CN110596262A - 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂mrjp1蛋白含量的方法 - Google Patents

利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂mrjp1蛋白含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白(王浆主蛋白1)含量的方法，所述方法包括：特征肽段的选择，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测定量等步骤。本发明提供的蜂蜜中意蜂MRJP1含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适合于蜂蜜中意蜂MRJP1的准确定量。由于蜂蜜中MRJP1的含量相对恒定，基于其含量可用于蜂蜜真实性评价，辅助鉴别蜂蜜是否掺假。此外，中蜂蜂蜜中不含有意蜂MRJP1，因此可以用于中蜂蜂蜜中是否混入意蜂的鉴别。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。

Description

利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的 方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序，阻碍了我国蜂业的健康发展，侵害了消费者权益。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。
王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1，MRJP1)，是蜂蜜中的主要蛋白质之一，大小约57KD，占水溶性蛋白质的45％，是蜂蜜中含量最丰富的蛋白质。研究结果表明MRJP1的含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则其含量必定发生较大的变化，因此MRJP1含量可用以辅助鉴别蜂蜜的掺假现象。此外，意蜂(意大利蜂)与中蜂(中华蜜蜂)MRJP1的氨基酸序列存在显著的差异，因此，可以意蜂 MRJP1的检测可以用于中蜂蜜中是否混入廉价意蜂蜜的鉴别。但是，对于如何准确定量蜂蜜中MRJP1的含量，目前尚无相关报道。
液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列特异于的胰蛋白酶特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略的基础上，提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法。
本发明的另一目的是将该方法用于生产和商业中对蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法，包括以下步骤：
A、提取标准意蜂蜂蜜样品中的蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，将MRJP1蛋白对应的条带切胶回收，然后酶解MRJP1蛋白，酶解产物除盐后，用0.1％v/v的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；
B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出MRJP1蛋白的特征肽段并测序，然后人工合成所述特征肽段及其稳定同位素内标肽段；
C、配制不同浓度的所述特征肽段的标准品溶液；
D、向标准品溶液中加入稳定同位素内标肽段混匀，然后进行液相色谱串联质谱检测；
E、根据标准品溶液的浓度以及特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比绘制标准曲线；
F、对待测蜂蜜样品进行前处理：先将蜂蜜样品溶解于水或PBS缓冲溶液中，利用超滤法提取蜂蜜中的蛋白质；将蛋白溶液用胰蛋白酶水解，酶解产物除盐后作为待测样本；
G、用待测样本替代步骤D中的标准品溶液，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
H、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对蜂蜜样品中意蜂MRJP1蛋白的定量检测。
本发明成功筛选出意蜂MRJP1的特异性肽段FFDYDFGSDER(SEQ ID NO:1)，其特异性通过Uniprot数据库进行了验证；并选择稳定的内标(IS)肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量MRJP1蛋白。
优选地，所述稳定同位素内标肽段为：FFDYDFGSDER*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C6，氮置换为15N。
前述的方法，步骤A包括以下子步骤：
a1、蜂蜜中蛋白质的提取：将蜂蜜与去离子水或PBS缓冲溶液按照1:1体积比溶解，离心10min，收集上清液至10KD分子通量的超滤管中，以5000g离心力离心，使蛋白溶液浓缩至最小体积，然后收集上清液，作为蛋白提取液，并测定提取液中总蛋白浓度(Bradford法)；
a2、蛋白质的SDS-PAGE分析：将蛋白提取液进行SDS-PAGE分析，用12％浓缩胶和10％分离胶将MRJP1与其它蛋白分离，然后用考马斯蓝染色；
a3、MRJP1蛋白的酶解：从电泳凝胶上切下MRJP1蛋白对应的条带(约57KD，MRJP1蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO:2)，置于离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色；弃去脱色液并加入乙腈使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其反应15min，吸走乙腈并蒸发浓缩干燥；然后加入100mM DTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min，吸干多余的DTT，再加入100mM IAA溶液在室温下暗反应60min；吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mM NH4HCO3溶解的胰蛋白酶(胰蛋白酶与MRJP1蛋白的质量比为1:50)浸没胶条，37℃酶切过夜；然后加入0.1％v/v甲酸水溶液终止酶切反应，加入70％v/v乙腈水溶液(含0.1％v/v甲酸) 浸没胶条进行萃取，静置10-20min，将萃取液转移至新的离心管中，重复一次萃取，合并两次萃取液，除盐后将样品进行真空干燥，然后用甲酸水溶液复溶，进行液相色谱串联质谱检测。
本发明中，可以采用UHPLC-Q Exactive plus(超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱)进行液相色谱串联质谱检测。
优选地，液相色谱条件如下：
色谱柱：为C18柱；
流动相组成：流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为含0.1％v/v甲酸的乙腈；
梯度洗脱条件为：0-0.5min，5％的B；0.5-1.0min，5-15％的B；1.0-6.5min，15-40％的B；6.5-7.0min，40-95％的B；7.0-8.5min，95％的B；8.5-8.6min，95-5％B，8.6-10.0min，5％的B；
流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
优选地，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速(sheath gas flow rate)38；辅助气的流速(aux gasflow rate)15；挡锥气的流速(sweep gas flow rate)0；电喷雾电压(spray voltage)3.2KV；离子导管的温度(capillary temperature)275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度 (Heater temperature)380℃；
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：
其中，Full MS的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：200-1500Da；Spectrum data：Centroid；Inclusion：on；
其中，dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：17500，AGC Target：1e5；Maximum IT：50ms；Loop count：2；Isolation window：2.0Da；NCE：15，25， 35；Spectrum data：Centroid；而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger： 2-6s；Exclude isotope：on；Dynamic exclus：4.0s；If idle：pick other。
所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有699.28586的质荷比；子离子包含质荷比为1103.42576、825.33563的子离子。
所述稳定同位素内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有704.28725的质荷比；子离子包含质荷比为1113.43347、835.34383的子离子。
前述的方法，步骤E得到的标准曲线为Y＝2.685e-3X-8.478e-2，R2＝0.9980，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度。
本发明中，MRJP1蛋白的线性检测范围为5-1000ng/mL，最低检出限为2ng/mL。
第二方面，本发明提供可用于液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白的特征肽段，所述特征肽段选自如下①～③任一个：
①FFDYDFGSDER；
②IMNANVNELILNTR；
③EYILVLSNK。
其中，①可作为定量肽段，②、③可作为定性肽段。
第三方面，本发明提供用于液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒中至少包括特征肽段标准品溶液和稳定同位素内标肽段溶液。
所述特征肽段标准品溶液的制备如下：取1mg特征肽段标准品，用500μL乙腈溶解，再加入500μL水混匀，即得。
所述稳定同位素内标肽段溶液的制备同所述特征肽段标准品溶液的制备。
第四方面，本发明提供所述特征肽段、所述方法或所述试剂盒在蜂蜜的质量控制和真实性鉴定中的应用，特别是中蜂蜂蜜中是否掺杂有廉价意蜂方面的鉴定。
进一步地，本发明的技术方案之一是：筛选出意蜂MRJP1蛋白的特异性肽段，基于意蜂MRJP1蛋白在蜂蜜中的含量辅助蜂蜜掺假的鉴别。
确定的意蜂MRJP1蛋白的特征肽段序列为FFDYDFGSDER，其特异性已经通过Uniprot数据库进行了验证；稳定同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER* (R*-13C6,15N4)。
本发明的技术方案之二是：建立了一种基于液相串联高分辨质谱技术对蜂蜜样本中意蜂MRJP1蛋白的特征肽段的定量方法。该方法采用UHPLC-Q Exactive Plus(超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱)检测蜂蜜样本，通过比较其图谱中 MRJP1特征肽段/IS肽段峰面积比，推算MRJP1蛋白含量，进而判定蜂蜜是否掺假，主要基于MRJP1的特征肽段的定量子离子在液质上的峰面积和稳定同位素标记的内标(IS)肽段的定量子离子在液质上的峰面积。
筛选意蜂MRJP1特征肽段采取以下步骤：
S1：蜂蜜中蛋白质的提取：将适量的意蜂蜜以1g:1mL的比例在去离子水中溶解，在室温下搅拌至完全溶解，并在12000g，4℃下离心10min。收集上清液至10kD分子通量的超滤管，以5000g离心力离心，使蛋白溶液浓缩至最小体积，然后收集上清液并使用Bradford法测得蜂蜜中蛋白质浓度。上清液储存在-20℃直至进一步分析。
S2：蜂蜜中蛋白质的SDS-PAGE分析：将蛋白提取溶液进行SDS-PAGE分析。通过使用12％浓缩胶和10％分离胶将MRJP1与其它蛋白分离，然后用考马斯蓝染色。
S3：蜂蜜中MRJP1蛋白的酶解：通过文献查询MRJP1分子量(约57KD)，从电泳凝胶上切下靶蛋白条带，之后进行胶内酶解，对酶解产物进行冻干；并用胰蛋白酶进行凝胶内消化，然后通过UHPLC-Q Exactive plus表征目标蛋白质。具体步骤如下：
脱色：从电泳凝胶上切下靶蛋白条带，置于1.5mL离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色。脱水：弃去脱色液并加入ACN使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其反应15min，吸走ACN并蒸发浓缩干燥半小时。酶切：然后加入 100mM DTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min，吸干多余的DTT，再加入5 倍DTT体积的100mM IAA溶液在室温下暗反应60min。吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mM NH4HCO3溶解的胰蛋白酶(胰蛋白酶与MRJP1蛋白的质量比为1:50)浸没胶条，倒置并在37℃下孵育过夜。萃取：向过夜酶切的缓冲液中加入0.1％ FA终止酶切，加入体积比70％乙腈水(含0.1％v/v甲酸)浸没胶条进行萃取，静置10-20 min，取出萃取液至新的1.5mL离心管中，重复一次，合并两次萃取液。酶切得到的肽段进行下一步除盐后将样品进行真空干燥。
S4：MRJP1肽段的测定：使用UHPLC-Q Exactive plus对肽段进行测序和鉴定。
将肽段重新溶解在流动相A(0.1％v/v的甲酸水)中。色谱条件为：分析柱是为 C18色谱柱。流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
离子源参数：鞘气的流速(sheath gas flow rate)38；辅助气的流速(aux gasflow rate)15；挡锥气的流速(sweep gas flow rate)0；电喷雾电压(spray voltage)3.2KV；离子导管的温度(capillary temperature)275℃；S-lens RF level设为60；离子源的温度(Heater temperature)380℃。
采集的模式：正离子模式下的Full MS-ddMS2。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据直接导入PEAKS 8.0进行定性分析。搜索数据库为NCBI上下载的蜜蜂(Apis mellifera)蛋白质数据库，污染库为常见数据污染库(common repository of adventitious proteinsdatabase， cRAP，从The Global Proteome Machine Organization下载)。检索参数设置如下：母离子质量误差(The precursor mass tolerances)为15ppm，子离子质量误差(Thefragment mass tolerances)为0.05Da，酶为：Trypsin酶切，最大漏切位点数为2；可变修饰为 oxidation(M，+15.99)，固定修饰为carbamidomethyl(C，+57.02)。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率(False discovery rate FDR)，FDR<1％。通过UHPLC-Q Exactive plus，蛋白质分别被鉴定为意蜂MRJP1。
S5：特征性肽段的确定：UHPLC-Q Exactive plus分析期间的三种候选肽段显示带电状态和相应的分子量与其理论值良好一致。三种肽段的单电荷离子是m/z 1397.56444，1614.86320和1078.61429。类似地，肽段片段的双电荷离子是m/z 699.28586，807.93534和539.81078，它们相应的肽段序列是FFDYDFGSDER， IMNANVNELILNTR和EYILVLSNK。通过UniProt(www.uniprot.org)中的BLAST搜索验证了三种候选肽段的特异性。选择肽段FFDYDFGSDER作为定量肽段，因为其具有最高的信号强度，灵敏度，特异性和稳定性，并将其合成为意蜂MRJP1的特征肽段。IMNANVNELILNTR和EYILVLSNK作为定性肽段。此外，通过UHPLC-Q Exactive plus分析还证实在未消化的蜂蜜样品中不存在特征肽段。因此，以FFDYDFGSDER作为意蜂MRJP1的特异性肽段时，在MRJP1的定量中没有发生内源性干扰。
S6：合成与储存肽段标品：特征肽段FFDYDFGSDER和稳定同位素标记的内标 (IS)肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度超过98％；储存在-20℃备用。
进一步通过以下列顺序溶解制备特征肽段FFDYDFGSDER和同位素标记的内标肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的储备溶液(1mg/mL)：准确称取1mg标品，先用500μL的ACN溶解，然后再用500μL水充分溶解。
S7：标准曲线的绘制：在初始流动相(97：3v/v，水/ACN，含0.1％甲酸)中制备一系列特征肽段标准品(5，10，20，100，250，500，800和1000ng/mL)，然后向配置好的每个浓度的标准品中加入800ng IS肽段。通过绘制分析物/IS肽段峰面积比与分析物浓度来绘制校准曲线。
S8：在蜂蜜样本进行检测时，优选对其采用如下前处理方法：将适量的待测蜂蜜以1g:1mL比例在去离子水中溶解，在室温下搅拌至完全溶解，并在12000g，4℃下离心10min。收集上清液至10kD分子通量的超滤管，以5000g离心力离心至最小体积，然后收集上清液，使用Bradford法测得蜂蜜中蛋白质浓度。将蛋白质溶液用5M 尿素稀释至总蛋白质的终浓度为2mg/mL。然后向50μL样品溶液中加入8μL的100 μg/mL内标肽段(FFDYDFGSDER*)，并与200μL 40mM NH4HCO3混合。向上述加入25.8μL 30mM DTT溶液，在室温反应60min，然后再加入129μL 100mM IAA溶液在室温下暗反应60min。
随后，将胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:50)加入到蜂蜜蛋白样品中并在37℃过夜酶切。当反应完成时，加入1μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品经真空干燥，所得样品在0.1％FA溶液中溶解。进入质谱分析。
应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。
进一步地，采用UHPLC-Q Exactive plus对蜂蜜样本进行检测时，所述的液相条件如下：
色谱柱：为C18色谱柱，柱温为室温：20℃。
流动相组成：流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为0.1％的甲酸乙腈。
梯度洗脱条件为：0-0.5min，5％的B；0.5-1.0min，5-15％的B；1.0-6.5min，15-40％的B；6.5-7.0min，40-95％的B；7.0-8.5min，95％的B；8.5-8.6min，95-5％B，8.6-10.0min，5％的B。
流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：
鞘气的流速(sheath gas flow rate)38；辅助气的流速(aux gas flow rate)15；挡锥气的流速(sweep gas flow rate)0；电喷雾电压(spray voltage)3.2KV；离子导管的温度(capillary temperature)275℃；S-lens RF level设为60；离子源的温度(Heatertemperature)380℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：200-1500Da；Spectrum data：Centroid；Inclusion：on。
其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：17500，AGC Target：1e5；Maximum IT：50ms；Loop count：2；Isolation window：2.0Da；NCE：15，25， 35；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger： 2-6s；Exclude isotope：on；Dynamic exclus：4.0s；If idle：pick other。
具体地，采用UHPLC-Q Exactive Plus检测蜂蜜样本的图谱中应该含有意蜂MRJP1特征肽段FFDYDFGSDER的精确m/z值：699.28586([M+2H]2+)；样本的图谱中应该含有添加的稳定同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4) 的精确m/z值：704.28725([M+2H]2+)，其允许偏差应在5ppm以内。
其MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有意蜂MRJP1特征肽段FFDYDFGSDER 的特征碎片离子1103.42576(y9),m/z 825.33563(y7)，相应地，稳定同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*的子离子图谱(MS/MS)中应含有碎片离子m/z 1113.43347(y9),m/z835.34383(y7)，且其精确质量数的误差应当小于5ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的MRJP1含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂蜜质量。
本发明采用UHPLC-Q Exactive plus仪器对蜂蜜中的MRJP1定量，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
研究发现，蜂蜜中MRJP1的含量相对恒定，本发明据此建立起一套蜂蜜真实性评价的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本发明提供的蜂蜜中MRJP1蛋白含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适用于蜂蜜中MRJP1 的准确定量。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus提取的MRJP1的三种候选肽段的离子流图。
图2为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的MRJP1的三种候选肽段的质谱图。
图3为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的MRJP1的三种候选肽段的二级碎片质谱图。
图4为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus提取的同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的离子流图。
图5为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的质谱图。
图6为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的二级碎片质谱图。
图7为本发明实施例2中蜂蜜掺假的定量检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的仪器与试剂：
1.质谱仪(Q-Exactive)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国BeckMAN Coul TER公司；
3.全波长酶标仪(Multiskan GO)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
4.电子分析天平(PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5.pH计(DELTA 320)，德国METTLER TOLEDO公司；
6.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem,RVC2-18)，德国MarinChrist公司；
7.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；
8.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；
9.1290Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
尿素(Urea)购自Solarbio公司；硫脲、CHAPS、Tris碱、二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)购自Amresco公司；碘乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)购自Merk(Kenilworth,NJ,USA) 公司；丙酮、Ti(SO4)2、三氟乙酸(TFA)购自J.T.Baker公司；Bradford法蛋白质定量试剂盒购自普利莱公司；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)均购自Roche(Basel, Switzerland)公司；碳酸氢铵(NH4HCO3)购自Sigma Aldrich公司；质谱级胰蛋白酶 (Trypsin)购自Promega(Madison,WI,USA)公司，甲酸(FA)购自从MREDATechnology (Carlsbad,CA,USA)公司；乙睛(ACN)购自Fisher公司；Zip-Tip除盐洗脱柱购自 Millipore；其余化学试剂均购买自北京化学试剂公司。
实施例1利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的蜂蜜样本共80份，如洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、油菜蜂蜜、枣花蜂蜜、椴树蜂蜜等。
2.实验步骤
(1)溶液配制
5M Urea溶液：称取Urea 4.5g，超纯水定容到15mL；
蛋白裂解液(Lysis buffer,LB)：8M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，20mM Tris碱；
100mM DTT 100mL体系配置如下：称取尿素48.06g、硫4％CHAPS，20mM Tris 碱，15.22g，CHAPS 4.00g，Tris碱0.24g和DTT 0.46g，用超纯水溶解、混匀并定容至100mL，-20℃冰箱保存待用。
40mM NH4HCO3溶液：称取0.316g NH4HCO3，用超纯水定容100mL，4℃冰箱保存待用。
100mM IAA溶液：称取IAA 0.39g，用40mM的NH4HCO3溶液定溶至20mL， -20℃冰箱保存待用。
15％分离胶配制：依次加入去离子水2.3mL，30％丙烯酰胺5ml,pH8.8的Tris 2.5mL，10％过硫酸铵100μL，10％SDS 100μL、四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine,TEMED)。
5％浓缩胶配制：依次加入去离子水2.7mL，30％丙烯酰胺670μL，pH8.8的Tris 500μL，10％过硫酸铵40μL，10％SDS 40μL、TEMED 6μL。
脱色液：50％乙腈，50％40mM NH4HCO3，4℃保存。
胶内酶切萃取液：700μL CAN、1μL FA,用超纯水定容至1mL，4℃保存。
活化液：500μL ACN、3μL TFA，超纯水定容至1mL，4℃保存。
平衡液:1μL TFA，超纯水定容至1mL，存于4℃。
洗脱液：800μL ACN、1μL TFA，用超纯水定容至1mL，存于4℃。
(2)特征肽段的选择：
①蜂蜜中蛋白质的提取
称取1g意蜂蜜加入1mL去离子水，在室温下涡旋至完全溶解，并在12000g，4℃下离心10min。收集上清液至10KD分子通量的超滤管中，以5000g离心力离心50 min。然后收集超滤管中的蛋白溶液，并使用Bradford法测得蜂蜜中蛋白质浓度。上清液储存在-20℃直至进一步分析。
②蜂蜜中蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
配制浓度为15％和5％的分离胶和浓缩胶溶液；将10μL检测样品和10μL 1×(或6×) 的loading buffer混合，然后取15μL混合物用移液枪慢慢加至样品槽中，10μL预染Maker；200V恒压，电泳至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部，将蜂蜜中的蛋白按照分子量大小分离开，然后用考马斯蓝染色，判断分析蜂蜜中蛋白成分。
③蜂蜜中蛋白质的胶内酶切
通过文献查询MRJP1分子量(约57KD)，从电泳凝胶上切下靶蛋白条带，之后进行胶内酶解，对酶解产物进行冻干；并用胰蛋白酶进行凝胶内消化，然后通过 UHPLC-QExactive plus表征目标蛋白质。具体步骤如下：
A.脱色：从电泳凝胶上切下靶蛋白条带，置于1.5mL离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色。
B.脱水：弃去脱色液并加入ACN使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其反应15min，吸走CAN并蒸发浓缩干燥半小时。
C.酶切：然后加入100mM DTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min。吸干多余的DTT，再加入5倍DTT体积的100mM IAA溶液在室温下暗反应60min。吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mM NH4HCO3溶解的胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:50)浸没胶条，倒置并在37℃下孵育过夜。
D.萃取：向过夜酶切的缓冲液中加入0.1％FA终止酶切，加入体积比70％乙腈水(含0.1％v/v甲酸)浸没胶条进行萃取，静置10-20min取出萃取液至新的1.5mL离心管中，重复一次，合并两次萃取液。
酶切得到的肽段进行下一步除盐。
④酶切肽段的除盐
向C18除盐小柱中加入活化液1mL，缓慢打出进行活化；再加入平衡液1mL，缓慢打出进行平衡；再加入平衡液600μL和酶切得到的肽段溶液400μL，将此混合液缓慢打到新的1mL离心管中，将打出的液体重新加入小柱中，使蛋白样品充分结合在C18柱子上；再加入平衡液1mL，缓慢打出，洗去盐；最后再加入洗脱液1mL，缓慢打出至新1mL离心管中，得到除盐肽段。干燥：将样品进行真空干燥。
⑤纯蛋白的质谱分析
将脱盐并干燥后的肽段在0.1％FA溶液中溶解。色谱条件为：分析柱是为C18色谱柱。流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
离子源参数：鞘气的流速(sheath gas flow rate)38；辅助气的流速(aux gasflow rate)15；挡锥气的流速(sweep gas flow rate)0；电喷雾电压(spray voltage)3.2KV；离子导管的温度(capillary temperature)275℃；S-lens RF level设为60；离子源的温度(Heater temperature)380℃。
采集的模式：正离子模式下的Full MS-ddMS2。
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：200-1500Da；Spectrum data：Centroid；Inclusion：on。离子列表见表1。
表1质谱数据采集列表
其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：17500，AGC Target：1e5；Maximum IT：50ms；Loop count：2；Isolation window：2.0Da；NCE：15，25， 35；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6s；Exclude isotope：on；Dynamic exclus：4.0s；If idle：pick other。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据直接导入PEAKS 8.0进行定性分析。搜索数据库为NCBI上下载的蜜蜂(Apis mellifera)蛋白质数据库，污染库为常见数据污染库(common repository of adventitious proteinsdatabase， cRAP，从The Global Proteome Machine Organization下载)。检索参数设置如下：母离子质量误差(The precursor mass tolerances)为15ppm，子离子质量误差(Thefragment mass tolerances)为0.05Da，酶为：Trypsin酶切，最大漏切位点数为2；可变修饰为 oxidation(M，+15.99)，固定修饰为carbamidomethyl(C，+57.02)。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率(False discovery rate FDR)， FDR<1％。通过UHPLC-Q Exactive plus，蛋白质分别被鉴定为意蜂MRJP1。
⑥特征性肽段的确定
UHPLC-Q Exactive plus分析期间的三种候选肽段显示带电状态和相应的分子量与其理论值良好一致。三种肽段的单电荷离子是m/z 1397.56444，1614.86320和1078.61429。类似地，肽段片段的双电荷离子是m/z 699.28586，807.93534和539.81078，它们相应的肽段序列是FFDYDFGSDER，IMNANVNELILNTR和EYILVLSNK。通过 UniProt(www.uniprot.org)中的BLAST搜索验证了三种候选肽段的特异性。选择肽段FFDYDFGSDER作为定量肽段，因为其具有最高的信号强度，灵敏度，特异性和稳定性，并将其合成为MRJP1的特征肽段。IMNANVNELILNTR和EYILVLSNK作为定性肽段。此外，通过UHPLC-Q Exactiveplus分析还证实在未消化的蜂蜜样品中不存在特征肽段。因此，当肽段FFDYDFGSDER用作意蜂MRJP1的特异性肽段时，在 MRJP1的定量中没有发生内源性干扰。
(3)合成肽段标品
特征肽段FFDYDFGSDER和稳定同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER* (R*-13C6,15N4)由上海强耀生物科技有限公司提纯，纯度超过98％；储存在-20℃备用。
进一步通过以下列顺序溶解制备特征肽段FFDYDFGSDER和同位素标记的内标肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的储备溶液(1mg/mL)：准确称取1mg标品，先用500μL的ACN溶解，然后再用500μL水充分溶解。
(4)标准曲线的绘制：在初始流动相(97：3，v/v，水/ACN，含0.1％v/v甲酸) 中制备一系列特征肽段标准品(5，10，20，100，250，500，800和1000ng/mL)，然后向配置好的每个浓度的标准品中加入800ng IS肽段。
1290Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱液相条件如下：
色谱柱：Kinetex C18(50mm×2.1mm)2.6μm，柱温为室温：20℃。
流动相组成：流动相A为0.1％v/v的甲酸水，流动相B为0.1％v/v的甲酸乙腈。梯度洗脱条件为：0-0.8min，10％的B；0.8-1.3min，10-20％的B；1.3-4.5min，20-30％的B；4.5-5.4min，30-95％的B；5.4-6.0min，95％的B；6.0-6.1min，95-5％B，6.1-5.0 min，5％的B。
流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：鞘气温度350℃；鞘气流速12L/min；辅助气温度290℃；辅助气流速11L/min；毛细管电压正模式3.5kV；iFunnel参数正模式高压200V、低压100V，采集的模式为正离子模式下的SIM模式。通过绘制特征肽段/IS肽段峰面积比与分析物浓度来绘制校准曲线。通过绘制特征肽段/IS肽段峰面积比与分析物浓度来绘制校准曲线。
标曲方程式如下：Y＝2.685e-3X-8.478e-2，R2＝0.9980 式(1)
其中，Y为特征肽段/IS肽段峰面积比，X为特征肽段浓度(μg/mL)。
MRJP1蛋白的线性检测范围为5-1000ng/mL，最低检出限为2ng/mL。
(5)蜂蜜样本的前处理
①准确称取均匀待测蜂蜜10g至50mL离心管中，加入10mL去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000g，4℃条件下离心10min。收集上清液至10kD分子通量的超滤管，以5000g离心力离心至最小体积，然后收集上清液于新的2mL离心管中，使用Bradford法测得蜂蜜中蛋白质浓度。
②将蛋白质溶液用5M尿素稀释至总蛋白质的终浓度为2mg/mL。然后向50μL样品溶液中加入8μL的100μg/mL内标肽段(FFDYDFGSDER*)，并与200μL 40mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入25.8μL 30mM DTT溶液，在室温反应60min，然后再加入129μL 100mM IAA溶液在室温下暗反应60min。
③每个样品中加入60μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
(6)蜂蜜样本的质谱分析
1290Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测时，所述的液相条件如下：
色谱柱：Kinetex C18(50mm×2.1mm)2.6μm，柱温为室温：20℃。
流动相组成：流动相A为0.1％v/v的甲酸水，流动相B为0.1％v/v的甲酸乙腈。梯度洗脱条件为：0-0.8min，10％的B；0.8-1.3min，10-20％的B；1.3-4.5min，20-30％的B；4.5-5.4min，30-95％的B；5.4-6.0min，95％的B；6.0-6.1min，95-5％B，6.1-5.0 min，5％的B。
流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：鞘气温度350℃；鞘气流速12L/min；辅助气温度290℃；辅助气流速11L/min；毛细管电压正模式3.5kV；iFunnel参数正模式高压200V、低压100V，采集的模式为正离子模式下的SIM模式。
(7)蜂蜜样本的数据处理
根据特征肽段/IS肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式(2)得到意蜂MRJP1蛋白的含量。
X＝(ФcVM1)/(M2m) 式(2)
其中，X为(ng/g)是蜂蜜样品中MRJP1蛋白的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c(ng/mL)是特征肽在胰蛋白酶消化物中的浓度，V(mL)是胰蛋白酶消化物的体积，M1、M2是MRJP1和特征肽段的摩尔质量，m(g)是蜂蜜样品的质量。以达到对蜂蜜样品中MRJP1定量的目的。
经过对部分蜂蜜样品的检测，蜂蜜中MRJP1蛋白含量在0.08～0.31mg/g范围内。并且检测蜂蜜样本的图谱中应该含有意蜂MRJP1特征肽段FFDYDFGSDER的精确 m/z值：699.28586([M+2H]2+)；样本的图谱中应该含有添加的稳定同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的精确m/z值：704.28725([M+2H]2+)，其允许偏差应在5ppm以内。
其MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有意蜂MRJP1特征肽段FFDYDFGSDER 的特征碎片离子1103.42576(y9)，m/z 825.33563(y7)，相应地，稳定同位素标记的内标(IS)肽段FFDYDFGSDER*的子离子图谱(MS/MS)中应含有碎片离子m/z 1113.43347(y9),m/z835.34383(y7)，且其精确质量数的误差应当小于5ppm。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的意蜂MRJP1含量可信，可以根据含量的高低鉴别蜂蜜质量。
通过UHPLC-Q Exactive plus提取的MRJP1的三种候选肽段的离子流图见图1。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的MRJP1的三种候选肽段的质谱图见图2。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的MRJP1的三种候选肽段的二级碎片质谱图见图3。
通过UHPLC-Q Exactive plus提取的同位素标记的内标(IS)肽段 FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的离子流图见图4。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的同位素标记的内标(IS)肽段 FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的质谱图见图5。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的同位素标记的内标(IS)肽段 FFDYDFGSDER*(R*-13C6,15N4)的二级碎片质谱图见图6。
实施例2蜂蜜掺假的定量检测
1、样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的蜂蜜样本以及糖浆。
2、实验步骤
(1)溶液配制
同实施例1。
(2)蜂蜜的混掺：按不同比例向蜂蜜中掺入糖浆。
向蜂蜜中按照5％、10％、20％、50％、80％的比例掺入糖浆。
(3)蜂蜜样本的前处理
①准确称取待测蜂蜜10g至50mL离心管中，加入10mL去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000rpm，4℃离心10min。收集上清液于新的2mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200μL，加入800μL 40mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100μL 30mM DTT溶液，在室温反应60min，然后再加入500μL 100mM IAA 溶液在室温下暗反应60min。
③每个样品中加入30μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
(4)蜂蜜样本的质谱分析
使用1290Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测。
(5)蜂蜜样本的数据处理
从质谱数据中提取特征肽段的质荷比，以m/z 699.28586的峰面积作为对比依据。结果如图7所示，结果表明本发明能够检测出掺入糖浆为5％以上的蜂蜜掺假现象。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法
<130> KHP191113030.9
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 1
Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 432
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 2
Met Thr Arg Leu Phe Met Leu Val Cys Leu Gly Ile Val Cys Gln Gly
1 5 10 15
Thr Thr Gly Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro
20 25 30
Ile Leu His Glu Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu
35 40 45
Arg Arg Gln Asp Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Lys Asn Asn
50 55 60
Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Gln Trp His Asp Lys Ile Phe Val Thr Met
65 70 75 80
Leu Arg Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys
85 90 95
Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe
100 105 110
Ala Lys Tyr Asp Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Ser Lys Leu Ala
115 120 125
Ile Asp Lys Cys Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn
130 135 140
Asn Thr Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr
145 150 155 160
Thr Ser Gln Leu Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val
165 170 175
Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Ser
180 185 190
Leu Asp Cys Asn Thr Asn Ser Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Gly Leu Ile Val Tyr His Asn Ser Asp Asp Ser Phe His
210 215 220
Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met
225 230 235 240
Thr Ile Asp Gly Glu Ser Tyr Thr Ala Gln Asp Gly Ile Ser Gly Met
245 250 255
Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser
260 265 270
Thr Ser Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asp Tyr
275 280 285
Gln Gln Asn Asp Ile His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr
290 295 300
Gln Ser Ser Ala Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Thr Leu
325 330 335
Glu Arg His Asn Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln
340 345 350
Met Ile Ala Ser Met Lys Ile Lys Glu Ala Leu Pro His Val Pro Ile
355 360 365
Phe Asp Arg Tyr Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Lys
370 375 380
Met Gln Lys Met Val Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe
385 390 395 400
Arg Ile Met Asn Ala Asn Val Asn Glu Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys
405 410 415
Glu Asn Pro Asp Asn Asp Arg Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu
420 425 430

Claims (8)

1.利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取标准意蜂蜂蜜样品中的蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，将MRJP1蛋白对应的条带切胶回收，然后酶解MRJP1蛋白，酶解产物除盐后，用0.1％v/v的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；
B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出MRJP1蛋白的特征肽段并测序，然后人工合成所述特征肽段及其稳定同位素内标肽段；
C、配制不同浓度的所述特征肽段的标准品溶液；
D、向标准品溶液中加入稳定同位素内标肽段混匀，然后进行液相色谱串联质谱检测；
E、根据标准品溶液的浓度以及特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比绘制标准曲线；
F、对待测蜂蜜样品进行前处理：先将蜂蜜样品溶解于水或PBS缓冲溶液中，利用超滤法提取蜂蜜中的蛋白质；将蛋白溶液用胰蛋白酶水解，酶解产物除盐后作为待测样本；
G、用待测样本替代步骤D中的标准品溶液，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
H、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对蜂蜜样品中意蜂MRJP1蛋白的定量检测；
其中，所述特征肽段为：FFDYDFGSDER。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括以下子步骤：
a1、蜂蜜中蛋白质的提取：将蜂蜜与去离子水或PBS缓冲溶液按照1:1体积比溶解，离心10min，收集上清液至10KD分子通量的超滤管中，以5000g离心力离心，使蛋白溶液浓缩至最小体积，然后收集上清液，作为蛋白提取液，并测定提取液中总蛋白浓度；
a2、蛋白质的SDS-PAGE分析：将蛋白提取液进行SDS-PAGE分析，用12％浓缩胶和10％分离胶将MRJP1与其它蛋白分离，然后用考马斯蓝染色；
a3、MRJP1蛋白的酶解：从电泳凝胶上切下MRJP1蛋白对应的条带，置于离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色；弃去脱色液并加入乙腈使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其均匀反应，吸走乙腈并蒸发浓缩干燥；然后加入100mM DTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min，吸干多余的DTT，再加入100mM IAA溶液在室温下暗反应60min；吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mM NH4HCO3溶解的胰蛋白酶浸没胶条，37℃酶切过夜，其中，胰蛋白酶与MRJP1蛋白的质量比为1:50；然后加入0.1％v/v甲酸水溶液终止酶切反应，加入含0.1％v/v甲酸的70％v/v乙腈水溶液浸没胶条进行萃取，静置10-20min，将萃取液转移至新的离心管中，重复一次萃取，合并两次萃取液，除盐后将样品进行真空干燥，然后用0.1％v/v甲酸水溶液复溶，进行液相色谱串联质谱检测。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D和G中采用UHPLC-Q Exactive plus进行液相色谱串联质谱检测；
(1)液相色谱条件如下：
色谱柱：为C18柱；
流动相组成：流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为含0.1％v/v甲酸的乙腈；
梯度洗脱条件为：0-0.5min，5％的B；0.5-1.0min，5-15％的B；1.0-6.5min，15-40％的B；6.5-7.0min，40-95％的B；7.0-8.5min，95％的B；8.5-8.6min，95-5％B，8.6-10.0min，5％的B；
流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL；
(2)质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速38；辅助气的流速15；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.2KV；离子导管的温度275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380℃；
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：
其中，Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：200-1500Da；Spectrum data：Centroid；Inclusion：on；
dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500，AGC Target：1e5；Maximum IT：50ms；Loopcount：2；Isolation window：2.0Da；NCE：15，25，35；Spectrum data：Centroid；而ddsettings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6s；Exclude isotope：on；Dynamicexclus：4.0s；If idle：pick other。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有699.28586的质荷比；子离子包含质荷比为1103.42576、825.33563的子离子。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：FFDYDFGSDER*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C6，氮置换为15N；
所述稳定同位素内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有704.28725的质荷比；子离子包含质荷比为1113.43347、835.34383的子离子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E得到的标准曲线为Y＝2.685e-3X-8.478e-2，R2＝0.9980，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；MRJP1蛋白的线性检测范围为5-1000ng/mL，最低检出限为2ng/mL。
7.用于液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中至少包括特征肽段标准品溶液和稳定同位素内标肽段溶液；
其中，所述特征肽段、稳定同位素内标肽段的定义同权利要求5中所述；
所述特征肽段标准品溶液的制备如下：取1mg特征肽段标准品，用500μL乙腈溶解，再加入500μL水混匀，即得；
所述稳定同位素内标肽段溶液的制备同所述特征肽段标准品溶液的制备。
8.权利要求1-6任一项所述方法或权利要求7所述试剂盒在蜂蜜的质量控制和真实性鉴定中的应用。
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