CN112098578A - 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可区分鹿皮胶与鹿角胶的特征肽段及其检测方法，本发明通过大量实验筛选，以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，建立标准曲线方程为y=1.034x+0.0157，R²=0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，建立标准曲线方程为y=0.7883x+0.0949，R²=0.9905；鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。

Description

一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种鹿源特征肽段及其检测方法，具体涉及区分鹿皮胶与鹿角胶，以及鹿角胶中掺有鹿皮胶的样品、掺入鹿皮胶的比例的特征肽段和检测方法。
技术背景
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80％以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链(COL1A1)、I型胶原α2链(COL1A2)、II型胶原α1链(COL2A1)、III型胶原α1链(COL3A1)等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
鹿角胶与鹿皮胶均来源于梅花鹿或马鹿，两者为名贵胶类中药材，鹿角胶为梅花鹿或马鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，鹿皮胶为梅花鹿或马鹿的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。如何将鹿皮胶与鹿角胶进行区分，着实是胶类药材鉴定研究的难题，给鹿角胶与鹿皮胶鉴别，以及鹿角胶掺入鹿皮胶的伪品鉴别都带来了挑战。
鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，且两者均来源于梅花鹿或马鹿，其蛋白质组成相同，因此，通过寻找专属性肽段来区分两者基本不可能。
发明内容：
发明目的：本发明通过大量是实验筛选，研究确定3条鹿源肽段相对含量的比值，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段，其特征在于，所述的特征肽为：
肽1:
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽2：
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽3：
Gly-Asp-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的3个鹿源特征肽配成混合对照品溶液；
(2)将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)鹿源特征肽混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4、肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4进行检测、肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4进行检测；以肽1峰面积A肽1与肽3峰面积A肽3的比值或肽2峰面积A肽2与肽3峰面积A肽3的比值确定样品为鹿皮胶或是鹿角胶。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1％～10％。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z 864.0(三电荷)→535.4、m/z 858.7(三电荷)→527.4、m/z 845.4(三电荷)→507.4。
7、根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，鹿角胶的A肽1/A肽3不得低于1.0，A肽2/A肽3不得低于0.5，鹿皮胶的A肽1/A肽3不得高于0.2，A肽2/A肽3不得高于0.5。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，鹿皮胶与鹿角胶所含比例检测的标准曲线方程的建立：
将鹿角胶与鹿皮胶按0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的比例混合，将每批次混胶样品各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入质量浓度为1％胰蛋白酶，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用；
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1μm×100mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，建立标准曲线方程为y＝1.034x+0.0157，R2＝0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，建立标准曲线方程为y＝0.7883x+0.0949，R2＝0.9905；鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，可根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过大量是实验筛选，研究确定3条鹿源肽段相对含量的比值，并建立的线性方程，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。
附图说明
图1为鹿角胶在混合胶中占比与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值关系。
图2为肽1的质谱图。
图3为肽2的质谱图。
图4为肽3的质谱图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种鹿源特征肽，所述的特征肽序列有3个，如序列表1：
肽1:
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys；
肽2：
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys；
肽3：
Gly-Asp-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
实施例2鹿皮胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的测定
取10个批次市售鹿皮胶样品，每批次各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿皮胶药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
将上述10批次的鹿皮胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
10个批次鹿皮胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值见表1，A肽1/A肽3平均值为0.085±0.039，A肽2/A肽3平均值为0.186±0.099。
表1鹿皮胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3结果
Figure BDA0002661318120000041
实施例3鹿角胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的测定
取10个批次鹿角样品，按照2020版《中国药典》制备鹿角胶方法，获得鹿角胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，超声酶解10min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将10个批次的鹿角胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
10个批次鹿角胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值见表2，A肽1/A肽3平均值为1.659±0.453，A肽2/A肽3平均值为0.898±0.167。
表2鹿角胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3结果
Figure BDA0002661318120000051
实施例4不同比例鹿皮胶与鹿角胶混合样品中A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的测定
将鹿角胶与鹿皮胶按0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的比例混合，将每批次混胶样品各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用。
将不同比例混胶样品酶解液依次注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
不同比例混胶样品的A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值见表3，鹿角胶在混合胶中占比与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值关系如图1所示。以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，y＝1.034x+0.0157，R2＝0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，y＝0.7883x+0.0949，R2＝0.9905。表明鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，因此可根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
表3鹿角胶/鹿皮胶混合样品掺入比例与峰面积关系
Figure BDA0002661318120000061
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
<141> 2020-09-01
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Xaa Gly Ala Xaa Gly Pro Lys
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Pro Gly Ala Xaa Gly Pro Lys
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Asp Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys
20 25 30

Claims (8)

1.一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段，其特征在于，所述的特征肽为：
肽1:
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽2：
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽3：
Gly-Asp-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
2.一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的3个鹿源特征肽配成混合对照品溶液；
（2）将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）鹿源特征肽混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z 864.0（三电荷）→535.4、肽2：m/z 858.7（三电荷）→527.4进行检测、肽3：m/z 845.4（三电荷）→507.4进行检测；以肽1峰面积A肽1与肽3峰面积A肽3的比值或肽2峰面积A肽2与肽3峰面积A肽3的比值确定样品为鹿皮胶或是鹿角胶。
3.根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10% 三氟乙酸溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
4.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1%~10%。
5.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
6.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm × 100 mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z 864.0（三电荷）→535.4、m/z 858.7（三电荷）→527.4、m/z 845.4（三电荷）→507.4。
7. 根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，鹿角胶的 A肽1/A肽3不得低于1.0，A肽2/A肽3不得低于0.5，鹿皮胶的A肽1/A肽3不得高于0.2，A肽2/A肽3不得高于0.5。
8.根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，鹿皮胶与鹿角胶所含比例检测的标准曲线方程的建立：
将鹿角胶与鹿皮胶按0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的比例混合，将每批次混胶样品各取10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入质量浓度为1%胰蛋白酶，摇匀，微波酶解30 min，酶解后加入10% 三氟乙酸溶液60 μl终止反应，12000rpm离心20 min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用；
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1 μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1 μm × 100 mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱；
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0（三电荷）→535.4，DP=166.57, CE=33.95；
肽2：m/z 858.7（三电荷）→527.4，DP=160.35, CE=35.65；
肽3：m/z 845.4（三电荷）→507.4，DP=143.27, CE=31.50；
以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，建立标准曲线方程为y = 1.034x + 0.0157，R² = 0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，建立标准曲线方程为y = 0.7883x + 0.0949，R² = 0.9905；鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，可根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
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