CN102961378A - 一种复方a-酮酸片及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方a-酮酸片及其制备方法和检测方法，所述制备方法包括：取消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、酮苯丙氨酸钙、酮缬氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙、醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸，将上述主药分别粉碎过100目筛；取淀粉、滑石粉、硬脂酸镁分别过80目筛；将上述各主药和淀粉混合均匀，并用6％PVP k30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干；整粒，加入上述硬脂酸镁、滑石粉及交联聚维酮，混合均匀；中间体检测，压片；包衣，即得。通过利用上述方法可制备出颗粒可压性、流动性及硬度和溶出度均较为理想的片剂，另外，通过本发明所提供的检测方法，可进一步保证制备的复方a-酮酸片的质量。

Description

一种复方a-酮酸片及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及一种一种复方a-酮酸片及其制备方法和检测方法，属于医药技术领域。

背景技术

在发达国家，普通人群慢性肾病(CKD)的患病率达6.5%～10%，美国肾病患者已超过2000万。据中华肾脏病学会天津分会提供的资料，最新调查结果显示，我国40岁以上的人群慢性肾病的患病率高达8%～9%，且发病仍呈增高趋势。

营养治疗一直是延缓CKD进展、缓解尿毒症症状的一种有效措施，在限制蛋白摄入的同时补充必需氨基酸可以使病人达到氮平衡。而根据Brenner的“超滤学说”理论，残余肾单位的过度滤过，引起球内压力增高，同时增加肾小球滤过率，使残余肾单位劳损，造成慢性肾脏病的不断进展与恶化。其中，饮食蛋白的含量是调节肾小球滤过的最主要因素。因此，饮食疗法的目的不仅仅在于减少尿毒症的症状，还在于保护残余肾功能。

申请号为201010105058.4名称为“一种复方α-酮酸片剂及其制备方法”的专利申请及专利号为200810224131.2名称为“一种复方α-酮酸分散片”的专利文件分别公开了一种复方α-酮酸制剂，该制剂可延缓肾衰进展，纠正代谢紊乱，配合低蛋白饮食可预防和治疗因慢性肾功能不全而造成蛋白质代谢失调引起的损害。但是上述的复方α-酮酸片选用的辅料制粒差，颗粒可压性、流动性及颗粒的硬度和溶出度也不够理想；此外，现有技术中还没有任何关于复方α-酮酸制剂的检测方法的报道，因而并不能保证制备的制剂质量，也不能方便工业化生产的要求。因此，寻求稳定的检测方法是我们目前急需解决的事情。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种复方a-酮酸片及其制备方法和检测方法，可制备出颗粒可压性、流动性及硬度和溶出度均较为理想的片剂，同时可保证制备的复方a-酮酸片的质量，方便工业化生产的要求，同时能够医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。

本发明是这样构成的：一种复方a-酮酸片，按重量份计算，由下述组分：消旋酮异亮氨酸钙67份、酮亮氨酸钙101份、酮苯丙氨酸钙68份、酮缬氨酸钙86份、消旋羟蛋氨酸钙59份、醋酸赖氨酸105份、苏氨酸53份、色氨酸23份、组氨酸38份、酪氨酸30份、淀粉95份、交联聚维酮15份、滑石粉20份、硬脂酸镁20份及润湿剂6％PVP k30异丙醇溶液制备而成。

具体的说，按重量计算，由下述组分：消旋酮异亮氨酸钙67mg、酮亮氨酸钙101mg、酮苯丙氨酸钙68mg、酮缬氨酸钙86mg、消旋羟蛋氨酸钙59mg、醋酸赖氨酸105mg、苏氨酸53mg、色氨酸23mg、组氨酸38mg、酪氨酸30mg、淀粉95mg、交联聚维酮15mg、滑石粉20mg、硬脂酸镁20mg及6％PVP k30异丙醇溶液制备而成。

前述的复方a-酮酸片的一种制备方法，包括以下步骤：取消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、酮苯丙氨酸钙、酮缬氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙、醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸，将上述主药分别粉碎过100目筛；取淀粉、滑石粉、硬脂酸镁分别过80目筛；将上述各主药和淀粉混合均匀，并用6％PVP k30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干；整粒，并加入上述硬脂酸镁、滑石粉及交联聚维酮，混合均匀；中间体检测，确定片重，压片；包衣，即得。

所述的复方a-酮酸片的检测方法，该检测方法包括以下步骤：

（1）性状

复方a-酮酸片为黄色薄膜衣片，去除薄膜衣后为白色或类白色；

（2）鉴别

（A）α-酮（或羟）代氨基酸钙峰

（B）氨基酸峰

（3）含量测定

（a）照高效液相色谱法《中国药典》2005二部附录V D测定，用氢型强阳离子交换色谱柱，硫酸溶液为流动相；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算不低于2000；分别称取酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙、酮苯丙氨酸钙置于量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液；取复方a-酮酸片，研细，称取细粉适量，置于量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取滤液，置于量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙的含量。

（b）取复方a-酮酸片，精密称定，研细，精密称取细粉适量置于量瓶中，加盐酸溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定，得供试品溶液；另取相应的氨基酸对照品，用盐酸溶液溶解并稀释制成相应浓度的对照品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量。

（c）取复方a-酮酸片20片，精密称定，研细，取细粉50.4g，加水微热使溶解，加氢氧化钠试液与钙紫红素指示剂少许，用乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色，计算钙的含量。

优选的，所述的含量测定具体包括：

（a）照高效液相色谱法《中国药典》2005二部附录V D测定，用氢型300mm×7.8mm的强阳离子交换色谱柱，0.021mol/L硫酸溶液为流动相，柱温为30℃，流速为0.6ml/min；检测波长为205nm；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算不低于2000；分别精密称取酮缬氨酸钙25mg、消旋酮异亮氨酸钙20mg、酮亮氨酸钙28mg、消旋羟蛋氨酸钙17mg、酮苯丙氨酸钙18mg置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度50ml，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度50ml，作为对照品溶液；取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉183mg置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度50ml，摇匀，滤过；精密量取滤液5ml，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度50ml，摇匀，作为供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙的含量。

（b）取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉63mg置于100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定，得供试品溶液；另取相应的氨基酸对照品，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释制成浓度为0.105mg/ml的对照品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量。

（c）取复方a-酮酸片20片，精密称定，研细，取细粉50.4g，加水100ml微热使溶解，加氢氧化钠试液15ml与钙紫红素指示剂少许，用浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色，每1ml的乙二胺四乙酸二钠滴定液相当于2.004mg的Ca，计算钙的含量。

上述的检测方法或者进一步包括：

检查：取复方a-酮酸片，照溶出度测定法《中国药典》2005年版二部附录XC第二法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，经40分钟，取溶液滤过；

（A）试验仪器：

溶出仪器：RCZ-5A智能药物溶出度仪天津大学精密仪器厂；

测定仪器：原子吸收分光光度仪，Vrain240FS原子吸收分光光度计（美国Vrain公司）；火焰法；波长：422.7nm；VARSAL钙灯（3mA）；气体：乙炔；

（B）实验方法：

对照品贮备液的制备精密量取钙对照溶液（1000μg/ml）适量，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释成1ml中含钙100μg的溶液，作为对照品贮备液；

对照品溶液的制备精密量取钙对照贮备液（100μg/ml）3.0ml、4.0ml、6.0ml及8.0ml，分别置100ml量瓶中，各加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含钙分别为3.0μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备精密量取溶出的续滤液5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法取对照品溶液和供试品溶液，照原子吸收分光光度法《中国药典》2005年版二部附录ⅣD含量测定第一法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液为空白对照组，在422.7nm的波长处测定，计算。

本发明提供的检测方法能有效的控制产品质量；另外，本申请人进行了一系列实验来选择本发明提供的药物制剂的制备工艺；保证科学、合理、可行；保证得到的制剂具有有效的治疗效果，生产企业可以根据本发明直接生产、制备药物制剂，而不再需要进行新的摸索、研究；实际上对于制剂技术来讲，其关键就在于生产工艺条件的选择，尤其是辅料的选择也至关重要；如果选择不当，要么制备不出有效的产品、有时甚至危害健康，要么制剂品种的成本高昂、又不符合市场要求。

实验例1：辅料的选择

（1）粘合剂的选择

以常用溶剂制成的PVP溶液作为粘合剂，考察各处方外观、硬度、脆碎度及溶出度等项目，对处方进行筛选，处方组成见表1。

表1复方α-酮酸片粘合剂组成筛选试验

操作工艺：各主药过100目筛后混匀，淀粉过80目筛后与主药混粉混匀，分别用6％PVP k30水溶液、6％PVP k30乙醇溶液及6％PVP k30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干，整粒后加入硬脂酸镁和滑石粉，混合均匀，压片。对各处方外观、硬度、脆碎度及溶出度进行检测，结果见表2、3。

表2复方α-酮酸片粘合剂组成筛选试验检测结果1

表3复方α-酮酸片粘合剂组成筛选试验检测结果2

处方筛选结果分析：

处方3采用6％PVP k30异丙醇溶液作为粘合剂制粒较为容易，颗粒可压性和颗粒流动性较好，所制样品成型良好，因此发明中复方α-酮酸片的粘合剂选择6％PVP k30异丙醇溶液。

（2）稀释剂及用量的选择

以常用辅料作为稀释剂进行筛选，考察各处方外观、硬度、脆碎度及溶出度等项目，处方组成见表4。

表4复方α-酮酸片稀释剂及其用量组成筛选试验

操作工艺：各主药过100目筛后混匀，稀释剂(乳糖、甘露醇、微晶纤维素PH101、淀粉)过80目筛后分别与主药混粉混匀，用6％PVP k30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干，整粒后加入硬脂酸镁和滑石粉，混合均匀，压片。

对各处方外观、硬度、脆碎度及溶出度进行检测，结果见表5。

表5复方α-酮酸片稀释剂及其用量组成筛选试验检测结果

处方筛选结果分析：

各处方所制样品成型均良好，各处方的差异并不明显，所以复方a-酮酸片采用成本较低的淀粉作为粘合剂。采用淀粉作为稀释剂制粒较为容易，并且其他各项指标均较好，但溶出度较低，因此考虑加入一定量的崩解剂。

（3）崩解剂及其用量的选择

我们采用常用的崩解剂进行筛选，处方组成见表6。

表6复方α-酮酸片崩解剂及其用量组成筛选试验

操作工艺：各主药过100目筛后混匀，淀粉过80目筛后与主药混粉混匀，用6％PVPk30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干，整粒后加入崩解剂、滑石粉和硬脂酸镁，混合均匀，压片。对各处方外观、硬度、均匀性、脆碎度进行检测，结果见表7。

表7复方α-酮酸片崩解剂及其用量组成筛选试验检测结果

处方筛选结果分析：

采用交联聚维酮作为崩解剂各项检测指标均较好，溶出度有显著提高，因此选择处方9作为连续生产的小试和中试处方。

实验例2：检测方法

1．性状

复方a-酮酸片为黄色薄膜衣片，去除薄膜衣后为白色或类白色；

2．鉴别

（1）α-酮（或羟）代氨基酸钙峰

色谱条件与系统适用性试验用氢型强阳离子交换色谱柱（300mm×7.8mm）；0.021mol/L硫酸溶液为流动相；柱温30℃，流速为每分钟0.6ml，检测波长为205nm；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算，应不低于2000，各种α-酮（或羟）代氨基酸钙峰的分离度应符合要求。

对照品溶液的制备取酮缬氨酸钙约25mg、消旋酮异亮氨酸钙约20mg、酮亮氨酸钙约28mg、消旋羟蛋氨酸钙约17mg、酮苯丙氨酸钙约18mg（以上对照品均按无水物计算），精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于酮缬氨酸钙25mg），置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液中各种α-酮（或羟）代氨酸钙峰的保留时间应与各相应的对照品峰的保留时间一致。

在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液中各种α-酮（或羟）代氨酸钙峰的保留时间见表8：

表8α-酮（或羟）代氨基酸钙鉴别结果（保留时间：分）

试验结果：供试品溶液中各种α-酮（或羟）代氨基酸钙峰的保留时间与各相应的对照品峰的保留时间一致；其中编号1、2、3为本发明所涉及的复方α-酮酸片编号。

（2）氨基酸

色谱条件与系统适用性试验用氢型强阳离子交换色谱柱（300mm×7.8mm）；0.021mol/L硫酸溶液为流动相；柱温30℃，流速为每分钟0.6ml，检测波长为205nm；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算，应不低于2000，各种α-酮（或羟）代氨基酸钙峰的分离度应符合要求。

供试品溶液的制备取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，取细粉适量（约相当于醋酸赖氨酸10.5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，用高效液相色谱仪进行分离测定；

对照品溶液的制备另取氨基酸对照品10.5mg，精密称定，置100ml量瓶中，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液。

在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液中各种氨基酸的保留时间见表9：

表9氨基酸鉴别结果（保留时间：分）

试验结果：供试品溶液中各种氨基酸峰的保留时间与各相应的对照品峰的保留时间一致；其中编号1、2、3为本发明所涉及的复方α-酮酸片编号。

3．检查

3.1溶出度

3.1.1溶出方法

取复方a-酮酸片，照溶出度测定法（中国药典2005年版二部附录XC第二法），以0.1mol/L的盐酸溶液1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作，经40分钟时，取溶液滤过。

3.1.2仪器

溶出仪器：RCZ-5A智能药物溶出度仪天津大学精密仪器厂

测定仪器：原子吸收分光光度仪，Vrain240FS原子吸收分光光度计（美国Vrain公司）；火焰法；波长：422.7nm；VARSAL钙灯（3mA）；气体：乙炔。

3.1.3实验方法

对照品贮备液的制备精密量取钙对照溶液（1000μg/ml）适量，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释成1ml中含钙100μg的溶液，作为对照品贮备液。

对照品溶液的制备精密量取钙对照贮备液（100μg/ml）3.0ml、4.0ml、6.0ml及8.0ml，分别置100ml量瓶中，各加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含钙分别为3.0μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备精密量取溶出的续滤液5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法取对照品溶液和供试品溶液，照原子吸收分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣD含量测定第一法），以0.1mol/L的盐酸溶液为空白，在422.7nm的波长处测定，计算，即得。

3.1.4专属性

按复方a-酮酸片处方比例配制成不含α-酮（或羟）代氨基酸钙的空白样品，按上述供试品溶液的制备方法制成相当浓度的空白溶液，进行测定。结果此溶液在422.7nm波长处无吸收，说明其它原辅料不干扰钙的含量测定。

3.1.5线性

精密量取钙对照贮备液（100μg/ml）3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml及8.0ml，分别置100ml量瓶中，各加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含钙分别为3.0μg、4.0μg、5.0μg、6.0μg及8.0μg的溶液。将上述各溶液照原子吸收分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣD含量测定第一法），在422.7nm的波长处测定，结果见下表10。

表10钙测定---线性

实验结果表明：钙元素在3~8μg/ml之间有良好的线性关系。

3.1.6回收率

取线性试验下的5种浓度的溶液作为对照品溶液。

精密称取酮缬氨酸钙约21mg、消旋酮异亮氨酸钙约17mg、酮亮氨酸钙约25mg、消旋羟蛋氨酸钙约15mg、酮苯丙氨酸钙约17mg（以上对照品均按无水物计，平行三份），置250ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声并稀释至刻度，摇匀，作为回收用贮备液。分别精密量取回收用贮备液8ml、10ml、12ml各三份，分别置100ml量瓶中，各加按处方比例配制的缺此五种成分的混和空白颗粒适量，分别加0.1mol/L的盐酸溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

将上述各溶液照原子吸收分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣD含量测定第一法），在422.7nm的波长处测定，计算回收率，试验结果见表11。

表11钙测定---回收率

实验结果表明：回收率良好，本方法测钙含量，准确度高。

3.1.7进样精密度试验

取复方a-酮酸片细粉约83mg，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，取此溶液，连续测定6次，测定结果见下表12。

表12钙测定---进样精密度

实验结果表明：进样精密度良好。

3.1.8重复性试验

精密量取复方a-酮酸片细粉适量，平行6份，用0.1mol/L的盐酸溶液超声溶解并稀释成每ml约含Ca 5.0μg/ml的溶液，照上述方法测定每片的钙含量，测定结果见下表13。

表13钙测定---重复性

实验结果表明：重复性良好。

3.1.9溶液稳定性

精密量取复方a-酮酸片细粉适量，用0.1mol/L的盐酸溶液超声溶解并稀释成每ml约含Ca 5.0μg/ml的溶液，照上述方法分别在0、2、4、8、12小时测定钙含量，测定结果见下表14。

表14钙测定---溶液稳定性

溶出均一性与重现性

取复方a-酮酸片，照溶出度测定法（中国药典2005年版二部附录X C第二法），以0.1mol/L的盐酸溶液1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作，分别于5、10、20、30、40、50、60分钟时，分别取溶液滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，另取含钙分别为3.0、4.0、6.0、8.0μg/ml的对照溶液，照原子吸收分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣD），在422.7nm的波长处测定，计算每片的钙溶出量，以溶出时间为横坐标，每片钙的溶出度为纵坐标作溶出曲线，1批小试样品（20080801）、三批中试样品及被仿品的测定结果见表15~19。

表15复方α-酮酸片溶出曲线数据（批号：20080801）

表16复方α-酮酸片溶出曲线数据（批号：20081001）

表17复方α-酮酸片溶出曲线数据（批号：20081002）

表18复方α-酮酸片溶出曲线数据（批号：20081003）

表19复方α-酮酸片（开同）溶出曲线数据（批号：080402）

表20复方α-酮酸片溶出曲线数据比较

由表20表明，复方a-酮酸片同批内6片的溶出均一性曲线基本吻合，批与批之间的溶出重现性好。

3.1.11不同溶出介质中溶出曲线试验研究

取自制样品20081001批和被仿品080402批，分别以pH4.5的醋酸-醋酸铵缓冲液和pH6.8的磷酸盐缓冲液（按中国药典附录XV D配制）为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，分别于5、10、20、30、40、50、60分钟时，分别取溶液滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，另取含钙分别为3.0、4.0、6.0、8.0μg/ml的对照溶液，照原子吸收分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣD），在422.7nm的波长处测定，计算每片的钙溶出量，以溶出时间为横坐标，溶出度为纵坐标作溶出曲线，见表21～25。当溶出介质为水时，自制样品与市售样品在水中溶出较慢，现象与在pH6.8的磷酸盐缓冲液中基本一致，因此没有做在水中的溶出曲线比较。

表21自制样品20081001批在pH4.5介质中的溶出曲线数据

表22市售样品080402批在pH4.5介质中的溶出曲线数据

表23自制样品20081001批在pH6.8介质中的溶出曲线数据

表24市售样品080402批在pH6.8介质中的溶出曲线数据

表25不同介质中的溶出曲线比较

上述研究结果表明，复方a-酮酸片在pH6.8的介质中几乎不溶出，在pH4.5的介质和0.1mol/L的盐酸介质中溶出较好，0.1mol/L的盐酸介质的溶出效果最佳。

3.1.12三批样品的溶出度测定

取复方a-酮酸片，照溶出度测定法（中国药典2005年版二部附录X C第二法），以0.1mol/L的盐酸溶液1000ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经40分钟时，取溶液滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，另取1000μg/ml的钙标准溶液，用0.1mol/L的盐酸溶液稀释制成含钙分别为3.0、4.0、6.0、8.0μg/ml的溶液，照原子吸收分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣD第一法），在422.7nm的波长处测定，计算每片的钙溶出量。三批样品与被仿品的溶出度测定结果见下表26。

表26三批样品的溶出度测定结果

3.2重量差异

按中国药典2005年版二部附录I A片剂项下规定，需对复方a-酮酸片进行重量差异检查。取复方a-酮酸片20片，精密称定总重量，计算平均片重，再分别精密称定每片的重量，与平均片重相比较，复方a-酮酸片的重量差异限度定为±5%，规定超出限度的不得多于2片，并不得有1片超出限度的1倍。结果见下表27。

表27重量差异检查

结果：三批样品的重量差异检查均符合规定。

3.3微生物限度

取复方a-酮酸片，照微生物限度检查法（中国药典2005年版二部附录ⅪJ）操作，应符合规定。经检查，三批样品均符合规定。

4.含量测定

4.1α-酮（或羟）代氨基酸钙

4.1.1仪器

液相系统：岛津LC－10ATvp泵，岛津SPD－10Avp检测器。

4.1.2色谱条件

色谱柱：氢型强酸性阳离子交换色谱柱（Rezex ROA-Organic Acid 300×7.8mm）；

柱温：30℃；

流动相：0.021mol/L的硫酸溶液；

流速：0.6ml/min；

检测波长：205nm；

进样量：10μl。

4.1.3色谱条件的确定

①色谱柱

由于复方a-酮酸片所含的5种α-酮（或羟）代氨基酸钙均为有机酸钙，参照原标准，用氢型强酸性阳离子交换色谱柱进行分离测定。我们选用的是Phenomenex公司的RezexROA-Organic Acid 300×7.8mm色谱柱。

②流速

根据所用的色谱柱的特点，流速不宜超过0.6ml/min，流速太低则测定的时间过长，因此选用0.6ml/min的流速。

③检测波长

由于复方a-酮酸片中除了酮苯丙氨酸钙，其它4种α-酮（或羟）代氨基酸钙均为末端吸收，因此选用205nm为检测波长。

④流动相

以0.0125mol/L的硫酸溶液为流动相，对五种α-酮（或羟）代氨基酸钙进行分离，此流动相对5种酮酸钙的对照品分离良好，但由于复方a-酮酸片的阴性样品中含醋酸赖氨酸，醋酸根在此条件下出峰并对测定有干扰，分别尝试0.025mol/L、0.021mol/L、0.01mol/L的硫酸为流动相，结果均可将阴性样品中的醋酸根分离，0.021mol/L条件下5种主成分分离效果最好，因此确定将流动相改为0.021mol/L的硫酸溶液，此条件下醋酸根不干扰测定，其它5种主成分成峰分离良好。

4.1.4溶剂的选择

采用流动相为溶剂。在溶液的稳定性试验中，分别以流动相和水作为溶剂进行比较，虽然在流动相中对照品及供试品较易溶解，但酮苯丙氨酸钙降解很快，影响测定的准确性，而以水为溶剂，提高了酮苯丙氨酸钙的稳定性，基本满足测定要求。

4.1.5实验方法

对照品溶液的制备取酮缬氨酸钙约25mg、消旋酮异亮氨酸钙约20mg、酮亮氨酸钙约28mg、消旋羟蛋氨酸钙约17mg、酮苯丙氨酸钙约18mg（以上对照品均按无水物计算），精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉183mg置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各种α-酮（或羟）代氨基酸钙的含量。

4.1.6专属性试验

①辅料及其它组分的影响

取按处方配制不含α-酮（或羟）代氨基酸钙的空白颗粒，按上法制成阴性样品溶液，进样10μl，记录色谱图。辅料及其它组分不干扰测定。

②各组分定位

取五种α-酮（或羟）代氨基酸钙对照品，单独制成相应的对照品溶液后进样10μl，记录色谱图，混和对照品溶液的色谱图。

③系统适应性试验

从供试品溶液的色谱图可看出，各主成分的理论板数与相邻峰的分离度见下表28。

表28α-酮（或羟）代氨基酸钙测定系统适应性结果

结果表明：各α-酮（或羟）代氨基酸钙的分离度均大于1.5，理论板数均大于4000，满足含量测试的要求。

4.1.7进样精密度试验

取按上述方法制备的对照品溶液，连续进样5次，记录峰面积，结果见下表29：

表29α-酮（或羟）代氨基酸钙的进样精密度测定结果

结果表明，进样精密度良好。

4.1.8溶液稳定性

取按上述方法制备的对照品溶液，室温放置，分别于0、1、2、4、6、8小时分别进样，记录峰面积，结果见下表30。

表30α-酮（或羟）代氨基酸钙在水中的溶液稳定性测定结果

以流动相为溶剂，制备对照品溶液，室温放置，分别于0、1、2、3小时进样，记录峰面积，结果见下表31。

表31α-酮（或羟）代氨基酸钙在流动相中的溶液稳定性测定结果

结果表明，以水为溶剂制成的对照品溶液在放置过程中基本稳定，8小时内各主峰面积的RSD仍小于2%，溶液在8小时内基本稳定；而以流动相为溶剂制成的对照品溶液放置过程中，酮苯丙氨酸钙峰面积下降明显，3小时内RSD已大于2.0%。

4.1.9线性

取酮缬氨酸钙约25mg、消旋酮异亮氨酸钙约20mg、酮亮氨酸钙约28mg、消旋羟蛋氨酸钙约17mg、酮苯丙氨酸钙约18mg（以上对照品均按无水物计算），精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3、4、5、6、8ml置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以各α-酮（或羟）代氨基酸钙的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，测定结果见下表32。

表32α-酮（或羟）代氨基酸钙的线性测定结果

结果表明，上述5种成分的浓度与峰面积呈良好的线性关系。

4.1.10回收率

精密取酮缬氨酸钙约25mg、消旋酮异亮氨酸钙约20mg、酮亮氨酸钙约28mg、消旋羟蛋氨酸钙约17mg、酮苯丙氨酸钙约18mg（以上对照品均按无水物计算，平行三份），精密称定，置50ml量瓶中，加入按处方量制备的缺此五种成分的空白颗粒适量（按处方比例加入），加水超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得100%的回收溶液；另按上述五种成分的称量值的80%、120%称取各对照品，同法操作，即得80%、120%的回收溶液，按上述含量测定法测定，结果见下表33、34。

表33回收率测定结果

表34

上述结果表明，5种成分的回收率均在98.0%~102.0%之间，准确性较高。

4.1.11重复性试验

取复方a-酮酸片（批号：20081001），按上述（1）中方法平行制备6份供试品溶液，照含量测定方法测定，测定结果见下表35。

表35α-酮（或羟）代氨基酸钙的重复性试验测定结果（标示含量，%）

上述结果表明，本法测定重复性好。

4.1.12含量测定

取复方a-酮酸片三批和被仿品，按上述（1）中含量测定方法进行测定，结果见下表36，4批样品的α-酮（或羟）代氨基酸钙的含量均在90.0%～110.0%的范围内。

表36α-酮（或羟）代氨基酸钙的含量测定结果（标示含量，%）

4.2氨基酸（醋酸赖氨酸、苏氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸）

复方a-酮酸片采用异硫氰酸苯酯柱前衍生法处理样品，高效液相色谱法来测定复方a-酮酸片中5种氨基酸的含量，该方法专属性强、灵敏度高、重现性好，经方法学研究，可满足测定的要求。

4.2.1仪器

液相系统：岛津LC－10ATvp泵，岛津SPD－10Avp检测器。

4.2.2色谱条件

色谱柱：Venusil氨基酸分析柱250mm×4.6mm（北京艾杰尔科技有限公司）

流动相：A液：0.1mol/L醋酸钠溶液(pH 6.4)-乙腈（93：7）

B液：乙睛-水（4：1）

检测波长：254nm

柱温：37℃

进样体积：5μL，梯度见下表37：

表37

4.2.3溶液的配制

(1)1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺139μl，加乙腈861μl，混匀。

(2)0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液：取PITC 12μl，加乙腈988μl，混匀。

4.2.4供试品溶液及对照品溶液的配制

取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉63mg，精密称定，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；另取相应的氨基酸对照品适量，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释制成浓度为0.105mg/ml的对照品溶液。

原标准中对照品及供试品均用水溶解，而因为色氨酸在水中微溶，酪氨酸在水极微溶，用水作溶剂不能保证对照品全溶，改用0.1mol/L的盐酸溶解可增加这两种氨基酸的溶解度，使对照品可全溶。

4.2.5对照品溶液和供试品溶液的衍生

精密量取供试品溶液200μl置于1.5ml离心管中，加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液100μl，1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混匀，室温放置1小时，加入400μL正己烷，混匀，放置10分钟，取下层溶液进样。另取对照品溶液同法衍生，即得。

4.2.6色谱条件的确定

①检测波长

复方a-酮酸片的5种氨基酸本身是只有末端吸收，但和异硫氰酸苯酯反应生成的衍生产物在254nm有紫外吸收，因此选用254nm为检测波长。

②流动相梯度

取供试品溶液衍生后，分别试验下述3个梯度条件，见表38：

表38

结果以条件三的梯度分离效果最好。

4.2.7专属性

用上述确定后的色谱条件进行下述实验：

①辅料及其它的影响

取按处方配制不含五种氨基酸的空白颗粒，按上法制成空白溶液后进行衍生。进样，记录色谱图。辅料及其它组分不干扰测定。

②各组分定位

取五种氨基酸对照品，单独制成相应的对照品溶液后进行衍生，进样，记录色谱图。

③系统适应性试验

按上法制备供试品溶液衍生后进样，各主成分的理论板数与相邻杂质峰的分离度见下表39。

表39氨基酸测定系统适应性结果

结果表明：各氨基酸衍生物的分离度均大于1.5，理论板数均大于30000，满足含测的要求。

4.2.8进样精密度试验

取衍生过的对照品溶液，连续进样5次，记录主成分的峰面积，结果见下表40。

表40氨基酸测定进样精密度结果

结果显示进样精密度良好。

4.2.9重复性试验

取20081001批样品，按上述供试品溶液的制备方法平行制备6份，衍生后分别进样，另取衍生后的对照品溶液进样，按外标法计算主成分的标示含量，结果见下表41。

表41氨基酸测定重复性试验结果

结果表明，此方法重复性较好。

4.2.10溶液稳定性试验

取对照品溶液，衍生后室温放置，于0、2、4、6、8小时分别进样，记录峰面积，结果见下表42。

表42氨基酸测定溶液稳定性试验结果

结论：复方a-酮酸片在衍生后放置8个小时基本稳定。

4.2.11线性试验

精密称取5种氨基酸对照品适量（组氨酸约19mg、苏氨酸约26mg、酪氨酸约15mg、盐酸赖氨酸约46mg、色氨酸约12mg）置同一100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸超声使溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液3ml、4ml、5ml、6ml、7ml，分别置25ml量瓶中，用0.1mol/L的盐酸稀释至刻度，摇匀，经上述步骤衍生后，分别注入色谱仪，记录主成分峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回归，结果见下表43。

表43线性测定结果（浓度单位：mg/ml）

线性方程及相关系数分别如下表44：

表44

结果表明，5种主成分在一定的范围内，浓度与峰面积的线性良好。

4.2.12回收率试验

精密称取各氨基酸适量（组氨酸19mg、苏氨酸26.5mg、酪氨酸15mg、醋酸赖氨酸52.5mg、色氨酸11.5mg），置50ml量瓶中（平行三份），各加入按处方配制的缺五种氨基酸的空白颗粒适量，用0.1mol/L的盐酸使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，作为100%的回收溶液；另按上述对照品量的80%、120%分别称取各对照品，同法制备80%、120%的回收溶液。取回收溶液及对照品溶液分别衍生后，分别进样，计算回收率，结果见下表45、表46：

表45回收率测定结果

表46

上述结果表明，5种主成分的回收率均在98.0~102.0%之间，此方法的准确度高。

4.2.13样品的含量测定

三批样品与被仿品的含量测定结果见下表47。4批样品的氨基酸含量均在90.0%~110.0%的范围内。

表47三批样品的氨基酸含量测定结果（按标示量计%）

4.3钙盐

参照复方a-酮酸片的进口质量标准，采用络合滴定法对复方a-酮酸片的钙盐进行测定。

实验方法：取复方a-酮酸片20片，精密称定，研细，精密称取细粉50.4g，加水100ml微热使溶解，加氢氧化钠试液15ml与钙紫红素指示剂少许，用乙二胺四乙酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色。每1ml的乙二胺四乙酸二钠滴定液（0.05mol/L）相当于2.004mg的Ca。

4.3.1滴定终点的判断

参照中国药典中对含钙制剂的钙盐测定方法，大多同上所述。实际在测定复方a-酮酸片的钙盐的过程中，溶液颜色的变化依次为紫红色、紫蓝色、纯蓝色，滴定终点需仔细辩认，最后溶液的紫色消失转变为纯蓝色即为滴定终点。

4.3.2其它原辅料的干扰试验

按处方比例制备缺五种α-酮（或羟）代氨基酸钙的空白颗粒，同上述实验方法操作，同时以100ml水加上15ml氢氧化钠试液与少许钙紫红指示剂作空白对比，结果两种溶液现象一样，说明复方a-酮酸片的其它原辅料不干扰钙的测定。

4.3.3重复性试验

按上述实验方法，取复方a-酮酸片平行六份进行测定，结果如下表48：

表48钙含量测定重复性试验结果

结果表明，此法测定钙重复性良好。

4.3.4回收率

精密称取酮缬氨酸钙（C10H14CaO6）约68.8mg、消旋酮异亮氨酸钙（C12H18CaO6）约53.6mg、酮亮氨酸钙（C12H18CaO6）约80.8mg、消旋羟蛋氨酸钙（C10H18CaO6S2）约47.2mg、酮苯丙氨酸钙（C18H14CaO6）约54.4mg（以上对照品均按无水物计，平行六份），各加按处方比例配制的缺此五种成分的混和空白颗粒适量，置250ml三角瓶中，加水100ml微热使溶解，加氢氧化钠试液15ml与钙紫红指示剂少许，用乙二胺四乙酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色。计算回收率，结果见下表49：

表49钙含量测定回收率试验结果

结果表明，此法测定钙含量回收率良好。

4.3.5溶液稳定性

取复方a-酮酸片细细适量（约相当于钙40mg）5份，精密称定，加水100ml微热使溶解，于室温放置，分别于0、2、4、6、8小时，各取一份，照上法进行测定，测定结果见下表50。

表50钙含量溶液稳定性测定结果

试验结果表明，此法溶液稳定性良好。

4.3.6三批样品及被仿品钙含量测定

取复方a-酮酸片三批及被仿品，按上述实验方法测定，结果如下表51：

表51钙含量测定结果

5．溶剂残留

复方a-酮酸片在制粒及包衣过程中均使用了异丙醇作为溶剂，按中国药典2005年版二部附录ⅧP残留溶剂测定法第一法测定复方a-酮酸片的异丙醇残留量，异丙醇为三类溶剂，要求不得过0.5%。

5.1气相色谱条件及测定法

仪器：美国瓦里安CP-3800气相色谱仪

检测器：FID

顶空进样装置：HSJ-05B（北京雷德科技发展有限公司）

GC毛细管柱：DB-624（30m×0.53mm×3.0ｕm）（美国Agilent公司）

固定液：（6%）氰丙基苯基-二甲基硅氧烷

柱温：70℃。

进样口温度：200℃；检测器温度：250℃

顶空温度：80℃；平衡时间：40分钟；进样体积：1ml

顶空压力：0.35MP

柱流速：1ml/min；氢气：25ml/min；空气：300ml/min

尾吹：25ml:min；分流比：1

试剂：异丙醇为色谱纯

测定法：取复方a-酮酸片10片，研成细粉，精密称取约0.5g置20ml顶空瓶中，精密加水5.0ml，加盖密封，大力振摇，作为供试品溶液；另精密称取异丙醇适量，加水稀释成0.15mg/ml的溶液，精密量取对照品溶液5ml，置20ml顶空瓶中，作为对照品溶液。分别取供试品溶液及对照品溶液顶空后进样。按外标法以峰面积计算供试品中的异丙醇残留量。

5.2系统适用性试验

在上述的气相色谱条件下，分别取水、对照品溶液、供试品溶液（20080801批）顶空后进样，测定结果表明，空白溶剂无干扰，异丙醇色谱峰的理论板数达15000以上，拖尾因子为1.04，供试品溶液中异丙醇与相邻杂质峰分离度达1.5以上，符合要求。

5.3线性试验

精密称取异丙醇181.05mg，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取0.25ml,0.5ml,2ml,4ml,8ml分别置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为线性试验溶液。精密量取5.0ml置顶空瓶中，进样。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，结果见下表52。

表52溶剂残留检查异丙醇线性试验结果

结论：异丙醇的峰面积与浓度线性关系良好。

5.4进样精密度试验

精密量取对照品溶液5.0ml，平行6份，连续进样，记录峰面积，计算RSD值，结果见下表53。

表53溶剂残留检查进样精密度试验结果

结果：进样精密度良好。

5.5检出限与定量限

精密称取异丙醇适量，用水配成适当浓度的溶液，加水逐级稀释成一定浓度后顶空进样，记录异丙醇色谱峰面积至信噪比为3：1和10：1时的浓度分别为检测限及定量限。结果异丙醇的检出限为3.62μg/ml，定量限为10.86μg/ml。

5.6重复性试验

精密称取复方a-酮酸片（批号：20080801）细粉约0.5g，各置顶空瓶中，精密加水5ml，平行6份，按上述方法测定异丙醇的残留量，结果见下表54。

表54异丙醇测定重复性试验结果

结果：此法测定异丙醇的重复性良好。

5.7回收率试验

对照品溶液的制备:精密称取异丙醇184.05mg，加水稀释至50ml。分别精密量取8ml，10ml,12ml,置250ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得1号、2号、3号对照品溶液。以2号对照品溶液作为检测用对照品，1号、2号、3号为加样回收用对照液。

供试品溶液的制备:取复方a-酮酸片粉末（批号：20080801）0.5g，置20ml顶空瓶中，精密加入上述1号、2号、3号对照品溶液5ml，每个浓度3份，共9份，大力振摇，即得供试品溶液。

取对照品溶液及供试品溶液顶空后进样，按外标法计算加样回收率，结果见下表55。

表55异丙醇测定加样回收率测定结果

结果：此法测定异丙醇回收率良好。

与现有技术相比，通过本发明所提供的复方α-酮酸片的检测方法，可进一步保证制备的复方a-酮酸片的质量，方便工业化生产的要求，同时能够医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。本发明中的润滑剂选择硬脂酸镁和滑石粉，其中硬脂酸镁的润滑性强，抗粘附性好，助流性差，若与其他润滑剂混合应用，润滑性更佳，－般用量为0.25%～1%，但是，滑石粉密度大，抗粘附性及助流性好，但附着性及润滑性较差，一般用量为3%～6%，两者联合使用可以起到很好的互补作用。

具体实施方式

取消旋酮异亮氨酸钙67mg、酮亮氨酸钙101mg、酮苯丙氨酸钙68mg、酮缬氨酸钙86mg、消旋羟蛋氨酸钙59mg、醋酸赖氨酸105mg、苏氨酸53mg、色氨酸23mg、组氨酸38mg、酪氨酸30mg，将上述主药分别粉碎过100目筛；取淀粉95mg、滑石粉20mg、硬脂酸镁20mg分别过80目筛；将上述各主药和淀粉混合均匀，并用6％PVP k30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干；整粒，并加入上述硬脂酸镁、滑石粉及15mg交联聚维酮，混合均匀；中间体检测，确定片重，压片；包衣，即得复方α-酮酸片。

本复方α-酮酸片的检测方法，包括：

（1）性状

复方a-酮酸片为黄色薄膜衣片，去除薄膜衣后为白色或类白色；

（2）鉴别

（A）α-酮（或羟）代氨基酸钙峰

（B）氨基酸峰

（3）含量测定

（a）照高效液相色谱法《中国药典》2005二部附录V D测定，用氢型300mm×7.8mm的强阳离子交换色谱柱，0.021mol/L硫酸溶液为流动相，柱温为30℃，流速为0.6ml/min；检测波长为205nm；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算不低于2000；分别精密称取酮缬氨酸钙25mg、消旋酮异亮氨酸钙20mg、酮亮氨酸钙28mg、消旋羟蛋氨酸钙17mg、酮苯丙氨酸钙18mg置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度50ml，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度50ml，作为对照品溶液；取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉183mg置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度50ml，摇匀，滤过；精密量取滤液5ml，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度50ml，摇匀，作为供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙的含量。

（b）取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉63mg置于100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定，得供试品溶液；另取相应的氨基酸对照品，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释制成浓度为0.105mg/ml的对照品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量。

（c）取复方a-酮酸片20片，精密称定，研细，取细粉50.4g，加水100ml微热使溶解，加氢氧化钠试液15ml与钙紫红素指示剂少许，用浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色，每1ml的乙二胺四乙酸二钠滴定液相当于2.004mg的Ca，计算钙的含量。

（4）检查：

取复方a-酮酸片，照溶出度测定法《中国药典》2005年版二部附录XC第二法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，经40分钟，取溶液滤过；

（A）试验仪器：

溶出仪器：RCZ-5A智能药物溶出度仪天津大学精密仪器厂；

测定仪器：原子吸收分光光度仪，Vrain240FS原子吸收分光光度计（美国Vrain公司）；火焰法；波长：422.7nm；VARSAL钙灯（3mA）；气体：乙炔；

（B）实验方法：

对照品贮备液的制备精密量取钙对照溶液（1000μg/ml）适量，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释成1ml中含钙100μg的溶液，作为对照品贮备液；

对照品溶液的制备精密量取钙对照贮备液（100μg/ml）3.0ml、4.0ml、6.0ml及8.0ml，分别置100ml量瓶中，各加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含钙分别为3.0μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备精密量取溶出的续滤液5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法取对照品溶液和供试品溶液，照原子吸收分光光度法《中国药典》2005年版二部附录ⅣD含量测定第一法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液为空白对照组，在422.7nm的波长处测定，计算。

本发明所述的

1.酮缬氨酸钙对照品的精制方法如下：

取600ml纯化水和60g酮缬氨酸钙精品（20070701批）加至2L三口瓶中，搅拌并加热至60℃；溶解后加入3g活性炭，脱色30min；趁热过滤，搅拌下向滤液中加入1.2L丙酮，冰水浴冷却至5-10℃，静置析晶8h；过滤，40℃真空干燥10h，得白色晶体40g，收率66.7%。

性状：复方a-酮酸片为白色或类白色结晶性粉末。

检查：

（1）水分取复方a-酮酸片适量，照水分测定法(《中国药典》2005年版二部附录VIIIM第一法A)测定，样品预搅拌时间为5分钟，含水分不超过10.0%。

（2）纯度照高效液相色谱法(《中国药典》2005版二部附录V D)测定。

色谱条件与系统适用性试验离子色谱柱(Rezex ROA-Organic Acid 300×7.8mm)，以0.025mol/L硫酸溶液为流动相，检测波长为205nm，流速为1.0ml/min，柱温为50℃；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算不低于2000。取复方a-酮酸片适量，加水制成每1ml中含1.0mg的溶液作为供试品溶液，量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。按面积归一化法计算供试品纯度不得小于99.5%。

钙含量测定取复方a-酮酸片适量(约相当于钙50mg)，精密称定，置500ml三角瓶中，加水300ml使溶解，加6ml氢氧化钠溶液(42→100)，加钙羧酸钠指示剂(取钙羧酸0.1g，加氯化钠9.9g，研磨均匀，即得)适量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液颜色由紫色变为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.004mg的Ca。按无水物计算，含Ca为14.60%～15.13%。

2.消旋酮异亮氨酸钙对照品精制方法：

取2L三口瓶，加入840ml纯化水和70g消旋酮异亮氨酸钙（20070801批），搅拌加热至70℃溶解，加入6g活性炭，脱色30min。趁热过滤，搅拌下向滤液中加入2.4L丙酮，冰水浴冷却至5-10℃，静置析晶6h。过滤，40℃真空干燥10h，得白色晶体48g，收率68.6%。

性状：复方a-酮酸片为白色或类白色结晶性粉末。

检查：（1）水分取复方a-酮酸片适量，照水分测定法(《中国药典》2005年版二部附录VIII M第一法A)测定，样品预搅拌时间为5分钟，含水分不超过12.0%。

（2）纯度照高效液相色谱法(《中国药典》2005版二部附录V D)测定。

色谱条件与系统适用性试验离子色谱柱(Rezex ROA-Organic Acid 300×7.8mm)，以0.0025mol/L硫酸溶液为流动相，检测波长为205nm，流速为0.6ml/min，柱温为30℃。理论板数按消旋酮异亮氨酸钙峰计算不低于2000。

取复方a-酮酸片适量，加水制成每1ml中含1.0mg的溶液作为供试品溶液，量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。按面积归一化法计算供试品纯度不小于99.5%。

钙含量测定：取复方a-酮酸片适量(约相当于钙50mg)，精密称定，置500ml三角瓶中，加水300ml使溶解，加6ml氢氧化钠溶液(42→100)，加钙羧酸钠指示剂(取钙羧酸0.1g，加氯化钠9.9g，研磨均匀，即得)适量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液颜色由紫色变为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.004mg的Ca。按无水物计算，含Ca应为13.22%～13.70%。

3.酮亮氨酸钙对照品精制方法：

取1L纯化水和50g酮亮氨酸钙（20070601批）加入2L三口瓶中，搅拌下水浴加热升温至80℃，待固体溶解后，加入4g活性炭，搅拌30min。趁热过滤。搅拌下向滤液中加入2L丙酮，搅拌均匀，将其冷至5～10℃，静置6h。过滤，将滤饼于40℃真空干燥10h。得精品42g，收率84.0%。

性状：复方a-酮酸片为白色或类白色结晶性粉末，微臭。

检查（1）水分取复方a-酮酸片适量，照水分测定法(《中国药典》2005年版二部附录VIII M第一法A)测定，样品预搅拌时间为5分钟，含水分不超过12.0%。

（2）纯度照高效液相色谱法(《中国药典》2005版二部附录V D)测定。

色谱条件与系统适用性试验离子色谱柱(Rezex ROA-Organic Acid 300×7.8mm)，以0.0025mol/L硫酸溶液为流动相，检测波长为205nm，流速为0.6ml/min，柱温为30℃。理论板数按酮亮氨酸钙峰计算不低于2000。取复方a-酮酸片适量，加水制成每1ml中含1.0mg的溶液作为供试品溶液，量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。按面积归一化法计算供试品纯度不小于99.5%。

钙含量测定取复方a-酮酸片适量(约相当于钙50mg)，精密称定，置500ml三角瓶中，加水300ml使溶解，加6ml氢氧化钠溶液(42→100)，加钙羧酸钠指示剂(取钙羧酸0.1g，加氯化钠9.9g，研磨均匀，即得)适量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液颜色由紫色变为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.004mg的Ca。按无水物计算，含Ca为13.22%～13.70%。

4.消旋羟蛋氨酸钙对照品的精制方法：

向1L三口瓶中加入600ml纯化水和60g消旋羟蛋氨酸钙（20070801批），搅拌水浴加热升温至60℃，溶解后加入5g活性炭，搅拌30min。趁热过滤。搅拌下向滤液中加入1.2L丙酮，搅拌均匀，将其冷至5～10℃，静置6h。过滤，将滤饼于40℃真空干燥10h。得样品44g，收率73.3%。

性状：复方a-酮酸片为白色或类白色结晶性粉末。

检查：（1）水分取复方a-酮酸片适量，照水分测定法(《中国药典》2005年版二部附录VIII M第一法A)测定，样品预搅拌时间为5分钟，含水分应不得过5.0%。

（2）纯度色谱条件与系统适用性试验离子色谱柱(Rezex ROA-Organic Acid300×7.8mm)，以0.025mol/L硫酸溶液为流动相，检测波长为205nm，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。理论板数按消旋羟蛋氨酸钙峰计算不低于2000。取复方a-酮酸片适量，加水制成每1ml中含1.0mg的溶液作为供试品溶液，量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。按面积归一化法计算供试品纯度不小于99.5%。

钙含量测定：取复方a-酮酸片适量(约相当于钙50mg)，精密称定，置500ml三角瓶中，加水300ml使溶解，加6ml氢氧化钠溶液(42→100)，加钙羧酸钠指示剂(取钙羧酸0.1g，加氯化钠9.9g，研磨均匀，即得)适量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液颜色由紫色变为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.004mg的Ca。按无水物计算，含Ca为11.66%～12.07%。

5.酮苯丙氨酸钙对照品的精制方法：

向三口瓶中加入60g酮苯丙氨酸钙（20070701批）和4L纯化水，加热升温至80℃，搅拌溶解。加入20g活性炭搅拌30分钟。趁热过滤，搅拌下向滤液中加入8L丙酮，搅拌均匀，于5-10℃静置析晶8h。过滤，将滤饼于40℃真空干燥10h。得34g白色固体，收率56.7%。

性状：复方a-酮酸片为白色或类白色结晶性粉末。

检查：（1）水分取复方a-酮酸片适量，照水分测定法(《中国药典》2005年版二部附录VIII M第一法A)测定，样品预搅拌时间为5分钟，含水分不超过6.0%。

（2）纯度照高效液相色谱法(《中国药典》2005版二部附录V D)测定。

色谱条件与系统适用性试验离子色谱柱(Rezex ROA-Organic Acid 300×7.8mm)，以0.025mol/L硫酸溶液为流动相，检测波长为205nm，流速为0.8ml/min，柱温为20℃。理论板数按酮苯丙氨酸钙峰计算不低于2000。取复方a-酮酸片适量，加水制成每1ml中含0.5mg的溶液作为供试品溶液，量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。按面积归一化法计算供试品纯度不小于99.5%。

钙含量测定：取复方a-酮酸片适量(约相当于钙50mg)，精密称定，置500ml三角瓶中，加水300ml使溶解，加6ml氢氧化钠溶液(42→100)，加钙羧酸钠指示剂(取钙羧酸0.1g，加氯化钠9.9g，研磨均匀，即得)适量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液颜色由紫色变为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.004mg的Ca。按无水物计算，含Ca为10.76%～11.16%。

Claims (6)

1.一种复方a-酮酸片，其特征在于，按重量份计算，由下述组分：消旋酮异亮氨酸钙67份、酮亮氨酸钙101份、酮苯丙氨酸钙68份、酮缬氨酸钙86份、消旋羟蛋氨酸钙59份、醋酸赖氨酸105份、苏氨酸53份、色氨酸23份、组氨酸38份、酪氨酸30份、淀粉95份、交联聚维酮15份、滑石粉20份、硬脂酸镁20份及润湿剂6％PVP k30异丙醇溶液制备而成。

2.根据权利要求1所述的复方a-酮酸片，其特征在于，按重量计算，由下述组分：消旋酮异亮氨酸钙67mg、酮亮氨酸钙101mg、酮苯丙氨酸钙68mg、酮缬氨酸钙86mg、消旋羟蛋氨酸钙59mg、醋酸赖氨酸105mg、苏氨酸53mg、色氨酸23mg、组氨酸38mg、酪氨酸30mg、淀粉95mg、交联聚维酮15mg、滑石粉20mg、硬脂酸镁20mg及润湿剂6％PVP k30异丙醇溶液制备而成。

3.权利要求1或2所述的复方a-酮酸片的一种制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、酮苯丙氨酸钙、酮缬氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙、醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸，将上述主药分别粉碎过100目筛；取淀粉、滑石粉、硬脂酸镁分别过80目筛；将上述各主药和淀粉混合均匀，并用6％PVP k30异丙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃烘干；整粒，并加入上述硬脂酸镁、滑石粉及交联聚维酮，混合均匀；中间体检测，确定片重，压片；包衣，即得。

4.权利要求1或2所述的复方a-酮酸片的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

（1）性状

复方a-酮酸片为黄色薄膜衣片，去除薄膜衣后为白色或类白色；

（2）鉴别

（A）α-酮或羟代氨基酸钙峰

（B）氨基酸峰

（3）含量测定

（a）照高效液相色谱法《中国药典》2005二部附录V D测定，用氢型强阳离子交换色谱柱，硫酸溶液为流动相；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算不低于2000；分别称取酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙、酮苯丙氨酸钙置于量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液；取复方a-酮酸片，研细，称取细粉适量，置于量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取滤液，置于量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙的含量；

（b）取复方a-酮酸片，精密称定，研细，精密称取细粉适量置于量瓶中，加盐酸溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定，得供试品溶液；另取相应的氨基酸对照品，用盐酸溶液溶解并稀释制成相应浓度的对照品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量；

（c）取复方a-酮酸片20片，精密称定，研细，取细粉50.4g，加水微热使溶解，加氢氧化钠试液与钙紫红素指示剂少许，用乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色，计算钙的含量。

5.根据权利要求4所述的复方a-酮酸片的检测方法，其特征在于，所述的含量测定具体包括：

（a）照高效液相色谱法《中国药典》2005二部附录V D测定，用氢型300mm×7.8mm的强阳离子交换色谱柱，0.021mol/L硫酸溶液为流动相，柱温为30℃，流速为0.6ml/min；检测波长为205nm；出峰顺序依次为酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙；理论板数按酮缬氨酸钙峰计算不低于2000；分别精密称取酮缬氨酸钙25mg、消旋酮异亮氨酸钙20mg、酮亮氨酸钙28mg、消旋羟蛋氨酸钙17mg、酮苯丙氨酸钙18mg置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度50ml，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度50ml，作为对照品溶液；取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉183mg置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度50ml，摇匀，滤过；精密量取滤液5ml，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解并稀释至刻度50ml，摇匀，作为供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算酮缬氨酸钙、消旋酮异亮氨酸钙、酮亮氨酸钙、消旋羟蛋氨酸钙和酮苯丙氨酸钙的含量；

（b）取复方a-酮酸片10片，精密称定，研细，精密称取细粉63mg置于100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定，得供试品溶液；另取相应的氨基酸对照品，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释制成浓度为0.105mg/ml的对照品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量；

（c）取复方a-酮酸片20片，精密称定，研细，取细粉50.4g，加水100ml微热使溶解，加氢氧化钠试液15ml与钙紫红素指示剂适量，用浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色，每1ml的乙二胺四乙酸二钠滴定液相当于2.004mg的Ca，计算钙的含量。

6.根据权利要求4或5所述的复方a-酮酸片的检测方法，其特征在于，还包括：

检查：取复方a-酮酸片，照溶出度测定法《中国药典》2005年版二部附录XC第二法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，经40分钟，取溶液滤过；

（A）试验仪器：

溶出仪器：RCZ-5A智能药物溶出度仪天津大学精密仪器厂；

测定仪器：原子吸收分光光度仪，美国Vrain公司的Vrain240FS原子吸收分光光度计；火焰法；波长：422.7nm；3mA的VARSAL钙灯；气体：乙炔；

（B）实验方法：

对照品贮备液的制备精密量取1000μg/ml钙对照溶液适量，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释成1ml中含钙100μg的溶液，作为对照品贮备液；

对照品溶液的制备精密量取100μg/ml钙对照贮备液3.0ml、4.0ml、6.0ml及8.0ml，分别置100ml量瓶中，各加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含钙分别为3.0μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备精密量取溶出的续滤液5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法取对照品溶液和供试品溶液，照原子吸收分光光度法《中国药典》2005年版二部附录ⅣD含量测定第一法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液为空白对照组，在422.7nm的波长处进行测定、计算。