CN105223280A - 一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法 - Google Patents

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CN105223280A CN201410273887.1A CN201410273887A CN105223280A CN 105223280 A CN105223280 A CN 105223280A CN 201410273887 A CN201410273887 A CN 201410273887A CN 105223280 A CN105223280 A CN 105223280A
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Abstract

本发明公开了一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法，包括对乌鸡增乳制剂进行蛋白质水解处理；然后采用氨基酸分析仪对水解产物进行氨基酸含量测定，本发明方法弥补了现行标准只能以总氮含量测定表征蛋白质含量的不足，能精确测定制剂中17种氨基酸含量，且所述测定方法前处理简便，专一性强、重复性好、精确度高，能很好的提高乌鸡增乳制剂内在质量的可控性和安全有效性。

Description

一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法
技术领域
本发明涉及药学领域中质量控制的运用方法，尤其涉及一种同时测定乌鸡增乳制剂中17种氨基酸含量的测定方法。
背景技术
乌鸡增乳制剂是益气养血，使气血生化促进乳汁分泌的良药，而氨基酸是补益药效的有效成分。对于氨基酸的测定方法，现行质量标准为国家食品药品监督管理局标准WS3-461(Z-054)-2005(Z)，其中蛋白质含量测定只是总氮测定方法，此方法只能说明产品中氮元素含量，不能说明蛋白质，特别是氨基酸有效成分含量的多少。近年来，国内外对氨基酸分析测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、离子色谱法、液质联用法、氨基酸分析仪法等；分光光度法只能解决氨基酸总量的分析，无法确定氨基酸种类；HPLC法与离子色谱法的前处理复杂且需要进行衍生化方可测定，专一性不强；液质联用法仪器昂贵，前处理要求高，操作难度大。全自动氨基酸分析仪采用离子交换柱将对其吸附程度不同的氨基酸分离，分离后的氨基酸再进入仪器的柱后衍生反应检测单元与反应液在反应柱上发生显色反应，从而被检测出来；全自动氨基酸分析仪法不需要氨基酸衍生化步骤，前处理简单，并且具有专一性强、重复性好、精确度高等优点，逐渐成为氨基酸分析测定的主要方法。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法，本发明中的氨基酸测定方法具有操作简便、精密度高、重复性好、回收率好等优点。
为实现本发明目的，本发明提供一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法，包括对乌鸡增乳制剂进行蛋白质水解处理；然后采用氨基酸分析仪对水解产物进行氨基酸含量测定。
其中，所述水解处理是将乌鸡增乳制剂中的蛋白质水解成游离氨基酸。
特别是，所述蛋白质水解处理是将乌鸡增乳制剂与盐酸溶液混合后置于水解瓶中，在氮气保护下，于温度≥100℃的条件下进行所述的蛋白质水解处理。
尤其是，精密称取约55±2mg乌鸡增乳制剂与5-6mol/L盐酸溶液10ml，后置于水解瓶中，在氮气保护下，于温度100-110℃的条件下进行所述的蛋白质水解处理。
特别是，所述盐酸溶液的浓度为6mol/L；所述蛋白质水解处理的温度优选为110℃；处理时间为20-24h，优选为22-24h，进一步优选为22h。
特别是，还包括将蛋白质水解处理的反应混合物干燥后溶于浓度为0.01-0.02mol/L盐酸溶液后，再采用氨基酸分析仪进行所述的氨基酸含量测定。
尤其是，还包括将蛋白质水解处理的反应混合物干燥后溶于浓度为0.02mol/L盐酸溶液后，再采用氨基酸分析仪进行所述的氨基酸含量测定。
尤其是，精密称取约55±2mg乌鸡增乳制剂置于水解管中，加5-6mol/L盐酸溶液10ml，充氮气封口，将已封口的水解管置于100-110℃的恒温干燥箱内，水解22-24h后，取出冷却；打开水解管，将水解液全部转移至蒸发皿中，置于水浴上蒸干，向残渣中加适量0.01-0.02mol/L盐酸溶液溶解并转移至50ml量瓶中，加0.01-0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，定容，摇匀，用微孔滤膜滤过，取滤液作为待测品溶液，再采用氨基酸分析仪进行所述的氨基酸含量测定。
本发明采用氨基酸分析仪对水解产物进行氨基酸含量测定，其中，所述氨基酸含量测定过程中的色谱条件为：
色谱柱的填料为离子交换树脂；反应柱的填料为金刚砂惰性材料；
蛋白质水解分析缓冲溶液包括：PH-1；PH-2；PH-3；PH-4；PH-RG；反应液包括：茚三酮；茚三酮缓冲液；5％乙醇；所述蛋白质水解分析缓冲溶液按照下表配制而成：
名称 PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG
钠浓度(N) 0.16 0.2 0.2 1.2 0.2
密度 1.02 1.02 1.02 1.06 1.00
1.蒸馏水 700mL 700mL 700mL 700mL 700mL
2.柠檬酸钠(二水) 6.19g 7.74g 13.31g 26.67g —
3.氢氧化钠 — — — — 8.00g
4.氯化钠 5.66g 7.07g 3.74g 54.35g —
5.柠檬酸(一水) 19.80g 22.00g 12.80g 6.10g —
6.乙醇 130.0mL 20.0mL 4.0mL — 100.0mL
7.苯甲醇 — — — 5.0mL —
8.硫代双乙醇 5.0mL 5.0mL 5.0mL — —
9.聚氧乙烯月桂醚* 4.0mL 4.0mL 4.0mL 4.0mL 4.0mL
10.pH(标称) 3.3 3.2 4.0 4.9 —
11.总计(标准) 1.0L 1.0L 1.0L 1.0L 1.0L
12.辛酸 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL
所述反应液按照下表配制而成：
检测波长：570nm、440nm；色谱柱柱温：57℃；反应柱柱温：135℃；进样量：20μl；所述蛋白质缓冲溶液的流速为0.400ml/min；反应液的流速为0.350ml/min。
特别是，在570nm波长下检测门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸；在440nm波长下检测脯氨酸。
其中所述氨基酸含量测定过程中色谱柱的流动相按照下表的梯度进行洗脱：
时间/min PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG
0 100 0 0 0 0
2.5 100 0 0 0 0
2.6 0 100 0 0 0
5.0 0 100 0 0 0
5.1 0 0 100 0 0
12.8 0 0 100 0 0
12.9 0 0 0 100 0
27.0 0 0 0 100 0
27.1 0 0 0 0 100
32.0
32.1
33.0 0 0 0 0 100
33.1 0 100 0 0 0
34.0 0 100 0 0 0
34.1 100 0 0 0 0
37.0
37.1
53.0 100 0 0 0 0
所述反应柱的流动相按照下表的梯度进行洗脱：
时间/min R1 R2 R3 时间/min R1 R2 R3
0 50 50 0 32.0 50 50 0
2.5 32.1 0 0 100
2.6 33.0
5.0 33.1
5.1 34.0
12.8 34.1
12.9 37.0 0 0 100
27.0 37.1 50 50 0
27.1 53.0 50 50 0
特别是，在进行乌鸡增乳制剂蛋白质水解处理之前，还包括绘制氨基酸标准曲线，即首先分别精确称取适量的17种氨基酸标准品：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸，接着将17中氨基酸标准品一并溶于盐酸溶液，配制成氨基酸混合标准品溶液，然后采用氨基酸分析仪测定氨基酸标准品溶液中氨基酸的含量；然后分别以各氨基酸的浓度为横坐标，相应氨基酸的峰面积为纵坐标绘制17种氨基酸标准品的标准曲线，分别获得17种氨基酸标准品的线性方程。
特别是，所述17种氨基酸标准品的质量分别为：门冬氨酸69±2mg、苏氨酸30±2mg、丝氨酸28±2mg、谷氨酸83±2mg、脯氨酸90±2mg、甘氨酸65±2mg、丙氨酸4±2mg、胱氨酸35±2mg、缬氨酸10±2mg、甲硫氨酸25±2mg、异亮氨酸53±2mg、亮氨酸15±2mg、酪氨酸29±2mg、苯丙氨酸36±2mg、赖氨酸14±2mg、组氨酸40±2mg、精氨酸67±2mg；所述盐酸溶液的浓度为0.01-0.02mol/L，优选为0.02mol/L。
尤其是，分别精密量取氨基酸混合标准品溶液2.5ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.5ml置于不同的50ml量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，定容，摇匀，制得氨基酸分析仪的测定液，然后进行标准曲线的绘制。
氨基酸分析仪作为一种氨基酸分析的经典专用仪器，其原理是利用各氨基酸在阳离子交换树脂色谱柱上的吸附程度不同，按照设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH值的缓冲溶液依次将氨基酸洗脱下来；分离后的氨基酸再进入仪器的柱后衍生反应检测单元与反应液在反应柱上发生显色反应，生产蓝紫色物质可在570nm被检测到(仲氨生成浅黄色物质在440nm检测)。
根据测定的氨基酸标准品的标准曲线，以外标法计算乌鸡增乳制剂中氨基酸含量。
本发明所具有的有益技术效果，至少包含：
1、本发明所述的氨基酸含量的测定方法首次将全自动氨基酸分析仪应用于乌鸡增乳制剂中同时测定17种氨基酸的含量。
2、对于乌鸡增乳制剂中氨基酸含量测定方法，现行的质量标准为国家食品药品监督管理局标准WS3-461(Z-054)-2005(Z)，2005年颁发至今已有8年历史，其中蛋白质含量测定只是总氮测定方法，此方法只能说明产品中氮元素的含量，不能说明蛋白质，也别是氨基酸等有效成分含量的多少，单纯控制氮元素的含量并不能保证产品安全有效。
3、本发明提供的氨基酸含量的测定方法解决了乌鸡增乳制剂中氨基酸含量测定的难题，能精确测定出每一种氨基酸的含量，能较好地反映乌鸡增乳制剂中蛋白质及氨基酸的情况，为更好的控制乌鸡增乳制剂的内在质量提供了一种可靠、有效的方法。
4、本发明提供的氨基酸含量的测定方法不需要氨基酸衍生化，节省试验时间，简化试验步骤，本方法对操作人员的操作熟练程度要求较低，很容易普及推广。
5、本发明提供的氨基酸含量的测定方法具有专一性强、重复性好、精确度高、回收率好等优点，能很好的提高乌鸡增乳制剂内在质量的可控性和安全有效性。
附图说明
图1为氨基酸混合标准品色谱图；
图2为待测品溶液色谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
仪器与试药
仪器：L-8900日立全自动氨基酸分析仪；DN-44干燥箱；水浴锅；色谱柱：以阳离子交换树脂为填料的日立公司#2622PH色谱柱(4.6mm×60mm，3μm)；反应柱：以金刚砂惰性材料为填料的日立#2650L反应柱(4.6mm×40mm)。
试药：乌鸡增乳胶囊样品16批(批号：1205003、1206004、1207005、1208006、1210007、1211009、1301001、1301002、1301003、1302004、1303005、1303006、1303007、1307008、1309009、1309010)，乌鸡增乳大颗粒(批号2014006-007)，乌鸡浓缩液(批号20140201)，乌鸡骨粉(批号20140202)均由天津亚宝药业科技有限公司提供；氨基酸标准品(批号020080154)由中国食品药品检定研究院提供，除谷氨酸纯度为99.5％，甲硫氨酸纯度为99.7％外，其余均按100％计算；蛋白质水解缓冲溶液及反应液(茚三酮、茚三酮缓冲液、5％乙醇)均购自日立公司，其组分见表1-2，所述蛋白质水解缓冲溶液及反应液按照L-8900日立全自动氨基酸分析仪使用说明书配制；盐酸为分析纯。
表1蛋白质水解分析缓冲液的组分
名称 PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG
容器(缓冲) B1 B2 B3 B4 B6
钠浓度(N) 0.16 0.2 0.2 1.2 0.2
密度 1.02 1.02 1.02 1.06 1.00
1.蒸馏水 700mL 700mL 700mL 700mL 700mL
2.柠檬酸钠(二水) 6.19g 7.74g 13.31g 26.67g —
3.氢氧化钠 — — — — 8.00g
4.氯化钠 5.66g 7.07g 3.74g 54.35g —
5.柠檬酸(一水) 19.80g 22.00g 12.80g 6.10g —
6.乙醇 130.0mL 20.0mL 4.0mL — 100.0mL
7.苯甲醇 — — — 5.0mL —
8.硫代双乙醇 5.0mL 5.0mL 5.0mL — —
9.聚氧乙烯月桂醚* 4.0mL 4.0mL 4.0mL 4.0mL 4.0mL
10.pH(标称) 3.3 3.2 4.0 4.9 —
11.总计(标准) 1.0L 1.0L 1.0L 1.0L 1.0L
12.辛酸 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL
备注：*将25g溶于100mL蒸馏水
表2反应液组分
实施例1氨基酸混合标准品溶液的制备
各取17种氨基酸标准品适量，精密称定，置同一250ml量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，定容，摇匀，作为标准品贮备液。再精密量取标准品贮备液5ml置于50ml量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，定容，摇匀，作为标准品溶液。各氨基酸标准品称样量及浓度见表3。
表3各氨基酸标准品称样量及浓度表
备注：标准品贮备液和标准品溶液中盐酸赖氨酸已折算成赖氨酸的浓度。
实施例2待测品溶液的制备
精密称取约55mg乌鸡增乳制剂置于水解管中，加6mol/L盐酸溶液10ml，充氮气封口，将已封口的水解管置于110℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。打开水解管，将水解液全部转移至蒸发皿中，置于水浴上蒸干，向残渣中加适量0.02mol/L盐酸溶液溶解并转移至50ml量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，定容，摇匀，用微孔滤膜滤过，取滤液作为待测品溶液。
实施例3色谱测定
分别精密吸取标准品溶液与待测品(批号为1307008)溶液各20μl，注入氨基酸分析仪，进行测定。
其中，蛋白质水解分析缓冲溶液B1：PH-1；B2：PH-2；B3：PH-3；B4:PH-4；B5：水；B6:PH-RG。反应液R1：茚三酮；R2：茚三酮缓冲液；R3：5％乙醇。分析方法按表4程序进行。
表4分析方法程序表
检测波长：通道1:570nm；通道2：440nm(检测脯氨酸)；色谱柱柱温：57℃；反应柱柱温：135℃；进样量：20μl。
各氨基酸保留时间及分离度结果见表3。
表5各氨基酸保留时间及分离度
由表5可知，在选定的色谱条件下，测得其中14种氨基酸与其它相邻峰的分离度大于1.5，可达到完全分离，其余3种氨基酸与其它相邻峰的分离度大于1.2，可达到基本分离，理论板数均大于3000。色谱图请参照图1-2，图1是氨基酸混合标准品色谱图；图2是待测品溶液色谱图。
实施例4线性试验
分别精密量取氨基酸混合标准品贮备液2.5ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.5ml置于不同的50ml量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，定容，摇匀。分别吸取20μL进样，按照实施例3中选定的色谱条件进行分析，以各氨基酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算线性方程及相关系数，结果见表6。
表6各氨基酸对照品线性方程及相关系数表
由表6可知，各氨基酸在相应浓度范围内，峰面积均与浓度呈良好的线性关系，回归系数均在0.9996～0.9999之间。
实施例5精密度试验
精密吸取氨基酸混合标准品溶液20μL，连续重复进样6次，按照实施例3中选定的色谱条件进行分析，测定各氨基酸的平均峰面积及相对标准偏差RSD，结果见表7。
表7精密度试验结果表
名称 平均峰面积 RSD
门冬氨酸 7114864 0.16％
苏氨酸 3762233 0.09％
丝氨酸 4067750 0.14％
谷氨酸 8653225 0.11％
甘氨酸 17186934 0.09％
丙氨酸 10492381 0.21％
胱氨酸 342615 0.37％
缬氨酸 4308784 0.08％
甲硫氨酸 1050176 0.15％
异亮氨酸 2741245 0.21％
亮氨酸 5520429 0.19％
酪氨酸 1184316 0.36％
苯丙氨酸 2401062 0.10％
赖氨酸 3193100 0.19％
组氨酸 1361343 0.08％
精氨酸 3281346 0.11％
脯氨酸 1606926 0.22％
由表7可知，各氨基酸峰面积RSD在0.08％～0.37％之间(n＝6)，表明本方法精密度良好。
实施例6稳定性试验
精密吸取氨基酸混合标准品溶液20μL，分别在0、5、12、24、48、60小时进样，精密吸取待测品(批号为1307008)溶液20μL，分别在0、6、12、24、38小时进样，按照实施例3中选定的色谱条件进行分析，计算各氨基酸峰面积及相对标准偏差RSD，结果见表8。
表8溶液稳定性试验结果
由表8可知，标准品溶液各氨基酸峰面积RSD在0.08％～0.37％之间(n＝6)，待测品溶液各氨基酸峰面积RSD在0.58％～1.35％之间(n＝5)，说明溶液在测试时间内稳定性良好。
实施例7重复性试验
精密称取乌鸡增乳制剂(批号为1307008)6份，按上述方法分别制备得到待测品溶液，按照实施例3中选定的色谱条件进行分析，依据表3中各氨基酸标准品线性方程，以外标法分别测定此乌鸡增乳制剂中的氨基酸含量，结果见表9。
表9重现性试验结果表
由表9可知，待测品中门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸和脯氨酸含量较高，均大于10mg/粒，胱氨酸含量最小，约0.7mg/粒，各氨基酸含量RSD在0.18％～2.59％之间(n＝6)，说明本方法重复性良好。
实施例8加样回收试验
精密称取22mg乌鸡增乳制剂(批号为1307008)置水解瓶中，重复9份，分别编号；1-3号水解瓶中分别加入1.5mL标准品贮备液和8.5ml的7.1mol/L盐酸溶液；4-6号水解瓶中分别加入2.5mL标准品贮备液和8ml的7.5mol/L盐酸溶液；7-9号水解瓶中分别加入3.5mL标准品贮备液和9.2ml的6.5mol/L盐酸溶液；充氮气封口，将已封口的水解管放在110℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。打开水解管，将水解液全部转移置蒸发皿中，置水浴上蒸干，加适量0.02mol/L盐酸溶液溶解并转移至50ml量瓶中，加0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取滤液进样，按照实施例3中选定的色谱条件进行分析，计算回收率，结果见表10。
由表10可知，除胱氨酸和甲硫氨酸外，其余氨基酸平均回收率在94.92％～99.43％之间，RSD在1.07％～1.97％之间(n＝9)，说明本方法回收率较好。
实施例9待测品氨基酸含量的测定
分别精密吸取取19批待测品溶液20μL进样，按照实施例3中选定的色谱条件进行分析，依据表3中各氨基酸标准品线性方程，以外标法计算各待测品中的氨基酸含量，测定结果见表12～14。
表11各批号样品的平均装量
表14氨基酸测定结果3单位：mg/g
名称 乌鸡增乳大颗粒 乌鸡浓缩液 乌鸡骨粉
批号 2014006-007 20140201 20140202
门冬氨酸 37.53 36.07 40.93
苏氨酸 16.31 14.45 19.83
丝氨酸 15.16 15.41 17.61
谷氨酸 58.89 65.37 58.12
甘氨酸 53.21 104.90 40.23
丙氨酸 32.95 49.14 31.58
胱氨酸 2.10 1.12 3.67
缬氨酸 19.09 15.63 23.30
甲硫氨酸 7.33 6.99 9.94
异亮氨酸 14.72 10.44 19.01
亮氨酸 28.58 22.77 36.45
酪氨酸 9.68 5.43 14.02
苯丙氨酸 14.99 12.59 18.12
赖氨酸 20.06 26.57 35.03
组氨酸 9.11 11.45 11.98
精氨酸 29.52 42.45 33.82
脯氨酸 33.09 60.31 27.37
总量 402.3 501.1 441.0
由测定结果可知，其中门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸和脯氨酸含量较高，均大于10mg/粒，胱氨酸含量最小，约0.7mg～0.8mg/粒，甲硫氨酸含量也较少，约2.5mg/粒，同时加样回收试验显示，这两个氨基酸平均回收率约为88％和87％，说明酸解过程有一定程度的破坏。另由于采用酸水解法，故本试验条件无法同时测定样品中的色氨酸。
尽管上述对本发明做了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种乌鸡增乳制剂中氨基酸含量的测定方法，包括对乌鸡增乳制剂进行蛋白质水解处理；然后采用氨基酸分析仪对水解产物进行氨基酸含量测定。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征是所述蛋白质水解处理是将乌鸡增乳制剂与盐酸溶液混合后置于水解瓶中，在氮气保护下，于温度≥100℃的条件下进行所述的蛋白质水解处理。
3.如权利要求2所述的测定方法，其特征是所述盐酸溶液的浓度为5-6mol/L。
4.如权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征是所述蛋白质水解处理的温度为100-110℃；处理时间为20-24h。
5.如权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征是还包括将蛋白质水解处理的反应混合物干燥后溶于浓度为0.01-0.02mol/L盐酸溶液后，再采用氨基酸分析仪进行所述的氨基酸含量测定。
6.如权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征是所述氨基酸含量测定过程中色谱条件为：
色谱柱的填料为离子交换树脂；反应柱的填料为金刚砂惰性材料；
蛋白质水解分析缓冲溶液包括：PH-1；PH-2；PH-3；PH-4；PH-RG；反应液包括：茚三酮；茚三酮缓冲液；5％乙醇；其中，蛋白质水解分析缓冲溶液按照下表配制而成：
名称 PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG 钠浓度(N) 0.16 0.2 0.2 1.2 0.2 密度 1.02 1.02 1.02 1.06 1.00 1.蒸馏水 700mL 700mL 700mL 700mL 700mL 2.柠檬酸钠(二水) 6.19g 7.74g 13.31g 26.67g — 3.氢氧化钠 — — — — 8.00g
4.氯化钠 5.66g 7.07g 3.74g 54.35g — 5.柠檬酸(一水) 19.80g 22.00g 12.80g 6.10g — 6.乙醇 130.0mL 20.0mL 4.0mL — 100.0mL 7.苯甲醇 — — — 5.0mL — 8.硫代双乙醇 5.0mL 5.0mL 5.0mL — — 9.聚氧乙烯月桂醚* 4.0mL 4.0mL 4.0mL 4.0mL 4.0mL 10.pH(标称) 3.3 3.2 4.0 4.9 — 11.总计(标准) 1.0L 1.0L 1.0L 1.0L 1.0L 12.辛酸 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL
其中所述反应液按照下表配制而成：
检测波长：570nm、440nm；色谱柱柱温：57℃；反应柱柱温：135℃；进样量：20μl；蛋白质水解分析缓冲溶液的流速为0.400ml/min；反应液的流速为0.350ml/min。
7.如权利要求6所述的测定方法，其特征是所述氨基酸含量测定过程中色谱柱的流动相按照下表的梯度进行洗脱：
时间/min PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG 0 100 0 0 0 0 2.5 100 0 0 0 0 2.6 0 100 0 0 0 5.0 0 100 0 0 0 5.1 0 0 100 0 0 12.8 0 0 100 0 0 12.9 0 0 0 100 0 27.0 0 0 0 100 0 27.1 0 0 0 0 100 32.0 32.1 33.0 0 0 0 0 100 33.1 0 100 0 0 0 34.0 0 100 0 0 0 34.1 100 0 0 0 0 37.0 37.1 53.0 100 0 0 0 0
所述反应柱的流动相按照下表的梯度进行洗脱：
时间/min R1 R2 R3 时间/min R1 R2 R3 0 50 50 0 32.0 50 50 0 2.5 32.1 0 0 100 2.6 33.0 5.0 33.1 5.1 34.0 12.8 34.1
12.9 37.0 0 0 100 27.0 37.1 50 50 0 27.1 53.0 50 50 0
8.如权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征是在进行乌鸡增乳制剂蛋白质水解处理之前，还包括绘制氨基酸标准曲线，即分别精确称取17中氨基酸标准品：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸，一并溶于盐酸溶液，配制成氨基酸混合标准品溶液，接着采用氨基酸分析仪测定氨基酸标准品溶液中氨基酸的含量；然后分别以各氨基酸的浓度为横坐标，相应氨基酸的峰面积为纵坐标绘制17种氨基酸标准品的标准曲线，分别获得17种氨基酸标准品的线性方程。
9.如权利要求8所述的测定方法，其特征是根据测定的氨基酸标准品的标准曲线计算乌鸡增乳制剂中氨基酸含量。
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