CN118146339A

CN118146339A - 意蜂mrjp1突变体及其作为内标蛋白在蜂产品分析中的应用

Info

Publication number: CN118146339A
Application number: CN202410588311.8A
Authority: CN
Inventors: 胡菡; 刘西子; 赵文; 王鹏; 常硕; 金玥; 张金振; 刘然; 薛晓锋
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Filing date: 2024-05-13
Publication date: 2024-06-07

Abstract

本发明公开了意蜂MRJP1突变体及其作为内标蛋白在蜂产品分析中的应用。本发明通过对多种蜂蜜、蜂王浆中蛋白质组学研究，发现蜂王浆主蛋白1在这两类蜂产品中的含量均较高，且稳定存在；通过序列比对、蛋白质酶切后上机、数据分析等，针对其中检出效率高、仪器响应强的检出肽段，进行针对性氨基酸位点突变，获得一条与天然MRJP1蛋白质序列相似，且在自然环境中不存在一样序列的重组MRJP1蛋白质突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，可作为内标蛋白直接添加到样品中一起进行前处理，可实现对实验步骤的评估，计算回收率，从而实现对蜂产品中的各种蛋白质含量进行准确定量分析或对蜂产品的蜜蜂蜂种进行辨别分析。

Description

意蜂MRJP1突变体及其作为内标蛋白在蜂产品分析中的应用

技术领域

本发明涉及蜂王浆主蛋白1（MRJP1）的突变体，尤其涉及意蜂MRJP1突变体及其在峰产品蜜蜂蜂种辨别分析或对各种蛋白质含量进行定量分析中的应用，属于蜂王浆主蛋白1（MRJP1）的突变体及其应用领域。

背景技术

蜜蜂中的蛋白质主要是在蜜蜂采集花蜜存入蜜囊和酿蜜的过程中混入蜂蜜中的，因此，蜂蜜中的蛋白质主要来源于采集者。利用蜜蜂蛋白质序列差异辨别蜂种的方法已多有报道，其中利用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法在辨别不同蜂种的蜂蜜，例如中华蜜蜂蜂蜜（中蜂，中蜂蜜）、意大利蜜蜂蜂蜜（意蜂，意蜂蜜）、无刺蜂蜂蜜等以及蜂王浆中蛋白质含量测定中均有应用。但采用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法存在蛋白质的提取、烷基化、酶切和纯化过程复程序繁多、且涉及多个反应等问题，但目前蛋白质的提取效率、酶切程度、纯化时回收率均无法评估，因而限定了LC-MS/MS方法在峰产品蜜蜂蜂种辨别分析实际检测过程中的应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供意蜂MRJP1突变体。

本发明的目的之二是将所述的意蜂MRJP1突变体作为内标蛋白应用于对蜂产品的蜜蜂蜂种进行辨别分析或者作为内标蛋白应用于对蜂产品中各种蛋白质含量进行定量分析。

为了实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

本发明的一方面是提供了意蜂MRJP1突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明根据正常的意蜂（Apismellifera）蛋白质（SEQ ID No.2）和正常的中蜂（Apiscerana）蛋白质序列（SEQID No.14），采用PEAKS 8.5软件对蛋白质序列进行计算和搜库比对，通过对多种蜂蜜样品进行肽段检测和数据库比对分析，分别挑选出来7条中蜂和意蜂特异性肽段，将这7条肽段放置到NCBI网站上进行protein-protein的BLAST比对，证明这7条肽段与分别是所属蛋白质的特殊肽段，采用软件对这7条肽段的二级质谱图进行提取分别得到二级谱图，在蜂蜜中发现丰度相对较高的蛋白质。基于蜂蜜中蛋白质的鉴定结果，蜂王浆主蛋白1（MRJP1）在中、意蜂蜜中含量均相对较高，在10种蜂蜜种均检出，且存在稳定，因此，选择意蜂MRJP1作为参比蛋白进行位点突变，意蜂MRJP1突变后的氨基酸序列为SEQID No.1所示，突变后的氨基酸序列与原序列相比，去掉了跨膜区域，亲水性更好。

意蜂MRJP1突变后的氨基酸序列编码432个氨基酸，无跨膜区，1-19aa为信号肽序列，局部亲水性较好，预计表达蛋白不可溶，因此，本发明选取突变后的氨基酸中的20-432aa氨基酸序列（SEQ ID No.1）连接亲水标签表达重组蛋白；经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析和结构域分析，最终确定氨基酸序列在大肠杆菌中进行表达制备意蜂MRJP1重组蛋白质。

本发明的另一方面是提供了表达意蜂MRJP1突变体的重组大肠杆菌，其微生物保藏编号是CCTCC NO：M 20221586；其分类命名是：Escherichia coli rMRJP1；其保藏时间是2022年10月17日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉武汉大学。

本发明进一步提供了意蜂MRJP1突变后的特征性肽段作为检测内标，可实现对实验步骤的评估，计算回收率，用于鉴定中蜂蜜中是否掺入意蜂蜜，其氨基酸序列选自SEQ IDNo.10- SEQ ID No.13所示氨基酸序列中的任何一种。

本发明的再一方面是将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的意蜂MRJP1突变体或氨基酸序列选自SEQ ID No.10- SEQ ID No.13所示氨基酸序列中的任何一种的特征性肽段应用于鉴定中蜂蜜中掺入意蜂蜜。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的应用包括：（1）提取待检测的中蜂蜜样品的蛋白质；（2）将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的意蜂MRJP1突变体作为内标蛋白加入到提取的待检测的中蜂蜜样品的蛋白质中；用蛋白质胰酶酶切后采用串联液相色谱质谱法检测特异性目标肽段；（3）以SEQ ID No.10- SEQ ID No.13中的任何一种氨基酸序列所示的肽段母离子的蜂面积作为对照指标，对待检测的中蜂蜜样品中特异性目标肽段的蜂面积进行校正；如果待检测的中蜂蜜样品中只检测到SEQ ID No.6- SEQ ID No.9（pC1-pC4）中任意两条或两条以上肽段的样品，则判定待检测的中蜂蜜样品是“中蜂蜜中未掺入意蜂蜜”；若检测到SEQ ID No.6- SEQID No.9（pC1-pC4）两条或两条以上以及SEQ ID No.3- SEQ IDNo.5 （pM1-pM3）中任意中一条肽段，则判定待检测的中蜂蜜样品是“中蜂蜜中掺入意蜂蜜”；若未检测到SEQ ID No.6- SEQID No.9（pC1-pC4）中的任何一条肽段，而检测到SEQ IDNo.3- SEQ ID No.5（pM1-pM3）中任意两条肽段，则判定待检测的中蜂蜜样品是“意蜂蜜”。

其中，所述的特异性目标肽段选自SEQ ID No.3- SEQ ID No.5中的任何一种氨基酸序列，或者所述的特异性目标肽段选自SEQ ID No.6- SEQ ID No.9中的任何一种氨基酸序列。

本发明通过对多种蜂蜜、蜂王浆中蛋白质组学研究，发现蜂王浆主蛋白1（MRJP1）在这两类蜂产品中的含量均较高，且稳定存在；通过序列比对、蛋白质酶切后上机、数据分析等，针对其中检出效率高、仪器响应强的检出肽段，进行针对性氨基酸的相对应DNA序列位点进行突变，利用大肠杆菌重组表达，获得一条与天然MRJP1蛋白质序列相似，但又不完全一致，且在自然环境中不存在一样序列的重组MRJP1蛋白质突变体（rMRJP1），该蛋白质可作为内标蛋白直接添加到样品中，一起进行前处理，最终通过仪器检测到rMRJP1特异性肽段的仪器信号强度与稳定同位素标记的该特异性肽段标准溶液的仪器信号强度，可实现对实验步骤的评估，计算回收率，从而实现对蜂产品中的各种蛋白质含量进行准确定量分析或对蜂产品的蜜蜂蜂种进行辨别分析。

附图说明

图1为pM1号肽段IVNDDFNFDDVNFR的质谱二级碎裂图。

图2为pM2号肽段IMNANVNELILNTR的质谱二级碎裂图。

图3为pM3号肽段SLPILHEWK的质谱二级碎裂图。

图4为pC1号肽段IVNNDFNFNDVNFR的序列比对结果。

图5为pC2号肽段TSNYEQNAVHYEGVQNILDTQSSAK的序列比对结果。

图6为pC3号肽段LVDFLDDLVAVGVAGFR的序列比对结果。

图7为pC4号肽段SLSVLHEWK的质谱二级碎裂图。

图8为大量表达的菌体破碎上清及沉淀SDS-PAGE电泳图；泳道M：蛋白分子量标准（116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4kDa）；Lane 1：诱导表达破碎后的上清蛋白；Lane 2：诱导表达破碎后的不溶蛋白；（箭头所指为重组蛋白）。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组MRJP1蛋白质（rMRJP1）的筛选、突变以及表达

一、特异性肽段的选取

从NCBI网站下载意蜂（Apismellifera）和中蜂（Apiscerana）蛋白质序列，采用PEAKS 8.5软件进行对质谱下机数据进行计算和搜库比对。参数设置如下：先进行从头测序（De novo）计算，酶选择Tryspin；固定修饰选择Carbamidomethyl；可变修饰选择Oxidation；母离子质量数误差范围为20.0 ppm；碎片离子误差范围为0.05 Da；每条肽段最多允许有2个漏切位点；每个肽段最多允许有3种翻译后修饰；搜库完成后，采用假阳性率（FDR）≤1.0 %及鉴定到的蛋白中特有肽段（unique peptide）≥1这两个条件对搜库结果进行筛选。

对蜂蜜样品S1-S10进行肽段检测和数据库比对分析，分别挑选出来中蜂和意蜂特异性肽段如下表1：

表1 挑选出的7条特异性肽段的氨基酸序列有关信息

将表1中的这7条肽段放置到NCBI网站上进行protein-protein的BLAST比对，均证明这7条肽段分别为所属蛋白质的特殊肽段。

采用软件对样品中这7条肽段的二级质谱图进行提取，检测得到的这7条肽段的二级谱图分别见图1-图7。

二、重组蛋白质的挑选

在意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜中鉴定到丰度相对较高的蛋白质分别见表2和表3。

表2为中蜂蜜中鉴定到主要蛋白质列表

表3为意蜂蜜中鉴定到主要蛋白质列表

鉴于蜂蜜中蛋白质的鉴定结果，蜂王浆主蛋白1（MRJP1）在中、意蜂蜜中含量均相对较高，在10种蜂蜜中均检出，且存在稳定，因此，选择意蜂MRJP1作为参比蛋白进行位点突变，使用大肠杆菌进行重组。意蜂MRJP1突变后的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，突变后的氨基酸序列与原序列相比，去掉了跨膜区域，亲水性更好。

三、大肠杆菌重组蛋白质的表达与纯化

1基因的序列分析以及抗原序列的选择

意蜂MRJP1突变后的氨基酸序列编码432个氨基酸，无跨膜区，1-19aa为信号肽序列，局部亲水性较好，预计表达蛋白不可溶，选取SEQ ID No.1的20-432aa（SEQID No.2）连接亲水标签表达重组蛋白。

经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析和结构域分析，最终确定氨基酸序列在大肠杆菌中进行表达制备意蜂MRJP1重组蛋白质。

2蛋白质的制备和纯化

2.1重组质粒的构建及小量表达

设计引物，构建大肠PET-28a（标签大小约4kD）的表达载体或pet-sumo（18kD）促溶载体，构建完成后，测序结果100%正确无突变，进入小试验证，尽量通过助溶标签和温度诱导的方案实现分泌表达。

2.2大量表达及蛋白纯化

选择最佳的载体进行扩大，首先采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和Ni-NTA纯化介质把螯合剂（氮川三乙酸或NTA）共价偶联到琼脂糖介质（4%交联）上，然后再螯合Ni²⁺制备而成。NTA能够通过四个位点牢固的螯合Ni²⁺从而减少纯化过程中Ni²⁺泄露到蛋白样品中。

主要步骤：将Ni-NTA 树脂装入合适的层析柱，用 10 倍柱床体积的 NTA-0Buffer冲洗；将样品加到层析柱中，流速控制在0.5 mL/min左右，收集穿透部分；层析用10倍柱床体积的NTA-0 Buffer 冲洗，流速控制在1 mL/min小时左右；分别用10倍柱床体积的NTA-20，NTA-60，NTA-200，NTA-500 Buffer洗脱（注：分别为NTA-0溶液含咪唑20 mmol/L、60mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L），流速控制在1 mL/min左右，收集各洗脱峰。

3蛋白质纯度检测

洗脱后的蛋白质溶液置于透析带中，4 °C以1×PBS透析（换液2次），4 °C超滤浓缩透析产物。检测溶液中蛋白质的浓度，浓度在1mg/mL的情况下，SDS-PAGE验证蛋白质纯度在85%以上，再进行蛋白质的酶切和质谱检测（参考以下试验例1中的有关酶切和质谱检测）。

3.1大量表达及破菌SDS-PAGE检测

将大肠杆菌大量表达后，将菌体破碎后的上清和沉淀蛋白质分别进行SDS-PAGE检测，检测结果见图8，重组目标蛋白在包涵体蛋白中。

3.2纯化蛋白SDS-PAGE检测

重组蛋白在大肠杆菌中重组表达后，放大摇菌体积，进行重组蛋白质纯化，测得蛋白浓度为2 mg/mL，分子量大小为49Kd，纯度为90%。

4重组蛋白质的质谱检测

将上述获得的重组rMRJP1蛋白酶切和纯化后（参考试验例1中的有关酶切和质谱检测），进行质谱检测，检测到肽段如下表4。

表4 重组蛋白特异性肽段的定性子离子

结合离子响应强度及特异性结果，最后选取特征性肽段pR1“EALPGVPIFDR”和pR4“LLTFDASTSQLLK”作为优先定量检测的内标。

试验例1 应用重组rMRJP1为内标，采用串联液相色谱质谱方法判定中蜂蜜中是否混入意蜂蜜的验证试验

在中蜂蜜样品种分别添加5%、10%、30%和50%的意蜂蜜，应用重组rMRJP1蛋白质作为内标加入蜂蜜样品。提取蜂蜜样品中蛋白质，以rMRJP1蛋白质为参比品，蛋白质胰酶酶切后采用串联液相色谱质谱法检测特异性目标肽段（pC1-pC4、pM1-pM3、pR1-pR4）。以pR1肽段母离子的蜂面积作为对照指标（也可选择pR2-pR4中任意一条），检测各样品处理的平行性，同时对样品中特定肽段的蜂面积进行校正。若样品中只检测到pC1-pC4中任意两条及两条以上肽段的样品，认为是“中蜂蜜中未掺入意蜂蜜”；若检测到两条及两条以上pC1-pC4以及任意pM1-pM3中一条肽段，则认为是“中蜂蜜中掺入意蜂蜜”；若未检测pC1-pC4，而检测到pM1-pM3中任意两条肽段，则认为是“意蜂蜜”。

1试验方法

1.1蜂蜜样品的选取

为了验证rMRJP1作为内标法的效果，选取了20个样品进行方法学验证，20个样品的具体信息见表5。

表5 20个待检测蜂蜜样品的具体信息

表5中S28、S29、S30和S31号样品为中、意蜂蜜的混合样品（意蜂蜜含量分别为5%、10%、30%和50%），用于考察本方法的最低检出限。S28、S29、S30和S31的测定重复了两次，分别用两组蜂蜜按比例进行的混合（S11和S20，S13和S23）。

1.2蜜蜂蛋白质提取

称取5 g蜂蜜于50 mL离心管中，加入25 μL内标工作液（rMRJP1含量为10 μg/μL），加入3 mL水，振荡5 min充分溶解，加入20 mL预冷的10%三氯乙酸（TCA）丙酮溶液，振荡5min混匀，-20℃ 沉淀>2 h；8000 rpm，4 ℃离心，弃上清；加入10 mL预冷的20%TCA水溶液，振荡5 min混匀；8000 rpm，4 ℃离心，弃上清；加入10 mL丙酮清洗沉淀，8000 rpm，4 ℃离心弃上清；放置2-3 min使丙酮挥发；加入1.0 mL 5 M尿素，涡旋振荡10 min溶解蛋白质沉淀；8000 rpm，4 ℃离心，取上清蛋白质溶液到新的1.5 mL离心管中，采用brandford试剂盒检测蛋白质浓度。试样溶液-20 ℃存放。

1.3串联液相色谱质谱联用方法检测蛋白质

取100 μL 5M尿素溶解的1.2中所提取的蛋白质溶液（>200 μg），取100 μL 5M尿素溶解的rMRJP1参比品蛋白质溶液（浓度为1 μg/μL），分别加400 μL的40 mM的碳酸氢铵溶液混合均匀，加入50 μL的0.1 M的二硫苏糖醇（DTT）溶液，37 ℃反应60 min，再加入250 μL的50 mM的碘乙酰胺（IAA）溶液，避光室温反应40 min，加入10 μL 0.2 μg/μL的胰酶溶液，37℃反应酶切过夜，加入1.0 μL的甲酸溶液终止反应，得到酶切后的多肽溶液，将此多肽溶液通过Agilent Bond Elut C18柱子（Agilent, 12102025）除盐。

C18柱子先用1 mL纯乙腈溶液活化，依次分别加入1 mL的75 %乙腈的0.1 %甲酸水溶液和0.1 %甲酸水溶液平衡，再加入上面约1 mL的多肽溶液，将多肽吸附到C18小柱上，加入1 mL的0.1 %甲酸水溶液洗脱盐，再加入1 mL的75 %乙腈的0.1 %甲酸水溶液洗脱肽段，将最终的洗脱液冷冻干燥。干燥后的多肽，加入50 μL的0.1 %甲酸水溶液复溶后等待上机。

采用液相色谱系统UPLC3000（Thermo Fisher Scientific）通过电喷雾源与质谱Q-Exactive plus（QEplus，Thermo FisherScientific）串联仪器方法进行肽段鉴定。

色谱条件为：分析柱型号ES-C₁₈（160 Å，2.1 mm×50 mm，2 μm），以0.1 %甲酸水溶液为流动相A，以乙腈/0.1 %甲酸水溶液为流动相B，进样量5 μL，流速0.3 μL/min；按表6的梯度洗脱程序进行洗脱。

表6 梯度洗脱程序

质谱条件为：采用了两种方法进行实验。首先采用FullMS-MS/MS采集所有肽段信息：以数据依赖模式收集离子信号；母离子扫描分辨率为70, 000，400 m/z，质荷比范围为200-2000 m/z，对丰度最高前10个母离子碎片离子通过高能碰撞诱导解离模式，MS/MS扫描分辨率为17, 500，碰撞能为30，动态剔除（带电荷为1或者＞8的剔除；动态剔除：30 s）。在选择特定肽段（pC4-pC7或pM1-3）进行定量后，采用FullMS-PRM方法进行确定肽段离子的定性和定量：数据采集模式及参数与全扫模式基本一致，在inclusion信息部分填入目标肽段准确的m/z值。质谱部分通过Xcalibur软件（版本2.2，Thermo FisherScientific）收集MS/MS数据并保存为Raw文件。

1.4数据处理

各样品中pR1的母离子响应强度分别计为I₁-I_i，通过I值监测各样品前处理的平行性，同时，可通过I值将各样品之间的目标测量值进行均一化处理。采用Xcalibur软件QualBrower程序，通过pR1肽段的m/Z值和出峰时间、蜂面积和参比品含量设置定量程序，导入样品序列，对全部样品进行定量处理，即可得到定量结果。

2实验结果

定性检测中蜂蜜中是否含有意蜂蜜：将试样S28-S31按1.2方法进行蛋白质提取，按1.3方法进行前处理和质谱检测，通过样品中特征性肽段pC4-pC7，pM1-3的检出及信号强度定性判断中蜂蜜中是否掺有意蜂蜜。参比品和样品中内标肽段pR1信号强度及各样品校正因子见表7，样品中各目标肽段校正前、后结果见表8。

表7 内标肽段在各样品中的信号强度及校正因子

表8 试样中特征离子的信号强度

注：ND表示未检测到。

由表7和表8可看出，中蜂蜜中掺入5%的意蜂蜜后，意蜂特征性肽段pM1-pM3出现了部分检出的情况，即不能全部稳定检出。而中蜂蜜中掺入10%的意蜂蜜后，意蜂特征性肽段pM1-pM3均能稳定检出，母离子响应值也较高；且pM1-pM3的母离子的响应值随掺入意蜂蜜质量的增加（10%、30%和50%）而梯度升高，即掺入意蜂蜜含量越高，母离子响应值越高。

此外，校正因子“pR1”的引入，显著降低了两个样品测量值之间的相对标准偏差（RSD）。校正前，各样品测量值的RSD分别为9.31%~54.53%，一半以上的数据超过30%；校正后，各样品测量值的RSD%分别为2.59%~44.85%，只有一个数据的RSD%超过30%，为44.85%。由此可见，rMRJP1作为内标的引入能够较好的评估样品前处理和上机过程的效率和准确性，能够确保检测结果的可靠性。

从样品S11-S27中，分三次选取中、意蜂蜜，进行10%意蜂蜜添加实验，每次选取中蜂蜜1个，意蜂蜜3个，添加成为3个试验样品。三次的实验结果如表9所示：

表9 中蜂蜜中添加10%意蜂蜜检测结果

注：“√”为能够正确检测；“×”为未能检出。

由表9结果可见，三轮实验结果均较为稳定，10%的添加样品均可稳定检出。因此，采用本发明建立的方法可以检测中蜂蜜掺入10%及以上意蜂蜜的样品。

Claims

1.意蜂MRJP1的突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的意蜂MRJP1的突变体作为内标蛋白对蜂产品中的各种蛋白质含量进行定量分析中的应用。

3.权利要求1所述的意蜂MRJP1的突变体作为内标蛋白对蜂产品的蜜蜂蜂种辨别分析中的应用。

4.表达权利要求1所述意蜂MRJP1突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，其微生物保藏编号是CCTCC NO：M20221586。

5.权利要求4所述的重组大肠杆菌在制备内标蛋白对蜂产品中的各种蛋白质含量进行定量分析或对蜂产品的蜜蜂蜂种辨别分析中的应用。

6.用于鉴定中蜂蜜中是否掺入意蜂蜜的特征性肽段，其特征在于，所述特征性肽段的氨基酸序列选自SEQ ID No.10- SEQ ID No.13所示氨基酸序列中的任何一种。

7.权利要求6所述的特征性肽段在对蜂产品的蜜蜂蜂种辨别分析中的应用。

8.一种检测中蜂蜜样品中是否掺入意蜂蜜的方法，其特征在于，包括：

（1）提取待检测的中蜂蜜样品的蛋白质；（2）将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的意蜂MRJP1突变体作为内标蛋白加入到提取的待检测的中蜂蜜样品的蛋白质中，用蛋白质胰酶酶切后采用串联液相色谱质谱法检测特异性目标肽段；（3）以SEQ ID No.10- SEQ IDNo.13中的任何一种氨基酸序列所示的肽段母离子的蜂面积作为对照指标，对待检测的中蜂蜜样品中特异性目标肽段的蜂面积进行校正；如果待检测的中蜂蜜样品中只检测到SEQID No.6- SEQ ID No.9中任意两条或两条以上肽段的样品，则判定待检测的中蜂蜜样品是“中蜂蜜中未掺入意蜂蜜”；若检测到SEQ ID No.6- SEQ ID No.9两条或两条以上以及SEQID No.3- SEQ ID No.5中任意中一条肽段，则判定待检测的中蜂蜜样品是“中蜂蜜中掺入意蜂蜜”；若未检测到SEQ ID No.6- SEQ ID No.9中的任何一条肽段，检测到SEQ ID No.3-SEQ ID No.5中的任意两条肽段，则判定待检测的中蜂蜜样品是“意蜂蜜”。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的特异性目标肽段选自SEQ ID No.3-SEQ ID No.5所示氨基酸序列中的任何一种氨基酸序列，或者所述的特异性目标肽段选自SEQ ID No.6-SEQ ID No.9所示氨基酸序列中的任何一种氨基酸序列。