CN113896770B

CN113896770B - 一种鳖甲特征肽段及其检测方法

Info

Publication number: CN113896770B
Application number: CN202111405406.4A
Authority: CN
Inventors: 刘睿; 陈盛君; 段金廒
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine; Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine; Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-11-24
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2041-11-24
Also published as: CN113896770A

Abstract

本发明公开了一种鳖甲特征肽段及其检测方法，本发明通过大量实验筛选，筛选出序列为Gly‑Leu‑Hyp‑Gly‑Gln‑Hyp‑Gly‑Asp‑Ser‑Gly‑Pro‑Ala‑Gly‑Lys的鳖甲特征肽，这条鳖甲特征肽具有很高的专属性，可用于鉴定含有鳖甲药材的药品。本发明提供的鳖甲特征肽的检测方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件，整个方法操作简单，判断准确，能准确区分鳖甲特征肽。本发明提供的鳖甲特征肽及其检测方法，有利于鳖甲药品的质量控制，对于含有鳖甲药品的质量保证具有重要的意义。

Description

一种鳖甲特征肽段及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种动物药的检测鉴别方法，具体涉及鳖甲特征肽段及其检测方法。

背景技术

鳖甲为鳖科动物鳖(Trionyxsinensis Wiegmann)的背甲，始载于《神农本草经》，谓之“主心腹症瘕坚积、寒热，去痞、息肉、阴蚀，痔(核)、恶肉。”鳖甲胶为鳖的背甲经煎煮、浓缩制成的固体胶块，鳖甲与鳖甲胶现收录于2020版《中国药典》中，通常用于阴虚发热，骨蒸劳热，阴虚阳亢，头晕目眩，虚风内动，经闭等症，是中医临床及中药制药行业的重要品种。现代药理研究表明鳖甲在抗炎、解热、治疗肝硬化、肝纤维化，调控癌细胞，免疫调节、抗血栓、增强免疫等方面具有良好效果。中医临床及中药制药行业将鳖甲及鳖甲胶应用于中成药：鳖甲煎丸、复方鳖甲软肝片、鳖甲育肝颗粒、龟鹿二仙膏等，在临床应用中均有较好疗效。鳖甲物质基础研究表明，蛋白质类、肽类、氨基酸类、甾醇类、核苷类、无机元素类等为其主要成分。鳖甲质量标准并不完善，鳖甲药材、鳖甲胶、复方鳖甲颗粒、含鳖甲的成方制剂缺少专属性鉴别、含量测定的方法，药材市场存在以其它胶类混售的现象。有研究表明基于COI序列的DNA条形码技术可用于鉴别鳖甲药材混伪品，但是中药高温提取过程会影响DNA的完整性，进而影响DNA条形码鉴定的准确性，相较于DNA分子，蛋白质、肽类成分的一级序列信息在高温提取条件下保存较好，以I型胶原(Type I Collagen)等蛋白质类成分为鳖甲、阿胶、黄明胶等胶类动物药重要物质基础。本发明通过检测鳖甲特征肽来检测鳖甲成分，该方法为鳖甲质量研究提供了参考与依据，有利于鳖甲及其制品质量标准进一步完善。

发明内容

本发明主要目的是针对上述存在的问题与不足，提供一种鳖甲特征肽及检测角类动物药中鳖甲特征肽的方法。本发明提供的鳖甲特征肽专属性强。提供的方法操作简单，灵敏度高，能准确鉴定角类动物药中是否含有鳖甲成分，为保证鳖甲及其制品的质量提供科学方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种鳖甲特征肽段，所述的特征肽序列如序列表1：

特征肽为：Gly-Leu-Hyp-Gly-Gln-Hyp-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys。

一种鳖甲特征肽的检测方法，包括以下步骤：

(1)将鳖甲特征肽配成对照品溶液；

(2)将待检测胶类动物药样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)鳖甲特征肽混合对照品溶液注入液质联用仪，以鳖甲特征肽为对照，采用多反应监测模式，选择的母离子为：m/z 635.3(双电荷)，进行检测；如果检测出上述离子对，且离子的保留时间与鳖甲特征肽对照品一致，其子离子与对照品的子离子一致，则所述待检测样品中含有鳖甲成分。

作为优选方案，以上所述的鳖甲特征肽的检测方法，所述的酶切方法如下进行：取待检测各个胶类动物药样品，各加入Tris-HCl缓冲液复溶，超声至完全溶解，取1000μg蛋白，加入Tris-HCl缓冲液稀释至1ml，加入胰蛋白酶，恒温水浴孵育，即得。

作为优选方案，以上所述的鳖甲特征肽的检测方法，所述的酶切方法如下进行：取待检测各个胶类动物药样品10mg，各加入5ml Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.8)复溶；超声30min促进完全溶解，BCA测定蛋白质含量，取1000μg蛋白，加入Tris-HCl缓冲液50mM Tris-HCl，pH＝8.8，稀释至1ml，加入在各个胶类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶20μl，37℃恒温水浴孵育12h，即得。

作为优选方案，以上所述的鳖甲特征肽的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C₁₈柱，规格为2.1μm×50mm，上样量为10μl，流速0.3ml/min，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为0.1％甲酸乙腈，0～3.5min，5～20％B线性梯度洗脱，3.5～4min，20～5％B线性梯度洗脱，4～6min，5％B等度洗脱；采用三重四极杆质谱，电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。

MRM模式的离子对为：m/z 635.3(双电荷)→801.1(DP＝42.00，CE＝34.36)、m/z635.3双电荷→516.2(DP＝58.00，CE＝45.09)。

作为优选方案，以上所述的鳖甲特征肽的检测方法，其特征在于，胶类动物药包括鳖甲胶、阿胶、黄明胶、新阿胶(猪皮胶)、鹿皮胶。

有益效果：本发明通过大量实验筛选，筛选出1条鳖甲特征肽，这1条鳖甲特征肽具有很高的专属性，可用于鉴定含有鳖甲药材的药品。

本发明提供的鳖甲特征肽的检测方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件。整个方法操作简单，判断准确，能准确区分鳖甲特征肽。本发明提供的鳖甲特征肽及其检测方法，有利于鳖甲药品的质量控制，对保证含有鳖甲药品的质量具有重要的意义。

附图说明

图1为鳖甲特征肽的XIC图；图中(A)为对照品；(B)为鳖甲胶；(C)为阿胶；(D)为黄明胶；(E)为猪皮胶；(F)为鹿皮胶。

图2为鳖甲特征肽的XIC图，图中(A)为对照品；(B)为鳖甲配方颗粒；(C)为鹿角配方颗粒。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种鳖甲特征肽段，所述的特征肽序列如序列表1：

特征肽为：Gly-Leu-Hyp-Gly-Gln-Hyp-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys。

实施例2各种胶类动物药中特征多肽的检测

(1)取鳖甲胶、阿胶、黄明胶、猪皮胶、鹿皮胶样品各10mg，各加入5ml Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.8)复溶；超声30min促进完全溶解，BCA测定蛋白质含量，取1000μg蛋白，加入Tris-HCl缓冲液50mM Tris-HCl，pH＝8.8)稀释至1ml，各个胶类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶20μl，37℃恒温水浴孵育12h，即得。得到各胶类样品酶解液。

(2)将实施例1所述的特征肽纯品配成200ng/ml浓度的特征肽对照品溶液1ml。

(3)将步骤(1)各角类酶解液与IAA处理过的步骤(2)特征肽对照品溶液，采用液质联用仪检测，液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱(2.1μm×50mm)，上样量为10μl，流速0.3ml/min，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为0.1％甲酸乙腈，0～3.5min，5～20％B线性梯度洗脱，3.5～4min，20～5％B线性梯度洗脱，4～6min，5％B等度洗脱。采用三重四极杆质谱，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。MRM模式的离子对为：m/z 635.3双电荷→801.1，DP＝42.00，CE＝34.36、m/z 635.3双电荷→516.2，DP＝58.00，CE＝45.09。

结果见图1(图中(A)为对照品；(B)为鳖甲胶；(C)为阿胶；(D)为黄明胶；(E)为猪皮胶；(F)为鹿皮胶)，鳖甲样品中可检测出与特征肽对照品溶液一致的离子峰，其它样品中均没有检出，说明本发明能特异性的检测鳖甲中的特征肽成分，从而与其它的胶类动物药进行区分。

实施例3鳖甲配方颗粒中特征多肽的检测

(1)取鳖甲配方颗粒、鹿角配方颗粒样品各10mg，各加入5ml Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8.8)复溶；超声30min促进完全溶解，BCA测定蛋白质含量，取1000μg蛋白，加入Tris-HCl缓冲液50mM Tris-HCl，pH＝8.8)稀释至1ml，加入在各个胶类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶20μl，37℃恒温水浴孵育12h，即得到各胶类样品酶解液。

(3)将步骤(1)各角类酶解液与IAA处理过的步骤(2)特征肽对照品溶液，采用液质联用仪检测，液相条件为：色谱柱为1.7μmWaters C18柱(2.1μm×50mm)，上样量为10μl，流速0.3ml/min，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为0.1％甲酸乙腈，0～3.5min，10～20％B线性梯度洗脱，3.5～4min，20～5％B线性梯度洗脱，4～6min，10％B等度洗脱。采用三重四极杆质谱，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。MRM模式的离子对为：m/z 635.3双电荷→801.1，DP＝42.00，CE＝34.36、m/z 635.3双电荷→516.2，DP＝58.00，CE＝45.09。

结果见图2(图中(A)为对照品；(B)为鳖甲颗粒；(C)为鹿角颗粒)，鳖甲样品中可检测出与特征肽对照品溶液一致的离子峰，鹿角样品中均没有检出，表明该方法也能用于检测与鉴别鳖甲水提液或配方颗粒等提取物，与其它的胶类、角质类动物药的提取物进行区分。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江阴天江药业有限公司

南京中医药大学

<120> 一种鳖甲特征肽段及其检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Gly Leu Xaa Gly Gln Xaa Gly Asp Ser Gly Pro Ala Gly Lys

1 5 10

Claims

1.一种鳖甲特征肽，其特征在于，所述的特征肽为：

Gly-Leu-Hyp-Gly-Gln-Hyp-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys。

2.一种鳖甲特征肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述的鳖甲特征肽配成对照品溶液；

（2）将待检测胶类动物药样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）鳖甲特征肽对照品溶液分别注入液质联用仪，以鳖甲特征肽为对照，采用多反应监测模式，离子对为：m/z 635.3双电荷→801.1，DP=42.00，CE=34.36、m/z 635.3双电荷→516.2，DP=58.00，CE=45.09；如果检测出上述离子对，且离子的保留时间与鳖甲特征肽对照品一致，则所述待检测样品中含有鳖甲成分；

液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7 μm Waters C₁₈柱，规格为2.1 μm × 50mm，上样量为10 μl，流速0.3 ml/min，流动相A为0.1 %甲酸，流动相B为0.1 %甲酸乙腈，0~3.5 min，5~20% B线性梯度洗脱，3.5~4 min，20~5% B线性梯度洗脱，4~6 min，5% B等度洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱参数为：离子源温度500 ℃；电离电压5500 V；脱溶剂温度500 ℃。

3.根据权利要求2所述的鳖甲特征肽的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测各个胶类动物药样品，各加入Tris-HCl缓冲液复溶，超声至完全溶解，取1000 μg蛋白，加入Tris-HCl缓冲液稀释，加入胰蛋白酶，恒温水浴孵育，即得。

4.根据权利要求3所述的鳖甲特征肽的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测各个胶类动物药样品10 mg，各加入5ml pH为8.8，浓度为50 mM的 Tris-HCl缓冲液，复溶；超声30 min促进完全溶解，BCA测定蛋白质含量，取1000 μg蛋白，加入 pH为8.8，浓度为50 mM的 Tris-HCl缓冲液稀释至1ml，各个胶类样品中分别加入0.1 μg/μl的胰蛋白酶20μl，37 ℃恒温水浴孵育12 h，即得。

5.根据权利要求2所述的鳖甲特征肽的检测方法，其特征在于，胶类动物药包括鳖甲胶、阿胶、黄明胶或鹿皮胶。