CN118010891B - 一种枸橼酸托法替布缓释片中有关物质的检测分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枸橼酸托法替布缓释片中有关物质的检测分析方法。采用高效液相色谱法，稀释剂为0.05%三氟乙酸溶液：乙腈=95：5，v/v；流速为0.8~1.2 mL/min，柱温为30~38℃，检测波长为210~230 nm，流动相A：pH3.8~4.2的0.01M磷酸二氢钾溶液‑乙腈，两者体积比为97：3；流动相B：乙腈；进行梯度洗脱。本发明使用普通的HPLC仪，能够有效分离和定量检测10种特定杂质，具有检测杂质种类多、成本低和时间短的优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测领域，尤其涉及一种枸橼酸托法替布缓释片中有关物质的检测分析方法。
背景技术
类风湿关节炎（RA）是一种慢性进展性疾病，表现为对称性炎症性多关节炎，可引发不可逆的关节损害和进行性残疾。
枸橼酸托法替布（Tofacitinib citrate），是Janus激酶（JAK）选择性抑制剂，能强效抑制JAK3，对JAK1有交叉抑制作用，对JAK具有中度选择性。托法替布作为一种靶向合成改善病情抗风湿药（tsDMARD）已显示其在类风湿关节炎患者中具有较好的获益风险比。其结构式如下：
式A。
化学名称：(3R，4R)-4-甲基-3-(甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基氨基) -β-氧代-1-哌啶丙腈枸橼酸盐。
枸橼酸托法替布缓释片（Xeljanz XR）于2016年2月23日经美国FDA批准上市，适用于甲氨蝶呤疗效不足或对其无法耐受的中度至重度活动性类风湿关节炎（RA）成人患者，可与甲氨蝶呤或其他非生物改善病情抗风湿药（DMARD）联合使用。
目前没有关于枸橼酸托法替布及相关制剂的法定方法，Xeljanz XR进口注册标准中涉及杂质多为工艺杂质，仅含一个降解杂质，对制剂（尤其是改良型制剂）的质量控制指导有限。同时该标准方法为超高效液相（UPLC）方法，成本高，适用范围受限，且该方法中稀释剂干扰大，检测能力低，无法普遍应用于枸橼酸托法替布缓释片中有关物质的检测；
其他涉及托法替布检测方法的文献较少，大多是针对托法替布特定工艺杂质或中间体的控制检测方法，目前未有涉及枸椽酸托法替布缓释片的杂质分析方法专利。
现有技术有公开了一种托法替布片中降解产物的检测方法，未涉及枸橼酸托法替布缓释片。存在仅能检测一个降解杂质和一个工艺杂质且洗脱时间较长的缺点（总时间60.14min），检测时间与成本增加，无法满足同时检测多个杂质的需求；
还有现有技术公开了枸橼酸托法替布中杂质检测分析方法，采用普通高效液相色谱法（HPLC）对枸橼酸托法替布中13个杂质进行检测，未明确区分降解杂质和工艺杂质，同时该方法中的甲酸铵流动相系统会对低波长（210-220nm）的吸收造成较强的干扰，适用范围较有限，没办法对仅在低波长有吸收的杂质（如杂质10）进行定量检测，且未对该方法在制剂中的分析应用进行研究，同时也存在洗脱时间较长的缺点（80min）。
上述方法基本都存在成本高，适用性低，无法满足枸橼酸托法替布缓释片的检测需求。因此，结合枸橼酸托法替布常见的工艺杂质及可能出现的降解杂质，开发一种成本低、快速、高效的普通HPLC检测方法，用于测定枸橼酸托法替布缓释片中的有关物质是有实际意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以同时分离测定10个杂质的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种枸橼酸托法替布缓释片中有关物质的检测分析方法，具体步骤如下：
采用高效液相色谱法，待测品的进样体积为20~100µl，利用紫外检测器，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶（C18）为填充剂，4.6 mm × 250 mm，5μm；稀释剂：0.05%三氟乙酸溶液：乙腈=95：5，v/v；流速为0.8~1.2 mL/min，柱温为30~38℃，检测波长为210~230 nm；
流动相A：pH3.8~4.2的0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈，两者体积比为97：3；
流动相B：乙腈；
流动相采用以下方式进行梯度洗脱：
0~5min，流动相A的比例为100%~95%，流动相B的比例为0~5%；
5~19min，流动相A的比例变为85%~75%，流动相B的比例变为15%~25%；
19~28min，流动相A的比例变为55%~45%，流动相B的比例变为45%~55%；
28~30min，流动相A的比例变为100%~95%，流动相B的比例变为0~5%；
30~40min，流动相A的比例保持100%~95%，流动相B的比例保持为0~5%；
所述有关物质为表1中的10种，其中杂质1至杂质4为潜在降解杂质，杂质5至杂质10为托法替布的工艺杂质，目前没有方法能够很好的检测杂质10。
具体结构式见表1：
表1杂质1-10的结构式
进一步的，所述梯度洗脱设置如下：
流动相A为pH 4.0的10mM磷酸二氢钾溶液-乙腈，两者体积比为97：3；
检测波长为220nm；
流速为1.0mL/min；
柱温为35℃。
进一步的，所述检测分析方法中，枸橼酸托法替布检测时，取枸橼酸托法替布缓释片，用稀释剂稀释，磁力搅拌至药品溶散完全，取出搅拌子后超声，冷却至室温后用稀释剂定容，摇匀静置；再取部分溶液离心；取上清液稀释后过滤，再取续滤液作为待测品溶液。
进一步的，用稀释剂稀释至每1mL中含托法替布0.22mg。
进一步的，所述超声时间为20min。
进一步的，所述离心为8000rpm转速离心5min。
进一步的，所述过滤为采用0.22 μm亲水PTFE材质滤膜过滤。
本发明还提供所述的检测分析方法在检测含有空白辅料的枸橼酸托法替布缓释片中有关物质含量中的应用。
进一步的，所述空白辅料包括羟丙甲纤维素、聚乙二醇、滑石粉、微晶纤维素、乳糖、甘露醇、醋酸纤维素、聚维酮、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、HPMC 2910、硬脂酸镁、氧化铁红、山梨糖醇、二氧化钛、三醋精、氧化铁黄、欧巴代中的一种或多种。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
本发明采用普通的HPLC仪（紫外检测器），能对4个降解杂质以及6个常见工艺杂质进行有效分离和定量检测，且尚未有公开的方法报道可以同时分离测定这10个杂质，本技术存在检测杂质种类多、成本低和时间短的特点，可见图1。同时，本发明在检测含有如下空白辅料（由羟丙甲纤维素、聚乙二醇、滑石粉、微晶纤维素、乳糖、甘露醇、醋酸纤维素、聚维酮、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、HPMC 2910、硬脂酸镁、氧化铁红、山梨糖醇、二氧化钛、三醋精、氧化铁黄、欧巴代等部分或全部辅料按处方比例组成）的枸橼酸托法替布缓释片中有关物质含量时，均具有良好的专属性，可见表4。因此本发明可广泛应用于枸橼酸托法替布缓释片中有关物质检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1的HPLC检测中10个杂质的色谱图。
图2是本发明实施例2中加标溶液的色谱图。
图3是本发明对比例1中加标溶液的色谱图。
图4是本发明对比例1中现有技术检测加标溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所用稀释剂为0.05%三氟乙酸水溶液：乙腈=95:5的体积比混合溶液。
实施例1：枸橼酸托法替布缓释片的有关物质HPLC分析
1.制备各种溶液的制备：
制备供试品溶液：取枸橼酸托法替布缓释片5片（规格22mg）/10片（规格11mg），置于100mL量瓶中，加适量稀释剂，磁力搅拌至药品溶散完全，取出搅拌子，超声20min，冷却至室温后用稀释剂定容至刻度处，摇匀静置。取部分溶液，8000rpm转速离心5min。精密移取上清液10mL，置于50mL量瓶中，用稀释剂定容至刻度，摇匀。取部分此溶液用0.22 μm亲水PTFE材质滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，每1mL中含托法替布0.22mg；
制备空白辅料溶液：称取约825mg空白辅料（空白辅料：由羟丙甲纤维素、聚乙二醇、滑石粉、微晶纤维素、乳糖、甘露醇、醋酸纤维素、聚维酮、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、HPMC 2910、硬脂酸镁、氧化铁红、山梨糖醇、二氧化钛、三醋精、氧化铁黄中的部分或全部辅料按照处方比例配制），按供试品溶液配制方法进行，获得空白辅料溶液；
制备对照品贮备液：称取枸椽酸托法替布约36mg（相当于托法替布约22mg），并将其放置于100mL容量瓶中，用稀释剂溶解对照品并稀释至100mL指定刻度，摇匀后作为托法替布对照品贮备液；
制备对照品溶液：精密移取托法替布对照品贮备液1mL至100mL容量瓶，用稀释剂稀释定容后摇匀，即得每1mL中含托法替布0.0022mg的溶液，作为对照品溶液；
制备灵敏度溶液：精密移取对照品溶液1mL至20mL容量瓶，用稀释剂稀释定容后摇匀，即得每1mL中含托法替布0.00011mg的溶液，作为灵敏度溶液；
制备加标溶液：取杂质1对照品2.8mg，置25mL量瓶中；取杂质2对照品2.3mg，置50mL量瓶中；取杂质3对照品、杂质4对照品、杂质5对照品、杂质6对照品、杂质7对照品、杂质8对照品、杂质9对照品和杂质10对照品各约3.7mg，分别置不同的100mL量瓶中，加稀释剂适量超声使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品贮备液；移取杂质1对照品贮备液5mL、杂质2对照品贮备液5mL、杂质3~10对照品贮备液各3mL置于同一个50mL量瓶中，作为杂质贮备液1；取枸橼酸托法替布约35.8mg，置100mL量瓶中，加稀释剂适量超声使溶解，加入10mL杂质贮备液1，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得加标溶液；
制备各杂质定位溶液：移取杂质1对照品贮备液500μL、杂质2对照品贮备液500μL、杂质3~10对照品贮备液各300μL分别置于不同的100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得各杂质定位溶液；
制备各杂质和托法替布的混合溶液：精密移取托法替布对照品贮备液10mL至100mL容量瓶，用稀释剂稀释定容后摇匀。分别精密移取此溶液和杂质1~2对照品贮备液各5mL、杂质3~10对照品贮备液各3mL置于同一个50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀作为混合溶液贮备液；移取混合溶液贮备液5mL至25mL容量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀后即得混合溶液。
方法：
精密量取上述供试品溶液、空白辅料溶液、稀释剂、对照品溶液、灵敏度溶液、加标溶液、各杂质定位溶液和混合溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，进行梯度洗脱并记录色谱图。
高效液相色谱仪条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，250*4.6mm，5μm；
流动相A：10mM KH2PO4溶液（采用磷酸溶液调节其pH值至4.0）-乙腈（体积比97:3）；
流动相B：乙腈；
检测波长为220nm；
流速为1.0mL/min；
柱温为35℃。
梯度洗脱条件如下表2所示：
表2 梯度洗脱条件表
混合溶液进样结果如图1所示。各杂质峰之间及与托法替布峰之间均能有效分离（分离度>1.5）。
取加标溶液连续进样6针，得到10个杂质的进样精密度结果如下表3所示：
表3 杂质进样精密度结果
各杂质连续进样所得峰面积的RSD均不大于2.1%，说明本发明的检测分析方法重复性好。
实施例2 方法专属性实验
取稀释剂、加标溶液、供试品溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、各杂质定位溶液和混合溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，参阅图1，出峰顺序依次为杂质10、杂质7、杂质1、杂质2、杂质4、杂质3、杂质6、托法替布、杂质5、杂质9和杂质8，相邻色谱峰之间的分离度均不小于1.5，主峰理论板数不低于5000，结果见表4和图2。
表4 方法专属性实验结果
加标溶液中已知杂质间及与托法替布峰间的分离度均大于1.5，稀释剂和空白辅料均不干扰已知杂质和托法替布的检测，说明本发明的分析方法具较好的专属性。
实施例3 杂质1~10和托法替布的检测限和定量限实验
取杂质1~10和托法替布的对照品各适量，分别用0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈（95:5）稀释剂溶解并进行逐步稀释，取信噪比3:1为检测限，取信噪比10:1为定量限。检测限溶液连续进3针，定量限溶液连续进6针，实验结果如表5和表6。
表5杂质1~10和托法替布的检测限的实验结果表
表6杂质1~10和托法替布的定量限的实验结果表
结果显示：杂质9定量限浓度相当于供试品溶液浓度（0.22mg/mL）的0.008%，杂1、杂质2、杂质3、杂质8、杂质10和托法替布定量限浓度相当于供试品溶液浓度（0.22mg/mL）的0.01%，杂质4、杂质5和杂质6定量限浓度相当于供试品溶液浓度（0.22mg/mL）的0.015%，杂质7定量限浓度相当于供试品溶液浓度（0.22mg/mL）的0.02%，灵敏度满足制剂杂质分析要求。
实施例4 杂质1~10和托法替布的线性回归实验
取杂质1~10和托法替布对照品各适量，用稀释剂溶解并稀释制成一系列梯度浓度的混合溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪，以各峰面积A为纵坐标，对应浓度C为横坐标，绘制各成分的标准曲线，计算线性回归方程，实验结果如表7：
表7杂质1~10和托法替布的线性回归实验结果表
试验结果表明，杂质1-10与托法替布的线性良好。
实施例5 方法耐用性实验
精密量取加标溶液20μL，注入高效液相色谱仪，分别改变柱温、流速、进样量和梯度洗脱程序进行测定，考察各杂质间及与主峰间的分离度，以确定方法耐用性，实验结果如表8和表9。
表8 方法耐用性（柱温、流速、进样量）实验结果
表9 方法耐用性（梯度洗脱程序）实验结果
试验结果表明：本发明的检测方法参数（柱温、流速、进样量、梯度洗脱程序）在以上范围变动时，各杂质间及与托法替布峰间均能较好分离，说明本发明方法的耐用性良好。
对比例1 与现有技术的对比实验
精密量取加标溶液，注入高效液相色谱仪，分别采用本发明的检测方法及目前常见的检测方法分别同时进行检测，对比实验结果如表10。
表10 与现有技术对比实验结果
结果表明：现有技术不能有效分离杂质4和杂质2，2个杂质出峰重叠，同时杂质2与杂质3间、杂质6与未知杂质峰间分离不佳。本发明相比现有技术，流动相组成和梯度洗脱程序更为简单，且已知杂质间及与空白辅料峰和未知杂质峰均能很好分离。
从上述实施例和对比例可以看出，本发明提出的枸橼酸托法替布缓释片中4种降解杂质和6种工艺杂质的检测方法，经过对高效液相色谱分析中的色谱柱、流动相等相关条件进行筛选，选用合适的流动相体系，在流动相的比例调节上，确保稀释剂和辅料不干扰样品中各杂质的检测，进而确保托法替布、杂质1~10的色谱峰之间的分离度符合要求，最终建立梯度洗脱的HPLC分析方法，实现对托法替布片中杂质1~10的检测与控制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种枸橼酸托法替布缓释片中有关物质的检测分析方法，其特征在于，具体步骤如下：
采用高效液相色谱法，待测品的进样体积为20~100µl，利用紫外检测器；
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6 mm × 250 mm，5μm；
稀释剂：0.05%三氟乙酸溶液：乙腈=95：5，v/v；流速为0.8~1.2 mL/min，柱温为30~38℃，检测波长为220 nm；
流动相A：pH 4.0的0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈，两者体积比为97：3；
流动相B：乙腈；
流动相采用以下方式进行梯度洗脱：
0 min，流动相A的比例为97%，流动相B的比例为3%；
5 min，流动相A的比例为97%，流动相B的比例为3%；
19 min，流动相A的比例为80%，流动相B的比例为20%；
28 min，流动相A的比例为50%，流动相B的比例为50%；
30 min，流动相A的比例为97%，流动相B的比例为3%；
40 min，流动相A的比例为97%，流动相B的比例为3%；
所述有关物质为如下10种：
杂质1
杂质2
杂质3
杂质4
或/>
杂质5
杂质6
杂质7
杂质8
杂质9
杂质10
所述检测分析方法中，枸橼酸托法替布检测时，取枸橼酸托法替布缓释片，用稀释剂稀释，磁力搅拌至药品溶散完全，取出搅拌子后超声，冷却至室温后用稀释剂定容，摇匀静置；再取部分溶液离心；取上清液稀释后过滤，再取续滤液作为待测品溶液。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为1.0mL/min；柱温为35℃。
3.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述检测分析方法中，用稀释剂稀释至每1mL中含托法替布0.22mg。
4.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述超声时间为20min。
5.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述离心为8000rpm转速离心5min。
6. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述过滤为采用0.22 μm亲水PTFE材质滤膜过滤。
7.权利要求1所述的检测分析方法在检测含有空白辅料的枸橼酸托法替布缓释片中有关物质含量中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述空白辅料包括羟丙甲纤维素、聚乙二醇、滑石粉、微晶纤维素、乳糖、甘露醇、醋酸纤维素、聚维酮、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、HPMC 2910、硬脂酸镁、氧化铁红、山梨糖醇、二氧化钛、三醋精、氧化铁黄、欧巴代中的一种或多种。
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