CN114384158A - 一种2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种2‑氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质的检测方法，所述方法为高效液相色谱法。该方法选用氨基色谱柱，以缓冲盐水溶液与乙腈的混合溶液为流动相，进行等度洗脱。本发明通过色谱柱和流动相的选择，实现了2‑氨基吡咯烷盐酸盐的有效保留，将2‑氨基吡咯烷盐酸盐与其特定杂质有效分离，进而准确检测其有关物质，该方法快速、简便、高效、实用。
Description
技术领域：
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质的检测方法。
背景技术：
胸苷磷酸酶(TP)在许多人体实体瘤中高度表达，其通过促进肿瘤细胞的血管生成、转移以及抑制细胞凋亡，加速肿瘤生长。因此，选择性抑制胸苷磷酸酶可以作为抑制肿瘤生长的治疗策略。
盐酸替吡嘧啶(Tipiracil hydrochloride)是一种胸苷类似物，其化学名为5-氯-6-[(2-亚胺吡咯烷-1-基)甲基]-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮盐酸盐，分子式为C9H12Cl2N4O2，化学结构式如下：
盐酸替吡嘧啶为一种有效的胸苷磷酸酶抑制剂，其在体内及体外均表现了良好的抗肿瘤活性。日本大鹏制药开发的曲氟尿苷替吡嘧啶组合物复方制剂于2014年3月获批上市，用于治疗不可缺出型或复发性晚期结直肠癌。
2-氨基吡咯烷盐酸盐是制备盐酸替比嘧啶的关键中间体。为了确保盐酸替比嘧啶的质量有关物质达标，我们需要在前期对其中间体的有关物质进行控制，以免将杂质带入原料药中。2-氨基吡咯烷盐酸盐是强极性化合物，在常规的反相C18或C8键合硅胶填料的色谱柱中难以保留从而导致难以实现其与杂质之间的有效分离(特定杂质见表1)。对于强极性化合物的有关物质检测一直是药物质量控制的难点，2-氨基吡咯烷盐酸盐有关物质的检测方法至今未见报道。因此，提供一种高效、简便的2-氨基吡咯烷盐酸盐的有关物质检测方法是本领域急需解决的技术问题。
表1 2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质的基本信息
发明内容：
本发明的目的是提供一种快速、简便、高效的检测2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质的检测方法。
本发明采用的技术方案如下：选用色谱柱为氨基色谱柱，以缓冲盐水溶液与乙腈的混合溶液为流动相，流动相的体积比为缓冲盐水溶液：乙腈＝20～40:80～60，流速为0.5～1.5mL/min进行等度洗脱。
进一步，所述氨基色谱柱的固定相是以超纯全多孔球形硅胶为基质，使用含有氨基丙基功能团的有机硅烷键合而成，优选月旭氨基色谱柱(Welch Ultimate XB–NH2柱)。
更进一步，所述手性色谱柱的柱温箱温度为25～40℃，优选35℃。
进一步，所述流动相为缓冲盐水溶液与乙腈的混合溶液。
更进一步，所述流动相的体积比为缓冲盐水溶液：乙腈＝20～40:80～60，优选缓冲盐水溶液：乙腈＝30:70。
更进一步，所述缓冲盐水溶液为添加了氨水的磷酸二氢铵水溶液。
更进一步，所述流动相流速为0.5～1.5mL/min，优选1.0mL/min。
进一步，所述供试液浓度为0.5～2mg/mL，优选1mg/mL。
进一步，进样量为0.5～2uL，优选2uL。
进一步，所述检测波长为210nm。
进一步，所述运行时间不少于10min，优选20min。
本发明的有益效果在于，本发明选用氨基色谱柱和特殊的流动相，实现了强极性化合物2-氨基吡咯烷盐酸盐在色谱柱上的有效保留，实现了强极性化合物2-氨基吡咯烷盐酸盐与其特定杂质吡咯烷酮的有效分离，进而准确测试其有关物质，该方法快速、简便、高效、实用。
附图说明
附图1实施例1的高效液相色谱图(紫外吸收图)
附图2实施例1的高效液相色谱图(紫外吸收图)
附图3实施例1的高效液相色谱图(方法分离度谱图)
附图4实施例1的高效液相色谱图(方法灵敏度谱图)
附图5实施例1的高效液相色谱图(供试品检测谱图)
附图6实施例2的高效液相色谱图
附图7实施例3的高效液相色谱图
附图8实施例4的高效液相色谱图
附图9实施例5的高效液相色谱图
附图10实施例6的高效液相色谱图
附图11实施例7的高效液相色谱图
附图12实施例8的高效液相色谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
1、检测波长的选择
本发明考察了2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质吡咯烷酮的紫外吸收，具体方法为：取2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质吡咯烷酮适量，分别加水溶解成1mg/mL的溶液，进样2uL，使用两通管路，流速统一按照0.2mL/min，流动相统一采用用水/乙腈/三氟乙酸的混合溶液(30:70:0.1,V/V/V)，采用高效液相的二极管阵列检测器的全波长扫描功能确定2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质吡咯烷酮的最大吸收波长，紫外吸收图见附图1和附图2，结果见表2。
表2 2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质的最大吸收波长
| 化合物名称 | 最大吸收波长 |
| 2-氨基吡咯烷盐酸盐 | 210nm |
| 吡咯烷酮(特定杂质) | 210nm |
结论：由附图1和附图2可知，2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质吡咯烷酮的紫外吸收较弱,在210nm波长处有最大吸收，所以选定检测波长为210nm。
2、其它色谱柱条件的选择
本发明最终采用表3色谱条件。
表3色谱条件
实验步骤如下：
(1)方法的分离度实验步骤
取2-氨基吡咯烷盐酸盐50mg和特定杂质吡咯烷酮100mg至50mL容量瓶中，用上述稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀后作为分离度实验溶液。将分离度实验溶液按照上述色谱条件进样，记录色谱图，见附图3，其中2-氨基吡咯烷盐酸盐能在5min后出峰，其保留时间Rt为6.125min，峰形良好，拖尾因子为0.98(一般要求0.95～1.05)，特定杂质吡咯烷酮的保留时间Rt为3.976min，两者分离度R为13.0，完全符合基线分离的要求(基线分离要求R≥1.5)。
(2)方法的灵敏度实验步骤
称取特定杂质吡咯烷酮20mg至100mL容量瓶中，用流动相溶解混匀后，精密移取1mL至100mL容量瓶中，再称取2-氨基吡咯烷盐酸盐200mg加入其中，用流动相溶解摇匀后得到含0.1％特定杂质的灵敏度实验溶液，按照以上色谱条件进样，记录色谱图，见附图4，色谱图里特定杂质吡咯烷酮所对应的色谱峰的信噪比S/N为11.9，达到定量检测的信噪比要求(定量检测要求信噪比≥10)。
(3)供试品检测实验步骤
称取2-氨基吡咯烷盐酸盐供试品200mg加入其中，用流动相溶解摇匀即得样品供试液，按照以上色谱条件进样，记录色谱图，见附图5，色谱图里特定杂质吡咯烷酮的检测结果为0.02％，其它未知结构的保留时间Rt位于2.439min的单个杂质为0.04％(该未知的单个杂质与相邻的吡咯烷酮峰也实现了基线分离)。该方法能实现2-氨基吡咯烷盐酸盐供试品里有关物质的检测。
实施例2 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了2-氨基吡咯烷盐酸盐在不同色谱柱上的保留能力，使用实施例1相同的条件和方法，仅将色谱柱替换为常规C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18，250mm*4.6mm*5um)，进样分离度实验溶液，2-氨基吡咯烷盐酸盐出峰过早，保留时间Rt仅为2.188min。，也未实现与杂质的分离，见附图6。
实施例3 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了2-氨基吡咯烷盐酸盐在不同色谱柱上的保留能力，使用实施例1相同的条件和方法，仅将色谱柱替换为C8色谱柱(Kromasil C8，250mm*4.6mm*5um)，进样分离度实验溶液，2-氨基吡咯烷盐酸盐出峰过早，保留时间Rt仅为2.006min，也未实现与杂质的分离，见附图7。
实施例4 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了流动相中添加的氨水对2-氨基吡咯烷盐酸盐在色谱柱上的保留能力的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流动相中的氨水去掉，进样分离度实验溶液，2-氨基吡咯烷盐酸盐出峰仍然比较早，保留时间Rt为3.569min，也未实现与杂质的分离，见附图8。
实施例5 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了不同种类流动相对2-氨基吡咯烷盐酸盐在色谱柱上的保留能力的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流动相替换为水、乙腈与三氟乙酸的混合溶液(30/70/0.1,V/V/V)，进样分离度实验溶液，2-氨基吡咯烷盐酸盐在5min前就出峰，保留时间Rt为3.217min，也未实现与杂质的分离，见附图9。
实施例6 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了不同种类流动相对2-氨基吡咯烷盐酸盐在色谱柱上的保留能力的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流动相替换为15mM二水合磷酸二氢钠水溶液(磷酸调pH 3.0)与乙腈的混合溶液(30/70,V/V)，进样分离度实验溶液，2-氨基吡咯烷盐酸盐在5min后出峰，保留时间Rt为5.133min，但是峰形不好，有一定程度的拖尾，拖尾因子高达2.0，不符合一般要求0.95～1.05，也未实现与杂质的分离，见附图10。
实施例7 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了流动相组分体积比例变动对方法耐用性的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流动相中缓冲盐水溶液与乙腈的体积比例从30:70替换成20:80，进样灵敏度实验溶液，其中2-氨基吡咯烷盐酸盐能在5min后出峰，其保留时间Rt为8.115min，峰形良好，特定杂质吡咯烷酮的保留时间Rt为3.521min，两者分离度R大于15.0，完全符合基线分离的要求(基线分离要求R≥1.5)，见附图11。
实施例8 2-氨基吡咯烷盐酸盐中有关物质高效液相色谱分析
本发明考察了流动相流速变动对方法耐用性的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流速从1.0mL/min替换成0.8ml/min，进样灵敏度实验溶液，见附图12，其中2-氨基吡咯烷盐酸盐在5min后出峰，其保留时间Rt为7.906min，峰形良好，特定杂质吡咯烷酮的保留时间Rt为3.863min，两者分离度R大于15.0，完全符合基线分离的要求(基线分离要求R≥1.5)。
Claims (6)
1.一种2-氨基吡咯烷盐酸盐有关物质的检测方法，其特征在于，选用色谱柱为氨基色谱柱，以缓冲盐水溶液与乙腈的混合溶液为流动相，流动相的体积比为缓冲盐水溶液/乙腈＝20～40:80～60，流速为0.5～1.5mL/min进行等度洗脱。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲盐水溶液为添加氨水的磷酸二氢铵水溶液。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氨基色谱柱的固定相是以超纯全多孔球形硅胶为基质，使用含有氨基丙基功能团的有机硅烷键合而成。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，供试液浓度为0.5～2mg/mL，进样量为0.5～2uL。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测波长为210nm。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，运行时间为10～80min。
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