CN108333287A - 一种羚羊角粉的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析定量检测技术领域，特别涉及一种羚羊角粉中羚羊角的定量检测方法：待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取含有羚羊角肽的上清液；将上清液注入液相色谱‑质谱仪，选择定量离子对；根据线性关系计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角的含量。采用酶解并结合UPLC‑MS法，对羚羊角中特征肽进行了含量方法学研究，建立了羚羊角肽的专属性含量测定方法，填补了羚羊角粉的质量标准的空白，提高了羚羊角粉的质量控制水平；）该羚羊角中特征肽含量测定方法的建立，可以大大提高羚羊角粉的质量控制水平，确保羚羊角粉临床用药的有效性。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析定量检测技术领域，特别涉及一种羚羊角粉的定量检测方法。
背景技术
完整的羚羊角包括角壳和骨塞两部分，中医古方所使用的羚羊角均为羚羊角角壳，骨塞不能入药，加工成羚羊角粉时均需要除去骨塞，说明羚羊角角壳应为羚羊角的主要药效部位，故必须控制羚羊角粉中角壳的含量。为扩大药源及保护野生动物，从1995年版《中国药典》开始，规定羚羊角无需除去骨塞连同角壳一并入药，但没有严格控制羚羊角粉中角壳的含量。羚羊角肽（LYJT）来自羚羊角角壳部位，如果企业为降低生产成本大量使用廉价的骨塞代替角壳投料生产，就会导致羚羊角粉中羚羊角肽（LYJT）含量异常。
如果不对羚羊角粉中角壳的含量进行质量控制，则无法避免过度使用骨塞代替角壳生产羚羊角粉现象的产生，劣质羚羊角粉会严重影响其功效发挥，导致疗效降低，甚至无效。故非常有必要建立羚羊角粉中羚羊角肽（LYJT）的含量测定法。
CN106749599A公开了一种检测黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角中共有的角蛋白特征肽来确定羚羊角中是否掺假的方法。但其中只是提供了黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角中共有的角蛋白特征肽的检测离子对，没有记载羚羊角蛋白特征肽的检测离子对。
发明内容
2015年版《中国药典》中规定羚羊角为牛科动物赛加羚羊Saiga tatarica Linnaeus的角，猎取后锯取其角，晒干。羚羊角粉由羚羊角粉碎而成的细粉。现行的羚羊角粉标准中无主要成分角蛋白的含量控制指标，无法对本品质量进行评价，无法保证临床用药的疗效。为了解决以上现有技术中没有对羚羊角中主要成分角蛋白的定量检测方法的问题，本申请提供了一种羚羊角粉的含量检测方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种羚羊角粉的含量检测方法，包括以下步骤：
（1）待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取可能含有羚羊角肽的上清液；
（2）将上清液注入液相色谱-质谱仪，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z（三电荷） 697.66→1021.48、697.66→1181.49作为羚羊角肽的检测离子对，m/z（三电荷） 697.66→1021.48为定量离子对；
（3）提取离子697.66→1021.48色谱图，在保留时间5.24±0.2min处的色谱峰，在羚羊角肽进样浓度0.02528～2.528μg/ml范围内，以峰面积值为y，进样浓度为x，根据回归方程y= 15309x + 91.47，r = 0.9996，计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角肽的含量。
专属性的离子对来自专属性多肽的质谱响应信号，所以必须从成百上千种蛋白中找出羚羊角区别其它角的差异性氨基酸序列，而且该差异性序列必须稳定存在于不同批次的羚羊角中，通过优选角蛋白酶切酶，将获得的全部肽段通过超高分辨质谱仪检测，将获得的数据通过数据库比对，分析出不同角样品所含有的主要角蛋白及氨基酸序列，然后从复杂的蛋白中找出差异性的氨基酸序列及对应的多肽，并进一步判断序列是否会稳定出现，再根据软件预测出该特征性肽段的检测离子对，并将该离子对在低分辨率质谱仪上对多批次样品进行验证，从而进一步对专属性的离子对进行确认，所以，特定物质的离子对的选择，是一项非常有难度的工作,并且还要进一步定量检测，难度就更大了。
所述的方法，优选羚羊角肽检出限2.528ng/ml，定量限为12.64ng/ml。
所述的方法，优选胰蛋白酶酶解预处理操作如下：
待检样品经变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液处理后，放冷至室温，离心，上清液加入碘代乙酰胺溶液，避光反应，混匀，离心，上清液加入碳酸氢铵溶液和牛胰蛋白酶溶液，酶解，置90℃处理，取出放冷至室温，离心得上清液。
羚羊角的主要活性成分为角蛋白，而角蛋白不溶于水和有机溶剂。主要是因为角蛋白中含有丰富的胱氨酸,形成了大量二硫键, 且角蛋白分子主链间能形成氢键和离子键等空间联键，从而赋予了角蛋白紧密的结构,使其难溶于一般溶剂。为进行角蛋白的研究，需要破坏氢键，打开二硫键及其他化学键，同时不能破坏蛋白质的肽键。本实验采用高浓度(6mol/L)的盐酸胍破坏羚羊角角蛋白分子间的氢键，用二硫苏糖醇（DTT）将角蛋白分子中的二硫键打开，溶解角蛋白，用碘代乙酰胺（IAA）保护巯基，最后加入胰蛋白酶酶解，获得羚羊角角蛋白特征肽，采用UPLC-MS法对该多肽进行定量研究，从而建立了羚羊角粉专属性的含量测定方法。
所述的方法，优选液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 ，2.1×50mm，1.7μm，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：0-3min，流动相A 95%，流动相B 5%；3-8min，流动相A 95%→50%，流动相B 5%→50%；8-8.1min,流动相A50%→10%，流动相B 50%→90%；8.1-10min,流动相A 10%，流动相B 90%，10-10.1min,流动相A 10%→95%，流动相B 90%→5%，10.1-12min,流动相A 95%，流动相B 5%；
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速，46L/hr；辅助气流速，850 L/hr；喷雾电压，3.5Kv；离子源温度,150℃；辅助气温度，400℃。
所述的方法，优选胰蛋白酶酶解预处理操作如下：
将待检样品10mg加入10mL变性缓冲液和1mL二硫苏糖醇溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心，取上清液500μL，加入100μL 碘代乙酰胺溶液，避光反应30min，混匀，离心，取上清液100μL，加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心得上清液。
所述的方法，优选离心操作为12000rpm离心10min；牛胰蛋白酶溶液浓度为10mg/mL。
所述的方法，优选进样体积为5µl。
所述的方法，优选所述为电喷雾电离(ESI),正离子模式。
所述的方法，优选变性缓冲液制备如下：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得。
所述的方法，优选所述待检样品为羚羊角粉、羚羊角胶囊。
本发明的有益效果：
1）经大量实验研究及蛋白质数据库比对，寻找到了羚羊角区别于常见伪品山羊角、水牛角和黄牛角的专属性的羚羊角肽（LYJT），采用酶解并结合UPLC-MS法，对羚羊角粉中特征肽进行了含量方法学研究，建立了羚羊角肽的专属性含量测定方法，填补了羚羊角粉的质量标准的空白，提高了羚羊角粉的质量控制水平；
2）该羚羊角粉中特征肽含量测定方法的建立，可以大大提高羚羊角粉的质量控制水平，确保羚羊角粉临床用药的有效性。
附图说明
图1 专属性考察-空白溶液图谱，
图2 专属性考察-LYJT对照品图谱，
图3 专属性考察-样品SFX-60图谱，
图4进样量与色谱峰面积线性关系图，
图5 检出限图谱（离子对：697.66→1021.48），
图6 定量限图谱（离子对：697.66→1021.48）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
下述实施例中相关溶液的制备方法如下：
变性缓冲液：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得。
DTT溶液：称取DTT（二硫苏糖醇）适量，用水溶解，即得（浓度为0.50M）；
IAA溶液：称取IAA（碘代乙酰胺）适量，用水溶解，即得（浓度为0.55M，临用现配）；
碳酸氢铵溶液：称取碳酸氢铵适量，用水溶解，即得（浓度为1.0%）；
乙酸溶液：精密量取乙酸适量，用水稀释，即得（浓度为0.5%）；
牛胰蛋白酶溶液：称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，即得（浓度为10mg/ml），分装成小份，贮存于-20℃，备用。
实施例1
1 仪器、试剂与样品
仪器：Waters Quattro Premier XE高效液相色谱-质谱联用仪；Sartorius CP225D电子天平。
试剂：胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBG6452V）；羚羊角肽（SQQQEPLVCPSYQSHFR,上海强耀生物有限公司，批号：04010028811 纯度为98.11%，简称LYJT）；羚羊角对照药材（中检院提供，批号：1064-0801和121064-201004）；盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。
2 液相及质谱条件
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，见表1。
表1 梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 3 | 95 | 5 |
| 8 | 50 | 50 |
| 8.1 | 10 | 90 |
| 10 | 10 | 90 |
| 10.1 | 95 | 5 |
| 12 | 95 | 5 |
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5Kv；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；选择m/z（三电荷） 697.66→1021.48、697.66→1181.49作为检测离子对(锥孔电压20V，碰撞电压20V)，其中m/z（三电荷） 697.66→1021.48为定量离子对。溶剂延迟（solventdelay）为0～4.2min和7.1～12min。进样体积为5µl。
3 溶液的制备
3.1 供试品溶液制备
精密称取羚羊角粉10mg，精密加入10ml变性缓冲液和1mlDTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
3.2 对照品溶液制备
精密称取羚羊角肽（LYJT）12.88mg， 置于100ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得LYJT对照A溶液。精密量取LYJT对照A溶液2ml，置于100ml容量瓶，加入1ml变性缓冲液，再精密加入50μl DTT溶液和120μl IAA溶液，避光反应30min，加水定容至刻度，摇匀，即得LYJT对照B溶液。再精密量取LYJT对照B溶液5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得LYJT对照C溶液。
3.3 空白溶液制备
精密称取10ml变性缓冲液和1mlDTT溶液，置具塞试管中，混匀，密塞，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
4 专属性的考察
取供试品溶液、LYJT对照C溶液和空白溶液，各5μl，注入液相色谱-质谱进行分析，结果空白溶液在与羚羊角肽（LYJT）出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在与羚羊角肽（LYJT）出峰位置有相对应的色谱峰出现，表明该方法专属性良好。见图1、2、3。
5 线性关系考察
取3.2项下LYJT对照B溶液用水稀释成不同浓度的溶液,注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积值为纵坐标，羚羊角肽对照品进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程y= 15309x + 91.47（r = 0.9996），在0.02528～2.528μg/ml范围内，羚羊角肽的进样量与色谱峰面积成良好的线性关系，见表2。
表2 线性关系结果
| 编号 | 进样量（μg/ml） | 峰面积 |
| 1 | 0.02528 | 362.64 |
| 2 | 0.05056 | 755.34 |
| 3 | 0.1264 | 1830.06 |
| 4 | 0.2528 | 3568.66 |
| 5 | 0.5056 | 8409.41 |
| 6 | 1.0112 | 16073.57 |
| 7 | 2.528 | 38529.38 |
6 检出限与定量限的考察
取LYJT对照C溶液，用水稀释50倍，得到浓度为2.528ng/ml，进样5μl，见图5，在m/z（三电荷） 697.66→1021.48定量离子对质谱图中，信噪比S/N为3.2，故可以作为羚羊角肽检出限。取LYJT对照C溶液，用水稀释10倍，得到浓度为12.64ng/ml，进样5μl，见图6，在m/z（三电荷） 697.66→1021.48定量离子对质谱图中，信噪比S/N为14.2，故可以作为羚羊角肽定量限。
7 精密度考察
取LYJT对照C溶液，连续进针五次，测得697.66→1021.48定量离子对的峰面积，结果RSD值为1.7%，仪器精密度良好，结果见下表。
表3 精密度考察
8 稳定性考察
取3.1项下的供试品溶液，分别在0、0.5、1、2、4和6h进样，结果RSD值为3.0%为，供试品溶液在6h内保持稳定，结果见下表。
表4 稳定性考察
9 重复性考察
精密称取羚羊角粉6份，每份10mg，按羚羊角粉溶液制备方法，制得供试品溶液，注入液相色谱-质谱进行分析，结果6份样品含量平均值为1.95μg/mg，RSD值为2.6%。
表5 重复性考察
10 羚羊角粉回收率考察
精密称取已知LYJT含量的羚羊角粉（SFX-61，1.50μg/mg）羚羊角粉6份，每份10mg，各加入约5mg羚羊角粉（SFX-60，LYJT含量为1.95μg/mg），按羚羊角粉溶液制备方法，制得供试品溶液，注入液相色谱-质谱进行分析。
表6 羚羊角粉回收率考察结果
回收率在89.71～107.11%范围内，平均回收率为96.65%，RSD值为6.8%，该方法回收率良好。
11 羚羊角粉的含量测定
SFX-59为羚羊角胶囊，为羚羊角粉未未添加任何辅料，直接装入胶囊制备而成，故直接取内容物按照羚羊角粉含量测定方法进行测定。照上述确定的方法对收集到的样品及中检院提供的2批对照药材进行含量测定，结果见下表。
表7 羚羊角粉的含量测定结果
| 序号 | 生产单位 | 生产批号 | LYJT的含量（μg/mg） |
| 1 | 浙江某制药股份有限公司(SFX-59) | 17060901 | 0.19 |
| 2 | 山东某中药有限公司(SFX-60) | / | 1.95 |
| 3 | 济南某药业有限公司(SFX-61) | 160604 | 1.50 |
| 4 | 济南某药业有限公司(SFX-62) | 170201 | 1.30 |
| 5 | 济南某药业有限公司(SFX-63) | 170201 | 1.38 |
| 6 | 杭州某中药饮片有限公司(SFX-64) | 140409 | 0.08 |
| 7 | 北京某中药饮片有限公司(SFX-65) | 160819008 | 1.93 |
| 8 | 江苏某制药有限公司(SFX-66) | 160604 | 1.47 |
| 9 | 中检院(SFX-67) | 121064-201004 | 5.29 |
| 10 | 中检院(SFX-68) | 1064-0801 | 5.27 |
根据上述结果可知，不同企业的羚羊角粉中羚羊角肽（LYJT）含量差异显著。其中中检院提供的羚羊角对照药材中羚羊角肽含量远远高于其他企业样品，质量最好；而有2家企业样品（SFX-59和SFX-64）含量远远低于正常水平，提示上述两样品存在重大质量问题。出现上述质量差异的原因是羚羊角粉中掺入了大量羚羊角骨塞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种羚羊角粉的含量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取可能含有羚羊角肽的上清液；
（2）将上清液注入液相色谱-质谱仪，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z（三电荷） 697.66→1021.48、697.66→1181.49作为羚羊角肽的检测离子对，m/z（三电荷） 697.66→1021.48为定量离子对；
（3）提取离子697.66→1021.48色谱图，保留时间5.24±0.2min处的色谱峰，在羚羊角肽进样浓度0.02528～2.528μg/ml范围内，以峰面积值为y，进样浓度为x，根据回归方程y =15309x + 91.47，r = 0.9996，计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角肽的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于羚羊角肽检出限2.528ng/ml，定量限为12.64ng/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于胰蛋白酶酶解预处理操作如下：
待检样品经变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液处理后，放冷至室温，离心，上清液加入碘代乙酰胺溶液，避光反应，混匀，离心，上清液加入碳酸氢铵溶液和牛胰蛋白酶溶液，酶解，置90℃处理，取出放冷至室温，离心得上清液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 ，2.1×50mm，1.7μm，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：0-3min，流动相A 95%，流动相B 5%；3-8min，流动相A 95%→50%，流动相B 5%→50%；8-8.1min,流动相A 50%→10%，流动相B 50%→90%；8.1-10min,流动相A 10%，流动相B 90%，10-10.1min,流动相A10%→95%，流动相B 90%→5%，10.1-12min,流动相A 95%，流动相B 5%；
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速，46L/hr；辅助气流速，850 L/hr；喷雾电压，3.5Kv；离子源温度150℃；辅助气温度，400℃。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于胰蛋白酶酶解预处理操作如下：
将待检样品10mg加入10mL变性缓冲液和1mL二硫苏糖醇溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心，取上清液500μL，加入100μL 碘代乙酰胺溶液，避光反应30min，混匀，离心，取上清液100μL，加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心得上清液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于离心操作为12000rpm离心10min；牛胰蛋白酶溶液浓度为10mg/mL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于进样体积为5µl。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于所述电喷雾电离(ESI),正离子模式。
9.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于变性缓冲液制备如下：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于所述待检样品为羚羊角粉、羚羊角胶囊。
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