CN113173972A - 用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法 - Google Patents

用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法，该特征肽段包括肽1:Gly‑Phe‑Hyp‑Gly‑Leu‑Pro‑Gly‑Pro‑Ser‑Gly‑Glu‑Hyp‑Gly‑Lys等4条肽段，如序列表1，本发明通过以肽4为参比，以肽1峰面积A肽1与肽4峰面积A肽4的比值或肽2峰面积A肽2与肽4峰面积A肽4的比值或肽3峰面积A肽3与肽4峰面积A肽4的比值用于鹿角或鹿皮配方颗粒的质量控制。本发明采用液相色谱‑串连质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测，鹿角胶特征肽能够辨识区分鹿角胶与鹿皮胶，该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。

Description

用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种鹿源特征肽段及其检测方法，具体涉及区分鹿角与鹿皮，以及鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品、食品的质量控制。
技术背景
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80％以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链(COL1A1)、I型胶原α2链(COL1A2)、II型胶原α1链(COL2A1)、III型胶原α1链(COL3A1)等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
鹿角与鹿皮均来源于梅花鹿或马鹿，以鹿角或鹿皮熬制的胶块均为名贵胶类中药材。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。如何将鹿皮胶与鹿角胶进行区分，着实是胶类药材鉴定研究的难题，给鹿角胶与鹿皮胶鉴别，以及鹿角胶掺入鹿皮胶的伪品鉴别都带来了挑战。
鹿角胶配方颗粒、鹿角配方颗粒，以鹿角胶为原料的药品、保健品、食品均经过复杂加工过程，如有鹿皮胶掺伪情况，仅从外观上难以辨别，且鹿角与鹿皮的蛋白质组成相同，现有的种属专属肽无法区分鹿角胶与鹿皮胶。
发明内容：
发明目的：本发明通过大量是实验筛选，研究确定4条鹿源肽段相对含量的比值，从而用来区分鹿角与鹿皮。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿角及其相关产品的质量控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段，所述的特征肽为：
肽1:
Gly-Phe-Hyp-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Lys
肽2：
Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Arg
肽3：
Gly-Glu-Met-Gly-Pro-Ala-Gly-Ile-Hyp-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Arg
肽4：
Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Thr-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Arg
一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，包括以下步骤：
(1)将上述肽1～肽4的4个鹿源特征肽配成混合对照品溶液；
(2)将待检测鹿角提取物与鹿皮提取物样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)肽1～肽4混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z 665.2(双电荷)→841.4、肽2：m/z 525.1(双电荷)→894.4进行检测、肽3：m/z 819.4(双电荷)→924.6、肽4：m/z 730.4(双电荷)→544.3进行检测；其中肽4为参比，以肽1峰面积A肽1与肽4峰面积A肽4的比值或肽2峰面积A肽2与肽4峰面积A肽4的比值或肽3峰面积A肽3与肽4峰面积A肽4的比值确定样品来源为鹿角或是鹿皮。
作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：取待检测样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角或鹿皮酶解液，置于-20℃保存，备用。
作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1％～10％。
作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z 612.2(双电荷)→747.4、m/z 871.4(三电荷)→726.4、m/z 808.9(双电荷)→892.4、m/z 596.8(双电荷)→518.7。
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 665.2(双电荷)→841.4，DP＝135.45,CE＝30.86；
肽2：m/z 525.1(双电荷)→894.4，DP＝133.61,CE＝32.47；
肽3：m/z 819.4(双电荷)→924.6，DP＝138.84,CE＝33.24；
肽4：m/z 730.4(双电荷)→544.3，DP＝141.97,CE＝33.19。
作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，
鹿角A肽1/A肽4平均值为3.62±0.34，A肽2/A肽4平均值为2.14±0.46，A肽3/A肽4平均值为3.19±0.65；
鹿皮胶A肽1/A肽4平均值为0.30±0.07，A肽2/A肽4平均值为0.09±0.01，A肽3/A肽4平均值为0.15±0.03。
作为优选方案，所述的鹿角或鹿皮配方颗粒包括鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品及食品等。
作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，包括鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品及食品等。
有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过大量是实验筛选，研究确定肽1～肽3共3条鹿源肽段与肽4的相对含量的比值，来区分鹿角与鹿皮。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿角与鹿角胶的质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。
附图说明
图1为肽1的质谱图。
图2为肽2的质谱图。
图3为肽3的质谱图。
图4为肽4的质谱图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段，所述的特征肽序列有4个，如序列表1：
肽1:
Gly-Phe-Hyp-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Lys
肽2：
Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Arg
肽3：
Gly-Glu-Met-Gly-Pro-Ala-Gly-Ile-Hyp-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Arg
肽4：
Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Thr-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Arg。
实施例2鹿角配方颗粒A肽1/A肽4、A肽2/A肽4、A肽3/A肽4的测定
取5个批次鹿角配方颗粒样品，每批次各取20mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角配方颗粒酶解液，置于-20℃保存，备用。
将上述5批次的鹿角配方颗粒酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 665.2(双电荷)→841.4，DP＝135.45,CE＝30.86；
肽2：m/z 525.1(双电荷)→894.4，DP＝133.61,CE＝32.47；
肽3：m/z 819.4(双电荷)→924.6，DP＝138.84,CE＝33.24；
肽4：m/z 730.4(双电荷)→544.3，DP＝141.97,CE＝33.19。
5个批次鹿角配方颗粒A肽1/A肽4、A肽2/A肽4、A肽3/A肽4的数值见表1，A肽1/A肽4平均值为3.62±0.34，A肽2/A肽4平均值为2.14±0.46，A肽3/A肽4平均值为3.19±0.65。
实施例3鹿皮胶A肽1/A肽4、A肽2/A肽4、A肽3/A肽4的测定
取5个批次鹿皮胶样品，每批次各取20mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿皮胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将上述5批次的鹿皮胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 665.2(双电荷)→841.4，DP＝135.45,CE＝30.86；
肽2：m/z 525.1(双电荷)→894.4，DP＝133.61,CE＝32.47；
肽3：m/z 819.4(双电荷)→924.6，DP＝138.84,CE＝33.24；
肽4：m/z 730.4(双电荷)→544.3，DP＝141.97,CE＝33.19。
5个批次鹿皮胶A肽1/A肽4、A肽2/A肽4、A肽3/A肽4的数值见表2，A肽1/A肽4平均值为0.30±0.07，A肽2/A肽4平均值为0.09±0.01，A肽3/A肽4平均值为0.15±0.03。
表1鹿角配方颗粒A肽1/A肽4、A肽2/A肽4、A肽3/A肽4的结果
Figure BDA0003029941170000041
Figure BDA0003029941170000051
表2鹿皮胶A肽1/A肽4、A肽2/A肽4、A肽3/A肽4的结果
Figure BDA0003029941170000052
序列表
<110> 江阴天江药业有限公司
南京中医药大学
<120> 用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法
<141> 2021-04-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Gly Pro Pro Gly Ala Gly Gly Pro Pro Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Arg

Claims (8)

1.一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段，其特征在于，所述的特征肽为：
肽1:
Gly-Phe-Hyp-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Lys
肽2：
Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Arg
肽3：
Gly-Glu-Met-Gly-Pro-Ala-Gly-Ile-Hyp-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Arg
肽4：
Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Thr-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Arg。
2.一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的4个鹿源特征肽配成混合对照品溶液；
(2)将待检测鹿角提取物与鹿皮提取物样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)肽1～肽4混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z 665.2(双电荷)→841.4、肽2：m/z 525.1(双电荷)→894.4进行检测、肽3：m/z 819.4(双电荷)→924.6、肽4：m/z 730.4(双电荷)→544.3进行检测；其中以肽4为参比，以肽1峰面积A肽1与肽4峰面积A肽4的比值或肽2峰面积A肽2与肽4峰面积A肽4的比值或肽3峰面积A肽3与肽4峰面积A肽4的比值确定样品来源为鹿角或是鹿皮。
3.根据权利要求2所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角或鹿皮酶解液，置于-20℃保存，备用。
4.根据权利要求3所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1％～10％。
5.根据权利要求3所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解或酶固定化酶解。
6.根据权利要求3所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z 612.2(双电荷)→747.4、m/z 871.4(三电荷)→726.4、m/z 808.9(双电荷)→892.4、m/z 596.8(双电荷)→518.7。
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 665.2(双电荷)→841.4，DP＝135.45,CE＝30.86；
肽2：m/z 525.1(双电荷)→894.4，DP＝133.61,CE＝32.47；
肽3：m/z 819.4(双电荷)→924.6，DP＝138.84,CE＝33.24；
肽4：m/z 730.4(双电荷)→544.3，DP＝141.97,CE＝33.19。
7.根据权利要求2所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，
鹿角中A肽1/A肽4平均值为3.62±0.34，A肽2/A肽4平均值为2.14±0.46，A肽3/A肽4平均值为3.19±0.65；
鹿皮胶中A肽1/A肽4平均值为0.30±0.07，A肽2/A肽4平均值为0.09±0.01，A肽3/A肽4平均值为0.15±0.03。
8.根据权利要求2所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，其特征在于，鹿角样品包括鹿角、鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品及食品。
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