CN104155378B - 一种快速分析氨基酸混合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，提供了一种快速分析氨基酸混合物的方法，将待测氨基酸混合物用流动相稀释成供试品溶液，然后采用高效液相色谱法进行氨基酸混合物的分析，色谱柱采用酰胺键合硅胶柱。该方法具有以下优点：1、同时方便的检出多种氨基酸并能达到良好分离；2、分析灵敏度高、结果准确可靠、方法简便快捷，可用于氨基酸类物质或含氨基酸杂质的药物的分析检测；3、酰胺键合硅胶柱比氨基键合硅胶具有更低的背景噪音，有利于保护色谱柱，并且稳定性良好；4、酰胺键合硅胶柱与氨基键合硅胶柱相比，价格低，降低分析成本；5、用酰胺柱进行检测所得峰的峰型较现有氨基色谱柱所出峰的峰型好。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种使用高效液相色谱法快速分析氨基酸混合物的方法。
背景技术
氨基酸已广泛应用于食品、药品中，经研究发现，有些药物中常含有多种氨基酸，各种氨基酸中有关物质主要是其他氨基酸，目前采用的方法中多为薄层色谱法，定性和定量都比较困难，尤其是其他氨基酸，含量在0.1％左右时，薄层板上看不出杂质斑点。氨基酸比例多少直接影响了制剂的质量，从而影响药物的药效。在色谱分离过程中，色谱柱、柱温、流速、流动相的pH都会影响到色谱分离效果，例如：高柱温、大流速都可能使出峰时间提前，然而传统硅胶色谱柱在高温下工作会加快色谱柱的老化，缩短柱寿命，加大流速则会使系统反压升高，而通过改变梯度则要求在色谱柱、柱温、流速等色谱条件相对固定的条件下进行，因此要能同时使多种氨基酸化合物在比较短的时间内达到快速分离，色谱柱显得非常关键。
酰胺键合硅胶色谱柱在反相条件下，可以有效的保留极性化合物，是一种崭现出比氨基柱更好的稳定性，更好的分离效果，酰胺键合硅胶比氨基键合硅胶具有更低的背景噪音。在现有的检测氨基酸的方法中大多采用氨基键合硅胶柱，存在不能同时实现多种氨基酸的有效分离，色谱柱的使用寿命短、成本高等缺点。
发明内容
针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种快速分析氨基酸混合物的方法，为氨基酸的质量控制提供有效的分析手段，并用于检测氨基酸类化合物。
为实现上述目的，本发明提供一种快速分析氨基酸混合物的方法，将待测氨基酸混合物用溶剂稀释成供试品溶液，然后采用高效液相色谱法进行氨基酸混合物的分析，色谱柱采用酰胺键合硅胶柱。
优选的，所述供试品溶液中氨基酸混合物浓度为0.01～1mg/mL。
优选的，所述流动相由无机盐水溶液与色谱纯有机溶剂混合而成，所述无机盐水溶液与所述色谱纯有机溶剂混合的体积比为35:65～40:60。
优选的，所述无机盐水溶液与所述色谱纯有机溶剂混合的体积比为40:60～50:50。
优选的，所述无机盐水溶液的浓度为0.03～0.1mol/L。
优选的，所述无机盐水溶液在制备中加入氨水，再用磷酸调pH值至4.0～4.6；进一步优选的，pH值为4.0±0.5；pH范围以4.0±0.1最佳；现有技术中调节pH在6.0左右，会缩短酰胺柱的使用寿命。
优选的，所述无机盐为磷酸钠盐、磷酸钾盐或磷酸二氢盐；优选的，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
优选的，所述色谱纯有机溶剂为醇类或腈类；优选的，所述色谱纯有机溶剂为甲醇或乙腈。
使用酰胺柱，用上述流动相进行洗脱，能实现各色谱峰的有效分离、分析灵敏度高、结果准确可靠、方法简便快捷，可用于氨基酸类物质或含氨基酸杂质的药物的分析检测。解决了一般液相分析方法的不足。
优选的，所述高效液相色谱法的检测波长为UV205～400nm；波长为205nm最佳，在此波长下，大多氨基酸类物质均有吸收。
优选的，设置的柱温为20～40℃；进一步优选的，柱温为25℃；
优选的，设置流动相的流速为0.6mL/min～2.5mL/min；进一步优选的流速为0.7mL/min～1.0mL/min。
优选的，一种快速分析氨基酸混合物的方法包括以下步骤：
1)制备磷酸二氢盐水溶液，加入氨水，用水稀释后，再用磷酸调节pH值至4.0～4.5，将缓冲盐溶液作为无机盐水溶液；加入氨水后形成的缓冲盐能够稳定溶液的pH，略呈酸性的pH值有利于提前保留时间，提高分析的效率，同时可以延长酰胺柱的使用寿命。
2)将无机盐水溶液与乙腈按35:65～40:60的体积比混合，制得流动相；优选的，无机盐水溶液与乙腈体积比为40:60，溶解样品所用溶剂为65％乙腈的水溶液(体积比)。而现有技术无机盐溶液浓度高，在实际操作过程中，盐易结晶，对色谱柱和仪器的损伤都较大。
3)将氨基酸混合物用65％乙腈的水溶液稀释成浓度为0.01～1mg/mL的供试品溶液；所用溶剂为65％乙腈的水溶液，有利于消除溶剂峰干扰，同时利于保护色谱柱。
4)取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪中，使用酰胺键合硅胶柱，用流动相进行洗脱，检测波长为UV205～400nm，记录液相色谱图；所采用的酰胺键合硅胶柱比氨基键合硅胶具有更低的背景噪音，有利于保护色谱柱。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、同时方便的检出多种氨基酸并能达到良好分离；
2、分析灵敏度高、结果准确可靠、方法简便快捷，可用于氨基酸类物质或含氨基酸杂质的药物的分析检测；
3、酰胺键合硅胶柱比氨基键合硅胶具有更低的背景噪音，有利于保护色谱柱，并且稳定性良好；
4、酰胺键合硅胶柱与氨基键合硅胶柱相比，价格低，降低分析成本；
5、用酰胺柱进行检测所得峰的峰型较现有氨基色谱柱所出峰的峰型好。
附图说明
图1实施例1中精氨酸的HPLC色谱图；
图2实施例1中精氨酸的检测限HPLC色谱图；
图3实施例2中门冬氨酸和鸟氨酸的HPLC色谱图；
图4实施例3测定甘氨酸含量的HPLC色谱图；
图5实施例4丙氨酸0小时测定的HPLC色谱图；
图6实施例4丙氨酸24小时测定的HPLC色谱图；
图7实施例5空白溶剂测定的HPLC色谱图；
图8实施例5使用酰胺柱分离混合液测定的HPLC色谱图；
图9实施例6使用氨基柱分离混合液测定的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1HPLC(高效液相色谱法)测定精氨酸定量限、检测限
色谱柱：酰胺键合硅胶柱(WATERS3.5μm4.6×150mm)。
流动相：乙腈：磷酸盐缓冲液＝60:40；磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾3.2664g，加水240mL溶解后，再加氨水5mL，用磷酸调节pH至4.5±0.1。
检测波长：205nm，流速：1.0mL/min，柱温：25℃。
取精氨酸适量，用65％乙腈溶解，取20μL溶解液注入液相色谱仪，记录液相色谱图(如图1所示)。对供试品进行逐级稀释，用液相色谱仪进行检测，当信噪比为10：1时确立精氨酸的定量限，得定量限：1.5×10-4mg/mL，再次用溶剂对供试品进行稀释，用液相进行检测，记录色谱图，当信噪比为3：1时确立精氨酸的检测限，得精氨酸检测限：5×10-5mg/mL(如图2所示)。由此可见，该方法的灵敏度高，准确度良好。
实施例2HPLC测定门鸟氨酸中门冬氨酸与鸟氨酸比例
色谱柱：酰胺键合硅胶柱(WATERS3.5μm4.6×150mm)。
流动相：乙腈：磷酸盐缓冲液＝60:40；磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾13.61g，加水500mL溶解后，加入25～28％的氨水5mL，加水稀释至1000mL，混合后用磷酸调节pH至4.2±0.1。
检测波长：205nm，流速：1.0mL/min，柱温：25℃。
本实施例的样品组成为：门冬氨酸和鸟氨酸。
取门鸟氨酸适量，加65％的乙腈溶解并稀释制成约4μg/mL的溶液作为供试品溶液；精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图(如图3所示)。经与对照品溶液进行比较，结果表明，15分钟左右为门冬氨酸，22分钟左右为鸟氨酸，门冬氨酸和鸟氨酸能实现有效分离。门冬氨酸和鸟氨酸比例符合测定要求。
实施例3HPLC测定甘氨酸含量
色谱柱：酰胺键合硅胶柱(WATERS3.5μm4.6×150mm)。
流动相：乙腈：磷酸盐缓冲液＝60:40；磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾13.61g，加水500mL溶解后加入25～28％的氨水5mL，加水稀释至1000mL，混合后用磷酸调节pH至4.2±0.1。
取甘氨酸适量，精密称定，加65％的乙腈稀释制成每1mL溶液中约含甘氨酸2μg，检测波长为205nm，流速为1.0mL/min，柱温：25℃。取20μL注入液相色谱仪，记录液相色谱图，参见图4，图中2.7分钟左右为甘氨酸的峰，在此测定条件下，甘氨酸峰型良好，用主成分自身对照法经6次测定，取6次测定含量的平均值，其结果和标示的含量结果一致，说明本法具有较好的准确度。
实施例4HPLC测定丙氨酸稳定性
色谱柱：酰胺键合硅胶柱(WATERS3.5μm4.6×150mm)。
流动相：乙腈：磷酸盐缓冲液＝60:40；磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾13.61g，加水500mL溶解后加入25～28％的氨水5mL，加水稀释至1000mL，混合后用磷酸调节pH至4.2±0.1。
取丙氨酸适量，精密称定，用65％的乙腈溶解并制成每1mL溶液中约含2mg的丙氨酸，作为供试品溶液。
检测波长为205nm，流速为1.0mL/min，柱温：25℃。分别于不同时间点进样，记录色谱图，典型色谱图分别如图5、图6所示，图中2.5分钟左右为丙氨酸，图5为丙氨酸在0小时测试结果，将样品在自然条件下放置24小时后再次检测(如图6所示)，考察丙氨酸峰面积的变化。通过不同时间点取样检查，得计算结果显示该溶液在24小时内测定稳定，含量变化在允许的范围内，同时说明本测定方法具有较好的重现性和稳定性。
实施例5HPLC测定混合样
色谱柱：酰胺键合硅胶柱(WATERS3.5μm4.6×150mm)。
流动相：乙腈：磷酸盐缓冲液＝60:40；磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾13.61g，加水500mL溶解后加入25～28％的氨水5mL，加水稀释至1000mL，混合后用磷酸调节pH至4.2±0.1。
检测波长为205nm，流速为1.0mL/min，柱温：25℃。
分别取富马酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸适量于同一容量瓶中，用65％的乙腈溶解并稀释至刻度，制得含四种物质的混合液，分别取空白溶剂、混合液20μL注入液相色谱仪，记录液相色谱图(如图7、图8所示)。
结果显示，所用空白溶剂对检测结果无干扰作用，混合液中四种物质在同一条件下得到有效分离，保留时间分别在1.3分钟左右、2.4分钟左右、3.1分钟左右、4.3分钟左右的峰依次对应于富马酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸，有效的提升了检测效率。
对比例采用氨基柱分离实施例5中混合样
通过只改变实施例5中检测条件的色谱柱，而其它条件相同情况下，将色谱柱换为氨基键合硅胶柱，进行同样混合样的分离，记录色谱图(如图9所示)。结果显示，有两个峰不容易分开，并且最后一个峰峰型差，对称性不好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种快速分析氨基酸混合物的方法，其特征在于，将待测氨基酸混合物用流动相稀释成供试品溶液，然后采用高效液相色谱法进行氨基酸混合物的分析，色谱柱采用酰胺键合硅胶柱；所述方法包括以下步骤：
1)制备磷酸二氢盐水溶液，加入氨水，用水稀释后，再用磷酸调节pH值至4.0～4.5，将缓冲盐溶液作为无机盐水溶液；所述无机盐水溶液的浓度为0.03～0.1mol/L；
2)将无机盐水溶液与乙腈溶液按35:65～40:60的体积比混合，制得流动相；
3)将氨基酸混合物用65％乙腈的水溶液稀释成浓度为0.01～1mg/mL的供试品溶液；
4)取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪中，使用酰胺键合硅胶柱，用流动相进行洗脱，检测波长为UV205～400nm，记录液相色谱图。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机盐水溶液与乙腈溶液混合的体积比为40:60～50:50。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为UV205～400nm；设置的柱温为20～40℃；设置流动相的流速为0.6mL/min～2.5mL/min。
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