CN113480599A - 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用。本发明提供的特征多肽为：肽段1如SEQ ID No.1所示：ASTGAALVVR；肽段2如SEQ ID No.2所示：TPVGQGPSVPVPNR。本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。本发明提供的特征多肽针对梅花鹿或马鹿的鹿角胶具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于鹿角胶药材及添加鹿角胶药材中成药的鉴别，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用。

背景技术

《中国药典》2020年版中载明，鹿角胶是以梅花鹿或马鹿的鹿角为原料，以水煎后的胶液浓缩后制得的。有温补肝肾，益精养血的效果^[1]。由于鹿角中胶原蛋白含量少，制备时得胶率低，其价格远远贵于阿胶。

中国是世界上产鹿种类最多的国家，世界鹿科动物现存38种，我国有16种。鹿角胶由于制备困难、原材料昂贵等原因，部分厂家以非马鹿、梅花鹿角投料的现象屡见不鲜。目前，对鹿角胶的鉴别检验专属性较差，《中国药典》2020年版中鹿角胶项下鉴别检验使用的特征肽段离子对无法将梅花鹿和马鹿与其他近缘物种区分。

近年来，关于使用特征肽段对天然药物进行定性或定量研究的报道越来越多。如巩丽萍等利用特征肽段对阿胶中皮源进行鉴别，可以精准鉴别出阿胶中是否掺杂了马皮，程显隆等使用主成分分析等手段找到了鹿角胶相对于阿胶、新阿胶、黄明胶、龟甲胶的特征离子对。房芳等结合鸟枪蛋白组学技术对不同物种的热稳定特征肽进行检测和鉴定等，都对特征肽段鉴别动物源性做出大量研究。而现有技术中，由于鹿种属蛋白数据比较少，难以查找到目标特征肽段，主要由于以下几点：1.梅花鹿、马鹿及其伪品驼鹿、驯鹿、黇鹿、白唇鹿、白尾鹿等同为鹿科哺乳动物，遗传物质相似度高，所对应蛋白质的相似度高，较难找到差异；2.梅花鹿的自然种群现在仅分布在东北亚，即俄罗斯的乌苏里地区到中国、中国台湾、越南北部和日本等国家和地区；而鹿角胶仅在中国大规模使用，对于梅花鹿茸蛋白质组学的研究材料很少，可参考的蛋白质数据库匮乏，尤其是胶原蛋白及角蛋白的研究数据比较少，难以通过库内比对序列的方法找到不同鹿科动物胶的差异肽段。目前，尚未有针对梅花鹿马鹿与其他鹿科动物进行鉴别、准确区分的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的技术空白，本发明提供了一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽。

本发明还提供了上述特征多肽在鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶种属鉴别中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽，所述特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：ASTGAALVVR；肽段2如SEQ ID No.2所示：TPVGQGPSVPVPNR。

进一步的，所述SEQ ID No.1肽段1的质荷比为472.77；所述SEQ ID No.2肽段2的质荷比为702.88。

本发明还提供了一种用于鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1或2所述的特征多肽。

本发明还提供了一种利用上述特征多肽鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的方法，包括以下步骤：

（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；

（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1、肽段2的质谱图，当质谱图中出现肽段1或肽段2的质谱图时，可判断待测样品为梅花鹿或马鹿的鹿角胶。

进一步的，待测样品的前处理具体过程为：样品粉碎，称取样品粉末0.1g，加碳酸氢铵溶液50ml，超声处理30min，用微孔滤膜过滤，取续滤液100μL，加牛胰蛋白酶溶液1μL，37℃酶解4h，取出放冷至室温，即得。

进一步的，所述碳酸氢铵的质量浓度为1%。

本发明所提供的液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。

上述梯度洗脱的条件为：0～9min,3%B→7.5%B；9～13min, 7.5%B→25%B；13～14min,25%B→90%B；14～17min, 90%B；17～17.5min, 10%B-97%B；17.5～21min,97%B，进样量为5 μm。

本发明所提供的液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；溶剂延迟（solvent delay）为0～8min和14～20min；选择m/z（两电荷）702.88→865.49、702.88→1107.6, m/z（两电荷）472.77→459.22、472.77→213.16,作为检测离子对。

本发明的有益效果为：

（1）本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。

（2）本发明提供的特征多肽针对梅花鹿或马鹿的鹿角胶具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于鹿角胶药材及添加鹿角胶药材成药的鉴别，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为m/z（两电荷）472.77的二级质谱图及y离子、b离子归属。

图2为m/z（两电荷）702.88的二级质谱图及y离子、b离子归属。

图3为m/z（两电荷）472.77的专属性实验结果。

图4为 m/z（两电荷）702.9的专属性实验结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

（一）仪器和试剂：Thermo EASY-nLC 1000纳升液相，Thermo ScientificOrbitrap-Fusion高分辨质谱，AB Triple Quad 6500+高效液相色谱质谱联用仪，赛多利斯XSE205电子天平，胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBG6452V）盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。甲酸、乙腈均为色谱纯。

用于进行分析实验及专属性实验的鹿角胶样品为中国食品药品检定研究院提供。

实施例1

1、测定条件

1.1 纳升液相-高分辨质谱测定条件

纳升色谱条件：以Thermo Acclaim PepMap C18柱（100 μm×3.5 cm，5 μm）脱盐富集，Thermo Acclaim PepMap C18柱（75μm×15cm，3 μm）分离，流速300nL/min，流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱(0~1min,1%B→6%B;1~96min,6%B→22%B;96~113min,22%B→30%B;113~117min,30%B→95%B; 117~120min,95%B）进样量为1 μm。高分辨质谱条件：离子源为Nanospray Flex纳喷源。以正离子模式进行分析，喷雾电压为1800V，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350~1550（m/z）；二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top 20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为30%。

1.2 液相-三重四极杆质谱测定条件

液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。（0～9min,3%B→7.5%B；9～13min, 7.5%B→25%B；13～14min,25%B→90%B；14～17min, 90%B；17～17.5min, 10%B -97%B,17.5～21min,97%B）进样量为5 μm。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)。溶剂延迟（solvent delay）为0～8min和14～20min。选择m/z（两电荷）702.88→865.49、702.88→1107.6, m/z（两电荷）472.77→459.22、472.77→213.16,作为鹿角胶的检测离子对。

鹿角胶特征离子对选择

2.1 供试品溶液的制备

鹿角胶样品：样品粉碎。称取样品粉末0.1g，加碳酸氢铵溶液（1%）50ml，超声处理30min，用微孔滤膜过滤，取续滤液100μL，加牛胰蛋白酶溶液1μL，37℃酶解4h，取出放冷至室温，即得。

2.2 特征离子的选择

上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入PEAKS 8.5软件，进行样品全部肽段的从头测序及序列预测，并分析得到的结果。从其分析结果中选择了只有马鹿及梅花鹿样品中可被检出，其他鹿科中几乎未检出的肽段作为母离子，并对其二级图谱进行逐个分析，选择响应较好的子离子。

筛选的特征离子对及其预测序列见表1，肽段二级质谱图及b、y离子归属见图1-2。

表1 特征离子对及其预测序列

3 鹿角胶样品特征离子对专属性研究

3.1鹿茸、鹿角特征离子对专属性实验

将肽段1、2离子对对所有鹿角胶类样品进行测定，结果两条肽段离子对在马鹿及梅花鹿角胶样品的色谱图中出现色谱峰，而驯鹿角胶、驼鹿角胶中相同保留时间未出现相应色谱峰。具体结果见表2.

表2 特征离子对专属性实验结果

样品编号	名称	肽段1	肽段2
				MHLJJ-1	梅花鹿角胶	检出	检出
MHLJJ-2	梅花鹿角胶	检出	检出
				MHLJJ-3	梅花鹿角胶	检出	检出
MLJJ-4	马鹿角胶	检出	检出
				MLJJ-5	马鹿角胶	检出	检出
MLJJ-6	马鹿角胶	检出	检出
				XLJJ-7	驯鹿角胶	未检出	未检出
XLJJ-8	驯鹿角胶	未检出	未检出
				TLJJ-9	驼鹿角胶	未检出	未检出
TLJJ-10	驼鹿角胶	未检出	未检出
				TLJJ-11	驼鹿角胶	未检出	未检出
TLJJ-12	驼鹿角胶	未检出	未检出
				TLJJ-13	驼鹿角胶	未检出	未检出

鹿角胶的制备过程复杂，可能导致一些蛋白质的变性和分解，故鹿角胶不能同鹿茸、鹿角等使用同样的特征多肽进行验证。

对比例1

使用《中国药典》2020年版鹿角胶鉴别项下规定的离子对(m/z)765.4双电荷→554.0和m/z765.4双电荷→733.0对鹿角胶样品进行测定，发现所有样品中均能检出吸收峰。

<110>山东省食品药品检验研究院

<120>一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用

<160> 2

<210> 1

<211>10

<212>PRT

<222>（1）…（10）

<400>1

Ala Ser Thr Gly Ala Ala Leu Val Val Arg

1 5 10

<210> 2

<211>14

<212>PRT

<222>（1）…（14）

<400>2

Thr Pro Val Gly Gln Gly Pro Ser Val Pro Val Pro Asn Arg

1 5 10

Claims (9)

1.一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽，其特征在于，所述特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：ASTGAALVVR；肽段2如SEQ ID No.2所示：TPVGQGPSVPVPNR。

2.根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述SEQ ID No.1肽段1的质荷比为472.77；所述SEQ ID No.2肽段2的质荷比为702.88。

3.一种用于鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1或2所述的特征多肽。

4.一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；

（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1、肽段2的质谱图，当质谱图中出现肽段1或肽段2的质谱图时，可判断待测样品为梅花鹿或马鹿的鹿角胶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品的前处理具体过程为：样品粉碎，称取样品粉末0.1g，加碳酸氢铵溶液50ml，超声处理30min，用微孔滤膜过滤，取续滤液100μL，加牛胰蛋白酶溶液1μL，37℃酶解4h，取出放冷至室温，即得。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳酸氢铵的质量浓度为1%。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。

8.根据权利要求7所述的方法，所述梯度洗脱的条件为：0~9min,3%B→7.5%B；9～13min, 7.5%B→25%B；13～14min,25%B→90%B；14～17min, 90%B；17～17.5min, 10%B-97%B；17.5～21min,97%B，进样量为5μm。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；溶剂延迟（solvent delay）为0～8min和14～20min；选择m/z（两电荷）702.88→865.49、702.88→1107.6, m/z（两电荷）472.77→459.22、472.77→213.16,作为检测离子对。

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