KR20210130623A

KR20210130623A - 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 재조합 혈구응집소 (ha)의 단백질 유전자 디자인, 식물에서의 상기 ha 재조합 단백질을 대량 생산하는 방법 및 이를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20210130623A
Application number: KR1020200170828A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 이준호; 디아오 하이핑; 시지엔 송; 김외연; 김민갑; 류경렬; 신경임; 송창선; 이지호; 김덕환
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 건국대학교 산학협력단; 경상국립대학교산학협력단; 주식회사 바이오앱
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2021-11-01
Also published as: KR102571164B1

Abstract

본 발명은 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 재조합 혈구응집소(HA) 단백질 유전자를 디자인하는 방법 및 식물에서의 상기 HA 재조합 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 자세하게는 면역원성 증진 및 효과적인 항원 전달을 위한 목적으로 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 재조합 혈구응집소(HA) 단백질을 삼량체로 만들 수 있는 재조합 유전자를 디자인하는 방법, 식물에서의 상기 HA 재조합 단백질을 대량 생산하는 방법, 상기 HA 재조합 단백질을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 재조합 혈구응집소 (HA)의 단백질 유전자 디자인, 식물에서의 상기 HA 재조합 단백질을 대량 생산하는 방법 및 이를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Design for recombinant protein for influenza virus surface protein hemagglutinin, a method of mass-production of its in plants, and pharmaceutical composition for treating and preventing influenza virus containing its}

최근에 식물에서 재조합 단백질을 저비용을 생산할 수 있는 가능성들이 제안되었으며, 이로 인하여 다양한 시도들이 진행되고 있다 (Schillberg et al., 2003; Holtz et al., 2015; Marusic et al., 2016). 특히 다양한 의료용 단백질의 생산 가능성 등을 확인하는 연구들이 진행되고 있다. 식물에서 재조합 단백질을 생산하는 경우에 다양한 장점들이 있을 수 있는데 그 중에 하나는 대장균 등 미생물에 존재하는 내독소와 같은 독소가 거의 존재하지 않는 다는 것과 인체에 감염할 수 있는 병원체들이 없다는 것이다. 또한 프리온과 같은 유해한 단백질도 없는 것으로 알려져 있어서 동물 세포나 미생물에 비해서 안전한 재조합 단백질을 생산할 수 있다는 것이다. 또한 제조 단가에서도 동물세포보다는 대단히 저렴하며, 식물을 재배하는 방법에 따라서 대규모 생산에 있어서는 대장균 등과 같은 미생물보다 더 경제적이다. 이러한 가능성을 실현하기 위해서는 몇 가지의 필수적인 기술들의 개발이 필요하다. 그 중에 가장 중요한 첫 번째 기술이 식물에서 유전자의 고발현을 유도할 수 있는 발현 벡터의 개발이다 (Staub et al, 2000; Regnard et al., 2010). 식물에서는 다양한 방법을 통해서 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 재조합 유전자를 식물체의 게놈에 integration 시키는 방법, 엽록체의 게놈에 integration 시키는 방법, 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하여 일과성 있게 유전자를 발현시키는 방법 등 다양한 방법들이 가능하다 (Arzola et al., 2011; Werner et al., 2011). Nuclear genome이나 엽록체 genome에 재조합 유전자를 integration 시키는 방법은 기본적으로 형질 전환체를 확보하는 과정을 통해서 식물에서 단백질을 생산하게 된다. 반면에 Agrobacterium을 식물 조직에 침투시켜 유전자의 일과성 발현을 유도하여 단백질을 생산하는 경우에는 형질 전환체의 제조 과정이 포함되지 않으므로 단백질 생산기간이 짧으며, 대체로 형질 전환체를 통한 단백질 생산에 비해서 단백질 생산 수준이 현저하게 높은 장점이 있다 (Arzola et al., 2011). 또한 식물이 가지고 있는 다른 유전자의 발현 억제 기작을 유전자 침묵 억제 인자를 co-infiltration하여 억제할 수 있으므로 단백질의 발현 수준을 더욱 높게 유도할 수 있다 (Garabagi et al., 2011). 그러나 일과성 발현을 하고자 할 때마다 목적 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 도입한 아그로박테리움 배양과 p38 유전자 침묵 억제 인자를 발현하는 바이너리 벡터를 도입한 아그로박테리움 배양을 따로 만들어서 이를 적절한 비율로 섞어서 co-infiltration 하는 과정을 수행하여야 하는 단점이 있다. 특히 두 종류의 아그로박테리움을 배양하는 경우에는 시간 및 경제적인 면에서 한계가 있다.

인플루엔자 바이러스(influenza virus)는 오르토믹소비리대 과(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 호흡기에 염증을 유발시키며, 감염자의 기침 및 타액으로 공기 중으로 직접 전달되거나 독감 환자의 접촉물 등에 의해 간접적으로도 타인에게 전염될 수 있는 전염력이 강한 바이러스이다. 잠복기는 24~30시간 정도이며, 바이러스의 혈청형은 A형, B형 및 C형으로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 인간에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 인간, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. 따라서 인플루엔자 바이러스의 감염 예방을 위해서 백신이 필요하다.

백신으로서 재조합 단백질 항원은 생산 및 활용에 있어서 안전성 측면에서는 우수 하지만 살아있는 바이러스에 기반한 백신에 비해서는 면역원성이 낮고 대체로 생산단가가 높은 점이 단점이다. 따라서 이 안전성이 탁월한 재조합 단백질을 이용하여 백신으로서 효능을 높이기 위해서는 다양한 면역반응을 유도할 수 있으며, 높은 면역반응을 유도할 수 있는 재조합 단백질 백신의 전달 기술의 개발이 필수적이다. 그리고 한 종류의 항원뿐만 아니라 여러 종류의 항원을 동시에 전달할 수 있다면 이는 더욱 효과적인 백신이 될 수 있을 것이다. 실제로 최근의 경향은 여러 종류의 항원을 하나의 주사제로 개발하는 것이다. 항원의 면역원성을 높이기 위해서 가장 효과적으로 활용되는 방법이 강력한 adjuvant를 사용하는 것이다. Adjuvant의 효능이 높으면 적은 양의 항원으로도 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있으므로 백신의 가격을 낮출 수도 있으므로 강력한 보조제의 개발이 단백질 기반의 백신의 개발에 있어서 대단히 중요하다. 또한 보조제의 종류에 따라서 서로 다른 면역반응을 유도할 수 있으므로 항원의 종류에 따라서 적절한 보조제의 사용이 대단히 중요하다. 현재 alumminium hydroxide와 같은 주사용 보조제들이 개발되어 인체에 사용되고 있으며, 경구 백신용으로 cholera toxin B subunit 등이 활용되고 있다. 가축 등 동물용으로는 더 많은 종류의 보조제들이 개발되어 활용되고 있다. 실험용으로는 mouse에 Freund complete adjuvant가 많이 활용되고 있다. 하지만 이들이 어떻게 인간과 가축 및 실험동물에서 항원의 면역원성을 높이는지 아직 명확하게 알려져 있지 않다.

다양한 종류의 보조제들이 개발되고 있다. 백신의 전달 방법도 다양하므로 이러한 다양한 전달 방법에 따라서 다른 종류의 보조제들이 필요로 하다. 최근에 박테라아를 경구용 백신 전달체 및 보조제로 활용하는 연구들이 많이 진행되었다. 특히 Lactococcus의 경우 미국 Food and Drug Administration (FDA)에서 'generally recognized as safe (GRAS) status'를 확보한 박테리아로 인체에 안전하다고 생각되며 이를 경구 보조제 및 항원 전달 제로 개발되고 있다. 박테리아는 그 자체로 대단히 항원성이 높으므로 박테리아가 전달하는 항원에 대해서 대단히 높은 면역반응을 보이는 것으로 보고가 되었다.

재조합 단백질은 안전성에서는 우수 하지만 live 바이러스에 비해서는 면역원성이 낮고 생산단가가 높은 점이 단점이다. 따라서 이 안전성이 탁월한 재조합 단백질을 이용하여 효율적인 예방을 위해서는 다양한 면역반응을 유도할 수 있으며, 높은 면역반응을 유도할 수 있는 고면역원성의 재조합 단백질 백신을 제작하는 것이 필수적이며, 또한 효과적인 전달이 가능하도록 제작된 재조합 단백질이 필요하다. HA의 전장(full length) 단백질은 막 관통 영역 (transmembrane domain)을 갖는 막 결합 형태 (membrane-bound form)로 세포에서 높은 수준으로 생산하는 것이 어렵다. 반면에 HA의 막 관통 영역 (transmembrane domain)을 제외하고 ectodomain만을 발현하면 이는 세포에 수용성 형태(soluble form)로 만들어져서 높은 효율로 생산할 수 있다. 하지만 HA의 ectodomain만을 수용성 형태로 만들면 원래 전장 HA가 인플루엔자 바이러스 표면에 존재할 때 갖는 삼량체 형태(trimeric form)이 잘 만들어지지 않는다. 백신 목적으로 사용하기 위해서 HA의 ectodomain의 재조합 단백질을 식물에서 발현 및 생산할 때 삼량체(trimer)를 형성하도록 유도하는 기술을 개발하고자 하였다. 또한 이렇게 생산된 단백질을 펩티도글리칸(peptidoglycan)에 결합하는 능력을 갖게 하여 lactococcus 또는 chitosan particle 등의 표면에 결합할 수 있는 유전자를 결합하여 다양한 방법으로 항원을 전달할 수 있도록 HA ectodomain 재조합 단백질을 고안하였다. 이렇게 제작된 HA의 재조합 유전자를 식물에서 고발현하도록 하는 바이너리 벡터(binary vector)를 구축 하였다. 상기 식물에서 고발현 HA 재조합을 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스에 처리한 결과 치료효과를 확인하였고, 나아가 상기 HA 재조합 단백질 항원 및 면역반응을 크게 높여 주는 것으로 알려진 cholera toxin B subunit을 GRAS status를 가지고 있는 Lactococcus를 가열과 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid)를 처리하여 박테리아의 수용성 단백질과 핵산을 제거한 후 상기 락토코커스 사균체에 coating 하여 주사용 백신으로 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 처리한 결과 치료 효과가 상승하는 것을 확인하였다. 나아가 수용성 H5N6의 HA 삼량체 또는 Lacotoccus 사균체의 표면에 코팅된 H5N6의 HA 삼량체를 주사용 백신으로 인플루엔자 바이러스 감염 닭에 처리한 결과 높은 면역효과를 확인하였다. CTB (cholera toxin B subunit), 수용성 H5N6의 HA 삼량체, 수용성 H9N2의 HA 삼량체를 각각 사균체 Lactococcus에 코팅한 뒤 이를 혼합하여 면역조성물을 만들어서 혈구 응집을 분석한 결과 CTB (cholera toxin B subunit)를 포함하는 군이 혈구 응집이 증가하여, CTB (cholera toxin B subunit)이 면역원성을 증가시키는 것을 확인하였다. H5N6의 HA 삼량체를 coating한 Lactococcus와 H9N2의 HA 삼량체를 coating한 Lactococcus를 1:1의 비율로 섞어서 이를 백신조성물로 만들어서 이를 이용하여 mouse에 면역 주사한 결과 면역원성이 증가하는 것을 확인하였다. H5N6의 HA 삼량체와 H9N2의 HA 삼량체 1:1로 섞은 후 이를 Lactococcus coating한 후 이를 백신조성물로 만들어서 mouse에서 면역 주사를 한 결과 면역원성이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해 안착된 것으로, 본 발명의 목적은 (i) 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (ii) Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 코딩하는 유전자; 를 포함하는 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터에 LysM 도메인의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 식물에서 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다:

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계; 및

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 수득하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 상기 서술한 생산방법으로 생산된 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 포함하는 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물을 락토코스 사균체에 코팅한 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물 cholera toxin B subunit을 추가로 포함하는 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 서술한 생산 방법으로 생산된 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 포함하는 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (ii) Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 코딩하는 유전자; 를 포함하는 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 H5N6, H7N9 및 H9N2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 17의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 LysM 도메인의 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 LysM 도메인의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, Mac 프로모터 (Mac promoter), 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공할 수 있다.

상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)일 수 있다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 식물에서 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하는 방법을 제공할 수 있다:

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

본 발명은 상기 서술한 생산방법으로 생산된 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 포함하는 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

상기 백신 조성물은 주사제 형태일 수 있다.

본 발명은 상기 백신 조성물을 락토코스 사균체에 코팅한 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 백신 조성물은 cholera toxin B subunit을 추가로 포함하는 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물를 제공할 수 있다.

상기 백신 조성물은 주사제 형태일 수 있다.

본 발명은 상기 서술한 생산방법으로 생산된 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 포함하는 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

상기 백신 조성물의 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA 단백질은 H5N6, H7N9 및 H9N2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 단백질일 수 있다.

본 발명은 상기 백신 조성물은 cholera toxin B subunit을 추가로 포함하는 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

상기 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질은 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 혼합 후에 락토코스 사균체에 코팅을 하거나; 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 각각 락토코스 사균체에 코팅한 후 혼합하거나; 또는 상기의 두 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질은 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N6 유래 HA의 막 통과 단백질을 결여된 ecotodomain 부분의 단백질, 마우스의 Coronin A의 삼량체 모티프 (trimeric motif) 및 Lactococcus lactis의 LysM 펩티도글리칸-결합 도메인-포함 단백질의 세포 벽 결합 도메인인 LysM 도메인을 포함하여, 식물에서 다량으로 제조할 수 있고, 삼량체를 형성하여 면역성이 증가하며, Lactococcus와 같은 박테리아나 chitosan particle에 결합하여 효과적으로 항원을 전달할 수 있는 효과가 있다. 상기 식물에서 고발현 HA 재조합을 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스에 처리한 결과 치료효과가 있고, 또한 상기 HA 재조합 단백질 항원 및 면역반응을 크게 높여 주는 것으로 알려진 cholera toxin B subunit에 GRAS status를 가지고 있는 Lactococcus를 가열과 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid)를 처리하여 박테리아의 수용성 단백질과 핵산을 제거한 후 상기 락토코커스 사균체에 coating 하여 주사용 백신으로 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 처리한 결과 치료 효과가 있다. 본 발명은 수용성 H5N6의 HA 삼량체 또는 Lacotoccus 사균체의 표면에 코팅된 H5N6의 HA 삼량체를 주사용 백신으로 인플루엔자 바이러스 감염 닭에 처리한 결과 높은 면역효과가 있었다. CTB (cholera toxin B subunit), 수용성 H5N6의 HA 삼량체, 수용성 H9N2의 HA 삼량체를 각각 사균체 Lactococcus에 코팅한 뒤 이를 혼합하여 면역조성물을 만들어서 혈구 응집을 분석한 결과 CTB (cholera toxin B subunit)를 포함하는 군이 혈구 응집이 증가하여, CTB (cholera toxin B subunit)이 면역원성을 증진시키는 효과가 있다. H5N6의 HA 삼량체를 coating한 Lactococcus와 H9N2의 HA 삼량체를 coating한 Lactococcus를 1:1의 비율로 섞어서 이를 백신조성물로 만들어서 이를 이용하여 mouse에 면역 주사한 결과 면역원성이 증가하는 효과가 있다. H5N6의 HA 삼량체와 H9N2의 HA 삼량체 1:1로 섞은 후 이를 Lactococcus coating한 후 이를 백신조성물로 만들어서 mouse에서 면역 주사를 한 결과 면역원성이 증가하는 효과가 있다. 서로 다른 항원을 사균체 Lactococcus로 coating한 뒤 섞거나, 여러 종류의 항원을 동시에 혼합뒤에 사균체 Lactococcus로 코팅 coating하거나, 두 가지 방법을 함께 사용하여 다중의 항원을 동시에 전달하여 면역원성을 증가하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 재조합벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 N. benthamiana에서의 발현한 단백질을 SDS/PAGE로 분리한 후 anti-His antibody를 이용하여 western blot 분석 및 Coomassie brillant blue로 염색한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 Gel filtration 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 mHA과 tHA 재조합 단백질이 단량체(monomer)와 삼량체(trimer)를 형성함을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 GFP-LysM과 GFP-mCor-LysM을 이용하여 TCA 처리한 lactococcus에 결합하는 정도를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 N. benthamiana 잎 세포에서 만들어진 단백질을 TCA 처리한 Lactococcus에 결합한 후 이를 다시 SDS/PAGE로 단백질을 전개한 후 이를 Coomassie brilliant blue로 염색한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 수용성 tHA 및 락토코커스 표면에 코팅된 tHA에 대한 마우스의 면역원성 반응을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 7은 수용성 tHA 및 락토코커스 표면에 코팅된 tHA가 혈구 응집을 저해하는 정도를 분석한 결과이다.
도 8은 닭을 대상으로 PBS, Lactococcus 사균체, 수용성 H5N6의 HA 삼량체, Lacotoccus의 표면에 코팅된 H5N6의 HA 삼량체를 항원으로 하여 항체 유도 실험을 한 결과이다.
도 9는 CTB(cholera toxin B subunit), 수용성 H5N6의 HA 삼량체, 수용성 H9N2의 HA 삼량체를 각각 coating한 Lactococcus를 섞어서 면역원성을 확인한 결과이다.
도 10은 H5N6의 HA 삼량체를 coating한 Lactococcus와 H9N2의 HA 삼량체를 coating한 Lactococcus를 1:1의 비율로 섞어서 이를 백신조성물로 만들어서 이를 이용하여 mouse에 면역주사한 후 두 종류의 두 항원에 대해서 강력한 면역원성을 확인한 결과이다.
도 11은 H5N6의 HA 삼량체와 H9N2의 HA 삼량체 1:1로 섞은 후 이를 Lactococcus coating한 후 이를 백신조성물로 만들어서 mouse에서 면역 주사를 한 후 두 종류의 두 항원에 대해서 강력한 면역원성을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)의 전장(full length) 단백질은 막 관통 영역 (transmembrane domain)을 갖는 막 결합 형태 (membrane-bound form)로 세포에서 높은 수준으로 생산하는 것이 어렵다는 한계가 있다. 이에 생산 수준을 증가시키기 위해, HA의 막 관통 영역 (transmembrane domain)을 제외하고 ectodomain만을 발현하면 이는 세포에 수용성 형태(soluble form)로 만들면 높은 효율로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 HA의 ectodomain만을 수용성 형태로 만들면 원래 전장 HA가 인플루엔자 바이러스 표면에 존재할 때 갖는 삼량체 형태(trimeric form)이 잘 만들어지지 않는다는 한계가 있다. 이에 본원 발명자들은 면역성이 증가된 백신 목적으로 사용하기 위해서 HA의 ectodomain의 재조합 단백질을 식물에서 발현 및 생산할 때 삼량체(trimer)를 형성하도록 유도하는 기술을 개발하고자 하였다. 또한 이렇게 생산된 단백질을 펩티도글리칸(peptidoglycan)에 결합하는 능력을 갖게 하여 lactococcus 또는 chitosan particle 등의 표면에 결합할 수 있는 유전자를 결합하여 다양한 방법으로 항원을 전달할 수 있도록 HA ectodomain 재조합 단백질을 개발하고자 하였다. 이에 대량 생산할 수 있는 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)의 막 관통 영역 (transmembrane domain)을 제외한 ectodomain만을 발현하는 HA, 삼량체 구조를 형성하는 마우스의 Coronin A의 삼량체 모티프 (trimeric motif) 및 lactococcus 또는 chitosan particle 등의 표면에 결합하여 효과적으로 항원을 전달 시켜주는 Lactococcus lactis의 LysM 펩티도글리칸-결합 도메인-포함 단백질을 디자인하여, 하나의 벡터에 발현시켜, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질 및 상기 단백질을 식물에서 대량 발현 할 수 있는 바이너리 벡터(binary vector)를 구축 하였다.

본원 발명은 생산력을 높이기 위해 인플루엔자 바이러스 유래 HA의 막 관통 영역 (transmembrane domain)을 제외하고 ectodomain만을 코딩하는 H5N6의 HA 아미노산 서열 17번째 내지 531번째를 선택되는 어느 하나일 수 있거나, H9N2의 HA 아미노산 서열 19번째 내지 524번째로 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 17의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 1의 염기서열 또는 서열번호 17의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 Coronin 1 (mCor 1)은 상기 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)의 ecto-domain만을 발현하더라도 삼량체를 만들 수 있다.

상기 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있으며. 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질 및 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 포함하는 HA 단백질에 다양한 면역효과를 촉진하고 항원의 효과적인 전달을 위해, Lactococcus와 같은 박테리아나 키토산 입자에 결합할 수 있는 Lactococcus lactis의 LysM 펩티도글리칸-결합 도메인-포함 단백질의 세포벽 결합 도메인인 LysM 도메인 (아미노산 220번째부터 320번째까지, 총 101 개의 아미노산 잔기)를 6 개의 아미노산 잔기를 갖는 링커를 이용하여 Coronin1 (mCor1)의 삼량체 모티프의 C-말단에 융합하였다. 이어서 재조합 단백질의 분리 정제를 위해서 6 개의 His 잔기를 갖는 His tag를 융합하고, ER 축적을 위해서 HDEL 모티프를 융합하여 컨스트럭를 완성하였다 (tHA, 도 1). 대조군으로 mCor1의 삼량체 모티프가 없는 컨스트럭을 구축하여 삼량체 모티프가 없는 컨스트럭을 구축하여 비교하였다 (mHA, 도 1).

이렇게 구축된 HA의 재조합 유전자들을 식물체 발현 벡터인 pTEX1에 도입하여 식물 발현 벡터(pTEX-tHA, pTEX-mHA)를 제작하였다. 그리고 이렇게 만들어진 발현 벡터들을 Agrobacterium에 도입 후 이를 이용하여 식물체에 일과성 발현을 유도하였다. 이렇게 발현된 HA의 재조합 단백질을 His 태그를 이용하여 Ni2+-NTA 친화 컬럼이나 LysM 도메인을 이용하여 lactococcus를 이용하여 분리 하였다.

이들 유전자를 도입한 N. benthamiana의 잎 추출물에서의 단백질의 발현을 확인하기 위해서 anti-His antibody를 이용하여 western blot 분석을 하였다. 도 2에서 보는 것과 같이 HA-LysM-His-HDEL이 약 80 kD 위치에서 단백질 확인되었다. 이는 계산상의 단백질 위치보다 크게 나왔으며, 이는 HA 단백질의 N-glycosylation 때문으로 생각된다. 그리고 tHA은 mHA 보다 약간 더 크게 나왔다 (도 2).

상기 단백질의 삼량체 형성을 확인하고자 겔 여과를 수행하였다. 단량체 형태인 mHA과 삼량체 형태인 tHA 섞어서 겔 여과를 수행하였다. 그 결과 두 개의 피크(peak)가 나타났으며 (도 3A), 이들 각 피크에 해당하는 fraction을 anti-His antibody를 이용하여 western blot을 수행하였을 때 삼량체에 해당하는 피크에서는 단백질은 tHA로 나타났으며, 단량체에 해당하는 피크에서는 mHA 단백질이 확인 되었다.

상기 재조합 단백질의 LysM의 lactococcus 결합을 확인하기 위한 대조군 단백질로 사용하기 위해서 GFP를 이용하여 His tagging된 GFP-mCor1-LysM (GFP-mCor1-LysM)과 His tagging된 GFP-LysM construct (GFP-LysM)를 만들고 이를 대장균의 발현 벡터인 pRSET-A에 도입하여 대장균에서 발현할 수 있는 발현 벡터를 구축하였다. 이들 단백질 (GFP-mCor1-LysM과 GFP-LysM)들을 대장균에서 발현하고 분리 정제하여 Lactococcus 결합 하는 정도를 현미경을 이용하여 확인할 수 있다. 그 결과 GFP-mCor1-LysM이 GFP-LysM보다 GFP 발현이 더 높은 것으로 확인되었다 (도 4).

단량체 형태 mHA(mH5N6)과 삼량체 형태 tHA(tH5N6)를 발현하는 N. benthamiana의 잎 조직을 분쇄하여 총 추출물을 수득하고 이를 TCA 처리한 Lactococcus와 혼합하여 결합을 유도하고 이로부터 Lactococcus를 pelleting하여 회수한 후 이를 SDS/PAGE로 전계한 후 이를 Coomassie brilliant blue로 염색하여, LysM에 의한 HA의 Lactococcus 표면 결합에 있어서 mCor1에 의한 Trimerization의 효과를 확인하였다. 그 결과 tHA(tH5N6)은 삼량체 구조의 HA를 형성하는 반면에 mHA(mH5N6)은 삼량체 구조의 HA를 형성하지 않았다.

상기 LysM 도메인의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 13의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, Mac 프로모터 (Mac promoter), 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Mac 프로모터 (Mac promoter)일 수 있으며, 더 바람직하게는 MacT 프로모터 (MacT promoter)일 수 있다.

상기 MacT 프로모터는 Mac 프로모터 염기서열의 3’말단 염기인 A를 T로 치환한 프로모터일 수 있으며, 상기 MacT 프로모터는 서열 번호 15의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 15의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 RD29B-t 종결 부위를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 RD29B-t 종결 부위는 서열 번호 16의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

재조합 단백질의 유전자의 N-과 C-말단에 각각 BiP의 signal sequence와 ER retention signal인 HDEL를 포함으로써, ER(소포체)에 고농도로 축적을 유도하는 효과를 가질 수 있다. 상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있고, 상기 BiP(chaperone binding protein)는 서열 번호 6의 염기서열을 포함할 수 있고, HDEL(His-Asp-Glu-Leu)는 서열 번호 10의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 재조합은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다. 상기 재조합 발현 벡터 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질 전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환 생물을 제공할 수 있다.

상기 형질 전환된 형질 전환 생물은 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으며, 그 예로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 대장균 등의 곰팡이, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용 될 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium)될 수 있다. 곤충세포, 사람세포 등의 경우에는 삼량체를 형성하는 재조합 스파크 단백질을 코딩하는 유전자를 를 이들 각 종류의 동물 세포의 발현에 필요한 발현 벡터를 사용하여 발현할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용 될 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium)될 수 있다. 곤충세포, 사람세포 등의 경우에는 삼량체를 형성하는 재조합 HA 유전자를 이들 각 종류의 동물 세포의 발현에 필요한 발현 벡터를 사용하여 발현할 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

상기 식물에 침유하는 방법은 화학 전지법, 진공 또는 주사기 침윤 방법이 있고 가장 바람직하게는 주사기 침윤 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배 나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 백신 조성물은 주사제 형태일 수 있다.

서로 다른 종류의 항원을 Lactococcus 각기 따로 coating한 후 각기 다른 항원이 coating된 Lactococcus를 두 종 또는 그 이상을 1:1 또는 적절한 비율로 섞어서 하나의 백신 조성물을 만들 수 있으며, 본 발명은 각기 다른 2 종 또는 그 이상의 항원을 1:1의 비율 또는 적정한 비율로 섞어서 이를 이용하여 Lactococcus에 coating하여, 두 종 또는 그 이상의 항원을 동시에 delivery하는 백신조성물을 만들 수 있으며, 두 개 이상의 항원을 coating한 Lactococcus 사균체에 또 다시 다른 종류의 두 가지 이상의 항원을 coating한 Lactococcus 사균체를 하나 또는 그 이상을 추가로 섞어서 다중의 항원을 delivery하는 백신 조성물을 만들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 유전자의 설계

H5N6 또는 H9N2의 HA를 ER lumen에 수용성 형태로 발현하도록 유도하기 위해 막 관통 도메인과 ER targeting leader 서열이 없는 H5N6의 HA(아미노산 위치 17-531) 및 H9N2의 HA(아미노산 위치 19-524)를 확보하였다. 상기 HA의 5'-말단에 애기장대 단백질인 BiP로부터 확보한 ER 표적화 신호를 fusion하여 ER targeting 되도록 하였다. 또한, Lactococcus lactics의 AcmA로부터 lactococcus 결합 도메인인 LysM의 삼 반복 서열 중 첫 번째 반복 서열을 HA의 C-말단에 linker를 이용하여 융합시켰다. 그리고 Hisx6 태그 및 ER retention motif인 HDEL을 HA 정제 및 ER에서의 고축적을 위해서 LysM의 C-말단에 순차적으로 융합하여 mHA를 구축하였다 (도 1A). 이렇게 만들어진 HA 재조합 단백질의 삼량체 형성을 유도하기 위해, 추가적으로 마우스 mCoronin1이라는 단백질로부터 동종 삼량체의 형성을 유도하는 motif를 HA와 LysM 사이에 첨가하여 tHA를 구축 하였다 (도 1A). 발현을 위해서 macT를 사용하였으며 Rd29b의 말단을 전사종결자로 사용하였다. 이들은 본 연구실에서 높은 전사효율을 보이는 것으로 확인되었다. 실험에 사용되는 염기 서열은 하기 표 1과 같다.

	서열(5‘-3)
H5N6의 HA 염기서열	gatcagatttgtattggatatcatgcgaacaactctacagagcaggttgatacaataatggaaaagaatgtgaccgttacacatgctcaagacatattggagaagacgcacaacgggaggctttgtgatctcaatggagttaaaccacttatacttaaggactgcagtgttgccggttggcttctgggaaacccaatgtgcgatgagtttattcgtgttcccgaatggagctacatcgtcgagagagctaacccagcaaatgatctgtgttatccagggaatctcaacgattacgaggaacttaagcatctactttcgagaatcaaccatttcgaaaagacacttattattcctaagtctagttggcctaatcacgaaacctcccttggtgtaagtgcagcatgcccttatcaaggtatgccgtcttttttccgaaacgtggtttggttgactaagaagaatgatgcttaccctactatcaagatgagctataataacaccaacagggaggaccttcttattttgtggggtattcaccattctaacaatgccgctgaacagactaatttgtacaagaaccctactacttatgtttcagtaggcacgtcaactttgaatcagagattggtcccaaaaatcgctacccgtagtcaagttaatggtcagagagggaggatggacttcttttggactattcttaagccaaatgatgctatacattttgagagcaatggaaactttatcgctcccgagtacgcctataagatagtaaagaagggcgattccactatcatgaagtctgaaatggaatatggtcattgcaatacgaagtgtcaaaccccgattggtgcaattaactcatctatgcctttccacaacattcacccactaactatcggagagtgtcctaaatacgtcaaatcaaataaattggtgcttgctacaggtctgcgcaactcccctttaagggagcgaagaagaaagaggggtttgtttggagctattgcaggcttcattgagggtggatggcaaggtatggtggatggctggtacggatatcatcattcgaatgaacaggggtctggttatgcagcggatcgggagagtacacaaaaggccatagatggagttaccaacaaggtaaactctattattgataaaatgaacacacagtttgaggctgtggggagggagttcaacaaccttgaaaggcgtatcgaaaacctcaacaaaaagatggaagacggctttctggacgtttggacttacaacgcagaattgctcgttcttatggaaaacgaacgtactttggatttccatgattctaacgtcaagaatctctacgataaagtgaggctgcaacttagggacaatgcaaaagaactaggtaacggttgctttgaattttatcacaagtgtgataatgagtgtatggagagtgtaagaaacgggacttatgactaccctcagtatagtgaggaagctagactcaagcgcgaggagatttccggagttaagcttgaatcaattggaacataccagatt	서열번호 1
H5N6의 HA 아미노산 서열	dqicigyhannsteqvdtimeknvtvthaqdilekthngrlcdlngvkplilkdcsvagwllgnpmcdefirvpewsyiveranpandlcypgnlndyeelkhllsrinhfektliipksswpnhetslgvsaacpyqgmpsffrnvvwltkkndayptikmsynntnredllilwgihhsnnaaeqtnlyknpttyvsvgtstlnqrlvpkiatrsqvngqrgrmdffwtilkpndaihfesngnfiapeyaykivkkgdstimksemeyghcntkcqtpigainssmpfhnihpltigecpkyvksnklvlatglrnsplrerrrkrglfgaiagfieggwqgmvdgwygyhhsneqgsgyaadrestqkaidgvtnkvnsiidkmntqfeavgrefnnlerrienlnkkmedgfldvwtynaellvlmenertldfhdsnvknlydkvrlqlrdnakelgngcfefyhkcdnecmesvrngtydypqyseearlkreeisgvklesigtyqi	서열번호 2
mCOr1 염기서열	gtgtctaggcttgaggaagatgttagaaatctcaacgcaattgtccagaaacttcaggaaaggttggataggctggaggaaactgttcaagctaag	서열번호 3
mCor1 아미노산 서열	vsrleedvrnlnaivqklqerldrleetvqak	서열번호 4
링커1 염기서열	gaggcagccgc taaggaagct gcagcgaaa	서열번호 5
링커 1 아미노산 서열	sggsgg	서열번호 6
링커 2 염기서열	tcaggaggatcaggagga	서열번호 7
링커 2 아미노산 서열	sggsgg	서열번호 8
BiP 염기 서열	atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta	서열번호 9
HDEL 염기서열	cacgatgagctc	서열번호 10
HDEL 아미노산서열	His-Asp-Glu-Leu	서열번호 11
M17 염기서열	ggcgtgtgtgtgtgttaaaga	서열번호 12
LysM 염기서열	ggtaatactaactctgggggttcaacgaccaccattacaaacaacaacagtggaacaaattcatcttcaaccacctacaccgtgaagagtggcgatacgttgtggggaatcagtcaacgttatggtattagcgttgctcagatccagtctgcaaataaccttaagtctactataatttatattgggcaaaagctagttctgactggctcggctagtagcaccaattccggaggtagcaataactcagcttctactacccctacaacctctgtaactccagctaagcctacatcacagactaca	서열번호 13
LysM 아미노산 서열	gntnsggstttitnnnsgtnsssttytvksgdtlwgisqrygisvaqiqsannlkstiiyigqklvltgsasstnsggsnnsasttpttsvtpakptsqtt	서열번호 14
MacT 염기서열	agagatctcctttgccccagagatcacaatggacgacttcctctatctctacgatctagtcaggaagttcgacggagaaggtgacgataccatgttcaccactgataatgagaagattagccttttcaatttcagaaagaatgctaacccacagatggttagagaggcttacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggagatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaacacagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacgcaagacgtgacgtaagtatctgagctagtttttatttttctactaatttggtcgtttatttcggcgtgtaggacatggcaaccgggcctgaatttcgcgggtattctgtttctattccaactttttcttgatccgcagccattaacgacttttgaatagatacgctgacacgccaagcctcgctagtcaaaagtgtaccaaacaacgctttacagcaagaacggaatgcgcgtgacgctcgcggtgacgccatttcgccttttcagaaatggataaatagccttgcttcctattatatcttcccaaattaccaatacattacactagcatctgaatttcataaccaatctcgatacaccaaatcgt	서열번호 15
RD29B terminator 염기서열	aattttactcaaaatgttttggttgctatggtagggactatggggttttcggattccggtggaagtgagtggggaggcagtggcggaggtaagggagttcaagattctggaactgaagatttggggttttgcttttgaatgtttgcgtttttgtatgatgcctctgtttgtgaactttgatgtattttatctttgtgtgaaaaagagattgggttaataaaatatttgcttttttggataagaaactcttttagcggcccattaataaaggttacaaatgcaaaatcatgttagcgtcagatatttaattattcgaagatgattgtgatagatttaaaattatcctagtcaaaaagaaagagtaggttgagcagaaacagtgacatctgttgtttgtaccatacaaattagtttagattattggttaacatgttaaatggctatgcatgtgacatttagaccttatcggaattaatttgtagaattattaattaagatgttgattagttcaaacaaaaat	서열번호 16
H9N2의 HA 염기서열	gataaaatttgcattggctaccagtcaacaaactccacagaaactgttgatacactagtagaaaacaatgtccctgtgacacataccaaagaattgctccacacagagcacaatggaatgttatgtgcaacaaacttgggacaccctcttatcctagacacctgcaccattgaagggttggtgtacggcaatccttcctgtgatttgctactgggagggaaagagtggtcttacattgtcgaaagatcatcagctgttaatgggatgtgctaccctggaagggtagagaatctggaagaactcaggtcctttttcagttctgctcgctcctacaaaagactcctactttttccagaccgtacttggaatgtgactttcaatgggacaagcaaagcatgctcaggctcattctacagaagtatgagatggctgacacacaagaacaattcttaccctattcaagacgcccaatataccaacgactggggaaagaatattctcttcatgtggggcatacaccatccacctactgatactgagcaaatgaatctatacaaaaaagctgatacaacaacaagtataacaacggaagatatcaatcgaactttcaaaccagggatagggccaaggcctcttgtcaatggtcaacaaggaagaattgattattattggtcagtactaaagccaggccagacattgcgaataagatccaatggaaatctaattgccccatggtatggacacattctttcaggagaaagccatggaagaatcctgaagaccgatttgaatagtggcaactgcataatacaatgccaaactgagaaaggtggtttgaacacgaccttgccattccaaaatgtcagcaaatatgcatttgggaactgtcccaaatatgttggagtgaagagtctcaaactggcagttggtctaaggaatgtgcctgctacatcaggtagagggcttttcggtgccatagctggattcatagaaggaggttggccaggactagttgcaggctggtacgggtttcagcactcaaatgatcaaggggttggaatagccgcagacaaagaatcaactcaagaagcagttgataaaataacatccaaagtaaataatataatcgacaaaatgaacaagcagtatgaaatcattgatcatgagttcagtgagattgaagccagactcaatatgatcaacaataagattgatgaccaaatacaggacatctgggcgtacaatgcagaattactagtactgcttgaaaaccagaaaacactcgatgatcatgatgcaaatgtgaacaatctgtataataaggtgaagagagcattgggttcaaatgcaatagaggatgggaagggatgcttcgagttgtatcacaaatgtgatgatcaatgcatggaaacaattagaaacgggacttatgacaggctaaagtataaagaagaatcaaaactagaaaggcagaaaatagaaggggtaaaactggagtctgaagaaacatacaagatt	서열번호 17
H9N2의 HA 아미노산 서열	dkicigyqstnstetvdtlvennvpvthtkellhtehngmlcatnlghplildtctieglvygnpscdlllggkewsyiverssavngmcypgrvenleelrsffssarsykrlllfpdrtwnvtfngtskacsgsfyrsmrwlthknnsypiqdaqytndwgknilfmwgihhpptdteqmnlykkadtttsittedinrtfkpgigprplvngqqgridyywsvlkpgqtlrirsngnliapwyghilsgeshgrilktdlnsgnciiqcqtekgglnttlpfqnvskyafgncpkyvgvkslklavglrnvpatsgrglfgaiagfieggwpglvagwygfqhsndqgvgiaadkestqeavdkitskvnniidkmnkqyeiidhefseiearlnminnkiddqiqdiwaynaellvllenqktlddhdanvnnlynkvkralgsnaiedgkgcfelyhkcddqcmetirngtydrlkykeesklerqkiegvkleseetyki	서열번호 18

실시예 2. 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 유전자의 발현 및 확인

mHA와 tHA를 vacuum infiltration 방법을 사용하여 4-5주령 Nicotiana benthamiana 식물 잎에서 일과성 발현을 통하여 발현을 유도하였다. 침윤된 잎을 침윤 후 3 일, 5 일 및 7 일 (dpi)에 각각 수확하고, 액체 질소에서 완전히 분쇄하고 3 부피의 완충액에 용해시켰다. 침윤된 잎 추출물로부터의 총 가용성 단백질을 SDS-PAGE로 전개한 후 이를 western blot 분석을 수행하였다. HA 재조합 단백질은 anti-His antibody에 의해서 예측된 크기에 상응하는 위치인 대략 85kDa (mH5N6) 및 90kDa (tH5N6)의 지점에 선명하게 밴드를 나타냈다. 그리고 같은 멤브레인을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 밴드를 확인하였을 때 여기에서도 관찰되었다. 이들 재조합 단백질의 발현 수준을 밴드 강도로부터 판단하건대 침윤된 잎에서 100μg/g 생 중량 (fresh weight) 정도인 것으로 추정되었다.

실시예 3. 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 유전자의 삼량체 구조 형성의 확인

바이러스 표면상의 HA 단백질은 동종 삼량체로서 존재하여 높은 안정성 및 면역원성을 나타낸다. 반면 재조합 HA는 발현 시스템에 따라 응집체 또는 단량체로서 발현되는 경향이 있다. 바이러스 표면에 존재하는 것과 같이 HA의 삼량체를 모방하기 위해, coiled coil구조를 이루며 동종 삼량체를 형성하는 motif인 마우스 코로닌1-1A (mCor1, 32 아미노산)를 HA의 C-말단에 첨가 하였다. 이들 유전자를 N. benthamiana에 도입하여 발현을 유도하고 각각 5dpi 잎 조직으로부터의 total soluble protein을 확보하여 Ni²⁺-NTA 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 분리 정제된 mHA와 tHA를 BSA 표준 곡선에 기초하여 정량화 하였다. mCor1에 의해 HA가 삼량체를 형성하는지를 확인하고자, 약 10μg의 mHA 및 10μg의 tHA에 PBS를 추가하여 전체 부피가 1mL이 되도록 혼합하고 이를 size exclusion chromatography(SEC)를 수행 하였다. mHA 및 tHA 혼합물은 280nm 흡수 스펙트럼에서 2개의 피크를 나타내었다 (도 3). 이들 두 peak를 포함하는 분획을 Anti-His 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다 (도 3). 도 3의 SEC 및 Western blotting 결과에서 보듯이 mCor1를 포함하는 tHA는 mCor1이 없는 mHA 보다 앞에서 용출되었다. 이를 통해서 mCor1가 HA의 삼량체 형성을 유도함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 유전자의 펩티도글리칸 결합 능력의 확인

Lactococcus lactis의 phage인 MG1363의 주요 autolysin인 AcmA는 C-말단에 LysM이라 불리는 도메인이 3 반복으로 나타나며 이 LysM의 3 반복 부분이 Lactococcus의 세포벽 성분인 펩티도글리칸에 결합하는 능력을 가지고 있다. 펩티도글리칸에 대한 최적의 활성을 위해서는 3개의 반복이 필요하다. 하지만 3 개의 반복 구간을 다 포함하는 경우에는 도메인의 길이가 너무 길어서 한 개의 LysM 만을 GFP의 C-말단에 fusion하여 확인을 하였다. 그 결과 GFP-LysM은 Lactococcus에 잘 결합하지 않았다. 여기에 HA의 삼량체 형성을 위해서 사용하였던 마우스 코로닌 1A (mCor-1A)의 삼량체 형성 모티프를 추가하여 GFP-mCOr1-LysM을 구축하여 HA에서의 삼량체와 같은 삼량체를 형성하도록 유도한 후 Lactococcus에 결합하는지를 확인하였다. 그 결과 GFP-LysM에 비해서 현저하게 증가된 GFP 신호를 Lactococcus에서 확인할 수 있었다. 이를 통해서 mCor1A의 삼량체 형성 모티프가 GFP의 삼량체 형성을 유도하고 이렇게 된 GFP 삼량체는 LysM 모티프 3 개를 갖게 되므로 이를 통해서 GFP가 Lactococcus에 잘 결합하는 것으로 해석할 수 있었다. 따라서 이러한 결과는 tHA가 Lactoccocus에 잘 결합 할 것이라는 것을 제시한다고 생각하였다.

실시예 5. 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 유전자의 최대 결합량의 확인

HA의 재조합 단백질인 mHA와 tHA 모두 Nicotiana benthamiana에서 높게 발현되었다. 침윤된 잎을 액체 질소에서 완전히 분쇄하고 0.5% 트리톤 X-100, 1 mM EDTA 및 25% 글리세롤을 함유하는 10배 부피 PBS buffer에 용해시켰다. 잎으로부터 총 가용성 단백질을 확보하고, 잎의 200 mg에서 2 g에 해당하는 총가용성 단백질의 양을 37℃에서 1시간 동안 TCA 전처리한 L. lactics와 함께 인큐베이션 한 후 PBS 완충액으로 3회 세척 하였다. 각 각의 sample로부터 Lactococcus를 침전하여 이를 SDS 버퍼에 넣고 가열한 후 다양한 양의 BSA와 함께 SDS-PAGE로 전개한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB 염색)로 염색하여 HA를 확인하였다. 삼량체 motif인 mCor1을 갖는 tHA는 L. lactics에 HA의 양에 따라서 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2A 및 2B). 반면에 mHA는 Lactococcus에 거의 결합하지 않음을 확인할 수 있었다. 삼량체인 tHA의 최대 결합량은 약 1.7μg/1 ml L. lactics (OD = 1)로 추정되었다 (도 5).

실시예 6. lactococcus 사균체의 제조 및 이를 이용한 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 단백질을 코팅하는 방법

Lactococcus (한국미생물보존센터; KCCM No. 43146)를 OD 600 1.0까지 배양한 후 배양액을 원심분리를 통해서 cell을 pelleting하여 회수한 후 이를 같은 부피의 10% 트리클로로 아세트산 (TCA) 재현탁한 후100°C에서 10 분 동안 처리했다. TCA를 제거하기 위해 cell을 원심분리를 통해서 pelleting한 후 이를 PBS로 3 회 세척 한 후 펠릿을 재현탁하여 Lactococcus 사균체를 만들었다. 완충액 (PBS pH = 7.5, 1 mM EDTA, Triton X-100, 칵테일 및 25 % 글리세롤)을 이용하여 만든 total soluble protein 추출액의 다양한 양을 첨가하여 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 12,000 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하여 Lactococcus 사균체를 pelleting 하였으며, 이를 단백질 추출액용 PBS 완충액으로 3 회 세척하였다.

실시예 7. 마우스를 이용하여 삼량체를 형성하는 항원들의 면역원성을 확인한 실험

실시예 2 및 실시예 6의 방법으로 제조된 재조합 tH5N6, Lactococcus 사균체에 코팅한 tH5N6, tH9N2, Lactococcus 사균체에 코팅한 tH9N2 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 복강내 주사하였다. 대조군으로는 PBS와 Lactococcus 사균체를 투여하였다. 하기 표 2과 같은 조성으로 아쥬반트를 혼합하거나 또는 하지 않고, 상기 제조합 백신을 첨가하여 시험 백신을 제조하였다.

시험군 (+adjuvant)	조성
PBS	PBS + Freund's complete
Lactococcus 사균체	Lactococcus cell+ 25% glycerol + PBS + Freund's complete
tH5N6	1 μg of tHA of H5N6 + Freund's complete + PBS
Lactococcus 사균체에 코팅한 tH5N6	1 μg of tHA of H5N6 + Lactococcus cell+ 25% glycerol + PBS + Freund's complete
tH9N2	1 μg of tHA of H9N2 + PBS
Lactococcus 사균체에 코팅한 tH9N2	1 μg of tHA of H9N2 + Lactococcus cell+ 25% glycerol + PBS + Freund's complete + PBS
시험군 (-adjuvant)	조성
PBS	PBS
Lactococcus 사균체	Lactococcus cell+ 25% glycerol + PBS
tH5N6	1 μg of tHA of H5N6 + PBS
Lactococcus 사균체에 코팅한 tH5N6	1 μg of tHA of H5N6 + Lactococcus cell+ 25% glycerol + PBS
tH9N2	1 μg of tHA of H9N2 + PBS
Lactococcus 사균체에 코팅한 tH9N2	1 μg of tHA of H9N2 + Lactococcus cell+ 25% glycerol + PBS

상기 투여된 시험 백신에 의해 유도된 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역전인 0주차 2차 백신 투여 후 2 주재인 4주차에 마우스의 혈청에 분리하여 항원 특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다. 전체 IgG 항체가는 하기와 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 정제된 상기 재조합 항원을 96웰 마이크로플레이트에 50 ng/well의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기 위하여 3%의 skim milk를 포함하는 PBST buffer (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH₂PO₄ 1.8mM,Tween 20 1% ) 200μl를 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 3% skim milk를 포함한 PBST 용액으로 희석한 혈청을 넣고 실온에서 1시간 동안 microplate shaker위에서 반응시켰다. 이어서 200μl PBST buffer로 3회 세척후, 2차 항체로 항-마우스 IgGHRP(horse radish heroxidase, KPL, 미국, Bethyl.)를 넣고 2시간 동안 동일한 조건에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 10분간 상온에서 반응시킨 다음 0.18 M H₂SO₄ 정지 용액을 이용해 발색 반응을 멈춘 후, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. 항체가는 음성대조군 OD 값의 2배에 해당하는 OD 값을 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다. 그 결과 보조제 없이 Lactococcus 표면에 coating된 tHA가 adjuvant을 포함한 것과 동일한 항체 유도효과를 나타내었다 (도 6). 이를 통해서 Lactococcus에 coating된 항원은 adjuvant 없이 강력하게 면역을 유도할 수 있으며, Lactococcus 사균체는 복강 내 및 근육 내 투여에서 강력한 보조제가 될 수 있음을 암시하며, 이는 예방 접종의 비용 효율성 적용이 될 수 있다.

실시예 8. 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 유래 혈구응집소 (HA)재조합 단백질이 Lactococcus에 표면에 coating된 형태와 수용성 삼량체의 혈구 응집 저해정도를 비교 분석한 실험

PBS를 대조군으로 사용하였으며, tH9N2 (H9N2의 HA 삼량체), tH5N6 (H5N6의 HA 삼량체), Lactococcus 사균체, Lact.-tH9N2 (Lactococcus 표면에 coating된 H9N2의 HA 삼량체), Lact.-tH5N6 (Lactococcus 표면에 coating된 H5N6의 HA 삼량체)를 2의 배수로 희석된 항원을 이용하여 혈구 응집 억제 실험(Hemagglutination inhibition assays)을 진행하여 혈구 응집을 분석하였다. U-bottom microplate에 첫 번째부터 마지막 웰 전까지 희석 버퍼 25 ㎕를 첨가하였다. 전 처리된 시료를 첫 번째 웰에 희석 버퍼를 25 ㎕ 첨가한 후 마지막 웰 전까지 25 ㎕씩 넘기면서 2진 희석하였다. 이때 시료의 비특이 반응을 확인하기 위하여 마지막 웰에 전 처리된 시료 25 ㎕를 첨가하였다. 8 HA Unit으로 희석된 각각의 항원을 첫 번째부터 마지막 웰 전까지 25 ㎕씩 첨가하고 밀봉하여 실온에서 45분 동안 배양하였다. 1% 닭 혈구 25 ㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 판독하였다. Hemagglutination inhibition assays에 있어서도 Lactococcus-coated antigen이 훨씬 더 활성이 높았다 (도 7).

실시예 9. 가금류를 대상으로 Lactococcus 표면에 coating된 삼량체의 항원성을 확인하는 실험

닭 [6주령, 남덕 SPF (한국); 5수/그룹)에 PBS, Lactococcus 사균체, 수용성 H5N6의 HA 삼량체, Lacotoccus의 표면에 코팅된 H5N6의 HA 삼량체를 항원으로 하여 1 번의 근육주사를 통한 항원의 투여한 후 항체의 생성을 확인하였다. 또한 실험은 동일하게 하면서 항원을 H9N2의 HA를 이용하여 마찬가지 방법으로 닭에 근육주사 후 항체의 생성을 확인하였다. 백신의 조성은 하기 표 3과 같다. 이때 H9N2 virus를 1x10⁷ EID50을 대조군으로 주사하여 항체의 생성을 확인하였다.

시험군	조성
PBS	PBS
Lactococcus 사균체	Lactococcus 사균체 cells,25 % glycerol , PBS
tH5N6	2 μg tHA of H5N6, PBS
Lactococcus 사균체에 코팅한 tH5N6	2 μg tHA of H5N6, Lactococcus 사균체 cells,25 % glycerol, PBS
시험군	조성
PBS	PBS
Lactococcus 사균체	Lactococcus 사균체 cells,25 % glycerol , PBS
tH9N2	2 μg tHA of H9N2, PBS
Lactococcus 사균체에 코팅한 tH9N2	2 μg tHA of H9N2, Lactococcus 사균체 cells, 25 % glycerol, PBS
formalin inactivated H9N2	formalin inactivated H9N2 10⁷viral particles

상기 투여된 시험 백신에 의해 유도된 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 2주차, 3 주차, 4주차에 닭의 혈청에 분리하여 항원 특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다. 전체 IgG 항체가는 하기와 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 정제된 상기 재조합 항원을 96웰 마이크로플레이트에 100 ng/well의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기 위하여 1%의 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체로 항-마우스 IgGHRP(horse radish heroxidase, KPL, 미국)를 넣고 1시간 동안 동일한 조건에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 10분간 상온에서 반응시킨 다음 정지 용액을 이용해 발색 반응을 멈춘 후, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. 항체가는 음성대조군 OD 값의 2배에 해당하는 OD 값을 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다. 닭에 있어서도 Lactococcus surface에 coating한 항원이 soluble form으로 injection한 것 보다 훨씬 강력한 면역반응을 유도하였다. 특히 Lacotoccus의 표면에 코팅된 H9N2의 HA 삼량체 2 μg이 H9N2 virus 1x10⁷ EID50을 주사한 것보다 훨씬 강력한 면역효과를 가지는 것을 확인하였다 (도 8).

실시예 10. CTB (cholera toxin B subunit), 수용성 H5N6의 HA 삼량체, 수용성 H9N2의 HA 삼량체를 각각 사균체 Lactococcus에 코팅한 후 면역 유도의 확인

CTB (cholera toxin B subunit), 수용성 H5N6의 HA 삼량체, 수용성 H9N2의 HA 삼량체를 각각 사균체 Lactococcus에 코팅한 후 이를 mouse (계통명: BALB/c; 동물규격, 5주령, 암컷, 20g;동물구입처, 샘타코,한국; 사용개체수: 3마리/그룹) 항원 복강 주사를 통해서 면역원성을 확인하였다. CTB (1μg)이 coating된 iLact을 대조군으로, iLact-tH5N6 (0.1 μg) + iLact-tH9N2 (0.1 μg), iLact-tH5N6 (0.5 μg) + iLact-tH9N2 (0.5 μg), CTB (1μg) + iLact-tH5N6 (0.1 μg) + iLact-tH9N2 (0.1 μg), 또는 CTB (1μg) + iLact-tH5N6 (0.5 μg) + iLact-tH9N2 (0.5 μg)을 백신조성물로 제조하여 2 주 간격으로 2 번 복강 주사한 후 2 주 후에 혈액을 채취하여 혈액에 존재하는 항체를 ELISA를 통하여 확인하였다. 이때 ELISA plate에는 H5N6과 H9N2 항원을 각각 20 ng을 coating하여 확인을 하였다. 그 결과 CTB를 tHA 항원들과 동시에 복강 주사를 하였을 때 HA의 면역원성을 증진시키는 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다 (도 9).

실시예 11. Lactococcus에 H5N6의 HA와 H9N2의 HA를 따로 coating한 후 Lactococcus를 섞어서 면역 유도능력의 확인

Lactoccus에 표면에 각기 다른 두 종류의 HA를 coating한 후 이들을 섞어서 mouse에 주사하였을 때 각각의 항원에 대한 면역원성의 효능을 확인하였다. 이를 위해서 H5N6의 tHA 의 0.1 μg, 0.5 μg 또는 1.0 μg을 Lactococcus 표면에 coating하여 iLact-tHA^H5N6를 준비하고, 마찬가지로 H9N2의 tHA를 0.1 μg, 0.5 μg 또는 1.0 μg을 Lactococcus 표면에 coating하여 iLact-tHA^H9N2를 준비하여, 각 농도별로 1:1로 섞어서 백신조성물질 (iLact-tHA^H5N6+ iLact-tHA^H9N2)을 마련하였으며, 이들을 mouse에 2 주 간격으로 복강 주사하여 면역반응을 유도하고, 두 번째 주사한 뒤 2 주 후에 혈액을 채취하여 항체의 양을 측정하였다. ELISA plate에tHA^H5N6 와 tHA^H9N2 종류의 항원을 50 ng coating 한 후 여기에 결합하는 각각에 대한 항체의 양을 [실시예 7]에서 기술한 방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 두 항원에 대해서 강력한 면원원성을 확인하였다 (도 10)

실시예 12. Lactococcus에 H5N6의 HA와 H9N2의 HA 두 종류를 동시에 coating한 후 이를 통한 면역유도 능력의 확인

Lactococcus에 antigen을 coating할 때 각각 0.1 μg, 0.5 μg 또는 1.0 μg 농도를 갖는 H5N6의 tHA (tHA^H5N6)와 H9N2의 tHA (tHA^H5N6) 두 종류의 antigen을 1:1로 섞어서 coating을 하여 두 종류의 antigen이 Lactococcus 같이 coating 되도록 하였으며 [iLact(tHA^H5N6+ tHA^H5N6)], 이를 mouse에 2 주 간격으로 복강 주사 한 후 2번째의 면역 주사 한지 2 주 후에 혈액을 채취하여 항체의 형성을 ELISA를 통해서 확인하였다. ELISA에는 사용한 antigen을 50 ng coating 한 후 혈액을 적절한 비율로 희석하여 혈액에 존재하는 항체의 양을 [실시예 7]에 설명한 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 이러한 방법으로 백신조성물을 만들었을 때 두 antigen에 모두에 대해서 강력한 면역반응을 유도하는 것을 확인하였다. 따라서 Lactococcus가 두 종류의 antigen (tHA^H5N6와 tHA^H9N2)를 동시에 delivery 할 수 있다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Design for recombinant protein for influenza virus surface protein hemagglutinin, a method of mass-production of its in plants, and pharmaceutical composition for treating and preventing influenza virus containing its <130> 1068313 <150> KR 10-2020-0048979 <151> 2020-04-22 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA of H5N6 <400> 1 gatcagattt gtattggata tcatgcgaac aactctacag agcaggttga tacaataatg 60 gaaaagaatg tgaccgttac acatgctcaa gacatattgg agaagacgca caacgggagg 120 ctttgtgatc tcaatggagt taaaccactt atacttaagg actgcagtgt tgccggttgg 180 cttctgggaa acccaatgtg cgatgagttt attcgtgttc ccgaatggag ctacatcgtc 240 gagagagcta acccagcaaa tgatctgtgt tatccaggga atctcaacga ttacgaggaa 300 cttaagcatc tactttcgag aatcaaccat ttcgaaaaga cacttattat tcctaagtct 360 agttggccta atcacgaaac ctcccttggt gtaagtgcag catgccctta tcaaggtatg 420 ccgtcttttt tccgaaacgt ggtttggttg actaagaaga atgatgctta ccctactatc 480 aagatgagct ataataacac caacagggag gaccttctta ttttgtgggg tattcaccat 540 tctaacaatg ccgctgaaca gactaatttg tacaagaacc ctactactta tgtttcagta 600 ggcacgtcaa ctttgaatca gagattggtc ccaaaaatcg ctacccgtag tcaagttaat 660 ggtcagagag ggaggatgga cttcttttgg actattctta agccaaatga tgctatacat 720 tttgagagca atggaaactt tatcgctccc gagtacgcct ataagatagt aaagaagggc 780 gattccacta tcatgaagtc tgaaatggaa tatggtcatt gcaatacgaa gtgtcaaacc 840 ccgattggtg caattaactc atctatgcct ttccacaaca ttcacccact aactatcgga 900 gagtgtccta aatacgtcaa atcaaataaa ttggtgcttg ctacaggtct gcgcaactcc 960 cctttaaggg agcgaagaag aaagaggggt ttgtttggag ctattgcagg cttcattgag 1020 ggtggatggc aaggtatggt ggatggctgg tacggatatc atcattcgaa tgaacagggg 1080 tctggttatg cagcggatcg ggagagtaca caaaaggcca tagatggagt taccaacaag 1140 gtaaactcta ttattgataa aatgaacaca cagtttgagg ctgtggggag ggagttcaac 1200 aaccttgaaa ggcgtatcga aaacctcaac aaaaagatgg aagacggctt tctggacgtt 1260 tggacttaca acgcagaatt gctcgttctt atggaaaacg aacgtacttt ggatttccat 1320 gattctaacg tcaagaatct ctacgataaa gtgaggctgc aacttaggga caatgcaaaa 1380 gaactaggta acggttgctt tgaattttat cacaagtgtg ataatgagtg tatggagagt 1440 gtaagaaacg ggacttatga ctaccctcag tatagtgagg aagctagact caagcgcgag 1500 gagatttccg gagttaagct tgaatcaatt ggaacatacc agatt 1545 <210> 2 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of H5N6 HA <400> 2 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Arg Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Arg Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Thr Leu Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser 115 120 125 Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Met Pro Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Met Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Arg Gly 210 215 220 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Met Glu Tyr Gly 260 265 270 His Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320 Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 325 330 335 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 340 345 350 Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Arg Glu 355 360 365 Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 370 375 380 Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn 385 390 395 400 Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 405 410 415 Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu 420 425 430 Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr 435 440 445 Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 450 455 460 Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 465 470 475 480 Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 485 490 495 Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 500 505 510 Tyr Gln Ile 515 <210> 3 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCOr1 <400> 3 gtgtctaggc ttgaggaaga tgttagaaat ctcaacgcaa ttgtccagaa acttcaggaa 60 aggttggata ggctggagga aactgttcaa gctaag 96 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mCor1 <400> 4 Val Ser Arg Leu Glu Glu Asp Val Arg Asn Leu Asn Ala Ile Val Gln 1 5 10 15 Lys Leu Gln Glu Arg Leu Asp Arg Leu Glu Glu Thr Val Gln Ala Lys 20 25 30 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 5 ggaggttcag gaggttcagg aggttcagga ggttca 36 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Linker 1 <400> 6 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 7 tcaggaggat caggagga 18 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Linker 2 <400> 8 Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP <400> 9 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDEL <400> 10 cacgatgagc tc 12 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HDEL <400> 11 His Asp Glu Leu 1 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M17 <400> 12 ggcgtgtgtg tgtgttaaag 20 <210> 13 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LysM <400> 13 ggtaatacta actctggggg ttcaacgacc accattacaa acaacaacag tggaacaaat 60 tcatcttcaa ccacctacac cgtgaagagt ggcgatacgt tgtggggaat cagtcaacgt 120 tatggtatta gcgttgctca gatccagtct gcaaataacc ttaagtctac tataatttat 180 attgggcaaa agctagttct gactggctcg gctagtagca ccaattccgg aggtagcaat 240 aactcagctt ctactacccc tacaacctct gtaactccag ctaagcctac atcacagact 300 aca 303 <210> 14 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of LysM <400> 14 Gly Asn Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile Thr Asn Asn Asn 1 5 10 15 Ser Gly Thr Asn Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp 20 25 30 Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ala Gln Ile 35 40 45 Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile Tyr Ile Gly Gln Lys 50 55 60 Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala Lys Pro 85 90 95 Thr Ser Gln Thr Thr 100 <210> 15 <211> 1220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MacT <400> 15 agagatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctctatctct acgatctagt 60 caggaagttc gacggagaag gtgacgatac catgttcacc actgataatg agaagattag 120 ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 180 tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggag atcaaatacc ttcccaagaa 240 ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat 300 atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc 360 aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat 420 ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt 480 catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 540 cgacacgctt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 600 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 660 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 720 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 780 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 840 ggattgatgt gacgcaagac gtgacgtaag tatctgagct agtttttatt tttctactaa 900 tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc 960 tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc agccattaac gacttttgaa tagatacgct 1020 gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt accaaacaac gctttacagc aagaacggaa 1080 tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc gccttttcag aaatggataa atagccttgc 1140 ttcctattat atcttcccaa attaccaata cattacacta gcatctgaat ttcataacca 1200 atctcgatac accaaatcgt 1220 <210> 16 <211> 520 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29B terminator <400> 16 aattttactc aaaatgtttt ggttgctatg gtagggacta tggggttttc ggattccggt 60 ggaagtgagt ggggaggcag tggcggaggt aagggagttc aagattctgg aactgaagat 120 ttggggtttt gcttttgaat gtttgcgttt ttgtatgatg cctctgtttg tgaactttga 180 tgtattttat ctttgtgtga aaaagagatt gggttaataa aatatttgct tttttggata 240 agaaactctt ttagcggccc attaataaag gttacaaatg caaaatcatg ttagcgtcag 300 atatttaatt attcgaagat gattgtgata gatttaaaat tatcctagtc aaaaagaaag 360 agtaggttga gcagaaacag tgacatctgt tgtttgtacc atacaaatta gtttagatta 420 ttggttaaca tgttaaatgg ctatgcatgt gacatttaga ccttatcgga attaatttgt 480 agaattatta attaagatgt tgattagttc aaacaaaaat 520 <210> 17 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA of H9N2 <400> 17 gataaaattt gcattggcta ccagtcaaca aactccacag aaactgttga tacactagta 60 gaaaacaatg tccctgtgac acataccaaa gaattgctcc acacagagca caatggaatg 120 ttatgtgcaa caaacttggg acaccctctt atcctagaca cctgcaccat tgaagggttg 180 gtgtacggca atccttcctg tgatttgcta ctgggaggga aagagtggtc ttacattgtc 240 gaaagatcat cagctgttaa tgggatgtgc taccctggaa gggtagagaa tctggaagaa 300 ctcaggtcct ttttcagttc tgctcgctcc tacaaaagac tcctactttt tccagaccgt 360 acttggaatg tgactttcaa tgggacaagc aaagcatgct caggctcatt ctacagaagt 420 atgagatggc tgacacacaa gaacaattct taccctattc aagacgccca atataccaac 480 gactggggaa agaatattct cttcatgtgg ggcatacacc atccacctac tgatactgag 540 caaatgaatc tatacaaaaa agctgataca acaacaagta taacaacgga agatatcaat 600 cgaactttca aaccagggat agggccaagg cctcttgtca atggtcaaca aggaagaatt 660 gattattatt ggtcagtact aaagccaggc cagacattgc gaataagatc caatggaaat 720 ctaattgccc catggtatgg acacattctt tcaggagaaa gccatggaag aatcctgaag 780 accgatttga atagtggcaa ctgcataata caatgccaaa ctgagaaagg tggtttgaac 840 acgaccttgc cattccaaaa tgtcagcaaa tatgcatttg ggaactgtcc caaatatgtt 900 ggagtgaaga gtctcaaact ggcagttggt ctaaggaatg tgcctgctac atcaggtaga 960 gggcttttcg gtgccatagc tggattcata gaaggaggtt ggccaggact agttgcaggc 1020 tggtacgggt ttcagcactc aaatgatcaa ggggttggaa tagccgcaga caaagaatca 1080 actcaagaag cagttgataa aataacatcc aaagtaaata atataatcga caaaatgaac 1140 aagcagtatg aaatcattga tcatgagttc agtgagattg aagccagact caatatgatc 1200 aacaataaga ttgatgacca aatacaggac atctgggcgt acaatgcaga attactagta 1260 ctgcttgaaa accagaaaac actcgatgat catgatgcaa atgtgaacaa tctgtataat 1320 aaggtgaaga gagcattggg ttcaaatgca atagaggatg ggaagggatg cttcgagttg 1380 tatcacaaat gtgatgatca atgcatggaa acaattagaa acgggactta tgacaggcta 1440 aagtataaag aagaatcaaa actagaaagg cagaaaatag aaggggtaaa actggagtct 1500 gaagaaacat acaagatt 1518 <210> 18 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of H9N2 HA <400> 18 Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Leu Val Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Thr Lys Glu Leu 20 25 30 Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu Gly His 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr Gly Asn 50 55 60 Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro Gly Arg Val Glu 85 90 95 Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Phe Phe Ser Ser Ala Arg Ser Tyr Lys 100 105 110 Arg Leu Leu Leu Phe Pro Asp Arg Thr Trp Asn Val Thr Phe Asn Gly 115 120 125 Thr Ser Lys Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg Trp Leu 130 135 140 Thr His Lys Asn Asn Ser Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr Thr Asn 145 150 155 160 Asp Trp Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile His His Pro Pro 165 170 175 Thr Asp Thr Glu Gln Met Asn Leu Tyr Lys Lys Ala Asp Thr Thr Thr 180 185 190 Ser Ile Thr Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Gly Ile Gly 195 200 205 Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asp Tyr Tyr Trp 210 215 220 Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser His Gly 245 250 255 Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Asn Ser Gly Asn Cys Ile Ile Gln Cys 260 265 270 Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln Asn Val 275 280 285 Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Pro Lys Tyr Val Gly Val Lys Ser 290 295 300 Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Thr Ser Gly Arg 305 310 315 320 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 325 330 335 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 340 345 350 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp Lys Ile 355 360 365 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 370 375 380 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn Met Ile 385 390 395 400 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 405 410 415 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp His Asp 420 425 430 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 435 440 445 Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 450 455 460 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Arg Leu 465 470 475 480 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 485 490 495 Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile 500 505

Claims

(i) 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질을 코딩하는 유전자; 및
(ii) Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 코딩하는 유전자;
를 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 H5N6, H7N9 및 H9N2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 유래 HA(hemagglutinin)에서 막 통과 단백질 부분이 결여된 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 Coronin 1 (mCor 1)의 삼량체 모티프(trimeric motif) 부위의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터에 LysM 도메인의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 7항에 있어서, 상기 LysM 도메인의 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 7항에 있어서, 상기 LysM 도메인의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, Mac 프로모터 (Mac promoter), 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함하는, 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터로 형질 전환 생물.
제 11항에 있어서, 상기 형질 전환된 형질 전환 생물은 원핵생물 또는 진핵생물인, 형질 전환체.
(a) 제 1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;
(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및
(e) 상기 식물을 분쇄하여 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 수득하는 단계;
를 포함하는 식물에서 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 생산하는 방법.
제 13항의 생산방법으로 생산된 삼량체를 형성하는 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 포함하는, 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 백신 조성물을 락토코스 사균체에 코팅하는, 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 백신 조성물은 cholera toxin B subunit을 추가로 포함하는, 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 백신 조성물은 주사제 형태인, 면역원성이 증가된 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 13항의 생산방법으로 생산된 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 포함하는, 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 백신 조성물의 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA 단백질은 H5N6, H7N9 및 H9N2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 단백질인, 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질은 락토코스 사균체에 코팅한, 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 백신 조성물은 cholera toxin B subunit을 추가로 포함하는, 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질은 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 혼합 후에 락토코스 사균체에 코팅을 하거나; 삼량체를 형성하는 다른 2개 이상의 종류의 인플루엔자 바이러스 유래 재조합 HA(hemagglutinin) 단백질을 각각 락토코스 사균체에 코팅한 후 혼합하거나; 또는 상기의 두 방법을 사용하여 제조된, 면역원성이 증가된 서로 다른 유전형의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.