CN110300805A - 通过s-标签-s-蛋白融合物的来自植物的寡聚体疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过在真核细胞中共表达两种融合蛋白来在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，所述两种融合蛋白包括蛋白质‑S‑标签融合蛋白，其中所述蛋白质为抗原或抗体；和S‑蛋白‑尾片段(tp)融合蛋白。进一步地，本发明涉及至少包含蛋白质‑S‑标签融合蛋白和S‑蛋白‑尾片段(tp)融合蛋白的寡聚蛋白质，其中所述蛋白质‑S‑标签融合蛋白中的蛋白质为抗原或抗体；以及在疫苗中的用途。

Description

通过S-标签-S-蛋白融合物的来自植物的寡聚体疫苗
本发明涉及用于通过在真核细胞中共表达两种融合蛋白来在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，寡聚蛋白质，以及其在疫苗中的用途。
现有技术
甲型流感病毒(负链有包膜正黏病毒)属于最严重的呼吸系统病原体。它们引起严重的和可能致死的疾病(Cox等人,2004)。预期高度致病的禽流感病毒将会引起下一次全球大流行病威胁，这是由于容易由禽类宿主扩散以及其直接感染人类的能力(Yen和Webster,2009)。因此，开发出有效且廉价的疫苗接种策略是即将出现的需求。
处于研究的焦点中的是来自植物的亚单位疫苗。Topp等人公开了在植物中重组地产生蛋白质(Topp等人,2016)。一项最近开发出的策略是通过将血凝素基因克隆到经充分表征的载体中和瞬时表达来在烟草物种本氏烟草(N.benthamiana)中产生基于病毒样颗粒的疫苗(Landry等人,2010；D’Aoust等人,2008)。不利的是，该策略包括下游加工步骤，例如几次过滤、渗滤、连续流离心和切向流过滤，或者备选地，色谱方法。
备选地，在本氏烟草叶细胞的内质网(ER)中瞬时产生三聚血凝素，以避开限制例如高的下游成本和低的病毒样颗粒的表达水平(Phan等人,2013)。关于三聚化，将血凝素在C末端处与三聚基元GCN4-pII相融合(Harbury等人,1993)。
Czajkowsky等人公开了使用Fc融合蛋白作为疫苗(Czajkowsky等人,2012)，其中所述Fc融合物通过增加血浆半寿期、增加与Fc受体的相互作用以及增加可溶性和稳定性而增加了抗原的治疗活性。Louveiro等人描述了基于血凝素-Fc融合蛋白的流感疫苗(人H1、H3流感病毒和禽H5流感病毒)(Loureiro等人,2011)。
US 7,067,110 B1公开了用于增强蛋白质和肽抗原的免疫原性的Fc-融合蛋白，其中将所述抗原与免疫球蛋白重链恒定区(CH2、CH3、CH4)相融合。进一步地，所述疫苗包含用于增强或调节特定免疫应答的佐剂，优选地人细胞因子。抗原选自前列腺特异性膜抗原、细胞因子受体的胞外结构域、病毒蛋白质或肿瘤特异性蛋白质。
备选地，通过使用具有S-标签的抗原融合蛋白，描述了用于在疫苗中使用的抗原的纯化。US 7,311,918 B2公开了轮状病毒亚单位疫苗，其包含具有选自麦芽糖结合蛋白、多组氨酸残基、S-标签、谷胱甘肽-S-转移酶等的融合伙伴(其防止轮状病毒融合蛋白发生复合物形成并且有助于纯化)的重组轮状病毒融合蛋白。US 2013/0164296 A1公开了作为亚单位疫苗免疫原的连接有例如麦芽糖结合蛋白、S-标签或谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，其中融合蛋白伙伴可以防止病毒融合蛋白装配成多聚形式。Asai等人公开了在S-标签(源自人核糖核酸酶1的氨基末端15-氨基酸肽)(人S-标签)与S-蛋白(人核糖核酸酶1的残基21至124)之间的特异性相互作用的用途，所述用途为将酶位点特异性地缀合至抗体以便靶向药物递送以用于癌症治疗(Asai等人,2005)。
相反地，US 2013/0039942 A1公开了关于针对微生物和肿瘤的自辅佐性疫苗的组合物和方法，其中将多聚化-细胞内细胞传导盒插入到病毒或载体中。
Wei等人(Wei等人,2008)描述了就其作为疫苗的潜在效力来比较各种形式的重组血凝素(HA)蛋白，单体、三聚和寡聚H5N1 HA蛋白。在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi5)细胞中(作为高分子量寡聚体(1,321kDa)和三聚体(214kDa))和在人胚胎肾细胞系293F中表达了重组单体、三聚和寡聚H5N1 HA蛋白。HA的高分子量寡聚体引发了最强的抗体应答，接着是三聚HA，而单体HA显示出最小的效力。
因此，对于用于产生具有在诱导潜在中和抗体方面的经改善的免疫原性、低的下游成本和高的表达水平的疫苗的方法，仍然存在需要。
本发明的目标
本发明的目标为找到有效且快速的疫苗接种策略，以及用于产生寡聚蛋白质(优选地用作疫苗)的容易且快速的方法。
本发明的特征
本发明的目标通过用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法而得到解决，所述方法包括下列步骤：
a)在真核细胞中共表达两种融合蛋白，其包括
-包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白(在下文中也称为蛋白质-S-标签融合蛋白)，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元，和
-包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(在下文中也称为S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白)，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽，
b)提取所述两种融合蛋白，
其中所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的蛋白质的寡聚化在根据步骤a)在真核细胞中进行共表达后和/或在根据步骤b)进行提取后发生。
有利地，根据本发明的用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法是快速的且便宜的。
当在上文和下文中参考一些文献时，在需要的情况下，将这些文献合并。
在本文中所使用的术语“寡聚(体)”是指由少数单体单元组成的分子复合物，其中少数是指2至20，优选地2至9。根据本发明的寡聚蛋白质为蛋白质-S-标签融合蛋白-S-蛋白-尾片段融合蛋白复合物这一单体单元的同寡聚体。在本文中所使用的术语“寡聚化”是指将单体或单体混合物转变为寡聚体的过程。
根据本发明的真核细胞为包含细胞核和其他包封在膜内的细胞器的细胞。
有利地，真核细胞展现出蛋白质二硫键异构酶。在本文中所使用的术语“蛋白质二硫键异构酶”是指在真核生物中在内质网中的这样的酶，其催化在蛋白质内在半胱氨酸残基之间的二硫键的形成和断裂。
在一个实施方案中，所述真核细胞选自植物细胞或酵母细胞。在本文中所使用的术语“植物细胞”是指植物界的多细胞真核生物。在本文中所使用的术语“酵母细胞”是指真菌界的单细胞真核微生物。
在一个优选的实施方案中，真核细胞为植物细胞。有利地，在植物细胞中的表达提供低的生产成本、生产安全性、易于扩大规模、低的基础设施成本以及寡聚蛋白质的高的稳定性和保存期限。进一步有利地，植物细胞能够提供复杂的、经正确折叠的和经翻译后修饰的蛋白质。
在一个实施方案中，所述植物细胞为植物的叶或种子的细胞。在一个实施方案中，所述植物细胞为烟草、大豆或豌豆植物的细胞。在一个优选的实施方案中，所述植物细胞为本氏烟草的叶细胞。有利地，重组抗体显示出在种子中的高的积累和长期稳定性(Fiedler和Conrad,1995)。
在一个进一步的实施方案中，所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的细胞。
在本文中所使用的术语“共表达”是指两个或更多个基因的同时表达。
在本文中所使用的术语“融合蛋白”是指通过连接原来编码分开的蛋白质的两个或更多个基因而产生的蛋白质。该融合基因的翻译导致具有源自原始蛋白质中的每一个的功能特性的单个蛋白质。
根据本发明的抗原为能够在宿主生物中诱导免疫应答的蛋白质，其中免疫系统产生针对所述抗原的抗体。
在一个实施方案中，所述抗原为病毒粒子的膜蛋白或表面蛋白，优选地血凝素。
在一个进一步的实施方案中，血凝素为流感血凝素、麻疹血凝素、副流感血凝素-神经氨酸酶或腮腺炎血凝素-神经氨酸酶。
在一个优选的实施方案中，血凝素选自人H1、H3流感病毒或禽H5流感病毒，优选地选自禽H5流感病毒(特别地，SEQ ID NO.1、35或36)。
在一个进一步的实施方案中，其中所述蛋白质为血凝素的所述第一融合蛋白进一步包含三聚化结构域。在本文中所使用的术语“三聚化结构域”是指能够进行寡聚化的寡肽。在一个实施方案中，所述三聚化结构域源自碱性亮氨酸拉链结构域(Harbury等人,1993)，优选地，所述三聚化结构域包含SEQ ID NO.27。
在本文中所使用的“抗原结合单元”为以抗体的特异性和亲和力特异性地结合抗原的分子，例如抗体、适配体或人工特异性结合蛋白。在本文中所使用的术语“抗体”是指通过Fab的可变区来识别抗原并且被用于鉴定和中和病原体例如细菌和病毒的蛋白质。抗原结合片段(Fab)这种片段为在抗体上的结合抗原的区域。它由重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。根据本发明的抗体包括纳米抗体(nanobody)和单链可变片段(scFv)抗体，以及其他至少包含抗体的轻链或重链的可变结构域的抗体片段。
在本文中所使用的术语“纳米抗体”是指单结构域抗体或者包含单个单体可变抗体结构域的抗体片段。纳米抗体能够选择性地结合特定抗原。优选地，所述纳米抗体为VHH抗体。在本文中所使用的术语“VHH抗体”是指重链的单个单体可变区(VH)。有利地，纳米抗体展现出相比于抗体而言良好的水溶性、高的耐热性、高的对胃酸的抗性和对蛋白酶的稳定性。
在本文中所使用的术语“单链可变片段(scFv)抗体”是指用短的连接体肽(优选地具有10至25个氨基酸)相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。
在一个进一步的实施方案中，所述抗体为纳米抗体或单链可变片段(scFv)抗体，优选地纳米抗体。
在一个进一步的实施方案中，所述抗体为特异性地结合病原体或毒素的抗体。所述病原体优选地选自但不限于：细菌、寄生虫和病毒。所述毒素为由活生物例如上面所列出的致病微生物或被其感染的细胞或者高等生物例如真菌或蛇所分泌的有毒物质。
在一个实施方案中，所述抗体为特异性地结合胃肠道(优选地口腔或肠)或呼吸系统的病原体的抗体。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为抗志贺菌类毒素抗体、抗猪痢疾短螺菌(Brachyspira hyodysenteriae)抗体、抗艾美虫属(Eimeria)寄生虫抗体或抗产肠毒素性大肠杆菌(Escherichia coli)(ETEC)抗体。
志贺菌类毒素是复杂的全毒素，其具有AB5组成，包含具有酶促活性的亚基(A)和由形成五聚体的每个大约7.7kDa的五个相同的B蛋白组成的结合结构域(Fraser等人,1994；Fraser等人,2004)。US 8,846,058 B2公开了用于产生志贺菌类毒素抗体的方法。
在一个实施方案中，所述抗志贺菌类毒素抗体为抗志贺菌类毒素1型抗体或抗志贺菌类毒素2型抗体。
猪痢疾短螺菌引起猪的痢疾，这是一种对于世界范围内的猪生产的重大损失负有责任的疾病(Harris和Glock,1972)。
艾美虫属是顶复门(apicomplexan)寄生虫的一个属，其包括能够在动物中引起球虫病这种疾病的各种物种，例如牛艾美虫(E.bovis)、邱氏艾美虫(E.zuernii)和奥本艾美虫(E.auburnensisare)。Zimmermann等人公开了抗艾美虫属scFv抗体的产生(Zimmermann等人,2009)。
在一个实施方案中，所述抗艾美虫属寄生虫抗体为抗禽艾美虫(E.tenella)抗体、抗堆形艾美虫(E.acervulina)抗体、抗波氏艾美虫(E.brunetti)抗体或抗乳突艾美虫(E.papillata)抗体。
肠毒性大肠杆菌(ETEC)是大肠杆菌的一种类型并且是腹泻的原因。由ETEC产生的肠毒素包括热不稳定肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)。ETEC菌株在其表面上展现出F4菌毛，头发样附属物。Virdi等人分别公开了抗产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)抗体或抗-F4菌毛抗体的产生(Virdi等人,2013)。
在一个实施方案中，所述抗产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)抗体为抗-FaeGab抗体、抗-FaeGac抗体或抗-FaeGad抗体。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为抗志贺菌类毒素纳米抗体。
在一个实施方案中，所述抗原-S-标签融合蛋白中的S-标签在所述抗原的C-末端或N-末端处，优选地在C-末端处。
在本文中所使用的术语“S-标签”和“S-蛋白”是指源自胰腺核糖核酸酶A(RNA酶A)的寡肽。
在一个实施方案中，所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的S-标签和所述S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的S-蛋白为来自胰腺RNA酶A的野生型。
在一个进一步的实施方案中，所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的S-标签选自人(SEQ ID NO.2)、牛(SEQ ID NO.3)、绵羊(SEQ ID NO.4)、山羊(SEQ ID NO.5)、猪(SEQ IDNO.6)、马(SEQ ID NO.7)或狍(SEQ ID NO.8)胰腺RNA酶A，或者与序列SEQ ID NO.2至8之一具有至少70％的序列同一性，优选地与序列SEQ ID NO.2至8之一具有至少85％的序列同一性，和最优选地与序列SEQ ID NO.2至8之一具有至少95％的序列同一性的寡肽。所述S-标签依照根据本发明的寡聚蛋白质的用途来进行选择，例如来自人胰腺RNA酶A的S-标签(SEQID No.2)用于在人用疫苗中使用。
在一个实施方案中，所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的S-标签包含序列SEQ IDNO.2至8之一。
在一个实施方案中，所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的S-标签包含序列SEQ IDNO.2至8之一，其中所述S-标签的长度为15至20个氨基酸，优选地15个氨基酸。
在一个进一步的实施方案中，所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的S-标签为长度为11至19个氨基酸，优选地13至17个氨基酸，和最优选地15个氨基酸的寡肽，其与序列SEQ IDNO.2至8之一具有至少70％的序列同一性，优选地与序列SEQ ID NO.2至8之一具有至少85％的序列同一性，和最优选地与序列SEQ ID NO.2至8之一具有至少95％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的S-蛋白选自人(SEQ IDNO.9)、牛(SEQ ID NO.10)、绵羊(SEQ ID NO.11)、山羊(SEQ ID NO.12)、猪(SEQ IDNO.13)、马(SEQ ID NO.14)或狍(SEQ ID NO.15)胰腺RNA酶A。所述S-蛋白依照根据本发明的寡聚蛋白质的用途来进行选择，例如来自人胰腺RNA酶A的S-蛋白(SEQ ID NO.9)用于在人用疫苗中使用。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的S-蛋白包含序列SEQID NO.9至15之一。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的S-蛋白包含序列SEQID NO.9至15之一，其中所述S-蛋白的长度为109至150个氨基酸，优选地109至120个氨基酸。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的S-蛋白包含长度为80至140个氨基酸，优选地100至120个氨基酸，和最优选地109至113个氨基酸的寡肽，其与序列SEQ ID NO.9至15之一具有至少65％的序列同一性，优选地与序列SEQ ID NO.9至15之一具有至少80％的序列同一性，和最优选地与序列SEQ ID NO.9至15之一具有至少95％的序列同一性。
在本文中所使用的术语“尾片段(tp)”是指源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽。有利地，所述tp与其他tp分子形成二硫化物，并因此与所述S-蛋白-tp融合蛋白相结合的所述蛋白质-S-标签融合蛋白能够进行寡聚化。
在一个进一步的实施方案中，所述S-蛋白-tp融合蛋白中的tp选自人(SEQ IDNO.16)、小鼠(SEQ ID NO.17)、大猩猩(SEQ ID NO.18)、猴(SEQ ID NO.19)、狗(SEQ IDNO.20)、大熊猫(SEQ ID NO.21)、兔(SEQ ID NO.22)、亚洲家鼩(SEQ ID NO.30)、牛(SEQ IDNO.31)、龟(SEQ ID NO.32)、仓鼠(SEQ ID NO.33)或备选的人变体(SEQ ID NO.34)，以及与序列SEQ ID NO.16至22或30至34之一具有至少75％，优选地85％，更优选地90％，最优选地95％的序列同一性的序列。所述tp依照根据本发明的寡聚蛋白质的用途来进行选择，例如人tp(SEQ ID No.16或SEQ ID No.34)用于在人用疫苗中使用。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-tp融合蛋白中的tp包含序列SEQ ID NO.16至22或30至34之一。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-tp融合蛋白中的tp包含序列SEQ ID NO.16至22或30至34之一，其中所述tp的长度为19至25个氨基酸，优选地19个氨基酸。
在一个实施方案中，所述S-蛋白-tp融合蛋白中的tp包含长度为15至25个氨基酸，优选地17至21个氨基酸，和最优选地19个氨基酸的寡肽，其与序列SEQ ID NO.16至22或SEQID NO.30至34之一具有至少75％的序列同一性，优选地与序列SEQ ID NO.16至22或SEQ IDNO.30至34之一具有至少85％的序列同一性，和最优选地与序列SEQ ID NO.16至22或SEQID NO.30至34之一具有至少95％的序列同一性，其中半胱氨酸(Cys，C)残基的位置是不变的。
在一个进一步的实施方案中，根据步骤a)的共表达包括在表达盒中提供编码所述两种融合蛋白的基因和将所述表达盒转移到穿梭载体中的步骤。
在一个实施方案中，所述穿梭载体选自带有穿梭载体(优选地pCB301载体)的土壤杆菌。
在一个进一步的实施方案中，所述表达盒包含选自USP启动子、豆球蛋白启动子、β-菜豆蛋白启动子、CaMV35S启动子或Patatin启动子的启动子。在一个实施方案中，在种子中的表达用USP启动子、豆球蛋白启动子或β-菜豆蛋白启动子来进行，在叶中的表达用CaMV35S启动子来进行，和在块茎中的表达用Patatin启动子或CaMV35S启动子来进行。
在一个进一步的实施方案中，所述提供编码所述两种融合蛋白的基因的步骤进一步包括用于表达HcPro的穿梭载体。有利地，HcPro是基因沉默的阻抑物，其已被发现显著地增强植物细胞中重组蛋白质的表达水平(Conley等人,2009；Sudarshana等人,2006)。
在一个进一步的实施方案中，根据步骤a)的共表达包括下述步骤：通过用包含编码所述两种融合蛋白的基因的土壤杆菌菌株共渗入植物细胞(土壤杆菌渗入(Agro-infiltration))来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因。
在本文中所使用的术语“土壤杆菌渗入”是指用土壤杆菌菌株对植物细胞进行渗入。
在一个进一步的实施方案中，通过土壤杆菌渗入来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来进行。
在一个进一步的实施方案中，通过土壤杆菌渗入来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因在真空中进行。在本文中所使用的术语“真空”是指低于大气压的气体压力。
在一个进一步的实施方案中，根据步骤a)的共表达在真核细胞的内质网(ER)中进行。
根据本发明，根据步骤a)的共表达之后为所述两种融合蛋白的提取。
在一个进一步的实施方案中，所述两种融合蛋白的提取用具有6至9的pH值的水性缓冲溶液，优选地具有7.4的pH值和0.88％氯化钠的磷酸盐缓冲盐水来进行。
在一个进一步的实施方案中，所述用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法在步骤a)和b)之后包括下列步骤：
c)用盐(优选地氯化钠)和/或热进行沉淀，
d)过滤，和
e)在水溶液中溶剂化。
在一个进一步的实施方案中，所述用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法在步骤a)和/或步骤b)之后进一步包括对所述真核细胞进行分析的步骤。
在一个进一步的实施方案中，在步骤a)和/或步骤b)之后对所述真核细胞进行分析包括基因组DNA的分析、蛋白质分析和/或生理学分析。
其中所述蛋白质为抗原的寡聚蛋白质的生物学活性可以通过间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)来证明。其中所述蛋白质为抗原结合单元的寡聚蛋白质的生物学活性可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来证明。
在一个进一步的实施方案中，所述用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法在步骤a)和b)之后进一步包括添加佐剂。有利地，佐剂通过贮存效应(depot effect)、通过增强通过膜的能力和/或通过增强免疫活性细胞(例如，T细胞、B细胞或巨噬细胞)的活性来增强抗原性。在一个进一步的实施方案中，所述佐剂根据所述寡聚抗原来进行选择。在一个实施方案中，所述佐剂选自水包油乳化佐剂，优选地-D佐剂(MVPTechnologies,NE,US)。
本发明进一步包括寡聚蛋白质，其至少包含：
包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白(其在下文中也称为蛋白质-S-标签融合蛋白)，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元；和
包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(其在下文中也称为S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白)，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽。
有利地，所述tp构成所述蛋白质(即所述抗原或抗体)的寡聚化。
有利地，所述至少包含蛋白质-S-标签融合蛋白和S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白的寡聚蛋白质展现出高的稳定性。在本文中所使用的术语“高的稳定性”是指提取出的寡聚蛋白质的稳定性，优选地在具有6至9的pH值的水性缓冲溶液中，最优选地在具有7.4的pH值和0.88％氯化钠的磷酸盐缓冲盐水中；在直至8℃，优选地0℃至4℃的温度下；持续直至几周，优选地几个月。
在一个进一步的实施方案中，所述寡聚蛋白质包含至少一种佐剂。有利地，佐剂通过贮存效应、通过增强通过膜的能力和/或通过增强免疫活性细胞(例如，T细胞、B细胞或巨噬细胞)的活性来增强抗原性。在一个进一步的实施方案中，所述佐剂根据所述寡聚抗原来进行选择。在一个实施方案中，所述佐剂选自水包油乳化佐剂，优选地-D佐剂(MVP Technologies,NE,US)。
在一个进一步的实施方案中，所述寡聚蛋白质是通过根据本发明的方法来获得的。
本发明的另一个目标是包含编码根据本发明的寡聚蛋白质的核酸序列的核酸，或者包含这样的核酸的载体。
在本文中所使用的术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。以DNA形式的核酸是优选的。
在本文中所使用的术语“载体”包括质粒、病毒或其他核酸承载体，其通过基因重组(重组地)，例如通过插入或掺入所述核酸序列，而包含根据本发明的核酸序列。原核载体以及真核载体适用于本发明。在本发明中优选地使用原核载体来转染土壤杆菌菌株。
在一个实施方案中，所述核酸至少包含核酸序列SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29。
在一个实施方案中，所述核酸为编码根据本发明的寡聚蛋白质的核酸序列。
本发明进一步包括包含编码根据本发明的寡聚蛋白质的核酸序列的核酸或者包含这样的核酸的载体在产生根据本发明的寡聚蛋白质中的用途。
本发明进一步包括包含根据本发明的核酸或载体的细胞或非人宿主生物。
优选地，所述细胞或非人宿主生物用于产生根据本发明的寡聚蛋白质。
在本发明意义上的细胞或非人宿主生物为天然出现的细胞或者(任选地经转化的或经遗传修饰的)细胞系或生物，其人工地包含至少一种根据本发明的载体或根据本发明的核酸，如上面所描述的。由此，本发明包括瞬时转染子(例如，通过mRNA注射)或包含至少一种根据本发明的载体的细胞。优选地，通过杀死人胚胎而取得的胚胎干细胞被特别地从在本发明意义上的术语“细胞”中排除。
所述细胞优选地选自真核生物的细胞。优选的真核细胞选自植物细胞。所述非人宿主生物优选地为植物。
本发明进一步包括根据本发明的寡聚蛋白质在疫苗中的用途。在本文中所使用的术语“疫苗”是指提供对于特定疾病的免疫性的蛋白质制备物。疫苗可以是预防性的或治疗性的。
在一个进一步的实施方案中，在主动和被动疫苗中使用根据本发明的寡聚蛋白质。
在一个进一步的实施方案中，在流感疫苗中使用根据本发明的寡聚蛋白质。
在一个进一步的实施方案中，在可食用疫苗，优选地针对胃肠道(最优选地口腔或肠)或呼吸系统的病原体的可食用被动疫苗中使用根据本发明的寡聚蛋白质。在本文中所使用的“可食用疫苗”是指口服施用的疫苗，例如包含疫苗的饲喂用转基因种子。
有利地，在用于产生可食用被动疫苗的种子中产生用于被动免疫接种的抗体伴随有最小的下游加工成本。
有利地，根据本发明的寡聚蛋白质是高度稳定的，其中在肠道中的稳定性对于可食用疫苗的成功开发来说是至关重要的。
在一个进一步的实施方案中，将根据本发明的寡聚蛋白质或者通过根据本发明的方法获得的寡聚蛋白质用于制备疫苗。
本发明进一步包括包含根据本发明的寡聚蛋白质的疫苗。
有利地，所述蛋白质(即所述抗原或抗体)的寡聚化增强免疫应答和疫苗效力。
在一个进一步的实施方案中，所述疫苗进一步包含至少一种佐剂。在一个进一步的实施方案中，所述佐剂选自水包油乳化佐剂，优选地-D佐剂(MVPTechnologies,NE,US)。
有利地，水包油乳化佐剂形成根据本发明的寡聚蛋白质的移动式储库，其可以靶向免疫效应细胞并且增强免疫应答和疫苗效力。
在一个进一步的实施方案中，可以组合新近所描述的实施方案。
附图和实施例
现在，将会通过下面的非限制性附图和实施例来进一步解释本发明。
图1显示了通过H5-S-标签和多聚S-蛋白-tp的共表达进行的寡聚体形成的模型。所述S-蛋白-tp的寡聚状态依赖于野生型S-蛋白的寡聚状态，后者是占优势的单体以及较少的二聚体、三聚体等的混合物。野生型S-蛋白与tp的融合引起通过二硫键的额外的连接，从而产生多种S-蛋白。在此作为例子进行描绘的S-蛋白-tp是通过二硫键而形成的同二聚体。
图2显示了在植物提取物中的血凝素衍生物和S-蛋白衍生物的抗-cmyc-标签Western印迹的结果，相比于在通过IMAC进行纯化的寡聚体中的没有His-标签的S-蛋白-tp而言。
图3显示了用于植物原位(in planta)产生H5-S-标签、H5Dk-S-标签变体和eGFP-S-标签以及S-蛋白融合蛋白的表达盒。CaMV35S Pro：花椰菜花叶病毒35S遍在启动子；CaMV35S Term：花椰菜花叶病毒35S终止子。
图4显示了植物提取物和灭活病毒rg A/天鹅/Germany/R65/2006(H5N1)的血细胞凝集滴度。WT：野生型本氏烟草；PBS：磷酸盐缓冲盐水。
图5显示了H5寡聚体和H5-S-标签的大小排阻色谱法级分的血细胞凝集滴度，以及H5寡聚体和H5-S-标签级分的Western印迹分析。将经由通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)的蛋白质纯化而纯化的H5寡聚体或H5-S-标签(各63μg，在0.5ml中)在SuproseTM6increase10/300GI上分开，并且通过血细胞凝集测定法来分析级分。
图6显示了相比于野生型提取物而言H5寡聚体、H5-S-标签和S-蛋白–tp提取物的免疫学表征：A)通过间接ELISA来测量在两次免疫接种后针对经纯化的血凝素的抗体应答，其通过将不同提取物注射入小鼠中而激起。P＝P-值。B)测量针对所提及的提取物而激起的血清的血细胞凝集抑制滴度。
图7显示了相比于野生型提取物而言H5寡聚体、H5-S-标签和S-蛋白–tp提取物的免疫学表征：A)通过间接ELISA来测量在三次免疫接种后针对经纯化的血凝素的抗体应答，其通过将不同提取物注射入小鼠中而激起。P＝P-值。B)测量针对所提及的提取物而激起的血清的血细胞凝集抑制滴度。
图8显示了来自10种分别针对包含H5的提取物(包含H5寡聚体的提取物、包含H5-S-标签的提取物、包含S-蛋白-tp的提取物或WT植物提取物)而激起的血清的混合物的抗体的血凝素(H5)特异性结合，其通过Western印迹来证明。
图9显示了免疫原性提取物的稳定性，其通过A)Western印迹和B)血细胞凝集滴度来揭示。
图10显示了植物提取物和灭活病毒rg A/天鹅/Germany/R65/2006(H5N1)的血细胞凝集滴度。WT：野生型本氏烟草；PBS：磷酸盐缓冲盐水。
植物表达载体的构建
将相应于A/鸭/Viet Nam/TG24-01/2005(H5N1)毒株的血凝素的aa 2-564和S-蛋白的aa 21-124(UniProtKB登录号：分别为Q14RX0和P61823)的DNA序列商业合成(GENECUSTEUROPE,Luxembourg)，并且提供在被命名为pUC57-H5TG和pUC57-S-蛋白的pUC57载体中。
为了表达野生型S-蛋白，将编码S-蛋白的DNA序列在BamHI和NotI处克隆到pRTRA-35S-H5pII中，从而形成被命名为pRTRA-S-蛋白的重组载体(Phan等人,2013)。为了使S-蛋白多聚化，将编码S-蛋白的DNA序列引入到pRTRA载体(其包含三聚化的结构域(GCN4-pII)(参照1)或二聚化的结构域(GCN4野生型)(参照2)(Harbury等人,1993)，和对于通过其半胱氨酸残基的二硫键形成作出响应的小鼠IgM抗体的尾片段)中，从而产生pRTRA-His-S-蛋白-GCN4pII(参照1)、pRTRA-His-S-蛋白-GCN4wt(参照2)和pRTRA-S-蛋白-tp，以分别用于表达S-蛋白-pII(参照1)(SEQ ID NO.23)、S-蛋白-GCN4(参照2)(SEQ ID NO.24)、S-蛋白-tp(SEQ ID NO.25)(图2和表1)。设计侧翼为NotI和NheI位点的S-标签编码序列，并且通过所提及的限制位点将其插入到pRTRA-H5TG-GCNpII中，从而产生pRTRA-H5TG-GCNpII-S-标签载体，其用于表达三聚化的H5-S-标签(SEQ ID NO.26)。
图2显示了在植物提取物中的血凝素衍生物和S-蛋白衍生物的抗-cmyc-标签Western印迹的结果，相比于在通过IMAC进行纯化的寡聚体中的没有His-标签的S-蛋白-tp而言。标准：抗-TNFα-纳米抗体ELP，S-蛋白-H5-S-标签共表达，H5寡聚体：S-蛋白-tp-H5-S-标签共表达。可以通过Western印迹来显示以所预期的大小的不同组分的表达。潜在中和抗体应答在用H5寡聚体提取物进行免疫接种后相比于用H5-S-标签三聚体提取物进行免疫接种的小鼠的血清而言显著地更好(P<0.001)。
将在所构建出的pRTRA载体(pRTRA-S-蛋白、pRTRA-His-S-蛋白-GCN4wt、pRTRA-S-蛋白-tp、pRTRA-H5TG-GCNpII-S-标签)中的五种表达盒(图3)在Hind III限制位点处克隆到穿梭载体pCB310中。将穿梭载体pCB310引入到土壤杆菌AGV2206菌株中。
土壤杆菌渗入
用于表达重组蛋白质的土壤杆菌渗入由Phan和Conrad(Phan和Conrad,2016)作了详细描述，并且简短描述在本文中。在28℃和140rpm下在具有50μg/ml卡那霉素、50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml利福平的溶源肉汤(lysogeny broth；LB)培养基中分开地过夜预培养带有用于表达重组蛋白质的穿梭载体(参见图2)和用于表达HcPro(它是基因沉默的阻抑物，其已被发现显著地增强植物细胞中重组蛋白质的表达水平(Conley等人,2009；Sudarshana等人,2006))的植物载体的土壤杆菌。将预培养物添加至40ml的新的LB培养基。在进一步的24小时的培养后，通过在4℃下以4000g离心10分钟来收获细菌，并且将其重悬浮在渗入缓冲液(10mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，10mM MgSO4，pH 5.6)中。将带有用于表达重组蛋白质的穿梭载体和用于表达HcPro的植物载体的土壤杆菌合并，并且在渗入缓冲液中稀释至1.0的最终光密度(OD)，其是在600nm的波长下测量的。通过将每株植物完全浸没在立在干燥器里面的包含土壤杆菌的杯子中来对本氏烟草植物(六至八周龄)进行渗入。施加真空2分钟，然后快速释放。然后，将植物放置在处于21℃、每天16小时光照的温室中。在渗入后五天，收获叶样品并贮存于-80℃。
通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)来进行蛋白质纯化
在真空土壤杆菌渗入后五天，收获叶样品，在液氮中冷冻，并且使用商业搅切器进行匀浆。将总蛋白质提取在50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中。将提取物通过离心(18,000g，30分钟，4℃)进行澄清，然后通过纸滤器进行过滤。将经澄清的提取物与之前用水洗涤过两次的镍-氨三乙酸(Ni-NTA)树脂琼脂糖相混合。在4℃下混合30分钟后，将混合物施加至色谱柱。在此之后，将柱彻底进行洗涤(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，30mM咪唑，pH 8.0)。然后，将重组蛋白质通过洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，125mM咪唑，pH 8.0)从柱上洗脱下，装填入透析袋中，用聚乙二醇(PEG)6000进行浓缩，并且逆PBS进行透析。
通过使用雪花莲(Galanthus nivalis)(GLN)-连接的琼脂糖来纯化H5寡聚体
将经冷冻的叶样品(40g)在液氮中进行匀浆。将总蛋白质提取在PBS缓冲液(137mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.5)中。将提取物离心两次(23,000rpm，30分钟，4℃)，并且与10ml的先前用水洗涤过两次和用PBS缓冲液洗涤过一次的GLN树脂相混合。在4℃下混合30分钟后，将混合物施加至色谱柱。在此之后，将柱用30ml PBS缓冲液洗涤两次。然后，用10ml洗脱缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，200mMα-甲基甘露糖苷，pH 7.4)从柱上洗脱下重组蛋白质。将蛋白质溶液在4℃下逆PBS透析过夜，并且通过使用聚乙二醇(PEG)6000来进行浓缩。
大小排阻色谱法(SEC)
将经纯化的H5寡聚体和H5-S-标签的在0.5ml中的34μg蛋白质分别加载到SuperoseTM 6Increase 10/300GL柱(GE Healthcare)上。高分子量试剂盒包含分子量在44kDa至2000kDa的范围内的的标准蛋白质，其被加载到柱上以估计目的蛋白质的分子量。收集500μl/级分以用于血细胞凝集测试和Western印迹分析。
对于ELISA测试，以在0.5ml中的1.25mg蛋白质的起始浓度，通过柱子进一步纯化作为抗原的经亲和纯化的三聚血凝素。
SDS-PAGE和Western印迹法
通过还原SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺)来分开提取出的植物蛋白质，10ng的经IMAC和SEC纯化的血凝素或抗-TNFα-纳米抗体-ELP标准蛋白质(Conrad等人,2011)，然后将其电转移至硝酸纤维素膜。Western印迹法程序按照Phan和Conrad(Phan和Conrad,2016)来进行。遵循由Gahrtz和Conrad(Gahrtz和Conrad,2009)所描述的实验方案，使用单克隆抗-c-myc抗体来进行Western印迹法程序。使用绵羊抗小鼠IgG，连接有辣根过氧化物酶的全抗体，作为二抗(二抗，GE healthcare UK limited Little Chalfont BuckinghamShire HP79NA UK)，随后为基于增强化学发光的检测(ECL)。为了检测H5-特异性小鼠抗体，将十份来自每个组的小鼠血清相混合并且将膜与各自混合物一起进行温育。
小鼠免疫接种
通过Western印迹法来半定量在植物提取物中的血凝素含量(H5寡聚体和H5-S-标签)。选择包含100ng的H5寡聚体或H5-S-标签的植物提取物用于进行小鼠免疫接种。在对照组中，使用包含S-蛋白-tp的植物提取物和未转化的植物提取物，其具有与包含H5寡聚体和H5-S-标签的植物提取物相同量的总可溶性蛋白质。将所有植物提取物以20％最终浓度与-D佐剂(MVP Technologies,US)一起进行配制。将七至九周龄的雄性C57/Black6J小鼠(Charles River Laboratories,Research Models and Services,GermanyGmbH；12只/组)在第0、14和28天用经-D佐剂进行配制的植物提取物以皮下方式进行免疫接种。在第2次和第3次免疫接种后一周，经由眶后窦给小鼠放血。独个地收集小鼠血清用于血细胞凝集抑制(HI)和ELISA测试。
血细胞凝集测试和血细胞凝集抑制测定法
血细胞凝集测试基于标准实验方案(世界动物卫生组织(World Organizationfor Animal Health)(OIE)(2004)，并且详细描述在Phan和Conrad(Phan和Conrad,2016)中)。将诱导完全血细胞凝集的稀释度定义为一个血细胞凝集单位(HAU)。血细胞凝集抑制(HI)测定法类似地基于标准程序(世界动物卫生组织(OIE)(2004))来进行。将25μl等份试样的单种小鼠血清放置在包含25μl PBS的微量滴定板的第一个孔中，并且跨越过一排8个孔进行两倍系列稀释。将包含4HAU的灭活rg A/天鹅/Germany/R65/2006(H5N1)病毒的25μl体积添加至反应体系，并且在25℃下保持30分钟。然后，添加25μl的1％鸡红细胞，并且将平板在25℃下温育30分钟。将HI滴度呈现为可以完全抑制血细胞凝集的最高血清稀释度的倒数。
图4和表1显示了植物提取物和灭活病毒rg A/天鹅/Germany/R65/2006(H5N1)的血细胞凝集滴度。由共表达的蛋白质所引起的血细胞凝集滴度是非常低的，而这两种蛋白质都在ER中积累，这表明了野生型S-蛋白的不充分的多聚化。
图5显示了H5寡聚体和H5-S-标签的大小排阻色谱法级分的血细胞凝集滴度，以及H5寡聚体和H5-S-标签级分的Western印迹分析。将H5-S-标签和H5寡聚体通过IMAC进行纯化。将经纯化的产物通过Western印迹进行分析。H5-S-标签和S-蛋白-tp(没有His-标签)两者均被检测到，这表明S-蛋白-tp与S-标签特异性地相互作用。将经纯化的H5寡聚体和H5-S-标签通过SEC进一步分开，并且估计每个级分的血细胞凝集滴度。在H5寡聚体的级分A3至A8中观察到高的血细胞凝集滴度。最高分子量(级分A3，大约2,000kDa)相应于最高血细胞凝集滴度。通过SEC的H5-S-标签的分析没有显示出高分子量和高血细胞凝集滴度。将H5-S-标签和H5寡聚体的级分通过SDS-PAGE来分开，并且通过Western印迹平行地进行分析。在共表达H5-S-标签和S-蛋白-tp后，仅在H5寡聚体提取物中实现了高分子量血凝素(700kDa至2,000kDa，级分A3至A7)。
间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)
将微量滴定板(ImmunoPlate Maxisorp,Nalgen Nunc International,Roskilde,Denmark)用100μl的在噬菌体PBS(100mM NaCl，32mM Na2HPO4，17mM Na2HPO4，pH 7.2)中的0.5μg/mL的经固定化金属亲和色谱法(IMAC)和大小排阻色谱法(SEC)纯化的血凝素(H5)三聚体进行包被，并且在室温下温育过夜。在用3％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、0.05％(v/v)在PBS中的Tween20(PBST)封闭2小时后，施加100μl的特别稀释物(6·10-4)并在室温下温育1小时。将平板用PBST洗涤5次，与在1％(w/v)BSA中稀释(2000倍)的兔抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合物一起进行温育，并且再次洗涤。添加酶促底物，在0.1M二乙醇胺-HCl(pH 9.8)中的磷酸对硝基苯酯(pNPP)，并且在37℃下温育1小时后在405nm下测量吸收信号。
图6A和图7A显示了通过间接ELISA来测量在分别两次或三次免疫接种后针对经纯化的血凝素的抗体应答，其通过将不同提取物注射入小鼠中而激起。针对经纯化的H5的所测试的特异性免疫应答也通过用H5寡聚体提取物和H5-S-标签提取物进行免疫接种而激起。在对照中，在用S-蛋白-tp和用野生型提取物进行免疫接种后几乎没有检测到针对H5的免疫应答。在用H5寡聚体粗提取物进行免疫接种后，针对经纯化的H5的所测试的体液免疫应答显著地更好(P＝0.044或0.008，分别地)。血细胞凝集抑制(HI)测定法显示，通过用H5寡聚体提取物和用H5-S-标签提取物进行免疫接种可以在小鼠中产生抑制血细胞凝集的潜在地中和抗体(图6B和图7B)。
图8显示了来自10种分别针对包含H5的提取物(包含H5寡聚体的提取物、包含H5-S-标签的提取物、包含S-蛋白-tp的提取物或WT植物提取物)而激起的血清的混合物的抗体的血凝素(H5)特异性结合，其通过Western印迹来证明。针对H5寡聚体而激起的小鼠血清以及针对与经纯化的血凝素相结合的H5-S-标签而激起的血清，而非来自用H5寡聚体提取物进行免疫接种的小鼠的血清，显示出了更强的反应。
稳定性测试
将免疫原性提取物贮存于4℃一周，没有抗原含量的损失，如通过Western印迹(图9A)和血细胞凝集滴度(图9B)所揭示的。
统计学分析
血细胞凝集抑制测定法数据和ELISA结果的统计学分析通过使用来自Sigma Plot软件的Mann-Whitney秩和检验来进行。将小于0.05的P值定义为显著差异。
应用于来自新的DkHT2-2014毒株的新的血凝素
为了验证我们的用于通过S-标签和S-蛋白相互作用来产生寡聚体的方法，将来自目前在越南传播的新的DkHT2-2014毒株的血凝素(命名为H5Dk，SEQ ID No.36)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP，SEQ ID No.37)与S-标签相融合。将蛋白质产物分别命名为H5Dk-S-标签、eGFP-S-标签。用于植物原位产生的表达盒呈现在图3中。通过共表达H5Dk-S-标签和S-蛋白-TP而形成的寡聚体被命名为H5Dk寡聚体，并且显示出相比于H5Dk而言非常高的血细胞凝集滴度(图10)。进一步的分析(大小排阻色谱法、小鼠免疫接种……)目前正在进行。
新的血凝素(H5Dk，SEQ ID No.36)与A/鸭/Viet Nam/TG24-01/2005(H5N1)毒株(SEQ ID No.35)的推断的血凝素氨基酸序列相似性为93％。
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序列表
<110> Leibniz-Institut fuer Pflanzengenetik und
Kulturpflanzenforschung (IPK)
<120> 通过S-标签-S-蛋白融合物的来自植物的寡聚体疫苗
<130> 10417P0035EPWO
<150> EP16206231.9
<151> 2016-12-22
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 506
<212> PRT
<213> 禽流感病毒
<400> 1
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
1 5 10 15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
35 40 45
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65 70 75 80
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
85 90 95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
100 105 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Ser His Glu Ala Ser
115 120 125
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
130 135 140
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
145 150 155 160
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
165 170 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
180 185 190
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
195 200 205
Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
210 215 220
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
225 230 235 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
245 250 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
260 265 270
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
275 280 285
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
290 295 300
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
305 310 315 320
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
325 330 335
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
340 345 350
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
355 360 365
Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
370 375 380
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
385 390 395 400
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
405 410 415
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
420 425 430
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
435 440 445
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
450 455 460
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
465 470 475 480
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Lys Arg
485 490 495
Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Gly
500 505
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Lys Glu Ser Arg Ala Lys Lys Phe Gln Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 家牛（Bos taurus）
<400> 3
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 家绵羊（Ovis aries）
<400> 4
Lys Glu Ser Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 家山羊（Capra hircus）
<400> 5
Lys Glu Ser Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 6
Lys Glu Ser Pro Ala Lys Lys Phe Gln Arg Gln His Met Asp Pro
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 家马（Equus caballus）
<400> 7
Lys Glu Ser Pro Ala Met Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 狍（Capreolus capreolus）
<400> 8
Lys Glu Ser Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Pro
1 5 10 15
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Asp Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Cys Asn Gln Met Met Arg
1 5 10 15
Arg Arg Asn Met Thr Gln Gly Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Pro Leu Val Asp Val Gln Asn Val Cys Phe Gln Glu Lys Val
35 40 45
Thr Cys Lys Asn Gly Gln Gly Asn Cys Tyr Lys Ser Asn Ser Ser Met
50 55 60
His Ile Thr Asp Cys Arg Leu Thr Asn Gly Ser Arg Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Arg Thr Ser Pro Lys Glu Arg His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Ser Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val Glu Asp Ser
100 105 110
Thr
<210> 10
<211> 109
<212> PRT
<213> 家牛
<400> 10
Ser Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys
1 5 10 15
Ser Arg Asn Leu Thr Lys Asp Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val
35 40 45
Ala Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met
50 55 60
Ser Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Asn Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
100 105
<210> 11
<211> 109
<212> PRT
<213> 家绵羊
<400> 11
Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys
1 5 10 15
Ser Arg Asn Leu Thr Gln Asp Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val
35 40 45
Ala Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met
50 55 60
Ser Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Glu Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
100 105
<210> 12
<211> 109
<212> PRT
<213> 家山羊
<400> 12
Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys
1 5 10 15
Ser Arg Asn Leu Thr Gln Asp Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val
35 40 45
Ala Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met
50 55 60
Ser Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Glu Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
100 105
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 13
Asp Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Leu Met Met Ser
1 5 10 15
Arg Arg Asn Met Thr Gln Gly Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Ile Asn Val
35 40 45
Asn Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Asn Ser Thr Met
50 55 60
His Ile Thr Asp Cys Arg Gln Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Ser Gln Glu Gln Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Asn Pro Pro Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
100 105
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 家马
<400> 14
Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asn Pro Thr Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys
1 5 10 15
Arg Arg Asn Met Thr Gln Gly Trp Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Pro Leu Ala Asp Val Gln Ala Ile Cys Leu Gln Lys Asn Ile
35 40 45
Thr Cys Lys Asn Gly Gln Ser Asn Cys Tyr Gln Ser Ser Ser Ser Met
50 55 60
His Ile Thr Asp Cys Arg Leu Thr Ser Gly Ser Lys Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Gln Thr Ser Gln Lys Glu Arg His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val Glu Val Ser
100 105 110
Thr
<210> 15
<211> 109
<212> PRT
<213> 狍
<400> 15
Ser Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Gln
1 5 10 15
Ser Arg Asn Leu Thr Gln Asp Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val
20 25 30
His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Phe Gln Lys Asn Val
35 40 45
Ile Cys Lys Asn Gly Gln Ser Asn Cys Tyr Gln Ser Asn Ser Ala Met
50 55 60
His Ile Thr Asp Cys Arg Glu Ser Gly Asn Ser Lys Tyr Pro Asn Cys
65 70 75 80
Val Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Glu Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu
85 90 95
Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
100 105
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 17
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 大猩猩（Gorilla gorilla）
<400> 18
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 普通猕猴（Macaca mulatta）
<400> 19
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 家犬（Canis familiaris）
<400> 20
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glx Cys Tyr
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）
<400> 21
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Ala Ser
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 穴兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 22
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Ala Ser
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 23
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S-蛋白-pII融合蛋白
<400> 23
Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Cys
1 5 10 15
Asn Gln Met Met Lys Ser Arg Asn Leu Thr Lys Asp Arg Cys Lys Pro
20 25 30
Val Asn Thr Phe Val His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys
35 40 45
Ser Gln Lys Asn Val Ala Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln
50 55 60
Ser Tyr Ser Thr Met Ser Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Pro Asn Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Asn Lys His Ile
85 90 95
Ile Val Ala Cys Glu Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala
100 105 110
Ser Val Gly Pro Lys Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu
115 120 125
Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys
130 135 140
Lys Leu Ile Gly Glu Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
145 150 155 160
Glu Asp Leu Asn Gly Ser Lys Asp Glu Leu
165 170
<210> 24
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S-蛋白-GCN4融合蛋白
<400> 24
Ser His His His His His His Gly Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn
1 5 10 15
Gln Met Met Lys Ser Arg Asn Leu Thr Lys Asp Arg Cys Lys Pro Val
20 25 30
Asn Thr Phe Val His Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser
35 40 45
Gln Lys Asn Val Ala Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser
50 55 60
Tyr Ser Thr Met Ser Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Pro Asn Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Asn Lys His Ile Ile
85 90 95
Val Ala Cys Glu Gly Asn Pro Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser
100 105 110
Val Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg
115 120 125
Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr
130 135 140
His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Ala Ala Ala
145 150 155 160
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ser Lys Asp Glu
165 170 175
Leu
<210> 25
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S-蛋白-尾片段融合蛋白
<400> 25
Gly Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys Ser Arg Asn
1 5 10 15
Leu Thr Lys Asp Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val His Glu Ser
20 25 30
Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val Ala Cys Lys
35 40 45
Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met Ser Ile Thr
50 55 60
Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Thr Gln Ala Asn Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu Gly Asn Pro
85 90 95
Tyr Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val Ala Ser Lys Pro Thr Leu
100 105 110
Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr Ala
115 120 125
Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ser Lys
130 135 140
Asp Glu Leu
145
<210> 26
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H5-S-标签融合蛋白
<400> 26
Gly Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu
1 5 10 15
Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln
20 25 30
Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly
35 40 45
Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu
50 55 60
Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr
65 70 75 80
Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp
85 90 95
Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His
100 105 110
Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Ser His Glu
115 120 125
Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser
130 135 140
Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro
145 150 155 160
Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val
165 170 175
Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu
180 185 190
Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn
195 200 205
Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln
210 215 220
Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala
225 230 235 240
Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr
245 250 255
Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu
260 265 270
Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn
275 280 285
Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys
290 295 300
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg
305 310 315 320
Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
325 330 335
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
340 345 350
His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser
355 360 365
Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile
370 375 380
Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn
385 390 395 400
Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe
405 410 415
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn
420 425 430
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp
435 440 445
Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly
450 455 460
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val
465 470 475 480
Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
485 490 495
Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Gly Pro Lys Arg Met
500 505 510
Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His
515 520 525
Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly
530 535 540
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg
545 550 555 560
Gln His Met Asp Ser Ala Ala Ala His His His His His His Leu Ala
565 570 575
Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ser Lys Asp
580 585 590
Glu Leu
<210> 27
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚化结构域
<400> 27
Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile
1 5 10 15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu
20 25 30
Arg
<210> 28
<211> 8074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCB301_H5-S-标签
<400> 28
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tgtggacaag cctggggata agtgccctgc ggtattgaca cttgaggggc gcgactactg 360
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gcgctttact gagatctggg gaaccctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg 3180
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gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 4320
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<211> 6733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCB_S-蛋白-尾片段
<400> 29
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atgcaccgcg atatcttgct gcgttcggat attttcgtgg agttcccgcc acagacccgg 4800
atgatccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 4860
ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 4920
atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 4980
atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 5040
gtgtcatcta tgttactaga tcgggccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 5100
gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 5160
cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 5220
ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 5280
ccatgattac gccaagcttg agctcctgca ggtcactgga ttttggtttt aggaattaga 5340
aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt cttatatgct 5400
caacacatga gcgaaaccct ataagaaccc taattccctt atctgggaac tactcacaca 5460
ttattctgga gaaaatagag agagatagat ttgtagagag agactggtga tttttgcgga 5520
ctctatcgac ggatcgggct agagttcgtc tttggaacca ttcagatcct cttctgagat 5580
gagtttttgt tctgcggccg cgtaacaagt cccgccggta tcggacataa tgagggaaac 5640
attatacaat gtcggtttgc tagcaacaga ggcgtcaaaa tgaaccggca catagggatt 5700
tccttcgcag gcgacaatta tgtgtttatt agcttgagta gttttataag cgcaatttgg 5760
atatttgcta gacccagttt ctcggcaatc ggtgatagac atggtggagt agctttggta 5820
gcaattcgtt tgaccattct tacaagccac attcttttgt gaacaaacag cctgaacatc 5880
tgccaatgac tcgtggacaa atgtgtttac aggcttacac ctgtcctttg taaggttacg 5940
tgacttcatc atctggttac agtagttact agaactggat cctgctaaac atgtgcttgt 6000
aaagagaagc aaggaaagtg aaagcaaaga tagaaaaggt ttggaagcca tggttcccgg 6060
ccgggtcaga tcctctagag tcgatcgagg tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata 6120
tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 6180
tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgt 6240
tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggt agaggcattc ttgaacgata 6300
gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg tagaagccat cttccttttc tactgtcctt 6360
tcgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt 6420
tgttgaaaag tctcaatagc cctctggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag 6480
tagacgagag tgtcgtgctc caccatgttg acctgcaggt cgacaagctt atcgataccg 6540
tcgacctcga gggggggccc ggtaccaaaa ccaccccagt acattaaaaa cgtccgcaat 6600
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc 6660
agccaacagc tccccgaccg gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca 6720
tcagtccact aga 6733
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 亚洲家鼩（Suncus murinus）
<400> 30
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Ala Ser
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 家牛
<400> 31
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Ala Ser
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 红耳龟（Trachemys scripta elegans）
<400> 32
Lys Pro Thr Ala Val Asn Val Ser Val Ile Leu Ser Asp Thr Asp Ile
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 金仓鼠（Mesocricetus auratus）
<400> 33
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Ala Gly Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 35
<211> 567
<212> PRT
<213> 禽流感病毒
<400> 35
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Ser His Glu Ala Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu
370 375 380
Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile
385 390 395 400
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn
405 410 415
Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly
420 425 430
Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu
435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
450 455 460
Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
485 490 495
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Lys
500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile
515 520 525
Tyr Gln Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu
530 535 540
Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 36
<211> 567
<212> PRT
<213> 禽流感病毒
<400> 36
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Thr Ile Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Leu Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Pro Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Lys Gly Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Ile Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Arg Ser Glu Val Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu
370 375 380
Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile
385 390 395 400
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn
405 410 415
Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly
420 425 430
Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu
435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
450 455 460
Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Lys Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser
485 490 495
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg
500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile
515 520 525
Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu
530 535 540
Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 37
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强型绿色荧光蛋白 (eGFP)
<400> 37
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235

Claims (13)

1.用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，其包括下列步骤：
a)在真核细胞中共表达两种融合蛋白，其包括
-包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白(在下文中也称为蛋白质
-S-标签融合蛋白)，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元，和
-包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(在下文中也称为S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白)，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽，
b)提取所述两种融合蛋白，
其中所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的蛋白质的寡聚化在根据步骤a)在真核细胞中进行共表达后和/或在根据步骤b)进行提取后发生。
2.权利要求1的方法，其中所述真核细胞为选自烟草、大豆或豌豆属(Pisum)植物的植物细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中所述植物细胞为植物的叶或种子的细胞。
4.权利要求2至3之一的方法，其中根据步骤a)的共表达包括下述步骤：通过用土壤杆菌菌株共渗入植物细胞来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因。
5.寡聚蛋白质，其至少包含：
包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白，其在下文中也称为蛋白质-S-标签融合蛋白，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元；和
包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白，其在下文中也称为S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽。
6.权利要求1至4之一的方法或者权利要求5的寡聚蛋白质，其中所述抗原为流感血凝素。
7.权利要求1至4之一的方法或者权利要求5的寡聚蛋白质，其中所述抗原结合单元为针对胃肠道或呼吸系统的病原体的抗体。
8.权利要求1至4或6至7之一的方法或者权利要求5至7之一的寡聚蛋白质，其中所述第一融合蛋白的S-标签在所述抗原或抗原结合单元的C-末端处。
9.权利要求1至4或6至8之一的方法或者权利要求5至8之一的寡聚蛋白质，其中所述tp为具有15至25个氨基酸残基的寡肽，其优选地包含序列SEQ ID NO.16至22或SEQ ID NO.30至34之一，或者与序列SEQ ID NO.16至22或SEQ ID NO.30至34之一具有至少75％，优选地85％序列同一性的序列，其中半胱氨酸(Cys，C)残基的位置是不变的。
10.包含编码权利要求5至9之一的寡聚蛋白质的核酸序列的核酸，或者包含这样的核酸的载体。
11.包含权利要求10的核酸或载体的细胞或非人宿主生物。
12.权利要求5至9之一的寡聚蛋白质或者通过权利要求1至4或6至9之一的方法获得的寡聚蛋白质用于制备疫苗的用途。
13.包含权利要求5至9之一的寡聚蛋白质的疫苗。
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