CN112898384B - 一种鹿角特征肽段及其检测方法 - Google Patents

一种鹿角特征肽段及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鹿角特征肽段及其检测方法，本发明通过大量实验筛选，以非标记多肽定量方法、主成分分析及含量比较法，筛选确定一个鹿角特征肽段Pep‑G，其氨基酸序列为：Gly‑Phe‑Hyp‑Gly‑Thr‑Hyp‑Gly‑Leu‑Hyp‑Gly‑Phe‑Lys，可用于区分鹿皮与鹿角。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。

Description

一种鹿角特征肽段及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种鹿角特征肽段，具体涉及可区分鹿皮胶与鹿角胶的特征肽段及其检测方法。
技术背景
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80%以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链（COL1A1）、I型胶原α2链（COL1A2）、II型胶原α1链（COL2A1）、III型胶原α1链（COL3A1）等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
鹿角胶与鹿皮胶均来源于梅花鹿或马鹿，两者为名贵胶类中药材，鹿角胶为梅花鹿或马鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，鹿皮胶为梅花鹿或马鹿的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，且两者均来源于梅花鹿或马鹿，其蛋白质组成相同，因此，通过寻找专属性肽段来区分两者基本不可能。
本发明筛选寻找特征肽段，在鹿皮胶与鹿角胶中的含量差异显著，可用于区分鹿皮胶与鹿角胶。
发明内容：
发明目的：本发明通过大量是实验筛选，研究确定1条鹿源肽段相对含量的比值，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鹿角特征肽段，该鹿角特征肽段可区分鹿角胶和鹿皮胶，所述的特征肽段为：
Pep-G:
Gly-Phe-Hyp-Gly-Thr-Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Phe-Lys
参比肽Pep-R：
Gly-Glu-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Gln-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Arg。
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其包括以下步骤：
（1）将Pep-G特征肽及参比肽Pep-R配成混合对照品溶液；
（2）将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）混合对照品溶液注入液质联用仪，以Pep-G特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：Pep-G：m/z 612.2（双电荷）→747.4、m/z 612.2（双电荷）→464.2；Pep-R：m/z 706.8（双电荷）→927.5、706.8（双电荷）→613.8；以Pep-G峰面积AG与Pep-R峰面积AR比值范围确定样品为鹿皮胶或鹿角胶。
作为优选方法，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品，加入磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，离心，取上清液，置于离心管中，以 PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入三氟乙酸溶液终止反应，离心，即得胶类药材酶解液，冷藏，备用。
作为更加优选方法，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10% 三氟乙酸溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
作为优选方法，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1%~10%。
作为优选方法，以上述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
作为优选方法，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm × 100 mm，上样量为2μl，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，流速0.3ml/min，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：Pep-G：m/z 612.2（双电荷）→747.4、m/z 612.2（双电荷）→464.2；Pep-R：m/z 706.8（双电荷）→927.5、m/z 706.8（双电荷）→613.8
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。
作为优选方法，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，鹿角胶的 AG/AR比值不得低于10.0，鹿皮胶的AG/AR比值不得高于1.0
有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过大量是实验筛选，研究确定1条鹿源肽段Pep-G与参比肽Pep-R相对含量的比值，并规定限度，来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。
附图说明
图1为LFQ肽段的散点图。
图2为Pep-G的质谱图。
图3为Pep-R的质谱图。
图4为Pep-G在鹿皮胶(DCG)与鹿角胶（DHG）中中含量。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种鹿源特征肽，所述的特征肽序列有2个，如序列表1：
Pep-G:
Gly-Phe-Hyp-Gly-Thr-Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Phe-Lys
参比肽（Pep-R）：
Gly-Glu-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Gln-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Arg。
实施例2 Pep-G、Pep-R的确定
取5批次鹿皮胶样品、5批次鹿角胶样品，每批次各取10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1ml 50 mM PBS稀释，加入1%胰蛋白酶（w/v），摇匀，37℃恒温酶解12 h，酶解后加入10% TFA溶液60 μl终止反应，Seppak C18脱盐处理，离心浓缩干燥，以纯水复溶，测定多肽浓度，再次离心浓缩干燥，置于-20℃保存，备用。
戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5 μm Reprosil C18AQ（75μm ×150 mm），LC-MS/MS质谱系统分析样品。用初始流动相复溶鹿皮胶与鹿角胶酶解样品，调整多肽浓度为1 μg/μl，上样2 μl，流速400 nL/min，流动相A（乙腈/甲酸/水=2/0.2/98，v/v/v），流动相B（乙腈/甲酸/水=80/0.2/20，v/v/v），2~30%B线性梯度洗脱120 min。Thermo Q-Exactive Orbitrap质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5 kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300~2000，分离宽度为3；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离（CID）二级串联质谱，每个样品重复进样1次。采用Xcalibur（3.0.63）软件进行数据采集。
串联质谱数据用PEAKS 8.5软件进行搜库分析，选择鹿胶原蛋白数据库搜索，检索参数设置为：前体离子误差10；子离子误差1；翻译后修饰（PTM）的设置参数为：脯氨酸的羟基化（+15.99）；天门冬酰胺与谷氨酰胺的脱酰胺（+0.98）；允许2个位点误切，假阳性率（FDR）≤1%；选择胰蛋白酶酶切（Trypsin），在上述检索条件下所得分值有显著性意义（P <0.05）被认定为有效的鉴定结果。
Label free定量（LFQ）通过比较提取离子色谱（XIC）和PEAK Studio 8.5计算峰面积，计算相对表达水平的变化。采集的LC-MS/MS数据首先通过软件进行校准。以其中一个样品为参照，以总离子流（TIC）对每一个鉴定肽的峰面积进行归一化，对鉴定肽的相对含量进行定量分析。
将肽段的LFQ结果以Fold change（FC）取log2为横坐标，显著性差异P值取−log10为纵坐标，作散点图，取FC > 3，P < 0.01的肽段为鹿皮胶与鹿角胶中显著变化的肽段。如图1所示，Pep-G为离散点，即在鹿皮胶与鹿角胶中含量差异大，且可用来区分鹿皮胶与鹿角胶。Pep-R的相对含量在鹿皮胶与鹿角胶中差异不明显。Pep-1、Pep-R的MS/MS图见图2、图3、。
实施例3 鹿皮胶与鹿角胶AG/AR的测定
取10批次鹿皮胶样品和10批次鹿角胶样品，每批次各取10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入1%胰蛋白酶（w/v），摇匀，37℃恒温酶解12 h，酶解后加入10%TFA溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得鹿皮胶和鹿角胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将上述10批次的鹿皮胶和鹿角胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1 μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱（2.1 μm × 100 mm），流速0.3ml/min，流动相A（乙腈），流动相B（0.1%甲酸），0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式（ESI+），质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
Pep-1：m/z 612.2（双电荷）→747.4，DP=104.98, CE=33.12；
Pep-R：m/z 706.8（双电荷）→927.5，DP=68.04, CE=40.07。
10个批次鹿角胶和鹿皮胶AG/AR数值见表1和图4，鹿角胶的AG/AR平均值为13.09± 2.93，鹿皮胶的AG/AR平均值为0.46 ± 0.08。
根据结果规定：鹿角胶的 AG/AR不得低于10.0，鹿皮胶的AG/AR不得高于1.0。
表1 鹿皮胶、鹿角胶的A1/AR、A 2/AR结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 一种鹿角特征肽段及其检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg
1 5 10 15

Claims (6)

1.一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段为：
Pep-G:
Gly-Phe-Hyp-Gly-Thr-Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Phe-Lys
参比肽Pep-R：
Gly-Glu-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Gln-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Arg；
将Pep-G特征肽段及参比肽Pep-R配成混合对照品溶液；
（2）将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）混合对照品溶液注入液质联用仪，以Pep-G特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：Pep-G：m/z 612.2双电荷→747.4、m/z 612.2双电荷→464.2；Pep-R：m/z 706.8双电荷→927.5、706.8双电荷→613.8；以Pep-G峰面积AG与Pep-R峰面积AR比值范围确定样品为鹿皮胶或鹿角胶；鹿角胶的 AG/AR比值不得低于10.0，鹿皮胶的AG/AR比值不得高于1.0；
所述的液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm ×100 mm，上样量为2μl，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，流速0.3ml/min，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱。
2.根据权利要求1所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测样品，加入磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，离心，取上清液，置于离心管中，以 PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入三氟乙酸溶液终止反应，离心，即得酶解液，冷藏，备用。
3.根据权利要求1所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测样品10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10% 三氟乙酸溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得酶解液，置于-20℃保存，备用。
4.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1%~10%。
5.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解或酶固定化酶解。
6.根据权利要求1所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。
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