CN117147881B - 一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用，属于生物检测技术领域。狍鹿角特征肽段氨基酸序列为VAEVGGEALGR，将待检测样品溶液注入液相色谱‑高分辨质谱联用仪，获得待检测样品的一级质谱和二级质谱，以鉴别狍鹿角特征肽段为对照，判断待检测样品溶液中是否含有狍鹿角成分。本发明提供了狍鹿角特征肽段，具有很高的专属性及信号响应，可用于狍鹿角药材的定性检测，无需特征肽对照品就可实现狍鹿角准确定性检测，操作简单，有利于狍鹿角的质量控制，对保证狍鹿角及其炮制品的质量及与正品鹿角的区别提供科学方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用。
背景技术
狍鹿角为鹿科动物狍(Capreolus capreolusLinnaeus)已骨化老角，其采收、炮制方法与鹿角相同。狍鹿角味辛、涩、咸，性凉，有燥脓血及黄水，清热解毒之功效。中医认为，狍角性温味咸，可入肝肾二经，具有补肾助阳、活血散瘀的功效，主要用于治疗头目眩晕、精神萎靡、形寒畏冷、阳痿早泄、宫冷不孕、小便频数、腰腿酸软等肾阳虚症，以及疮疡肿毒、乳痈、瘀血作痛和腰脊筋骨疼痛等病症。
狍鹿角现行的质量标准收载于2010年版《青海省藏药炮制规范》，标准中仅收载了炮制品的性状项描述内容，无其它有效检验项目。因本品作为药用需经过锯段、磨粉或熬胶等，性状发生了根本性改变，已经无法用肉眼根据外观性状对其进行真伪判断。相关文献有性状、显微或紫外等鉴别方法的报道，但均缺乏专属性。狍鹿角除本身具有药用价值外，还经常破碎后充当正品鹿角使用，传统方法很难将其区别开来。
发明内容
针对现有技术中缺乏狍鹿角专属性检测方法的问题，本发明提供了一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用，为狍鹿角质量研究提供参考与依据，也有利于狍鹿角及其炮制品与正品鹿角的鉴别研究。
本发明通过以下技术方案实现：
一种狍鹿角特征肽段，所述的狍鹿角特征肽段氨基酸序列为VAEVGGEALGR。
本发明中，利用上述的狍鹿角特征肽段检测狍鹿角的方法，将待检测样品溶液注入液相色谱-高分辨质谱联用仪，获得待检测样品的一级质谱和二级质谱，以鉴别狍鹿角特征肽段为对照，判断待检测样品溶液中是否含有狍鹿角成分。
进一步地，采用电喷雾正离子模式监测，选择以高分辨质谱m/z=529.287±0.005双电荷为检测离子，如果检测出上述离子，且二级质谱中主要碎片离子为659.349±0.005、758.418±0.005、416.263±0.005，则判断待检测样品中含有狍鹿角成分。
进一步地，所述的待检测样品溶液的制备方法为：向20mg待检测样品中加入1mL变性缓冲液，然后加入50μl的 0.5mol/L DTT溶液，置于90℃保温处理4h，取出，放冷至室温，加入120μl的0.55mol/L IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，取上清液200μl置于10k超滤管中，离心,截留物加200μl的1%碳酸氢铵溶液和5μl胰蛋白酶溶液，涡旋2min，置于37℃恒温培养箱中酶解30min，0.22μm滤膜过滤，得待检测样品溶液。
进一步地，所述的胰蛋白酶溶液的浓度为10mg/ml。
进一步地，所述的变性缓冲液中包括6mol/L盐酸胍、1.3mol/L Tris和2.4mmol/LEDTA，pH为8.0。
进一步地，液相色谱条件为：Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱，进样量为5μl，流速0.3ml/min；
高分辨质谱条件为：Thermo Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，ESI离子源，正离子模式，喷雾电压为2.1kV，离子传输管温度为320℃，S-Lens传输效率设置为60%；一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采集范围为350～1550Th，二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE设置为40%；选择529.287±0.005双电荷作为检测离子。
进一步地，所述梯度洗脱的条件为：0～2 min，5％B；2～75min，5％～45％B；75～80min，45％～100％B；80～85.9min，100％B；85.9～86min，100％～5％B；86～90min，5％B。
本发明中，所述的狍鹿角特征肽段或检测狍鹿角的方法在动物角类药材中鉴别中的应用。
进一步地，所述的动物角类药材为狍鹿角、梅花鹿角、马鹿角、驼鹿角、驯鹿角中的一种以上。
本发明取得的有益效果为：
本发明提供了狍鹿角特征肽段，特征肽段具有很高的专属性及信号响应，可用于狍鹿角药材的定性检测；
本发明提供的利用狍鹿角特征肽段检测狍鹿角的方法，通过提取特征肽段的精准m/z的一级质谱图，然后通过该特征肽段的二级质谱主要碎片离子进行匹配，无需特征肽对照品就可实现狍鹿角准确定性检测，操作简单，判断准确，能准确识别狍鹿角特征肽段，有利于狍鹿角的质量控制，对保证狍鹿角及其炮制品的质量及与正品鹿角的区别提供科学方法。
附图说明
图1为狍鹿角正离子流图；
图2为狍鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（m/z=529.287±0.005）；
图3为狍鹿角中狍鹿角特征肽段的二级质谱图；
图4为梅花鹿角正离子流图；
图5为梅花鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（m/z=529.287±0.005）；
图6为马鹿角正离子流图；
图7为马鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（m/z=529.287±0.005）；
图8为驼鹿角正离子流图；
图9为驼鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（m/z=529.287±0.005）；
图10为驯鹿角正离子流图；
图11为驯鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（m/z=529.287±0.005）。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一种鉴别狍鹿角的特征肽段，所述的鉴别狍鹿角的特征肽段的氨基酸序列SEQ IDNO.1为：VAEVGGEALGR；
所述的鉴别狍鹿角特征肽段的氨基酸的结构式为：
。
实施例2
（1）取待检狍鹿角样品粉末20mg，加1ml变性缓冲液（含6 mol/L盐酸胍、1.3mol/LTris和2.4 mmol/L EDTA，pH为8.0），加50μl的 0.5mol/L DTT溶液，置于90℃保温处理4h，取出，放冷至室温，加入120μl的0.55mol/L IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，取上清液200μl置于10k超滤管中，离心，截留物加200μl的1%碳酸氢铵溶液和5μl胰蛋白酶溶液（浓度为10mg/ml），涡旋2min，置于37℃恒温培养箱中酶解30min，0.22μm滤膜过滤，即得待检测样品溶液；
（2）将步骤（1）制备的待测样品溶液注入液相色谱-高分辨质谱联用仪，获得待检测样品的一级质谱和二级质谱，以狍鹿角特征肽段为对照，判断待检测样品溶液中是否含有狍鹿角成分；
所述的液相色谱-高分辨质谱联用仪中的液相色谱条件为：Thermo HypersilGOLD C18色谱柱（100mm×2.1mm，3μm），柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱：0～2 min，5％B；2～75min，5％B～45％B；75～80min，45％～100％B；80～85.9min，100％B；85.9～86min，100％B～5％B；86～90min，5％B；进样量为5μl，流速0.3ml/min；
高分辨质谱条件为：Thermo Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，ESI离子源，正离子模式，喷雾电压为2.1 kV，离子传输管温度为320℃，S-Lens传输效率设置为60%；一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采集范围为350～1550Th；二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE设置为40%。选择m/z=529.287±0.005（双电荷）作为一级质谱检测离子。
实施例2中狍鹿角的正离子流图如图1所示，狍鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（529.287±0.005）如图2所示，狍鹿角中狍鹿角特征肽段的二级质谱图如图3所示，由图2和图3可知，在m/z=529.287±0.005（双电荷）范围内狍鹿角样品的一级质谱图中可检测出明显色谱峰，在二级质谱图中上述母离子的主要碎片离子为659.349、758.418和416.263。
实施例3
实施例3中待检测样品为梅花鹿角，检测方法和检测条件与实施例2相同，梅花鹿角正离子流图如图4所示，梅花鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（529.287±0.005）如图5所示，由图可知，该样品一级质谱图中均没有检出色谱峰。
实施例4
实施例4中待检测样品为马鹿角，检测方法和检测条件与实施例2相同，马鹿角正离子流图如图6所示，马鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（529.287±0.005）如图7所示，由图可知，该样品一级质谱图中均没有检出色谱峰。
实施例5
实施例5中待检测样品为驼鹿角，检测方法和检测条件与实施例2相同，驼鹿角正离子流图如图8所示，驼鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（529.287±0.005）如图9所示，由图可知，该样品一级质谱图中均没有检出色谱峰。
实施例6
实施例6中待检测样品为驯鹿角，检测方法和检测条件与实施例2相同，驯鹿角正离子流图如图10所示，驯鹿角中狍鹿角特征肽段的一级质谱图（529.287±0.005）如图11所示，由图可知，该样品一级质谱图中均没有检出色谱峰。
目前，狍鹿角除本身具有药用价值外，还经常破碎后充当正品鹿角使用，传统方法很难将其区别开来，本发明能特异性检测狍鹿角特征肽这一成分，从而与其它角类药进行区分，具有专属性的特征，能够应用于动物角类药材中狍鹿角成分的鉴别，如狍鹿角、梅花鹿角、马鹿角、驼鹿角或驯鹿角，具有很高的专属性及信号响应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种狍鹿角特征肽段，其特征在于，所述的狍鹿角特征肽段氨基酸序列为VAEVGGEALGR。
2.一种利用权利要求1所述的狍鹿角特征肽段检测狍鹿角的方法，其特征在于，将待检测样品溶液注入液相色谱-高分辨质谱联用仪，获得待检测样品的一级质谱和二级质谱，以鉴别狍鹿角特征肽段为对照，判断待检测样品溶液中是否含有狍鹿角成分；采用电喷雾正离子模式检测，选择以高分辨质谱m/z=529.287±0.005双电荷为检测离子，如果检测出该离子，且二级质谱中主要碎片离子为659.349±0.005、758.418±0.005、416.263±0.005，则判断待检测样品中含有狍鹿角成分；
所述的待检测样品溶液的制备方法为：向20mg待检测样品中加入1mL变性缓冲液，然后加入50μl的 0.5mol/L DTT溶液，置于90℃保温处理4h，取出，放冷至室温，加入120μl的0.55mol/L IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，取上清液200μl置于10k超滤管中，离心,截留物加200μl的1%碳酸氢铵溶液和5μl胰蛋白酶溶液，涡旋2min，置于37℃恒温培养箱中酶解30min，0.22μm滤膜过滤,得待检测样品溶液。
3.根据权利要求2所述的检测狍鹿角的方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶溶液的浓度为10mg/ml。
4.根据权利要求2所述的检测狍鹿角的方法，其特征在于，所述的变性缓冲液中包括6mol/L盐酸胍、1.3mol/L Tris和2.4mmol/L EDTA，pH为8.0。
5.根据权利要求2所述的检测狍鹿角的方法，其特征在于，液相色谱条件为：ThermoHypersil GOLD C18色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱，进样量为5μl，流速0.3ml/min；
高分辨质谱条件为：Thermo Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，ESI离子源，正离子模式，喷雾电压为2.1kV，离子传输管温度为320℃，S-Lens传输效率设置为60%；一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采集范围为350～1550Th，二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE设置为40%；选择529.287±0.005双电荷作为检测离子。
6.根据权利要求5所述的检测狍鹿角的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：0～2 min，5％B；2～75min，5％～45％B；75～80min，45％～100％B；80～85.9min，100％B；85.9～86min，100％～5％B；86～90min，5％B。
7.一种权利要求1所述的狍鹿角特征肽段或权利要求2~6任一项所述的检测狍鹿角的方法在动物角类药材中鉴别中的应用；
所述的动物角类药材为狍鹿角、梅花鹿角、马鹿角、驼鹿角、驯鹿角中的一种以上。
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