아 단백질에 대해 식물 생산 cEDIII 단백질의 농도를 비교하여 계산되었다. 침윤 5일 후 cEDIII 및 cEDIII-Co1 단백질은 잎 조직의 건조중량당 각각 5.2 mg/g 및 4.8 mg/g이었다(도 4C).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for mass producing dengue virus vaccine using plant viral expression system <130> PN15181 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cEDIII <400> 1 aagggcatgt cctacgctat gtgcaccggc aagttcaagt tggagaagga ggtggctgag 60 acccagcacg gcaccatctt gatcaaggtg aagtacgagg gcgatggcgc tccttgcaag 120 atccctttcg agatccagga tgtggagaag aagcacgtga acggaaggtt gatcaccgct 180 aaccctatcg tgaccgataa ggagtcccct gtgaacatcg aggctgagcc tcctttcggc 240 gattcctaca tcgtgatcgg cgtgggcgat aaggctttga agttgaactg gttcaagaag 300 ggctcctcc 309 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cEDIII <400> 2 Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Leu Glu Lys 1 5 10 15 Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Lys Tyr 20 25 30 Glu Gly Asp Gly Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Gln Asp Val 35 40 45 Glu Lys Lys His Val Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val 50 55 60 Thr Asp Lys Glu Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Lys Ala Leu Lys Leu Asn 85 90 95 Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 100 <210> 3 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cEDIII-Co1 <400> 3 aagggcatgt cctacgctat gtgcaccggc aagttcaagt tggagaagga ggtggctgag 60 acccagcacg gcaccatctt gatcaaggtg aagtacgagg gcgatggcgc tccttgcaag 120 atccctttcg agatccagga tgtggagaag aagcacgtga acggaaggtt gatcaccgct 180 aaccctatcg tgaccgataa ggagtcccct gtgaacatcg aggctgagcc tcctttcggc 240 gattcctaca tcgtgatcgg cgtgggcgat aaggctttga agttgaactg gttcaagaag 300 ggctcctcct cttttcatca gcttccagct agatctccac ttcca 345 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cEDIII-Co1 <400> 4 Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Leu Glu Lys 1 5 10 15 Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Lys Tyr 20 25 30 Glu Gly Asp Gly Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Gln Asp Val 35 40 45 Glu Lys Lys His Val Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val 50 55 60 Thr Asp Lys Glu Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Lys Ala Leu Lys Leu Asn 85 90 95 Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ser Phe His Gln Leu Pro Ala Arg Ser 100 105 110 Pro Leu Pro 115 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttttggtctc aaggtatgaa gggcatgtcc 30 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttttggtctc aaagcttaaa gttcatcctt ttcgga 36

Claims (9)

  1. (1) 5'에서 3' 방향으로 애기장대 액틴 2 프로모터, TMV(tobacco mosaic virus) 유래 중합효소를 코딩하는 유전자, 벼 알파-아밀라아제로부터 유래한 신호 서열 및 부위 특이적 재조합 서열을 포함하는 5' 프로벡터를 제조하는 단계;
    (2) 5'에서 3' 방향으로 부위 특이적 재조합 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 뎅기 바이러스 외피 당단백질 도메인 Ⅲ cEDⅢ(Consensus Dengue Virus Envelope Protein Domain Ⅲ) 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 M-세포(microfold cell) 특이적 리간드(Co1)가 융합된 cEDⅢ 융합단백질 cEDⅢ-Co1을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 SEKDEL의 아미노산 서열로 이루어진 소포체 보유 신호를 코딩하는 염기서열을 포함하는 3' 프로벡터를 제조하는 단계;
    (3) 단계 (1)의 5' 프로벡터, 단계 (2)의 3' 프로벡터 및 스트렙토마이세스 파지 PhiC31 인테그라제(Streptomyces phage PhiC31 integrase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하는 단계;
    (4) 단계 (3)에서 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 침윤시키는 단계; 및
    (5) 침윤된 식물체에서 cEDⅢ 또는 cEDⅢ-Co1 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 식물체 소포체에서 cEDⅢ 또는 cEDⅢ-Co1 단백질을 대량생산하는 방법.
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